CN104593491A - 一种利用整合宿主因子来提高pcr扩增灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增，所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。本发明方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。
Description
【技术领域】
本发明涉及涉及一种用于以聚合酶链式反应(PCR)为基础的核酸分子扩增技术的方法，包括线性单元、多元(multiplex)以及套式(nest)PCR反应，主要涉及一种利用耐热的、与DNA双链结合的整合宿主因子(IHF)来提高PCR扩增效率的方法。
【背景技术】
PCR是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。聚合酶链式反应技术被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制，以及亲子鉴定等。
在实际应用中,特别是用现有的PCR技术诊断传染病的时候，仍存在一些根本的问题亟需改进，如特异性、灵敏度、反应速度等问题，特别是为了使被传染性病毒在早期感染初就能被诊断出来，因此PCR的灵敏度就显得非常的重要。研究人员已经将增效剂如聚右旋糖酐(Dextran)等树状大分子引入PCR体系，这些增效剂在一定程度上可以起到增加PCR扩增效率的作用，但在实际应用过程中，有时效果却不尽如人意，甚至会抑制PCR的扩增反应。如某些高分子增效剂，在加入反应体系后，会使反应体系粘稠，难以混合均匀，甚至定量操作等问题。而且在特异性PCR产物的灵敏度增加的同时非特异性PCR产物的灵敏度也随之增加。
美国专利US PATENT 5,646,019公开了“一种利于引发扩增核酸模板的制备方法”，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB，single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只结合单链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化,但它对提高PCR扩增灵敏度的效果并不十分显著。
整合宿主因子(IHF)是耐热的双链结合蛋白，是DNA结合蛋白DNABII家族的一个成员。除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，这些蛋白对DNA的结构也起到其它更具体的作用，例如DNA的弯曲，基因转录调控，核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应，和起始于复制原点的复制，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等。IHF有两个同源亚基(IHFα和IHFβ)，是DNA序列特异性DNA结合蛋白，可以将DNA弯曲160度以上。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，该方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。
本发明是这样实现的：
一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增。
进一步地，所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。
本发明具有如下优点：
本发明可以显著地提高PCR扩增的灵敏度，在增加特异性PCR产物的灵敏度的同时非特异性PCR产物的灵敏度并不会随之增加。本发明方法有助于解决现有PCR和分子克隆技术所存在的效率低等问题。填补了有关利用DNA双链结合耐热的蛋白质来提高PCR扩增效率的方法和应用领域空白。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明实施例1的IHFβSDS-PAGE电泳检测图。
图2是本发明实施例1的IHFβ活性电泳检测图，其以环状的双链DNA作为底物。
图3是本发明实施例1的IHFβ活性电泳检测图，其以线性状的双链DNA作为底物。
图4是本发明实施例1的IHFβ活性电泳检测图，其以线性状的单链DNA作为底物。
图5是本发明实施例2的IHFβ对PCR扩增产物电泳示意图。
图6是本发明实施例2的IHFβ对巢式PCR扩增产物电泳示意图。
【具体实施方式】
本发明涉及一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增。
所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：IHF的制备
1、将来源于大肠杆菌的IHFα或IHFβ亚基分别插入PET22b表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体PET22-IHFα或者pET22-IHFβ；
2、将构建好的重组载体pET22-IHFα或者pET22-IHFβ转化大肠杆菌BL21，取含重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6-0.8；加入IPTG,将菌液放入37℃摇床中诱导表达3小时，摇床转速为160rpm；
3、取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。结果如图1的IHF SDS-PAGE电泳检测图所示，IHF大小为10.5KD。
4、IHF的纯化
利用上述方法大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液经离心(3000×g)15min，收集大肠杆菌菌体，-70℃冷冻放置过夜。
菌体悬浮在裂解缓冲液(0.1M，0.02M EDTA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶)(pH 7.5)，30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离心(120000×g)90min。上清液以阴离子交换柱Prep Q纯化。以25mM Tris/HCl,1mM EDTA(pH 7.5)冲洗，再以NaCl梯度洗脱。之后，以肝素亲和柱纯化，以NaCl梯度洗脱，得到纯度为95％左右的IHF蛋白原液，即IHF蛋白原液的浓度为：1.5ng/μl。
经检测，本实验获得的IHFβ的DNA序列与文献报道(Bonnefoy E等，EMBO J，10(3)：687-696,，1991)一致；GenBank:LM995446.1其序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
以下所有实验过程中所用IHF蛋白原液的浓度为：1.5ng/μl。
5、IHF的活性检测(环状的双链DNA作为底物)
按照下表配置10μl的反应体系
