KR100793007B1

KR100793007B1 - 활성형 나노아케움 이퀴탄스 ｄｎａ 중합효소의 제조방법및 이의 방법으로 제조된 활성형 ｄｎａ 중합효소

Info

Publication number: KR100793007B1
Application number: KR1020050109371A
Authority: KR
Inventors: 권석태; 최정진; 남기훈
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2005-11-15
Filing date: 2005-11-15
Publication date: 2008-01-08
Also published as: US7749732B2; KR20070051596A; US20070154913A1

Abstract

본 발명은 활성형 나노아케움 이퀴탄스 B-type DNA 중합효소 (Nanoarchaeum equitans B-type DNA polymerase, Neq DNA polymerase, 이하 ‘Neq DNA 중합효소'라고 함)를 제조하는 방법, 이의 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소 및 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR'이라고 함)에 관한 것으로, 본 발명의 활성형 Neq DNA 중합효소는 PCR 등의 다양한 핵산 중합 반응에 이용되어질 수 있을 것이다.

DNA 중합효소 (DNA polymerase), 나노아케움 이퀴탄스 (Nanoarchaeum equitans), DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity), 분할된 미니 인테인 (split mini-intein), 단백질 트랜스 스플라이싱 (protein trans-splicing), 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction), 핵산 중합 반응

Description

활성형 나노아케움 이퀴탄스 ＤＮＡ 중합효소의 제조방법 및 이의 방법으로 제조된 활성형 ＤＮＡ 중합효소{Method for preparing active Nanoarchaeum equitans DNA polymerase and the active DNA polymerase prepared by the same method}

도 1은 나노아케움 이퀴탄스 게놈 상에서 Neq DNA 중합효소 유전자들에 초점을 맞춘 유전자 지도와 전기 유전자들로부터 만들어지는 폴리펩타이드들의 구성 및 유전자들의 발현을 위한 재조합 플라스미드 구축물들을 나타낸 것이다.

도 2는 Neq DNA 중합효소의 익스테인 아미노산 서열 및 인테인 아미노산 서열을 각각 종래의 고세균 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소들의 아미노산 서열들 및 Ssp DnaE 단백질의 인테인 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 공동발현된 Neq L과 Neq S의 열처리 시간에 따른 단백질 트랜스 스플라이싱 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 정제된 단백질들 Neq L, Neq S, Neq C 및 Neq P의 정제 단계별 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 정제된 Neq L과 Neq S를 이용하여 반응 시간별, 반응 온도별 및 반응 pH별로 단백질 트랜스 스플라이싱을 분석한 결과들을 나타낸 것이다.

도 6은 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어서의 생화학적 특성들을 나타낸 것이다.

도 7은 활성형 Neq DNA 중합효소의 열안정성을 나타낸 것이다.

도 8은 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 있어서의 생화학적 특성들을 나타낸 것이다.

도 9는 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과들을 나타낸 것이다.

도 10은 dUTP 존재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과를 비교를 위해 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과와 함께 나타낸 것이다.

본 발명은 활성형 나노아케움 이퀴탄스 B-type DNA 중합효소 (Nanoarchaeum equitans B-type DNA polymerase, Neq DNA polymerase, 이하 ‘Neq DNA 중합효소'라고 함)를 제조하는 방법, 이의 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소 및 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR'이라고 함)에 관한 것이다.

초고온성 극미고세균 (hyperthermophilic nanoarchaeon) 나노아케움 이퀴탄스는 아이슬랜드 (Iceland)의 콜베인세이 (Kolbeinsey)에 있는 해저 열수공 (submarine hot vent)으로부터 분리된 극단적으로 작은 나노 크기 (nano-size)의 혐기성 미생물 (anaerobe)이다 (참조: Huber, H. et al ., 2002, Nature 417, 63-67). 이 균주는 70-98℃ (최적 생육온도 90℃), 엄격한 혐기 조건 하에서 특별한 숙주 (specific host)인 이그니코커스 속 균주 KIN4/I (Ignicoccus sp. strain KIN4/I)의 표면에서 생육되어진다. 현재까지 알려진 가장 작은 미생물 게놈 (genome)들 중의 하나인 나노아케움 이퀴탄스 게놈 (490,885 염기쌍 (base pair, 이하 ‘bp'라고 함))의 완전한 염기서열이 최근 밝혀졌다 (참조: Waters, E. et al ., 2003, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 100, 12984-12988). 게놈 염기서열의 분석 등을 통해 나노아케움 이퀴탄스는 이그니코커스 속 균주 KIN4/I의 기생체 (parasite)로 추정되었으며, 가장 고대의 고세균 (archaeon)으로 간주되어지고 있다.

DNA 중합효소 (deoxyribonucleic acid polymerase, DNA polymerase, E.C. number 2.7.7.7)는 주형 DNA (template DNA)에 의존하여 5´→3´ 방향으로 DNA를 합성하는 효소로서, 생명체에 있어 DNA 복제 (replication)나 수리 (repair) 시에 가장 중요한 역할을 하는 효소이다 (참조: Lehninger, A. L. et al ., 1993, Principles of Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers). DNA 중합효소는 1957년 콘버그 (Kornberg) 등에 의해 대장균 (Escherichia coli)에서 최초로 발견된 이후 (참조: Kornberg, A. & Baker, T., 1992, DNA Replication, 2nd ed., Freeman Company), 다양한 원핵생물들 및 진핵생물들로부터 연구되어져 왔다. 이들 DNA 중합효소들은 아미노산 서열의 상동성을 기초로 하여 5개의 그룹으로 나뉘어지는데, 그룹 A, B, C 및 D는 각각 대장균 DNA 중합효소 (Escherichia coli DNA polymerase) I, II, III 알파 단위체 (α subunit) 및 파이로코커스 퓨리오서스 DNA 중합효소 (Pyrococcus furiosus DNA polymerase) II와 높은 상동성을 나타내는 DNA 중합효소들을 포함하며, 이들에 속하지 않는 기타 DNA 중합효소들은 그룹 X로 분류되어진다 (참조: Braithwaite, D. K. & Ito, J., 1993, Nucleic Acids Res. 21, 787-802; Cann, I. K. O. & Ishino, Y., 1999, Genetics 152, 1249-1267).

내열성 DNA 중합효소 (thermostable DNA polymerase)는 1976년 치엔 (Chien) 등에 의해 고온균 (thermophile)인 써머스 아쿠아티커스 YT-1 (Thermus aquaticus YT-1)에서 최초로 분리되어 그 특성이 밝혀졌으며 (참조: Chien, A. et al ., 1976, J. Bacteriol . 127, 1550-1557), 이후 몇몇 고온균들에서도 연구가 진행되었으나 그다지 주목을 받지 못했다. 그러나, 1988년 사이키 (Saiki) 등에 의해 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR 기술이 개발 (참조: Saiki, R. K. et al ., 1988, Science 239, 487-491)되면서 내열성 DNA 중합효소들이 주목을 받기 시작하였으며, 여러 고온균 및 초고온균 (hyperthermophile)들로부터 내열성 DNA 중합효소들이 경쟁적으로 개발되어져 왔다. 특히, 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus) 등의 초고온성 고세균들로부터의 내열성 DNA 중합효소들은 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)과 함께 교정 활성 (proofreading activity)이라 불리는 3´→5´ 핵산말단가수분해효소 활성 (3 ´→5´ exonuclease activity)도 가지고 있어 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 이용되어져 왔다 (참조: Mattila, P. et al ., 1991, Nucleic Acids Res . 19, 4967-4973; Lundberg, K. S. et al ., 1991, Gene 108, 1-6).

인테인 (intein)은 전구체 단백질 (precursor protein) 서열 내에 존재하는 단백질 삽입 서열로서, 전구체 단백질의 스플라이싱 과정 (splicing process)에서 스스로 제거되어지므로 전구체 단백질로부터 만들어지는 최종 단백질의 구조나 활성에는 전혀 영향을 주지 않는 부위이다 (참조: Perler, F. B. et al ., 1994, Nucleic Acids Res . 22, 1125-1127). 단백질 스플라이싱 (protein splicing)은 단백질 번역 (translation) 후 일어나는 과정으로서, 이 과정 동안에 인테인은 스스로의 작용에 의해 전구체 단백질로부터 정확히 빠져나옴과 동시에 활성을 가지는 최종 단백질을 구성하는 부위인 익스테인 (extein)들이 정상적인 펩타이드 결합 (peptide bond)에 의해 서로 연결되게 된다 (참조: Kane, P. M. et al ., 1990, Science 250, 651-657). 생명체의 단백질들에 존재하는 자연적으로 발생한 인테인들은 그들의 구성에 따라 3개의 타입으로 구분되어질 수 있다 (참조: Martin, D. D. et al ., 2001, Biochemistry 40, 1393-1402). 일반적인 인테인은 스스로에 의한 스플라이싱 (self-splicing)에 관여하는 도메인 (domain)과 유도성 핵산말단가수분해효소 (homing endonuclease) 도메인 모두를 가지며, 미니 인테인 (mini-intein)은 유도성 핵산말단가수분해효소 도메인 없이 스플라이싱 도메인만으로 구성되어 있고, 마지막으로 분할된 미니 인테인 (split mini-intein)은 유도성 핵산말단가수분해효소 도메인이 없을 뿐만 아니라 스플라이싱 도메인이 2개로 나뉘어진 유전자 들로부터 만들어지는 폴리펩타이드 (polypeptide)들에 분리되어 존재하는 인테인으로서, 두 인테인 부위 사이에 트랜스 스플라이싱 (trans-splicing)이 일어나게 된다.

Neq DNA 중합효소는 나노아케움 이퀴탄스 게놈 상에서 83,295 bp 떨어져 있는 2개의 유전자에 의해 암호화되어져 있으며, 이 유전자들은 각각 분할된 미니 인테인을 암호화하고 있는 것으로 추정되는 염기서열들을 포함하고 있다 (참조: Waters, E. et al ., 2003, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 100, 12984-12988). 이제까지 알려진 180 여 인테인 서열들 중에서 자연적으로 발생한 분할된 미니 인테인 서열들은 오직 몇몇 시아노박테리아 (cyanobacteria)의 C-타입 DNA 중합효소 III 알파 단위체 (C-type DNA polymerase III α subunit, DnaE protein, 이하 ‘DnaE 단백질’이라고 함)들에서만 발견되어져 왔으며 (참조: Caspi, J. et al ., 2003, Mol . Microbiol. 50, 1569-1577), 그 중에서도 시코시스티스 속 균주 PCC6803 DnaE 단백질 (Synechocystis sp. PCC6803 DnaE protein)에서만 다양한 연구가 진행되어져 왔다 (참조: Wu, H. et al ., 1998, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95, 9226-9231; Evans, T. C., Jr. et al ., 2000, J. Biol . Chem . 275, 9091-9094; Martin, D. D. et al ., 2001, Biochemistry 40, 1393-1402). 이들은 고세균이 아닌 박테리아 (bacteria) 유래이며, 내열성 단백질 (thermostable protein)이 아닌 중온성 내지는 저온성 단백질이고, B-타입 DNA 중합효소가 아닌 C-타입 DNA 중합효소라는 점에서 Neq DNA 중합효소와는 다르다. 한편, 메타노써모박터 써마토트로피커스 B-타입 DNA 중합효소 (Methanothermobacter thermautotrophicus B-type DNA polymerase)도 2개로 나뉘어진 유전자에 의해 암호화되어져 있으나, 이들로부터 만들어지는 폴리펩타이드들은 인테인이 없기 때문에 이합체 (dimer)로서 활성을 가진다 (참조: Kelman, Z. et al ., 1999, J. Biol . Chem . 274, 28751-28761).

