CN105200036A - 一种利用整合宿主因子来提高基于pcr的基因合成技术灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，其将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF原液，按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。本发明方法能够特异性地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
Description
技术领域
本发明是涉及一种基于PCR的基因合成技术为基础的核酸分子合成和扩增技术的方法，主要涉及一种耐热的，与DNA双链结合的整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法。
背景技术
一步到位PCR基因合成又称一步到位重叠延伸PCR，是一种简单快速的基因合成方法-Simplifiedgenesynthesis:aone-stepapproachtoPCR-basedgeneconstruction是由Wu博士2006年提出的，具体的步骤如下：设计需要合成DNA序列的重叠寡核苷酸大约50bp，每个序列之间都有大约25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)，将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述的混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF，按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。
体外DNA合成技术是合成生物学最基础、最有力的工具，可以突破传统克隆技术的局限，实现从头合成、按需合成和生物大分子的定向改造。基于PCR的基因合成又称重叠延伸PCR，是一种简单快速的基因合成方法，重叠延伸PCR使用长约50bp、互相重叠约25bp的寡核苷酸引物，通过一步简单的重叠延伸PCR，然后用最外端的两条引物进行扩增就可以得到完整的基因。此技术利用PCR能够在体外进行有效的基因重组，具有广泛而独特的应用价值。
整合宿主因子(IHF)是调控原核生物基因复制转录的蛋白之一，它是一种热稳定的DNA结合蛋白，能与DNA结构中的小槽处相互作用使之发生结构改变从而达到调控基因的表达转录等作用，IHF由α亚基和β亚基两个异源亚基构成，α亚基和β亚基之间有30％的同源性.已有研究报道单独表达的IHF-α亚基难与DNA结合，而IHF-β亚基可与DNA形成稳定的复合物。
IHFβ的DNA序列与文献报道(BonnefoyE等，EMBOJ，10(3)：687-696，1991)一致GenBank:LM995446.1其序列为
在PCR反应中,反应液的组成及热循环反应条件的优化是决定反应成败的关键,对于重叠延伸PCR反应而言更是如此。为了最大限度地避免碱基的错配,重叠延伸PCR反应一般采用高保真DNA聚合酶。传统的高保真DNA聚合酶虽具有较好的校正能力,但其扩增效率一直难以令人满意。虽然一些既具有校正功能又具有很强延伸能力的DNA聚合酶已陆续被开发应用，但是效果也仍需加强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，并且能够有效地提高合成和扩增目标核酸序列的灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通过如下步骤实现：
S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；
S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF原液；其中，IHF原液的浓度为102ng/μl；
S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。
采用上述方案后，本发明中将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF原液，按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，从而将目的核酸片段合成并且扩增。本发明方法能够特异性地、高效地合成和扩增目标核酸序列。
附图说明
图1为本发明中整合宿主因子活性电泳检测图；
图2为本发明中整合宿主因子对PCR合成影响的电泳检测图；
图3为本发明中合成产物光密度值结果图；
图4为本发明中IHFβSDS-PAGE电泳检测图。
具体实施方式
IHF-β对基于PCR的基因合成效率的影响：
将不同浓度的IHF-β蛋白加入到相同量的pET-22b质粒中，室温放置10min后用1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现由加入低浓度蛋白到高浓度蛋白后，pET-22b质粒的条带发生了明显的移动，结果如图1所示。图1中：
1：质粒(Z)与shiftbuffer(SB)混合液；
2：Z与SB混合液体系内加入0.5μlIHF；
3：Z与SB混合液体系内加入1μlIHF；
4：Z与SB混合液体系内加入2μlIHF；
5：Z与SB混合液体系内加入4μlIHF；
6：Z与SB混合液体系内加入6μlIHF；
7：Z与SB混合液体系内加入8μlIHF；
8：Z与SB混合液体系内加入9μlIHF。
为了探索IHF-β对基于PCR的基因合成效率的影响，我们使用PCR对IHF-β蛋白基因进行合成，在分别加入了不同浓度的IHF-β蛋白后，合成产物经1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了IHF-β蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没加的相比有如下变化：在一定浓度的IHF-β蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一定值后合成效率反而变小，结果如图2所示。而且我们对合成产物的光密度值进行了测定，结果如图3所示。
本发明一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，通过如下步骤实现：
S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；
S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF；其中，IHF原液的浓度102ng/μl；