在反应液中，加入不同浓度的实施例1得到的IHF蛋白，室温下静置10min。之后分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图2，由图2可见在加入IHF蛋白后，IHF与双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白IHF有活性并且与环状的双链DNA相互作用。
图2中各泳道表示如下，1：质粒(Z)与shift buffer(SB)混合液；2：Z与SB混合液体系内加入1μl IHF 3：Z与SB混合液体系内加入3μl IHF；4：Z与SB混合液体系内加入5μl IHF。
6、IHF的活性检测(线性状的双链DNA作为底物)
反应体系：
电泳结果见图3。由图3可见在加入IHF蛋白后，IHF与线性状的双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白IHF有活性并且与线性状的双链DNA相互作用。
图3中各泳道表示如下，M：DNA分子量Marker；1：PCR的DNA产物(P)与shift buffer(SB)混合液；2：P与SB混合液体系内加入0.25μl IHF蛋白原液3：P与SB混合液体系内加入0.5μl IHF；4：P与SB混合液体系内加入1μl IHF；5：P与SB混合液体系内加入2μl IHF；6：P与SB混合液体系内加入4μl IHF；7：P与SB混合液体系内加入5μl IHF。
7、IHF的活性检测(单链线性状的DNA作为底物)
反应体系：
电泳结果见图4。由图4可见在加入IHF蛋白后，IHF与线性状的单链DNA不结合，随着加入量的增加，DNA条带没有上移。表明纯化出的有活性的蛋白IHF没有与的单链DNA相互作用。
图4中各泳道表示如下，1：Oligo 65bp(O)与shift buffer(SB)混合液；2：O与SB混合液体系内加入0.25μl IHF 3：O与SB混合液体系内加入0.5μl IHF；4：O与SB混合液体系内加入1μl IHF；5：O与shift buffer混合液体系内加入3μl IHF；6：O与SB混合液体系内加入6μl IHF；7：O与SB混合液体系内加入8μl IHF。
实施例2：PCR反应的优化
以pUC19-IHF作为PCR扩增模板。
引物1(如序列表中SEQ ID NO.2所示):
5′-TATGACCAAGTCAGAATTGATA-3′；
引物2(如序列表中SEQ ID NO.3所示):
5′-CCGTAAATATTGGCGCGATCGCGC-3′。
按下表配制PCR反应液20μl：
| 试剂 | 使用量(μl) | 终浓度 |
| 2×Phusion Master Mix | 10 | 1× |
| Primer1 | 0.1 | 0.018μM |
| Primer2 | 0.1 | 0.017μM |
| 模板DNA | 0.2 | 0.78ng |
| 灭菌蒸馏水 | 9.6 | |
| 总体积 | 20 |
按以下条件进行PCR反应：95℃60s。95℃30s,55℃30s，72℃30s，共30个循环。最后72℃5min。
在PCR反应液中，加入不同浓度的实施例1得到的IHF蛋白，同法进行PCR。
分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图5。由图5，可见在加入IHF蛋白后，DNA扩增效率逐渐增加。在扩增效率提高的同时，非特异性条带没有增加。
图5是采用本发明方法的PCR扩增产物电泳示意图，其中图5中各泳道表示：M是DNA分子量Marker；0为市售PCR试剂盒的扩增产物；0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5分别表示在该PCR反应体系中加入对应体积的IHF蛋白原液(单位μl)。随着IHF量的增加，特异性PCR产物逐渐增加。在达到一定浓度后，特异性PCR产物的生成又受到抑制。
实施例3：巢式PCR反应的优化
①以PFE-2-MA为模板,进行第一次PCR
引物1(如序列表中SEQ ID NO.4所示)：
5′-CTGCCGTTCATCGTTGGTGGTCGTGACGTTTCTCC-3′；
引物(如序列表中SEQ ID NO.5所示)2：
5′-AGAGGTAACGCAACCAGAACGACCCCAAGAG-3′。
按下表配制PCR反应液20μl：
按以下条件进行PCR反应：95℃30s，58℃30s，72℃50s，共30个循环。最后72℃5min。
②以第一次PCR产物稀释100倍为PCR扩增模板，进行第二次PCR
引物1(如序列表中SEQ ID NO.6所示)：
5′-CCTGCGCTGCTCACTGCTCTTCTGACTCTC-3′；
引物2(如序列表中SEQ ID NO.7所示)：
5′-GTGGTGCATTCAGCTTCGGTCAGGATGTCA-3′。
按下表配制PCR反应液20μl：
按以下条件进行PCR反应：95℃30s，58℃30s，72℃40s，共30个循环。最后72℃5min。
在PCR反应液中，加入不同浓度的实施例1得到的IHF蛋白，同法进行PCR。
分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图6。由图6可见在加入IHF蛋白后，DNA扩增效率逐渐增加。在扩增效率提高的同时，非特异性条带没有增加。
图6是在巢式PCR中添加IHF时，对PCR扩增效率的作用效果图，其中图6中各泳道表示如下：M：DNA分子量Marker；1：市售PCR试剂盒的扩增产物；2：PCR反应体系内(PN)加入0.5μl IHF蛋白原液；3：PN加入1.5μl IHF；4：PN加入2.5μl IHF；5：PN加入3μl IHF；6：PN加入4μl IHF。
综上可知，在巢式PCR过程中加入IHF蛋白后，DNA扩增效率逐渐增加。在扩增效率提高的同时，非特异性条带没有增加。但是，IHF对巢式PCR的促进作用存在一个最适区间，超过一定量后，反而抑制了DNA的扩增。
实施例4：同源二聚体对DNA扩增及连接效率的影响
参照实施例1方法，制备IHF的同源二聚体。参照实施例2方法，观察IHF的同源二聚体对DNA扩增及连接效率的影响。
结果表明IHF的α或β同源二聚体，仍然具有较好的促进DNA扩增效率的作用。
实施例5：量效关系
本发现进一步研究了在PCR反应体系及巢式PCR反应体系内，IHF促进DNA扩增效率的量效关系。发现IHF对DNA扩增的促进均存在最佳的浓度区间。在PCR反应体系内，当引物与IHF的摩尔比例在0.005-1区间内，具有较好的DNA扩增效果。我们还发现在巢式PCR反应体系中，当引物与IHF的摩尔比例在0.005-1区间内，具有很好的DNA扩增效果。
综上，本发明可以显著地提高PCR扩增的灵敏度，在增加特异性PCR产物的灵敏度的同时非特异性PCR产物的灵敏度并不会随之增加。本发明方法有助于解决现有PCR和分子克隆技术所存在的效率低等问题。填补了有关利用DNA双链结合耐热的蛋白质来提高PCR扩增效率的方法和应用领域空白。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (2)
1.一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增。
2.根据权利要求1所述的一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。
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