PCR은 DNA 중합효소와 프라이머 (primer)를 이용하여 극미량의 주형 DNA를 대량 증폭시키는 기술로, DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 40-65℃) 및 DNA 증폭 (DNA extension, 72℃)의 3단계 과정을 연속적으로 반복한다. 반응 특성상 고온을 필요로 하기 때문에, PCR에 있어 가장 중요한 요소인 내열성 DNA 중합효소의 개발은 다양한 PCR 기술의 개발과 발전을 위해 필수불가결하다 (참조: Erlich, H. A., 1989, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press). 내열성 DNA 중합효소는 PCR에 의한 유전자의 확인 및 증폭, DNA 염기서열 결정 (DNA sequencing), 임상진단 (clinical diagnosis) 등에 있어 매우 유용한 효소로서, 유전공학 및 분자생물학 실험을 비롯하여 유전병 진단, 암 유전자와 바이러스 유전자의 조기진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 사용되고 있으며, 그 수요가 날로 증가하고 있다.

현재까지 초고온성 극미고세균 나노아케움 이퀴탄스로부터 단백질을 암호화하는 유전자의 발현, 단백질의 정제, 생화학적 특성 및 산업적인 이용에 대해서 알려진 것은 없다. 또한, 고세균 유래 단백질, 내열성 단백질, B-타입 DNA 중합효소들 중에서 분할된 미니 인테인을 가지고 있다고 보고된 것은 없다.

이런 배경 하에, 본 발명자들은 나노아케움 이퀴탄스의 B-타입 DNA 중합효소 를 암호화하고 있는 두 유전자들의 다양한 서열 분석을 수행한 다음, 이를 바탕으로 유전공학적 방법을 이용하여 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법을 확립하였으며, 전기 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소가 일반적인 PCR 및 디옥시유리딘 5´-트리포스페이트 (deoxyuridine 5´-triphosphate, dUTP) 존재 하에서의 PCR에 이용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 Neq DNA 중합효소 대 단편 (large fragment for Neq DNA polymerase)을 암호화하는 유전자 및 Neq DNA 중합효소 소 단편 (small fragment for Neq DNA polymerase)을 암호화하는 유전자를 포함하며, Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 발현시키는 재조합 벡터를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인테인 암호화 부위가 제거된 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자 및 인테인 암호화 부위가 제거된 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자를 포함하며, 한가닥의 폴리펩타이드로 번역되는, 상기에서 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자가 5´-3´ 배열에 있어서 상부에 해당하고 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자가 하부에 해당하는, 활성형 DNA 중합효소로 발현시키는 재조합 벡터를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 (transformant)를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용하여 핵산 중합 반응을 수행하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명자들은 전체 염기서열이 밝혀진 나노아케움 이퀴탄스 (Nanoarchaeum equitans) 게놈 (genome)(참조: Waters, E. et al ., 2003, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100, 12984-12988)의 정보를 이용하여 활성형 나노아케움 이퀴탄스 B-type DNA 중합효소 (Nanoarchaeum equitans B-type DNA polymerase, Neq DNA polymerase, 이하 ‘Neq DNA 중합효소'라고 함)를 제조하고자 하였다. 종래의 내열성 B-타입 DNA 중합효소들과의 아미노산 서열 비교분석을 통해, 80,000 염기쌍 (base pair, 이하 ‘bp'라고 함) 이상 떨어져 존재하며 Neq DNA 중합효소를 암호화하고 있는 2개의 개별적 유전자 각각은 익스테인 (extein) 암호화 부위와 분할된 미니 인테인 (split mini-intein) 암호화 부위로 구성되어 있음을 확인하였다. 본 발명자들은 각 유전자에서 익스테인 암호화 부위와 인테인 암호화 부위를 결정한 것을 토대로 단독으로는 DNA 중합 활성을 가지지 않는 상태의 폴리펩타이드를 암호화하는 2개의 유전자로부터 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조할 수 있는 다양한 재조합 벡터들을 구축한 다음, 이를 통한 DNA 중합효소로의 발현 및 특성을 직접 확인함으로써, 유전자 재조합 방법으로 활성형의 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 나노아케움 이퀴탄스 유래 DNA 중합효소에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "DNA 중합효소 (DNA polymerase)"는 DNA 한 가닥을 주형 (template)으로 사용하여 새로운 DNA 단사 형성 촉매능을 가지는 즉, 주형에 상보적인 디옥시라이보뉴클레오사이드 5´-트리포스페이트 (deoxyribonucleoside 5´-triphosphate, 이하 ‘dNTP’라고 함)를 프라이머 (primer)의 3´-OH에 중합 (polymerization)시킬 수 있는 효소를 의미한다. 본 발명의 DNA 중합효소는 초고온성 극미고세균 (hyperthermophilic nanoarchaeon)인 나노아케움 이퀴탄스로부터 유래한 내열성 B-타입 DNA 중합효소이다. Neq DNA 중합효소는 Neq DNA 중합효소 대 단편 (large fragment for DNA polymerase)과 Neq DNA 중합효소 소 단편 (small fragment for DNA polymerase)을 암호화하는 유전자들에 의해 만들어지게 된다. Neq DNA 중합효소는 게놈 상에서 따로 존재하는 2개의 유전자들로부터 각각의 폴리펩타이드 (polypeptide)로 발현된 다음, 단백질 트랜스 스플라이싱 (protein trans-splicing)을 통해 펩타이드 결합 (peptide bond)으로 연결되어, 최종 활성형의 DNA 중합효소를 형성하게 된다. 본 발명에서 용어, “활성형 Neq DNA 중합효소”는 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인과 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테 인이 펩타이드 결합으로 하나로 연결된 형태이다.

본 명세서에서, Neq DNA 중합효소 대 단편은 578 아미노산 잔기로 이루어진 Neq DNA 중합효소의 아미노 말단 부분 (amino-terminal part, N-terminal part)에 해당하는 익스테인 부위와 98 아미노산 잔기로 이루어진 단백질 트랜스 스플라이싱에 관여하는 분할된 미니 인테인의 아미노 말단 부분에 해당하는 인테인 부위로 구성되어 있으며, Neq L (large fragment for DNA polymerase)로 표기하였다. 본 명세서에서, Neq DNA 중합효소 소 단편은 30 아미노산 잔기로 이루어진 분할된 미니 인테인의 카르복실 말단 부분 (carboxyl-terminal part, C-terminal part)에 해당하는 인테인 부위와 223 아미노산 잔기로 이루어진 Neq DNA 중합효소의 카르복실 말단 부분에 해당하는 익스테인 부위로 구성되어 있으며, Neq S (small fragment for DNA polymerase)로 표기하였다. 본 발명자들은 Neq L 또는 Neq S만으로는 중합효소 활성을 가지지 못하고, Neq L은 단지 낮은 교정 활성 (proofreading activity)만을 가지는 것을 밝혔다.

본 명세서에서, Neq L 및 Neq S가 단백질 트랜스 스플라이싱에 의해 인테인들은 제거되고 익스테인들만이 펩타이드 결합으로 연결되어 형성된 단백질을 Neq C (protein trans-spliced form of Neq DNA polymerase)로 표기하였다. 본 명세서에서, 인테인 암호화 부위를 제거한 Neq DNA 중합효소 대 단편 유전자의 익스테인 암호화 부위와 인테인 암호화 부위를 제거한 Neq DNA 중합효소 소 단편 유전자의 익스테인 암호화 부위를 재조합시켜 하나의 폴리펩타이드 형태로 발현시켜 얻은 DNA 중합효소를 Neq P (genetically protein splicing-processed form of Neq DNA polymerase)로 표기하였다. 본 발명자들은 Neq C와 Neq P가 다른 방법으로 제조되었지만, 동일한 활성을 가질 뿐만 아니라 동일한 생화학적 특성을 나타내는 효소임을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 개별적으로 발현시키는 재조합 벡터; 또는 (2) 인테인 암호화 부위들을 제거하고, Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편 유전자들의 익스테인 암호화 부위들을 재조합시켜 하나의 폴리펩타이드 형태로 번역시킨는, 활성형 DNA 중합효소를 발현시키는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포에 DNA를 도입하여 단백질을 발현시키기 위한 수단을 말하며, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다. 바람직하게는, 플라스미드 벡터이다.

적합한 벡터는 프로모터 (promoter), 개시코돈 (start codon), 종지코돈 (stop codon), 폴리아데닐화 시그널 (polyadenylation signal) 및 인핸서 (enhancer) 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 (signal sequence)을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커 (selection marker)를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터 (expression vector)인 경우 복제 기원 (replication origin)을 포함한다. 개시코돈 및 종지코돈은 유전자 작제물이 투여 되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임 (in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 사용할 수 있는 프로모터는 예를 들어, λP_L, lac, trp, tac, T7 프로모터 등의 유도 가능하고 강력한 프로모터가 있다. 사용할 수 있는 시그널 서열은, 숙주가 대장균 (Escherichia coli)인 경우에는 예를 들어, PhoA, OmpA, PelB 등이, 숙주가 바실러스 (Bacillus) 속 균인 경우에는 예를 들어, α-아밀라아제, 서브틸리신 등이, 숙주가 효모인 경우에는 예를 들어, MFα, SUC2 등이 있다.

하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 Neq DNA 중합효소 대 단편을 암호화하는 유전자 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 암호화하는 유전자를 포함하며, Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 발현시키는 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 벡터는 다양한 응용이 가능하다. 이런 벡터의 한 가지 예로, DNA 중합효소 대 단편 및 DNA 중합효소 소 단편이 각 개별의 프로모터로부터 발현되는 벡터가 있다. 또 다른 예로, DNA 중합효소 대 단편 및 DNA 중합효소 소 단편이 하나의 프로모터로부터 발현되고 DNA 중합효소 대 단편 유전자와 DNA 중합효소 소 단편 유전자 사이에 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site)가 위치하여, 융합 단백질이 아닌 개별적인 폴리펩타이드 단편으로 각각 발현되도록 하는 벡터이다. 본 발명의 구체적인 실시에서는 Neq S를 암호화하는 유전자, 샤인-달가노 서열 (Shine-Dalgarno sequence), Neq L을 암호화하는 유전자 순으로 구축된 Neq L 및 Neq S를 공동발현 (co-expression)시키는 재조합 벡터를 구축하고, pENPC라 명명하였다. 상기 재조합 벡터를 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환 (transformation)시켜 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPC를 제조하였다. 재조합 벡터 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPC)을 경기도 수원시 권선구 서둔동 소재의 한국농업미생물자원센터에 2005년 9월 21일자로 기탁번호 KACC95038P로 기탁하였다.

또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 Neq DNA 중합효소 대 단편을 암호화하는 유전자에서 인테인 암호화 부위가 제거된 유전자 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 암호화하는 유전자에서 인테인 암호화 부위가 제거된 유전자를 포함하며 한 가닥의 폴리펩타이드로 번역되는, 활성형 DNA 중합효소로 발현시키는 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 벡터에서 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인을 암호화하는 부위 서열과 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테인을 암호화하는 부위의 서열들을 유전자 재조합 기술에 기초해서 하나로 연결하여 구축함으로써, DNA 중합효소가 펩타이드 결합으로 연결된 하나의 폴리펩타이드로 번역되게 된다. 이 때, 벡터에서 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자가 5´-3´ 배열에 있어서 상부(upstream)에 해당하고 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자가 하부(downstream)에 해당하도록 한다. 활성형 DNA 중합효소로 발현시키는 재조합 벡터.이러한 벡터 시스템을 통하여, 단백질 트랜스 스플라이싱이 필요없이 활성형의 Neq DNA 중합효소를 용이하게 제작할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서 는 Neq DNA 중합효소를 암호화하고 있는 두 유전자에서 인테인 암호화 부위들을 제외하고 익스테인 암호화 부위들만을 순서대로 연결하여 발현벡터에 삽입한 재조합 벡터를 구축하고, pENPP라 명명하였다. 상기 재조합 벡터를 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질전환시켜 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPP를 제조하였다. 재조합 벡터 pENPP를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPP)을 경기도 수원시 권선구 서둔동 소재의 한국농업미생물자원센터에 2005년 9월 21일자로 기탁번호 KACC95039P로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 (transformant)에 관한 것이다.