S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。
上述混合重叠寡核苷酸(所有的重叠寡核苷酸链)由LifeTechnologies公司合成。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：
本发明中，寡核苷酸引物设计过程如下：
1、使用的软件：GenSearch
2、GenSearch输出的结果见下表：
设计出的IHFgene的合成引物见表1：
表1
实施例2：IHF的制备
①将来源于大肠杆菌的IHFα或IHFβ亚基分别插入PET22b表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体PET22-IHFα或者pET22-IHFβ；
②将构建好的重组载体pET22-IHFα或者pET22-IHFβ转化大肠杆菌BL21，取含重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按体积比1％接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6-0.8；加入IPTG,将菌液放入37℃摇床中诱导表达3小时，摇床转速为160rpm；
③取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。结果如图4所示。
④IHF的纯化
利用上述操作②与③的操作大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液经离心(3000×g)15min，收集大肠杆菌菌体，-70℃冷冻放置过夜。
菌体悬浮在裂解缓冲液(组分为：0.1M，0.02MEDTA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶)(pH7.5)，30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离心(120000×g)90min。上清液以阴离子交换柱PrepQ纯化。以25mMTris/HCl,1mMEDTA(pH7.5)冲洗，再以NaCl梯度洗脱。之后，以肝素亲和柱纯化，以NaCl梯度洗脱，得到纯度为95％左右的IHF蛋白原液。经测定IHF蛋白原液的浓度为102ng/μl。
经检测，本实验获得的IHFβ的DNA序列与文献报道(BonnefoyE等，EMBOJ，10(3)：687-696,，1991)一致；GenBank:LM995446.1其序列如序列表中SEQIDNO.1所示。
⑤IHF的活性检测
按照表2配置10μl的反应体系
表2
如表2所示，在反应液中，加入不同体积的实施例2得到的IHF蛋白(浓度相同)，室温下静置10min。之后分别取5μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图3。可见在加入IHF蛋白后，IHF与双链DNA结合，随着加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白IHF有活性并且与环状的双链DNA相互作用。
实施例3：整合宿主因子对PCR合成的影响
设计好的寡核苷酸链由LifeTechnologies公司合成。订购的各寡核苷酸链分别用10mMTris-HCl(pH8.5)溶解至100μM浓度，再将所有的寡核苷酸链混合并用蒸馏水稀释至得到1μM浓度的寡核苷酸链混合液，在PCR反应体系中加入此寡核苷酸链混合液作模板，并至所有的寡核苷酸链的终浓度为25nM。
按表3配制PCR反应液20μl。
表3
在分别加入不同体积的实施例2得到的IHF蛋白(浓度相同)后，合成产物经1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测，发现加了IHF-β蛋白的PCR合成产物中目的片段的产量与没加的相比有如下变化：在一定浓度的IHF-β蛋白下合成效率有较显著的增强，浓度达到一定值后合成效率反而变小,结果见图4。
Claims (1)
1.一种利用整合宿主因子来提高基于PCR的基因合成技术灵敏度的方法，其特征在于：通过如下步骤实现：
S1：设计需要合成的DNA序列，得到混合重叠寡核苷酸；其中，每个序列都有25bp的重叠寡核苷酸，以覆盖整个DNA序列(200到1500碱基)；
S2：将含有脱氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作为模板的上述混合重叠寡核苷酸的反应液中加入IHF原液；其中，IHF原液的浓度为102ng/μl；
S3：按照常规PCR的解链，退火，延伸三个步骤进行反复的循环，将目的核酸片段合成并且扩增。
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|---|---|---|---|---|
| CN104388419A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-03-04 | 戚智青 | 一种高效扩增核酸分子的方法 |
| CN104593491A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-06 | 华侨大学 | 一种利用整合宿主因子来提高pcr扩增灵敏度的方法 |
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- 2015-09-21 CN CN201510602375.XA patent/CN105200036A/zh active Pending
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| CN104388419A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-03-04 | 戚智青 | 一种高效扩增核酸分子的方法 |
| CN104593491A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-06 | 华侨大学 | 一种利用整合宿主因子来提高pcr扩增灵敏度的方法 |
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| GANG WU ET AL.: "Simplified gene synthesis: A one-step approach to PCR-based gene construction", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
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