벡터를 숙주 세포로 형질전환시키는 방법은, 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로박테리아 (Agrobacteria) 매개된 형질전환, PEG, 텍스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

상기 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포는 바람직하게는 원핵세포이다. 대장균 (Escherichia coli), 로도코커스 (rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 시폴러버스 (Syfolobus), 써모플라즈마 (Thermoplasma), 써모프로테우스 (Thermoproteus), 마스티고클라더스 (Mastigocladus), 바실러스 (Bacillus) 및 써머스 (Thermus) 등을 예로 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 대장균으로, 대장균 XL1-blue, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109, 대장균 DH 시리즈, 대장균 TOP10 및 대장균 HB101 등을 예로 들 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로 (1) 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환시키는 단계; (2) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (3) 활성형 Neq DNA 중합효소를 정제하는 단계를 포함하는 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법으로 활성형의 Neq DNA 중합효소를 생산할 수 있는 시스템을 구현할 수 있었다.

단계 (1)에서 숙주 세포를 형질전환시키는 방법 및 숙주 세포의 종류는 상술한 바와 같다.

단계 (2)에서 형질전환체의 배양은 클로닝 (cloning)된 유전자의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건 하에서 통상적인 방법으로 수행된다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 함유해야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 등을 포함한다. 또한, 항생제를 포함할 수 있다. 형질전환체의 배양 온도 및 시간은 배양 조건에 따라 조절할 수 있다. 또한, 단백질을 이소프로필 싸이오갈락토피라노사이드 (isopropyl-β-_D-thiogalactopyranoside, 이하 ‘IPTG’라고 함) 등의 유도제 (inducer)를 이용하여 발현을 유도할 수 있다.

단계 (3)에서 단백질은 통상의 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 세포를 원심분리하여 회수한 다음, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등을 이용하여 세포를 파쇄하고, 세포 잔여물을 원심분리로 제거하여 상층액을 얻는다. 과발현에 의해 응집된 단백질은, 적절한 용액에서 단백질을 용해 및 변성시키고 재폴딩 (refolding)시켜서 얻을 수 있다 (참조: Kohno, 1990, Meth. Enzym . 185, 187-195). 숙주 세포로부터 획득한 단백질을 포함하는 용액을 염석 (예를 들어, 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 한외여과법 및 크로마토그래피 (예들 들어, 겔 여과, 이온 교환, 친화도 크로마토그래피) 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 활성형 Neq DNA 중합효소 단백질을 정제할 수 있다 (참조: Sambrook, J. et al ., 1989, Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Deutscher, M., 1990, Guide to Protein Purification Methods, Enzymology, vol. 182, Academic Press).

Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 공동발현시키는 재조합 벡터를 이용하여 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조할 경우, 단계 (3)에서 Neq DNA 중합효소 대 단편과 Neq DNA 중합효소 소 단편의 단백질 트랜스 스플라이싱을 유도하는 과정을 포함한다. 단편간의 단백질 트랜스 스플라이싱은 세포 파쇄액을 50℃ 내지 100℃에서 열처리함으로써 유도 가능하다. 또한, 세포 파쇄액의 열처리 과정은, DNA 중합효소의 정제에서 대장균 등의 숙주 세포 단백질을 제거하기 위한 목적으로 공정에 포함하여 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시에서는 80℃에서 30분간 열처리된 시료들을 각각 원심분리하여 상층액만을 모아 투석한 다음, 음이온교환 컬럼인 UNO^TM Q 컬럼과 양이온교환 컬럼인 UNO^TM S 컬럼을 이용하여 정제하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소에 관한 것이다.

상기 방법으로 제조된 본 발명의 활성형 Neq DNA 중합효소는 다음과 같은 특징을 가진다. 활성형 Neq DNA 중합효소는 pH 7.0 내지 9.5에서 50% 이상의 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)을 나타낸다. 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.5에서, 보다 바람직하게는 pH 8.0에서 최대 활성을 가진다. 또한, 활성형 Neq DNA 중합효소는 60 내지 80℃에서, 보다 바람직하게는 70℃에서 최대 활성을 가진다. 또한, 활성형 Neq DNA 중합효소는 1 mM 이상의 마그네슘 이온 농도에서 60% 이상의 DNA 중합 활성을 나타내며, 바람직하게는 2 내지 10 mM 마그네슘 이온 농도에 서, 보다 바람직하게는 5 mM 마그네슘 이온 농도에서 최대 활성을 가진다. 또한, 활성형 Neq DNA 중합효소는 30 내지 150 mM의 KCl 농도에서 60% 이상의 DNA 중합 활성을 나타내며, 바람직하게는 50 내지 130 mM KCl 농도에서, 보다 바람직하게는 90 내지 100 mM KCl 농도에서 최대 활성을 가진다. 또한, 활성형 Neq DNA 중합효소는 교정 활성이라 불리는 3´→5´ 핵산말단가수분해효소 활성 (3´→5´ exonuclease activity)을 가진다. 또한, 본 발명의 활성형 Neq DNA 중합효소는 디옥시유리딘 5´-트리포스페이트 (deoxyuridine 5´-triphosphate, 이하 ‘dUTP’라고 함) 존재 하에서 중합 반응을 수행하는 활성을 가진다. 즉, 본 발명은 dUTP 존재 하에서의 중합 반응이 가능하고 높은 교정 활성 (proofreading activity)과 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)을 가지는 내열성 Neq DNA 중합효소를 제공한다.

본 발명의 방법으로 제공하는 Neq DNA 중합효소는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. Neq DNA 중합효소의 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (참조: Neurath, H. & Hill, R. L., 1979, The Proteins, Academic Press). 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.

본 발명의 단백질 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내거나 바람직하게는 단백질의 특성이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이지 않는 강산성이나 강알카리성에서도 효소 활성을 나타낼 수 있고, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또는, 효소 촉매 활성이 증가된 변이체이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용하여 핵산 중합 반응을 수행하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 활성형 Neq DNA 중합효소는 DNA 한 가닥을 주형으로 주형에 상보적인 dNTP를 프라이머의 3´-OH에 중합시키는 것을 기본으로 하는 모든 반응에 이용될 수 있다. 대표적인 예는 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함)이다. PCR은 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 DNA 중합효소를 이용하여 대량으로 증폭하는 대표적인 핵산증폭기술 (NAT) 중의 하나로, 문헌 (참조: Mullis, K. et al ., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263-273) 및 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 4,965,188호 등의 특허에 폭넓게 기술되어 있다. PCR은 주형 DNA를 단일 가닥으로 변성시키는 단계; 프라이머를 표적 유전자 서열에 결합시키는 단계; DNA 중합효소를 이용하여 DNA를 합성하는 단계로 이루어진다. 상기 단계가 반복되면서 DNA가 증폭된다. 보통은 25 내지 30회 반복한다. 변성, 결합, 합성 반응이 일어나는 온도는 조절될 수 있다. 결합 온도가 너무 낮으면 비특이적 증폭이 일어날 수 있으므로, 이런 점을 고려하여 조절하도록 한다. PCR 방법에서의 다양한 변형 및 응용이 가능하고, 이는 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, RT-PCR, Touch down PCR, Differential Display PCR, Gradient PCR, Real time PCR 등이 있다.

특히, 상기한 바와 같이 본 발명에서 제공하는 활성형 Neq DNA 중합효소는 dUTP 존재 하에서 중합 반응 활성을 가지므로, 전기 효소와 저온성 우라실-DNA 글라이코실레이즈 (uracil-DNA glycosylase) 조합 사용은 진단 등의 목적으로 수행하는 PCR에 아주 적합할 것이다. 극미량의 DNA를 대량으로 증폭시키는 PCR의 특성상 오염물 DNA (contaminating DNA)가 아주 극미량이라도 목적 DNA (target DNA)와 함께 시료에 포함되어 있으면 문제가 발생할 수 있다. 이러한 오염은 시료 선별, 핵산 분리 과정, 시료 옮기는 과정, 시료의 PCR 과정, 전기영동 (electrophoresis) 후 겔 (gel)로부터 시료를 회수하는 과정 또는 시료의 보존 등 실험과정에서 언제든지 일어날 수 있는데, 클로닝 등을 목적으로 하는 PCR 시에는 큰 문제가 되지 않으나, 진단 등의 목적으로 PCR을 수행할 시에는 잘못된 진단 (false-positive result)을 내리는 등의 심각한 문제를 일으킬 수 있다 (참조: Borst, A. et al ., 2004, Eur . J. Clin . Microbiol. Infect . Dis . 23, 289-299). 이러한 문제를 해결하기 위한 몇몇 방법들이 연구되어져 왔는데, 그 중에서 롱고 (Longo) 등에 의해 개발된 방법은 디옥시싸이미딘 5´-트리포스페이트 (deoxythymidine 5´- triphosphate, 이하 ‘dTTP’라고 함) 대신에 dUTP를 넣어 PCR을 수행한 다음, 디옥시유리딘 5´-모노포스페이트 (deoxyuridine 5´-monophosphate, dUMP)가 포함된 DNA만을 특이적으로 절단하는 저온성 우라실-DNA 글라이코실레이즈 처리를 한 후, 정상적인 PCR을 수행하는 것이다 (참조: Longo, M. C. et al ., 1990, Gene 93, 125-128). 따라서, dUTP를 포함하는 혼합액에서 PCR이 가능하며 교정 활성을 가지는 DNA 중합효소는 상당히 유용하다고 할 수 있다. 지금까지 알려진 바로는, 상업적으로 많이 이용되어지고 있는 DNA 중합효소들 중에서 교정 활성을 가지지 않는 써머스 아쿠아티커스 YT-1 DNA 중합효소 (Thermus aquaticus YT-1 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, 이하 ‘Taq DNA 중합효소’라고 함)는 dUTP 존재 하에서 PCR이 가능하지만, 교정 활성을 가지면서 진단 등의 목적으로 수행하는 PCR에 주로 이용되어지는 파이로코커스 퓨리오서스 DNA 중합효소 (Pyrococcus furiosus DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, 이하 ‘Pfu DNA 중합효소'라고 함) 등의 경우에는 dUTP 존재 하에서 PCR이 불가능하다 (참조: Hogrefe, H. H. et al ., 2002, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99, 596-601).

본 발명의 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소는 PCR 프라이머, dNTP 등과 함께 PCR 키트 (kit)로 제공될 수 있다. 본 발명의 활성형 Neq DNA 중합효소 또는 이를 포함하는 PCR 키트는 유전공학 및 분자생물학 실험, 임상진단 (clinical diagnosis), 법의학적 연구 등에 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Neq DNA 중합효소를 암호화하는 유전자들의 염기서열들 및 추정 아미노산 서열들의 분석

기존에 보고된 나노아케움 이퀴탄스 게놈의 전체 염기서열 (참조: Waters, E. et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 12984-12988)이 공개되어 있는 미국 국립 생물공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 홈페이지로부터 전기 게놈 염기서열 (GenBank accession number AE017199)을 확보한 다음, Neq DNA 중합효소를 암호화하는 2개로 나뉘어진 유전자들의 염기서열들과 이 염기서열들로부터 추정한 아미노산 서열들을 서열 분석 소프트웨어들인 DNASIS (Hitachi Software Engineering Co., 일본)와 PCGENE (Intelligenetics Co., 미국)을 이용하여 분석하였다. 그 결과, Neq L을 암호화하는 크기가 큰 유전자(서열번호 18 및 19)는 578 아미노산 잔기로 이루어진 Neq DNA 중합효소의 아미노 말단 부분을 암호화하는 익스테인 암호화 부위와 98 아미노산 잔기로 이루어진 단백질 트랜스 스플라이싱에 관여하는 분할된 미니 인테인의 아미노 말단 부분을 암호화하는 인테인 암호화 부위로 구성되어 있고, Neq S를 암호화하는 크기가 작은 유전자(서열번호 20 및 21)는 30 아미노산 잔기로 이루어진 분할된 미니 인테인의 카르복실 말단 부분을 암호화하는 인테인 암호화 부위와 223 아미노산 잔기로 이루어진 Neq DNA 중합효소의 카르복실 말단 부분을 암호화하는 익스테인 암호화 부위로 구성되어 있음을 알 수 있었다 (참조: 도 1A). 또한, 각각의 유전자들로부터의 익스테인 암호화 부위들만을 순서대로 연결하면 완전한 하나의 고세균 (archaea) 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소를 암호화하고 있음(서열번호 22)을 알 수 있었으며, 578 아미노산 잔기로 이루어진 익스테인과 223 아미노산 잔기로 이루어진 익스테인의 추정 분자량은 각각 68,405 달톤 (dalton, 이하 ‘Da'라고 함)과 26,041 Da으로서, 이들을 합하면 다른 고세균 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소들의 추정 분자량과 매우 유사함을 알 수 있었다. 도 1A는 나노아케움 이퀴탄스 게놈 상에서 Neq DNA 중합효소 유전자들에 초점을 맞춘 유전자 지도와 전기 유전자들로부터 만들어지는 폴리펩타이드들의 구성을 나타낸 것으로서, 도 1A에서 나노아케움 이퀴탄스 게놈 상에 표시된 화살표들은 Neq DNA 중합효소 유전자들의 게놈 상에서의 위치와 발현 방향을 나타내며, 전기 유전자들로부터 만들어지는 폴리펩타이드들 Neq L과 Neq S는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로 표시되어져 있고, Ext-N, Int-N, Int-C 및 Ext-C는 각각 Neq L의 익스테인, Neq L의 인테인, Neq S의 인테인 및 Neq S의 익스테인을 나타낸다.

Neq DNA 중합효소를 구성하는 익스테인들의 추정 아미노산 서열들(서열번호 23)을 컴퓨터 프로그램인 MultAlin을 이용하여 종래의 고세균 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소들의 아미노산 서열들과 비교분석한 결과, Neq DNA 중합효소는 고세균 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소들에 잘 보존되어 있는 DNA 중합 활성에 중요한 6개의 5´→3´ 중합효소 모티프 (motif)들 (참조: Braithwaite, D. K. & Ito, J., 1993, Nucleic Acids Res. 21, 787-802), 교정 활성에 중요한 3개의 3´→5´ 핵산말단가수분해효소 모티프들 (참조: Blanco, L. et al., 1991, Gene 100, 27-38) 및 DNA 결합 (DNA binding) 모티프 (참조: Truniger, V. et al., 1996, EMBO J. 15, 3430-3441)를 모두 가지고 있었는데, 3개의 3´→5´ 핵산말단가수분해효소 모티프들과 DNA 결합 모티프는 Neq L의 익스테인 내에 존재했으며, 6개의 5´→3´ 중합효소 모티프들은 Neq L과 Neq S의 익스테인들에 퍼져 있었다 (참조: 도 2A). 또한, Neq DNA 중합효소를 제외하고 유일하게 2개로 나뉘어진 유전자들에 의해 암호화되어져 있는 B-타입 DNA 중합효소인 메타노써모박터 써마토트로피커스 B-타입 DNA 중합효소 (Methanothermobacter thermautotrophicus B-type DNA polymerase, Mth DNA polymerase, 이하 ‘Mth DNA 중합효소’라고 함)의 경우, 분할된 위치가 잘 보존되어 있는 모티프들을 피하여 Pol I 모티프 밖에 존재하는 데 반해, Neq DNA 중합효소의 경우에는 잘 보존되어 있는 모티프들 중의 하나인 Pol I 모티프 내에 존재함을 알 수 있었다 (참조: 도 2A). Neq DNA 중합효소는 2개로 나뉘어진 유전자들에 의해 암호화되어져 있으나 인테인이 없어 이합체 (dimer)로서 활성을 가지는 Mth DNA 중합효소 (참조: Smith, D. R. et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 7135-7155)와 32.6%의 아미노산 서열 상동성을 보였으며, 하나의 유전자에 의해 암호화되어져 있는 Pfu DNA 중합효소 (참조: Uemori, T. et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21, 259-265)와 36.6%의 아미노산 서열 상동성을 보였다. 도 2A는 Neq DNA 중합효소의 익스테인 아미노산 서열을 종래의 고세균 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소들의 아미노산 서열들과 비교하여 나타낸 것으로서, 도 2A에서 Neq, Mth 및 Pfu는 각각 Neq DNA 중합효소, Mth DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 나타내며, 음영 처리된 아미노산 잔기들은 Neq DNA 중합효소와 다른 DNA 중합효소들 사이에 동일한 아미노산 잔기들을 나타내고, 고세균 유래 내열성 B-타입 DNA 중합효소들에 잘 보존되어 있는 모티프들과 분할된 위치가 표시되어 있다.

Neq DNA 중합효소의 분할된 미니 인테인을 구성하는 인테인들의 추정 아미노산 서열들을 컴퓨터 프로그램인 MultAlin을 이용하여 시네코시스티스 속 균주 PCC6803 C-타입 DNA 중합효소 III 알파 단위체 (Synechocystis sp. PCC6803 C-type DNA polymerase III α subunit, Ssp DnaE protein, 이하 ‘Ssp DnaE 단백질’이라고 함)의 분할된 미니 인테인의 아미노산 서열 (참조: Wu, H. et al ., 1998, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95, 9226-9231)과 비교분석한 결과, Neq DNA 중합효소의 분할된 미니 인테인은 스스로에 의한 스플라이싱 (self-splicing)에 중요한 아미노산 잔기들을 포함하는 4개의 블록 (block)들 (참조: Pietrokovski, S., 1998, Protein Sci . 7, 64-71)을 모두 가지고 있었는데, 이 중 A 블록과 B 블록은 Neq L의 인테인에 존재하며, F 블록과 G 블록은 Neq S의 인테인에 존재함을 알 수 있었다 (참조: 도 2B). 도 2B는 Neq DNA 중합효소의 인테인 아미노산 서열을 Ssp DnaE 단백질의 인테인 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것으로서, 도 2B에서 Neq 및 Ssp는 각각 Neq DNA 중합효소의 분할된 미니 인테인 및 Ssp DnaE 단백질의 분할된 미니 인테인을 나타내며, 음영 처리된 아미노산 잔기들은 Neq DNA 중합효소의 분할된 미니 인테인과 Ssp DnaE 단백질의 분할된 미니 인테인 사이에 동일한 아미노산 잔기들을 나타내고, 스스로에 의한 스플라이싱에 관여하는 블록들과 분할된 위치가 표시되어 있다.

실시예 2: 재조합 플라스미드 ( recombinant plasmid )들의 구축

Neq DNA 중합효소를 암호화하고 있는 두 유전자들을 각각 발현벡터에 삽입한 재조합 플라스미드들과 함께 두 유전자를 한 발현벡터에 같이 삽입한 재조합 플라스미드와 익스테인 암호화 부위들만을 순서대로 연결하여 발현벡터에 삽입한 재조합 플라스미드를 하기와 같이 구축하였다 (참조: 도 1B). 도 1B는 유전자들의 발현을 위한 재조합 플라스미드 구축물들을 나타낸 것으로서, 도 1B에서 P_T7 _lac 및 His₆는 각각 T7lac 프로모터 (promoter)와 카르복실 말단 His₆ 표지 (His₆-tag)를 나타내며, Neq L의 익스테인, Neq L의 인테인, Neq S의 인테인 및 Neq S의 익스테인을 나타내는 표시들은 도 1A와 동일하고, 발현벡터 pET-22b(+)의 프로모터 부위와 함께 발현되어지는 부분들만이 보여지고 있다.

① Neq L을 암호화하는 크기가 큰 유전자의 염기서열을 바탕으로 5´ 말단 프라이머 및 3´ 말단에 상보적인 프라이머를 각각 제작하였다. 5´ 말단 프라이머 NPOL1FN (5´-ATTATAGCATATGTTACACCAACTCCCCACG-3´) (서열번호 1)은 개시코돈 (start codon, ATG) 서열을 가지는 제한효소 (restriction enzyme) NdeI 절단 부위 (5´-CATATG-3´)를 포함하여 31개의 염기로 합성하였으며, 3´ 말단에 상보적인 프라이머 NPOL1RX (3´-CGGTTCCTTATACTTTTATTTTTATTAGAGCTCTCTA-5´) (서열번호 2)는 정제 시 유용하게 이용될 수 있는 발현벡터의 카르복실 말단 His₆ 표지 부위가 함께 발현되도록 하기 위해 종결코돈 (stop codon) 없이 제한효소 XhoI 절단 부위 (5´-CTCGAG-3´)를 포함하여 37개의 염기로 합성하였다. 이어서, 나노아케움 이퀴탄스 균주를 최초로 분리한 연구팀으로부터 받은 나노아케움 이퀴탄스 게놈 DNA를 주형으로 다음과 같이 PCR을 수행하여 Neq L을 암호화하는 유전자를 증폭시켰다. Pfu DNA 중합효소를 제외한 PCR 반응 혼합물 (0.1 ㎍ 나노아케움 이퀴탄스 게놈 DNA, 5 pmole 5´ 말단 프라이머 및 3´ 말단 프라이머, 200 μM dNTP, 1X Pfu DNA 중합효소 반응 완충용액 (buffer)에 100℃에서 5분간 열을 가하여 상기 게놈 DNA를 변성시키고 얼음에서 급냉시킨 다음, Pfu DNA 중합효소 2.5 유닛 (unit)을 첨가하여 DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 58℃, 1분) 및 DNA 증폭 (DNA extension, 72℃, 5분)의 3단계 과정을 30회 반복한 후, DNA 사이즈 마커 (DNA size marker)와 함께 아가로스 겔 (agarose gel)에 전기영동하여 약 2 킬로베이스 (kilobase, 이하 ‘kb’라고 함) 위치에 밴드 (band)가 존재하는 것을 확인하였다. 다음으로, 반응이 끝난 PCR 반응 혼합물에 TE 포화 페놀 (TE-saturated phenol) 및 클로로포름 (chloroform) / 이소아밀알코올 (isoamylalcohol)(24 : 1)을 동량으로 처리하여 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 추출한 후, 에탄올 침전 (ethanol precipitation)을 통해 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동한 다음, 아가로스 겔로부터의 DNA 추출 키트 (gel extraction kit, Qiagen GmbH, 독일)를 이용하여 제한효소 절단된 DNA 단편을 회수하였다. 회수된 Neq L을 암호화하는 유전자를 포함하는 제한효소 절단된 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제 (T4 DNA ligase)를 이용하여 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pET-22b(+)에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 클로닝하였다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이어서, 형질전환체들로부터 알카리 용균법 (alkaline lysis method)에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NdeI 및 XhoI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동하여 Neq L을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편이 정확히 삽입되어 있는 형질전환체를 선별하였으며, 또한 전기 선별된 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA의 염기서열을 결정하여 Neq L을 암호화하는 유전자가 정확히 삽입되어 있는지를 다시 한 번 확인하였다. 이와 같이 구축된 Neq L을 암호화하는 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드를 pENPLX라 명명하였으며 (참조: 도 1B), 이 재조합 플라스미드 pENPLX를 가지는 형질전환된 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPLX라 명명하였다.

② Neq S를 암호화하는 크기가 작은 유전자의 염기서열을 바탕으로 5´ 말단 프라이머 및 3´ 말단에 상보적인 프라이머를 각각 제작하였다. 5´ 말단 프라이머 NPOL2FN (5´-TAATTTACATATGCGCTATCTTGGCAAAAAGAG-3´) (서열번호 3)은 개시코돈 서열을 가지는 제한효소 NdeI 절단 부위를 포함하여 33개의 염기로 합성하였으며, 3´ 말단에 상보적인 프라이머 NPOL2RAB (3´-GTTTTTTGATTGTCTAAAGAAATTTACTATTCTTCCTCTATATTAA TTACCTAGGGC-5´) (서열번호 4)는 종결코돈 뒤에 샤인-달가노 서열 (5´-GAAGGAG-3´)(참조: Shine, J. & Dalgarno, L., 1975, Nature 254, 34-38)의 상보 서열 (5´-CTCCTTC-3´)을 넣고 제한효소 AseI 절단 부위 (5´-ATTAAT-3´) 및 BamHI 절단 부위 (5´-GGATCC-3´)를 포함하여 57개의 염기로 합성하였다. 이어서, 나노아케움 이퀴탄스 게놈 DNA를 주형으로 프라이머들 NPOL2FN 및 NPOL2RBA를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 상기와 마찬가지 방법으로 약 760 염기쌍 (base pair, 이하 ‘bp'라고 함) 크기의 Neq S를 암호화하는 유전자를 발현벡터 pET-22b(+)의 제한효소 NdeI 및 BamHI 절단 부위에 삽입하여 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 클로닝하였다. 이와 같이 구축된 Neq S를 암호화하는 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드를 pENPS라 명명하였으며 (참조: 도 1B), 이 재조합 플라스미드 pENPS를 가지는 형질전환된 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPS라 명명하였다.

③ Neq DNA 중합효소를 암호화하고 있는 두 유전자를 한 발현벡터에 같이 삽입한 재조합 플라스미드를 구축하기 위해, 먼저 Neq L을 암호화하는 유전자의 3´ 말단에 상보적인 프라이머를 추가로 제작하였는데, 3´ 말단에 상보적인 프라이머 NPOL1RB (3´-GGTTCCTTATACTTTTATTTTTATTAATTACTCCTAGGGC-5´) (서열번호 5)는 종결코돈과 함께 제한효소 BamHI 절단 부위를 포함하여 40개의 염기로 합성하였다. 이어서, 나노아케움 이퀴탄스 게놈 DNA를 주형으로 프라이머들 NPOL1FN 및 NPOL1RB를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 상기와 마찬가지 방법으로 제한효소 NdeI 및 BamHI으로 절단된 DNA 단편에 포함되어 있는 Neq L을 암호화하는 유전자를 Neq S를 암호화하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 pENPS의 제한효소 AseI (제한효소 NdeI으로 절단된 부위와 제한효소 AseI으로 절단된 부위는 서로 연결되어질 수 있음) 및 BamHI 절단 부위에 삽입하여 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 클로닝하였다. 이와 같이 Neq S를 암호화하는 유전자, 샤인-달가노 서열, Neq L을 암호화하는 유전자 순으로 구축된 Neq L 및 Neq S를 암호화하는 두 유전자의 공동발현을 위한 재조합 플라스미드를 pENPC라 명명하였으며 (참조: 도 1B), 이 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 형질전환된 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPC라 명명하였다. 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPC)은 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 KACC95038P로서 2005년 9월 21일자로 기탁하였다.

④ Neq DNA 중합효소를 암호화하고 있는 두 유전자에서 인테인 암호화 부위들을 제외하고 익스테인 암호화 부위들만을 순서대로 연결하여 발현벡터에 삽입한 재조합 플라스미드를 구축하기 위해, 먼저 Neq L의 익스테인 암호화 부위의 3´ 말단에 상보적인 프라이머를 새로이 제작하였는데, 3´ 말단에 상보적인 프라이머 NPOL1PR (3´-CTTCCTAAGTTTCATTAAATACCTCTATGGCTAAGTAAT-5´) (서열번호 6)은 Neq S의 익스테인 암호화 부위의 5´ 말단에 상보적인 염기 12개를 포함하여 39개의 염기로 합성하였다. 이어서, 나노아케움 이퀴탄스 게놈 DNA를 주형으로 프라이머들 NPOL1FN 및 NPOL1PR을 이용하여 PCR을 수행한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동한 다음, 아가로스 겔로부터의 DNA 추출 키트를 이용하여 PCR 증폭된 Neq L의 익스테인을 암호화하는 DNA 단편을 회수하였다. 또한, Neq S의 익스테인 암호화 부위의 5´ 말단 프라이머를 새로이 제작하였는데, 5´ 말단 프라이머 NPOL2PF (5´-ATTTATGGAGATACCGATTCATTATTCATTTCTGGGG-3´) (서열번호 7)는 Neq L의 익스테인 암호화 부위의 3´ 말단에 상보적인 염기 12개를 포함하여 37개의 염기로 합성하였다. 이어서, 나노아케움 이퀴탄스 게놈 DNA를 주형으로 프라이머들 NPOL2PF 및 NPOL2RAB를 이용하여 PCR을 수행한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동한 다음, 아가로스 겔로부터의 DNA 추출 키트를 이용하여 PCR 증폭된 Neq S의 익스테인을 암호화하는 DNA 단편을 회수하였다. 이렇게 회수된 Neq L의 익스테인을 암호화하는 DNA 단편과 Neq S의 익스테인을 암호화하는 DNA 단편을 주형으로 프라이머들 NPOL1FN 및 NPOL2RAB를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 상기와 마찬가지 방법으로 약 2.4 kb 크기의 Neq P를 암호화하는 유전자를 발현벡터 pET-22b(+)의 제한효소 NdeI 및 BamHI 절단 부위에 삽입하여 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 클로닝하였다. 이와 같이 구축된 Neq P를 암호화하는 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드를 pENPP라 명명하였으며 (참조: 도 1B), 이 재조합 플라스미드 pENPP를 가지는 형질전환된 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL을 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPP라 명명하였다. 재조합 플라스미드 pENPP를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL (Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL / pENPP)은 한국농업미생물자원센터에 기탁번호 KACC95039P로서 2005년 9월 21일자로 기탁하였다.

실시예 3: 단백질들의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 구축된 재조합 플라스미드를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균주들을 100 ㎍/㎖ 농도의 암피실린 (ampicillin) 및 34 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜 (chloramphenicol)이 첨가된 LB 배지 (LB medium) 3 ㎖ 에 각각 접종하여 37℃에서 하룻밤 전배양한 후, 100 ㎍/㎖ 농도의 암피실린이 첨가된 LB 배지 50 ㎖에 각각 1% 접종하여 600 nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.6 정도가 될 때까지 37℃에서 배양한 다음, 클로닝된 유전자의 발현을 유도 (induction)하기 위해 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 다시 5시간 동안 37℃에서 본배양을 계속하였다. 이어서, 원심분리 (centrifugation)를 통해 각각의 균체를 회수한 후, 각각의 회수된 균체를 1 mM 페닐메칠썰포닐 플루오라이드 (phenylmethylsulfonyl fluoride, 이하 ‘PMSF'라고 함)를 포함하는 완충용액 A (20 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 50 mM NaCl)에 현탁하여 초음파 파쇄 (sonication)시킨 다음, 원심분리를 통해 상층액 (supernatant)과 침전물 (pellet)을 분리하였다. 상기 시료 (sample)들을 변성 겔 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 통해 분석해 본 결과, Neq L과 Neq P는 용해성 단백질 (soluble protein)로 발현되었으며, Neq S는 재조합 플라스미드 pENPS를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 단독으로 발현되어질 때는 불용성 단백질 (insoluble protein)로 발현되었으나, 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 Neq L과 함께 발현되어질 때는 용해성 단백질로 발현되었다.

재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL과 재조합 플라스미드 pENPP를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL로부터 IPTG 유도에 의해 발현된 단백질들의 정제 시에 대장균 유래 단백질들을 제거하기 위해 열처리 과정을 이용할 수 있는지의 여부를 확인해보고자 상기 초음파 파쇄액 (sonicated extract)들을 80℃에서 30분간 열처리한 다음 변성 겔 전기영동을 수행해 본 결과, 흥미롭게도 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 공동발현된 폴리펩타이드들 Neq L 및 Neq S는 열처리 동안에 단백질 트랜스 스플라이싱에 의해 인테인들은 제거되고 익스테인들만이 연결되어 하나의 단백질 Neq C로 합쳐짐을 알 수 있었으며 (참조: 도 3), Neq C와 Neq P의 정제 시에 열처리 과정을 이용할 수 있음을 알 수 있었다. 도 3은 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 공동발현된 Neq L과 Neq S의 열처리 시간에 따른 단백질 트랜스 스플라이싱 결과를 나타낸 것으로서, 도 3에서 IPTG 유도에 의해 공동발현된 Neq L과 Neq S의 양이 감소함과 함께 단백질 트랜스 스플라이싱 산물인 Neq C와 Neq L의 절단 산물인 Ext-N (Neq L의 익스테인)의 양이 증가함이 보여지고 있으며, 레인 (lane) U 및 레인 M은 각각 발현을 유도하지 않고 배양한 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액 및 단백질 저분자량 마커 (low-molecular-mass marker)를 로딩 (loading)한 것이다.

발현이 확인된 단백질들을 정제하기 위해 재조합 플라스미드를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균주들을 100 ㎍/㎖ 농도의 암피실린 및 34 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜이 첨가된 LB 배지 30 ㎖에 각각 접종하여 37℃에서 하룻밤 전배양한 후, 100 ㎍/㎖ 농도의 암피실린이 첨가된 LB 배지 2 ℓ에 각각 1% 접종하여 600 nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.6 정도가 될 때까지 37℃에서 배양한 다음, 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 다시 5시간 동안 37℃에서 본배양을 계속하였다. 이어서, 원심분리를 통해 각각의 균체를 회수한 후, 각각의 회수된 균체를 1 mM PMSF를 포함하는 완충용액 A에 현탁하여 초음파 파쇄시키고 원심분리를 한 다음, 각각의 단백질들을 하기와 같이 정제하였다.

① Neq L은 His₆ 표지된 단백질의 특성을 이용하여 정제되었다. IPTG 유도에 의해 발현된 Neq L을 포함하는 초음파 파쇄액을 완충용액 B (20 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 500 mM NaCl)에 투석 (dialysis)한 다음, His₆ 표지된 단백질의 정제를 위한 친화성 컬럼 (affinity column)인 HiTrap^TM Chelating HP 컬럼 (Amersham Biosciences AB, 스웨덴)을 이용하여 대부분의 목적 외 단백질들을 제거하였다. 이어서, Neq L을 포함하는 분획 (fraction)들을 모아 완충용액 A에 투석한 다음, 음이온교환 컬럼 (anion-exchange column)인 UNO^TM Q 컬럼 (Bio-Rad Laboratories Inc., 미국)을 이용하여 Neq L을 완전 정제한 후, 정제된 Neq L을 포함하는 분획들을 모아 다시 완충용액 A에 투석하여 4℃에 보관하였다. 정제된 Neq L의 분자량은 변성 겔 전기영동을 통해 79,000 Da으로 확인되었으며, 전기 분자량은 추정 아미노산 서열로부터의 추정 분자량 79,864 Da에 잘 부합하였다 (참조: 도 4A). 도 4A는 정제된 Neq L의 정제 단계별 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것으로서, 도 4A에서 레인 1은 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 2는 발현을 유도하지 않고 배양한 재조합 플라스미드 pENPLX를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 3은 발현을 IPTG로 유도하여 배양 한 재조합 플라스미드 pENPLX를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 4는 HiTrap^TM Chelating HP 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography)를 수행한 후 모아진 Neq L을 포함하는 분획들, 레인 5는 UNO^TM Q 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 모아진 정제된 Neq L을 포함하는 분획들, 레인 M은 단백질 저분자량 마커를 각각 로딩한 것이다.

② Neq S는 단독발현 시에 불용성 단백질로 발현되었기 때문에, 요소 (urea) 존재 하에서 정제되었다. IPTG 유도에 의해 발현된 Neq S를 포함하는 초음파 파쇄 침전물 (sonicated pellet)을 1.5 M 암모늄 썰페이트 (ammonium sulfate)를 포함하는 완충용액 C (20 mM Tris-HCl (pH 7.4) / 8 M urea)에 현탁한 다음, 불용성 단백질의 정제를 위한 소수성 상호작용 컬럼 (hydrophobic interaction column)인 HiTrap^TM Phenyl FF 컬럼 (Amersham Biosciences AB, 스웨덴)을 이용하여 Neq S를 완전 정제한 후, 정제된 Neq S를 포함하는 분획들을 모아 완충용액 A에 투석하여 4℃에 보관하였다. 정제된 Neq S의 분자량은 변성 겔 전기영동을 통해 30,500 Da으로 확인되었으며, 전기 분자량은 추정 아미노산 서열로부터의 추정 분자량 29,538 Da에 잘 부합하였다 (참조: 도 4B). 도 4B는 정제된 Neq S의 정제 단계별 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것으로서, 도 4B에서 레인 1은 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 2는 발현을 유도하지 않고 배양한 재조합 플라스미드 pENPS를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 3은 발현을 IPTG로 유도하여 배양한 재조합 플라스미드 pENPS를 가지 는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액 (원심분리 후 상층액), 레인 4는 발현을 IPTG로 유도하여 배양한 재조합 플라스미드 pENPS를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄 침전물 (원심분리 후 침전물), 레인 5는 HiTrap^TM Phenyl FF 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 모아진 정제된 Neq S를 포함하는 분획들, 레인 M은 단백질 저분자량 마커를 각각 로딩한 것이다.

③ Neq C와 ④ Neq P는 열처리 과정을 이용하여 동일한 방법으로 정제되었다. 재조합 플라스미드 pENPC를 이용하여 IPTG 유도에 의해 공동발현된 Neq L 및 Neq S를 포함하는 초음파 파쇄액과 재조합 플라스미드 pENPP를 이용하여 IPTG 유도에 의해 발현된 Neq P를 포함하는 초음파 파쇄액을 각각 80℃에서 30분간 열처리하여 대장균 유래 단백질들을 대부분 제거하였으며, 공동발현된 Neq L 및 Neq S는 상기에서 확인된 것처럼 열처리 동안에 하나의 단백질 Neq C로 합쳐졌다. 열처리된 시료들을 각각 원심분리하여 상층액만을 모아 완충용액 A에 투석한 다음, 음이온교환 컬럼인 UNO^TM Q 컬럼과 양이온교환 컬럼 (cation-exchange column)인 UNO^TM S 컬럼 (Bio-Rad Laboratories Inc., 미국)을 이용하여 Neq C와 Neq P를 각각 완전 정제한 후, 정제된 Neq C와 Neq P를 포함하는 분획들을 각각 모아 다시 완충용액 A에 투석하여 4℃에 보관하였다. 정제된 Neq C (참조: 도 4C)와 Neq P (참조: 도 4D)의 분자량은 변성 겔 전기영동을 통해 동일하게 94,000 Da으로 확인되었으며, 전기 분자량은 추정 아미노산 서열로부터의 추정 분자량 94,427 Da에 잘 부합하였다. 도 4C는 정제된 Neq C의 정제 단계별 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이며, 도 4D 는 정제된 Neq P의 정제 단계별 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것으로서, 도 4C와 도 4D에서 레인 1은 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 2는 발현을 유도하지 않고 배양한 재조합 플라스미드 pENPC 또는 pENPP를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 3은 발현을 IPTG로 유도하여 배양한 재조합 플라스미드 pENPC 또는 pENPP를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 균체의 초음파 파쇄액, 레인 4는 80℃에서 30분간 열처리된 시료의 상층액, 레인 5는 UNO^TM Q 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 모아진 Neq C 또는 Neq P를 포함하는 분획들, 레인 6은 UNO^TM S 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 모아진 정제된 Neq C 또는 Neq P를 포함하는 분획들, 레인 M은 단백질 저분자량 마커를 각각 로딩한 것이다.

실시예 4: 단백질 트랜스 스플라이싱 분석

단백질 수준에서 완전한 하나의 Neq DNA 중합효소를 제조하기 위해 필요한 단백질 트랜스 스플라이싱 과정을 재확인하고자 상기 실시예 3에서 정제된 Neq L과 Neq S 각각 100 pmole을 단백질 트랜스 스플라이싱 반응 완충용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl) 하에서 80℃로 30분간 반응시킨 다음, 변성 겔 전기영동을 통해 분석하였다. 그 결과, 재조합 플라스미드 pENPC를 가지는 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에서 공동발현된 Neq L과 Neq S의 열처리 시간에 따른 단백질 트랜스 스플라이싱 결과와 마찬가지로, 반응 혼합물에 넣어준 정제된 Neq L과 Neq S의 양이 감소함과 함께 단백질 트랜스 스플라이싱 산물인 Neq C와 Neq L의 절단 산물인 Ext-N의 양이 증가함을 알 수 있었는데, 발현량에서 차이를 보이는 공동발현된 Neq L과 Neq S를 이용한 단백질 트랜스 스플라이싱과 비교하여 동일량의 정제된 Neq L과 Neq S를 이용한 단백질 트랜스 스플라이싱에서는 Neq C가 더 많은 양으로 만들어지고 Ext-N이 더 적은 양으로 생김을 알 수 있었다 (참조: 도 5A). 도 5A는 정제된 Neq L과 Neq S를 이용하여 반응 시간별로 단백질 트랜스 스플라이싱을 분석한 결과들을 나타낸 것으로서, 도 5A에서 레인 L, 레인 S 및 레인 M은 각각 정제된 Neq L 100 pmole, 정제된 Neq S 100 pmole 및 단백질 저분자량 마커를 로딩한 것이다.

온도가 단백질 트랜스 스플라이싱에 미치는 영향을 살펴보기 위해 상기 반응 혼합물을 40-100℃에서 30분간 반응시킨 다음, 변성 겔 전기영동을 통해 분석해 본 결과, 단백질 트랜스 스플라이싱은 50℃ 이상에서만 발생함을 알 수 있었으며, 80℃에서 최대로 발생함을 알 수 있었다 (참조: 도 5B). 도 5B는 정제된 Neq L과 Neq S를 이용하여 반응 온도별로 단백질 트랜스 스플라이싱을 분석한 결과들을 나타낸 것으로서, 도 5B에서 레인 L, 레인 S 및 레인 M은 각각 정제된 Neq L 100 pmole, 정제된 Neq S 100 pmole 및 단백질 저분자량 마커를 로딩한 것이다.

pH가 단백질 트랜스 스플라이싱에 미치는 영향을 살펴보기 위해 상기 반응 혼합물에서 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액 대신에 pH 6.0-10.0 범위의 50 mM 완충용액 (pH 6.0-7.0은 50 mM Mops-NaOH 완충용액, pH 7.0-9.0은 50 mM Tris-HCl 완충용액, pH 9.0-10.0은 50 mM Glycine-NaOH 완충용액)을 사용하여 80℃로 30분간 반응시킨 다음, 변성 겔 전기영동을 통해 분석해본 결과, 단백질 트랜스 스플라이싱은 pH 6.0-9.0에서 잘 발생함을 알 수 있었으며, pH 10.0에서는 거의 발생하지 않음을 알 수 있었다 (참조: 도 5C). 도 5C는 정제된 Neq L과 Neq S를 이용하여 반응 pH별로 단백질 트랜스 스플라이싱을 분석한 결과들을 나타낸 것으로서, 도 5C에서 레인 L, 레인 S 및 레인 M은 각각 정제된 Neq L 100 pmole, 정제된 Neq S 100 pmole 및 단백질 저분자량 마커를 로딩한 것이다.

실시예 5: DNA 중합 활성 분석

상기 실시예 3에서 정제된 단백질들의 DNA 중합 활성은 다음과 같이 측정되었다 (참조: Choi, J. J. & Kwon, S.-T., 2004, J. Microbiol . Biotechnol . 14, 1022-1030). 정제된 단백질, 1.25 ㎍ 활성화된 송아지 흉선 DNA (activated calf thymus DNA), 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 40 mM KCl, 100 μM 디옥시아데노신 5´-트리포스페이트 (deoxyadenosine 5´-triphosphate, 이하 ‘dATP’라고 함), 100 μM 디옥시사이티딘 5´-트리포스페이트 (deoxycytidine 5´-triphosphate, 이하 ‘dCTP’라고 함), 100 μM 디옥시구아노신 5´-트리포스페이트 (deoxyguanosine 5´-triphosphate, 이하 ‘dGTP’라고 함), 10 μM dTTP 및 0.5 μCi [메칠-³H]싸이미딘 5´-트리포스페이트 ([methyl-³H]thymidine 5´-triphosphate)로 구성된 반응 혼합물 (50 ㎕)을 75℃에서 10분간 반응시킨 다음, 얼음에서 급냉시킨 후, DE81 필터 페이퍼 디스크 (DE81 filter paper disc, 23 ㎜, Whatman Co., 영국)에 점적하였다. 반응액이 점적된 DE81 필터 페이퍼 디스크를 65℃에서 건조시킨 다음, 0.5 M 소듐 포스페이트 (sodium phosphate, pH 7.0) 완충용액에 10분간, 70% 에탄올 (ethanol)에 5분간 순서대로 세척 (washing)한 후, 다시 65℃에서 건조시켰다. 이렇게 준비된 DE81 필터 페이퍼 디스크의 방사능 (incorporated radioactivity)을 LS6500 섬광 계수기 (LS6500 scintillation counter, Beckman Co., 미국)를 이용하여 측정함으로써 DNA 중합 활성을 확인하였다. 정제된 4종류의 단백질들의 DNA 중합 활성을 상기와 같이 측정해 본 결과, Neq S와 Neq L은 DNA 중합 활성을 갖지 않았지만, 완전한 하나의 Neq DNA 중합효소들인 단백질 수준에서 제조된 Neq C (공동발현된 단독으로는 DNA 중합 활성을 가지지 않는 폴리펩타이드들 Neq L 및 Neq S가 단백질 트랜스 스플라이싱을 거쳐 DNA 중합 활성을 가지는 하나의 단백질로 정제됨)와 유전자 수준에서 제조된 Neq P (PCR 방법을 이용한 유전자 재조합에 의해 만들어진 단백질 스플라이싱이 일어난 형태의 단백질을 암호화하는 유전자로부터 DNA 중합 활성을 가지는 하나의 단백질로 발현되어 정제됨)는 DNA 중합 활성을 가지는 활성형 Neq DNA 중합효소들임을 알 수 있었다. 이 결과는 DNA 중합 활성에 중요한 6개의 5´→3´ 중합효소 모티프들이 Neq L과 Neq S의 익스테인들에 퍼져 있음을 보여준 아미노산 서열 분석 결과에 부합하였다.

다음으로, 하기와 같이 다양한 조건들 하에서 Neq C와 Neq P의 DNA 중합 활성을 측정함으로써 이들 단백질들의 DNA 중합 활성에 있어서의 생화학적 특성들을 알 수 있었는데, 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P는 비록 다른 방법으 로 제조되었지만, 동일한 아미노산 서열을 가지는 효소들로서 예상대로 동일한 생화학적 특성을 나타내는 동일한 효소임을 확인할 수 있었다.

pH가 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액 대신에 pH 6.0-10.0 범위의 50 mM 완충용액 (pH 6.0-8.0은 50 mM Mops-NaOH 완충용액, pH 7.0-9.5는 50 mM Tris-HCl 완충용액, pH 9.0-10.0은 50 mM Glycine-NaOH 완충용액)을 사용하여 상기와 같이 DNA 중합 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 pH 8.0에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 6A). 도 6A는 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 pH의 영향을 나타낸 것으로서, 도 6A에서 ○, △ 및 □는 각각 50 mM Mops-NaOH 완충용액, 50 mM Tris-HCl 완충용액 및 50 mM Glycine-NaOH 완충용액을 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.

온도가 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 40-90℃에서 상기와 같이 DNA 중합 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 70℃에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 6B). 하지만, 활성형 Neq DNA 중합효소는 70℃ 이상의 온도들에서도 상당히 안정하였으므로, 전기 최대 활성을 내타내는 온도는 기질 (substrate)로서 사용되는 활성화된 송아지 흉선 DNA의 고온에서의 변성 때문인 것으로 보여진다. 도 6B는 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 온도의 영향을 나타낸 것이다.

2가 양이온 (divalent cation)들이 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활 성에 미치는 영향들을 살펴보기 위해 다양한 농도의 MgCl₂ 또는 MnCl₂ 존재 하에서 상기와 같이 DNA 중합 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 5 mM 마그네슘 이온 (magnesium ion, Mg² ⁺) 존재 하에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 6C). 도 6C는 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 2가 양이온들의 영향들을 나타낸 것으로서, 도 6C에서 ○ 및 ●는 각각 마그네슘 이온 및 망간 이온 (manganese ion, Mn² ⁺)을 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.

KCl이 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 다양한 농도의 KCl 존재 하에서 상기와 같이 DNA 중합 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 90-100 mM KCl 존재 하에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 6D). 도 6D는 활성형 Neq DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 KCl의 영향을 나타낸 것이다.

활성형 Neq DNA 중합효소의 열안정성 (thermostability)을 살펴보기 위해 전기 효소를 75℃, 95℃ 및 100℃에서 4시간 동안 보관하면서 시간 간격을 두고 시료 채취 (sampling)를 한 다음, 상기와 같이 DNA 중합 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 75℃에서 4시간 동안 보관 시 활성이 거의 떨어지지 않음을 알 수 있었으며, 95℃와 100℃에서 각각 183분과 62분의 반감기 (half-life)를 가짐을 알 수 있었다 (참조: 도 7). 도 7은 활성형 Neq DNA 중합효소의 열안정성을 나타낸 것으로서, 도 7에서 ○ 및 ●는 각각 95℃ 및 100℃에서 보관 시의 결과를 나타낸다.

실시예 6: 핵산말단가수분해효소 활성 분석

상기 실시예 3에서 정제된 단백질들의 핵산말단가수분해효소 활성은 다음과 같이 측정되었다 (참조: Choi, J. J. & Kwon, S.-T., 2004, J. Microbiol . Biotechnol . 14, 1022-1030). 먼저, 3´ 말단에 방사성 동위원소 표지된 DNA 기질을 준비하기 위해, 제한효소 NotI으로 절단된 pBluescript SK- 벡터 DNA를 [α-³²P]dCTP 존재 하에서 클레나우 단편 (Klenow fragment)을 이용하여 메우기 (filling-in) 반응을 시켰다. 또한, 5´ 말단에 방사성 동위원소 표지된 DNA 기질을 준비하기 위해, 제한효소 SmaI으로 절단된 pBluescript SK- 벡터 DNA를 [γ-³²P]ATP 존재 하에서 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 (T4 polynucleotide kinase)를 이용하여 인산화 (phosphorylation) 반응을 시켰다. 이어서, 상기 방사성 동위원소 표지된 DNA 기질들을 Sephadex G-25 컬럼을 이용하여 각각 정제하였다. 다음으로, 정제된 단백질, 상기와 같이 준비된 3´ 말단 또는 5´ 말단에 방사성 동위원소 표지된 DNA 기질, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 40 mM KCl 및 0.01% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, 이하 ‘BSA'라고 함)으로 구성된 반응 혼합물 (50 ㎕)을 dNTP 존재 또는 부재 하에서 70℃로 반응시킨 후, 얼음에서 급냉시켰다. 이 반응액에 5% 트리클로로아세트산 (trichloroacetic acid) 1㎖을 첨가하여 원심분리를 한 다음, 상층액만을 회수하여 LS6500 섬광 계수기로 방사능 (radioactivity)을 측정함으로써 핵산말단가수분해효소 활성을 확인하였다. 정제된 4종류의 단백질들의 5´→3´ 핵산말단가수분해효소 활성 및 교정 활성이라 불리는 3´→5´ 핵산말단가수분해효소 활성을 상기와 같이 측정해 본 결과, Neq S는 어떤 핵산말단가수분해효소 활성도 갖지 않았고, Neq L은 낮은 교정 활성만을 가졌으며, 완전한 하나의 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P는 높은 교정 활성만을 가졌다 (참조: 도 8A). 이 결과는 교정 활성에 중요한 3개의 3´→5´ 핵산말단가수분해효소 모티프들이 Neq L의 익스테인 내에 존재함을 보여준 아미노산 서열 분석 결과에 부합하였으며, 동일한 활성을 가지는 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P의 교정 활성이 단독으로도 교정 활성을 가지는 Neq L에 비해 높다는 사실은 Neq S의 익스테인이 교정 활성의 유무에는 영향을 주지 못하지만, 교정 활성의 정도에는 영향을 준다는 것을 보여준다. 도 8A는 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 반응 시간에 따른 교정 활성 결과를 나타낸 것으로서, 도 8A에서 △, ○, ▲ 및 ●는 각각 dNTP 존재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성, dNTP 부재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성, dNTP 존재 하에서 Neq L의 교정 활성 및 dNTP 부재 하에서 Neq L의 교정 활성을 나타내며, Total RA 및 Sol. RA는 각각 반응에 사용된 3´ 말단에 방사성 동위원소 표지된 DNA 기질의 방사능 및 반응 후 상층액의 방사능을 나타낸다.

다음으로, 하기와 같이 다양한 조건들 하에서 Neq L, Neq C 및 Neq P의 교정 활성을 측정함으로써 이들 단백질들의 교정 활성에 있어서의 생화학적 특성들을 알 수 있었는데, Neq L은 Neq C 및 Neq P와 다른 생화학적 특성을 나타냈으며, 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P는 DNA 중합 활성에 있어서와 마찬가지로 교정 활성에 있어서도 동일한 생화학적 특성을 나타내는 동일한 효소임을 재확인할 수 있었다.

pH가 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충용액 대신에 pH 6.5-9.5 범위의 50 mM 완충용액 (pH 6.5-8.0은 50 mM Mops-NaOH 완충용액, pH 7.0-9.5는 50 mM Tris-HCl 완충용액, pH 9.0-9.5는 50 mM Glycine-NaOH 완충용액)을 사용하여 dNTP 부재 하에서 상기와 같이 교정 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 Tris-HCl 완충용액, pH 9.0에서 최대 활성을 나타냈으며, Neq L은 Mops-NaOH 완충요액, pH 6.5에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 8B). 도 8B는 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 있어 pH의 영향을 나타낸 것으로서, 도 8B에서 ○, △ 및 □는 각각 50 mM Mops-NaOH 완충용액, 50 mM Tris-HCl 완충용액 및 50 mM Glycine-NaOH 완충용액을 사용하여 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성을 측정한 결과를 나타내며, ●, ▲ 및 ■는 각각 50 mM Mops-NaOH 완충용액, 50 mM Tris-HCl 완충용액 및 50 mM Glycine-NaOH 완충용액을 사용하여 Neq L의 교정 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

2가 양이온인 마그네슘 이온이 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 다양한 농도의 MgCl₂를 첨가하여 dNTP 부재 하에서 상기와 같이 교정 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 6 mM 마그네슘 이온 존재 하에서 최대 활성을 나타냈으며, Neq L은 3 mM 마그네슘 이온 존 재 하에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 8C). 도 8C는 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 있어 마그네슘 이온의 영향을 나타낸 것으로서, 도 8C에서 ○ 및 ●는 각각 활성형 Neq DNA 중합효소 및 Neq L의 교정 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

KCl이 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 다양한 농도의 KCl을 첨가하여 dNTP 부재 하에서 상기와 같이 교정 활성을 측정해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소는 40 mM KCl 존재 하에서 최대 활성을 나타냈으며, Neq L은 0 mM KCl 존재 하에서 최대 활성을 나타내었다 (참조: 도 8D). 도 8D는 Neq L과 활성형 Neq DNA 중합효소의 교정 활성에 있어 KCl의 영향을 나타낸 것으로서, 도 8D에서 ○ 및 ●는 각각 활성형 Neq DNA 중합효소 및 Neq L의 교정 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

실시예 7: 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR

상기 실시예 3에서 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소들을 사용하여 PCR을 수행하기 위해, 먼저 람다 파아지 (λ phage) 게놈의 염기서열 (참조: Sanger, F. et al., 1982, J. Mol. Biol. 162, 729-773)을 바탕으로 다음과 같은 네 조합의 프라이머들을 제작하였다. 정방향 프라이머 (forward primer) 람다-1F (5´-AATAACGTCGGCAACTTTGG-3´, 20개 염기) (서열번호 8)와 역방향 프라이머 (reverse primer) 람다-1R (3´-TCCTACTGACCACCGCATTG-5´, 20개 염기) (서열번호 9)은 람다 파아지 게놈 DNA를 주형으로 PCR 수행 시 500 bp 크기의 산물이 증폭되도록 합성하였다. 정방향 프라이머 람다-2F (5´-CAAAGGCGGTTAAGGTGGTA-3´, 20개 염기) (서열번호 10)와 역방향 프라이머 람다-2R (3´-TGAGTAACAGGCCATGTCGG-5´, 20개 염기) (서열번호 11)은 람다 파아지 게놈 DNA를 주형으로 PCR 수행 시 1 kb 크기의 산물이 증폭되도록 합성하였다. 정방향 프라이머 람다-3F (5´-AGAAGTTCAGGAAGCGGTGA-3´, 20개 염기) (서열번호 12)와 역방향 프라이머 람다-3R (3´-AAGACGCAGAGAAAAAGGCA-5´, 20개 염기) (서열번호 13)은 람다 파아지 게놈 DNA를 주형으로 PCR 수행 시 2 kb 크기의 산물이 증폭되도록 합성하였다. 정방향 프라이머 람다-4F (5´-CCGGTAATGGTGAGTTTGCT-3´, 20개 염기) (서열번호 14)와 역방향 프라이머 람다-4R (3´-TTACCGTTTCCGTGGTCATG-5´, 20개 염기) (서열번호 15)은 람다 파아지 게놈 DNA를 주형으로 PCR 수행 시 4 kb 크기의 산물이 증폭되도록 합성하였다.

이어서, 람다 파아지 게놈 DNA를 주형으로 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소들을 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소, 30 ng 람다 파아지 게놈 DNA, 5 pmole 람다-2F 프라이머 및 람다-2R 프라이머, 200 μM dNTP 및 1X 반응 완충용액 (30 mM Tris-HCl (pH 8.0) / 2 mM MgCl₂ / 50 mM KCl / 0.01% BSA)으로 구성되는 PCR 반응 혼합물 (50 ㎕)을 준비하여 95℃에서 10분간 DNA 변성 과정을 수행한 다음, DNA 변성 (94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (56℃, 1분) 및 DNA 증폭 (72℃, 2분)의 3단계 과정을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 더 DNA 증폭 과정을 수행하였다. 이 PCR 반응액을 DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동하여 PCR 증폭이 일어났는지의 여부를 확인하였다. 그 결과, DNA 중합 활성을 가지는 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P가 PCR에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

다음으로, 하기와 같이 다양한 조건들 하에서 Neq C와 Neq P를 사용하여 PCR을 수행함으로써 이들 효소들의 PCR에의 이용에 있어 최적 반응 완충용액 조성을 알 수 있었으며, 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P는 생화학적 특성 뿐만 아니라 PCR에서도 동일한 결과를 나타내는 동일한 효소임을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

활성형 Neq DNA 중합효소를 사용하는 PCR의 최적 pH를 결정하기 위해 30 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액 대신에 pH 6.0-9.5 범위의 50 mM 완충용액 (pH 6.0-8.0은 50 mM Mops-NaOH 완충용액, pH 7.0-9.5는 50 mM Tris-HCl 완충용액)을 사용하여 상기와 같이 PCR을 수행해 본 결과, PCR 증폭은 Mops-NaOH 완충용액, pH 7.0-7.5와 Tris-HCl 완충용액, pH 7.5-8.0에서 확인되었으며, 최적 pH는 Tris-HCl 완충용액, pH 7.5로 결정되었다 (참조: 도 9A). 도 9A는 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 pH에 따른 결과들을 나타낸 것으로서, 도 9A에서 레인 M은 DNA 사이즈 마커를 로딩한 것이다.

활성형 Neq DNA 중합효소를 사용하는 PCR의 최적 MgCl₂ 농도를 결정하기 위해 다양한 농도의 MgCl₂ 존재 하에서 상기와 같이 PCR을 수행해 본 결과, PCR 증폭은 0.5-3.0 mM MgCl₂ 존재 하에서 확인되었으며, 최적 MgCl₂ 농도는 1 mM로 결정되었다 (참조: 도 9B). 도 9B는 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 MgCl₂ 농도에 따른 결과들을 나타낸 것으로서, 도 9B에서 레인 M은 DNA 사이즈 마커를 로 딩한 것이다.

활성형 Neq DNA 중합효소를 사용하는 PCR의 최적 KCl 농도를 결정하기 위해 다양한 농도의 KCl 존재 하에서 상기와 같이 PCR을 수행해 본 결과, PCR 증폭은 10-130 mM KCl 존재 하에서 확인되었으며, 최적 KCl 농도는 90 mM로 결정되었다 (참조: 도 9C). 도 9C는 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 KCl 농도에 따른 결과들을 나타낸 것으로서, 도 9C에서 레인 M은 DNA 사이즈 마커를 로딩한 것이다.

상기와 같이 결정된 최적 반응 완충용액 (30 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 1 mM MgCl₂ / 90 mM KCl / 0.01% BSA) 하에서 람다 파아지 게놈 DNA를 주형으로 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소들을 사용하여 다양한 크기의 증폭 산물들을 목표로 하는 PCR을 다음과 같이 수행하였다. 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소, 30 ng 람다 파아지 게놈 DNA, 5 pmole 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 조합, 200 μM dNTP 및 1X 활성형 Neq DNA 중합효소 최적 반응 완충용액으로 구성되는 PCR 반응 혼합물 (50 ㎕)을 준비하여 95℃에서 10분간 DNA 변성 과정을 수행한 다음, DNA 변성 (94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (56℃, 1분) 및 DNA 증폭 (72℃, 10분)의 3단계 과정을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 더 DNA 증폭 과정을 수행하였다. 이 PCR 반응액을 DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소를 사용하는 PCR은 상기 최적 반응 완충용액 하에서 최소 4 kb까지 증폭이 가능함을 알 수 있었다 (참조: 도 9D). 도 9D는 최적 반응 완충용액 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과를 나타낸 것으로서, 도 9D에서 레인 M, 레인 1, 레인 2, 레인 3 및 레인 4는 각각 DNA 사이즈 마커, 람다-1F와 람다-1R 프라이머 조합을 사용한 PCR의 증폭 산물 (500 bp), 람다-2F와 람다-2R 프라이머 조합을 사용한 PCR의 증폭 산물 (1 kb), 람다-3F와 람다-3R 프라이머 조합을 사용한 PCR의 증폭 산물 (2 kb) 및 람다-4F와 람다-4R 프라이머 조합을 사용한 PCR의 증폭 산물 (4 kb)을 로딩한 것이다.

상기 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR 결과들을 통해 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P가 다양한 응용 분야들을 가지는 유용한 기술인 PCR에 사용되어질 수 있는 유용한 효소임을 알 수 있었다.

실시예 8: dUTP 존재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR

상기 실시예 3에서 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소들을 사용하여 dTTP 대신에 dUTP 존재 하에서 PCR을 수행하기 위해, 먼저 써머스 속 균주 X-1 (Thermus sp. X-1) 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 유전자의 염기서열을 바탕으로 5´ 말단 프라이머 및 3´ 말단에 상보적인 프라이머를 각각 제작하였다. 5´ 말단 프라이머 TXAPF (5´-NNNNCATATGAAGCGAAGGGACATCCTG-3´, 28개 염기) (서열번호 16)와 3´ 말단에 상보적인 프라이머 TXAPR (3´-GCTCCTGCAGACCCGGATTCAGCTGNNNN-5´, 29개 염기) (서열번호 17)은 써머스 속 균주 X-1 게놈 DNA를 주형으로 PCR 수행 시 1.5 kb 크기의 산물이 증폭되어진다. 이어서, 써머스 속 균주 X-1 게놈 DNA를 주형으로 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소들을 사용하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 정제된 활성형 Neq DNA 중합효소, 0.1 ㎍ 써머스 속 균주 X-1 게놈 DNA, 5 pmole 5´ 말단 프라이머 및 3´ 말단 프라이머, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 200 μM dUTP 및 1X 활성형 Neq DNA 중합효소 최적 반응 완충용액으로 구성되는 PCR 반응 혼합물 (50 ㎕)을 준비하여 95℃에서 10분간 DNA 변성 과정을 수행한 다음, DNA 변성 (94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (56℃, 1분) 및 DNA 증폭 (72℃, 3분)의 3단계 과정을 25회 반복한 후, 72℃에서 5분간 더 DNA 증폭 과정을 수행하였다. 이 PCR 반응액을 DNA 사이즈 마커와 함께 아가로스 겔에 전기영동해 본 결과, 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P가 dUTP 존재 하에서 PCR에 이용될 수 있음을 알 수 있었다 (참조: 도 10). 도 10은 dUTP 존재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과를 비교를 위해 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과와 함께 나타낸 것으로서, 도 10에서 레인 M은 DNA 사이즈 마커, 레인 1은 dUTP 존재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소인 Neq C를 사용한 PCR의 반응액, 레인 2는 dUTP 존재 하에서 활성형 Neq DNA 중합효소인 Neq P를 사용한 PCR의 반응액, 레인 3은 비교를 위해 dUTP 존재 하에서 Taq DNA 중합효소를 사용한 PCR의 반응액, 레인 4는 비교를 위해 dUTP 존재 하에서 Pfu DNA 중합효소를 사용한 PCR의 반응액을 각각 로딩한 것이다.

상기 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용한 dUTP 존재 하에서의 PCR 결과들을 통해 활성형 Neq DNA 중합효소들인 Neq C와 Neq P가 진단 등의 목적으로 수행하는 PCR에 아주 적합하게 사용되어질 수 있는 우수한 DNA 중합효소임을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 단독으로는 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)을 가지지 않는 폴리펩타이드들을 암호화하는 2개의 나노아케움 이퀴탄스 (Nanoarchaeum equitans) 유래의 내열성 B-타입 DNA 중합효소 (Nanoarchaeum equitans B-type DNA polymerase, Neq DNA polymerase, 이하 ‘Neq DNA 중합효소'라고 함) 유전자들로부터 유전공학적 기술을 이용하여 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법을 제공하며, 전기 방법으로 제조된 높은 교정 활성 (proofreading activity)과 함께 우수한 DNA 중합활성을 가지는 활성형 Neq DNA 중합효소는 일반적인 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함), 디옥시유리딘 5´-트리포스페이트 (deoxyuridine 5´-triphosphate, dUTP) 존재 하에서의 PCR 등 다양한 핵산 중합 반응에 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 19에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 Neq DNA 중합효소 대 단편(large fragment for Nanoarchaeum equitans (Neq) DNA polymerase) 유전자 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 Neq DNA 중합효소 소 단편 (small fragment for Neq DNA polymerase) 유전자를 포함하며, Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 발현시키는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 각각의 개별적 프로모터로부터 발현시키는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편을 하나의 프로모터로부터 발현시키며, Neq DNA 중합효소 대 단편을 암호화하는 유전자와 Neq DNA 중합효소 소 단편을 암호화하는 유전자 사이에 리보좀 결합 부위가 위치하는 재조합 벡터.
제3항에 있어서, pENPC인 재조합 벡터.
서열번호 19에 기재된 아미노산 서열에서 579번째에서 676번째까지의 인테인 아미노산 서열이 제거된 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인을 암호화하는 유전자 및 서열번호 21에 기재된 아미노산 서열에서 1번째에서 30번째까지의 인테인 아미노산 서열이 제거된 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테인을 암호화하는 유전자를 포함하며 한가닥의 폴리펩타이드로 번역되는, 상기에서 Neq DNA 중합효소 대 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자가 5´-3´ 배열에 있어서 상부(upstream)에 해당하고 Neq DNA 중합효소 소 단편의 익스테인 암호화 부위 유전자가 하부(downstream)에 해당하는, 활성형 DNA 중합효소로 발현시키는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, pENPP인 재조합 벡터.
제1항 또는 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제1항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; Neq DNA 중합효소 대 단편 및 Neq DNA 중합효소 소 단편의 단백질 트랜스 스플라이싱을 유도하는 단계; 및 활성형 Neq DNA 중합효소를 정제하는 단계를 포함하는 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 단백질 트랜스 스플라이싱을 세포 파쇄액을 50℃ 내지 100℃에서 열처리하여 유도하는 방법.
제 5항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 활성형 Neq DNA 중합효소를 정제하는 단계를 포함하는 활성형 Neq DNA 중합효소를 제조하는 방법.
제 8항 또는 제 10항의 방법으로 제조된 활성형 Neq DNA 중합효소.
제11항에 있어서, dUTP (deoxyuridine 5´-triphosphate)에 결합능을 가지는 활성형 Neq DNA 중합효소.
제11항의 활성형 Neq DNA 중합효소를 이용하여 핵산 중합 반응을 수행하는 방법.
제13항에 있어서, 핵산 중합 반응이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)인 방법.
제14항에 있어서, 핵산 중합 반응이 dUTP 존재 하에서의 중합효소 연쇄 반응인 방법.