CN105441424A - 一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，其特征在于：制备RCA反应液，在RCA反应液中加入IHF-β蛋白，所述RCA反应液中IHF-β蛋白的浓度为0.204～4.08ng/μl。本发明可以显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，填补了有关利用耐热的DNA双链结合蛋白来提高RCA扩增效率的方法和应用领域的空白。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法。
【背景技术】
滚环扩增(Rollingcircleamplification，RCA)是1998年建立的一种体外等温核酸扩增方法。该方法借鉴了自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式，可以实现环状DNA的高速循环复制，具有灵敏度高、特异性强、高通量、操作简便和反应条件温和等特点，在单核苷酸多态性分析、DNA芯片、蛋白质芯片、核酸测序等方面得到了广泛使用。
滚环扩增的机理主要在于使用具有强的持续性和链置换活性的聚合酶，如Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶等。在滚环扩增过程中，寡核苷酸引物与单链环状模板结合，在该类聚合酶的作用下，不断延伸互补链，在完成一圈复制后重新回到原点，核酸链间的位移活动使得新合成出的核酸链进一步取代之前的旧链作为聚合前体，从而使得延伸过程可以进一步循环，得到线性的与环状模板互补的多拷贝序列构成的联聚分子。根据使用的寡核苷酸引物的数量和特性，滚环扩增可分为线性扩增(LinearRCA，LRCA)、指数扩增(HyperbranchedRCA，HRCA)、多引物滚环扩增(multiply-primedRCA)和锁式探针扩增(Ligation-RCA，LRCA)等。其中，多引物RCA利用Phi29DNA聚合酶和多条寡核苷酸引物，提高了合成的速度和产量，不仅可以扩增质粒、人工细菌染色体(Bacteriaartificialchromosome,BAC)、粘粒等大的环状DNA，而且可以扩增未知序列的环状DNA和无法克隆的环状模板，产物为双链，可用于测序、酶切、克隆、标记和检测等方面，市售的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒即应用了多引物RCA技术。
尽管多引物RCA技术已得到广泛应用，但该技术仍存在一定的不足。尤其是当反应体系中的DNA模板复杂或含量很低时，大量引物不能与模板有效配对，引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，降低了目的DNA的滚环扩增效率。目前，有一种利用单链结合蛋白TthSSB来提高RCA扩增效率方法。TthSSB蛋白具备单链结合蛋白(single-strandednucleicacidbindingprotein，SSB)的特性，在RCA反应过程中，通过与体系中的单链DNA结合，不仅使得单链DNA保持稳定，防止其重新配对成双链或被核酸酶降解，还能促进同源的核苷酸链互补配对，从而实现了对RCA技术的优化。
整合宿主因子是调控原核生物基因复制转录的蛋白之一，其最初被发现具有辅助λ噬菌体整合到其宿主基因中的功能，故将其命名为整合宿主因子。它是一种热稳定的双链DNA结合蛋白，不仅具有维持DNA的超螺旋和压缩状态的作用，在DNA的弯曲、基因转录调控、核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应和起始于复制原点的复制，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等方面发挥作用。整合宿主因子(IHF)由α亚基(99个氨基酸)和β亚基(94个氨基酸)两个异源亚基构成，α亚基和β亚基之间有30％的同源性。已有研究报道单独表达的IHF-α亚基难与DNA结合，而IHF-β亚基可与DNA形成稳定的复合物。迄今为止，还没有关于运用双链DNA结合蛋白来提高RCA扩增效率的报道。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，该方法在很大程度上解决了RCA技术反应速度慢、灵敏度低等问题。
本发明是这样实现的：
一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，制备RCA反应液，在RCA反应液中加入IHF-β蛋白。
进一步地，所述RCA反应液中IHF-β蛋白的浓度为0.204～4.08ng/μl。
本发明具有如下优点：
通过在RCA反应过程中加入一定浓度的IHF-β，可以显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，填补了有关利用耐热的DNA双链结合蛋白来提高RCA扩增效率的方法和应用领域的空白。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中IHF-β蛋白的SDS-PAGE电泳检测示意图。
图2是本发明中IHF-β蛋白的活性检测电泳示意图。
图3是本发明中以重组质粒pUC19-hupB为模板，IHF-β蛋白对RCA扩增效率影响情况的电泳示意图。
图4是本发明中以单克隆(含有重组质粒pUC19-hupB)为模板，IHF-β蛋白对RCA扩增效率影响情况的电泳示意图。
【具体实施方式】
本发明涉及一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，制备RCA反应液，在RCA反应液中加入IHF-β蛋白所述RCA反应液中IHF-β蛋白的浓度为0.204～4.08ng/μl。
请参阅图1～4所示，结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1：
1、IHF-β的制备
①将来源于大肠杆菌的IHF-β的基因插入pET-22b表达载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-IHF-β；
②将构建好的重组载体pET-22b-IHF-β转化大肠杆菌BL21，取含重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6-0.8；加入IPTG,将菌液放入37℃摇床中诱导表达3小时，摇床转速为160rpm；
③取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，电泳结果见图1。
图1各泳道表示：M为PageRulerLowRangeUnstainedproteinLadder；IHF泳道表示制备的IHF-β蛋白。
由图1可以看出制备的IHF-β蛋白的大小为10.5kD,符合理论值。
④IHF-β的纯化。
利用上述方法大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液离心(3000×g)15min，收集大肠杆菌菌体，-70℃冷冻放置过夜。菌体悬浮在裂解缓冲液(0.1M，0.02MEDTA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶)(pH7.5)中30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离心(120000×g)90min。上清液以阴离子交换柱PrepQ纯化。以25mMTris/HCl,1mMEDTA(pH7.5)冲洗，再以NaCl梯度洗脱。之后，以肝素亲和柱纯化，以NaCl梯度洗脱，得到纯度为95％左右的IHF-β蛋白原液。
实施例2：IHF-β的活性检测
按照下表1配置10μl的反应体系:
表1
在反应液中，加入不同浓度的实施例1得到的IHF-β蛋白，室温下静置10min。之后分别取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳(105V，25min)，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图2.
图2各泳道表示：M为1kbDNALadderMarker；1，2，3，4，5，6，7，8表示在反应液中分别加入IHF-β蛋白0μl、0.5μl、1μl、2μl、4μl、6μl、8μl和9μl。
由图2可知，随着IHF-β蛋白加入量的增加，DNA条带逐渐上移。表明纯化出的蛋白IHF-β具有活性，能与环状的双链DNA发生结合作用。
实施例3：IHF-β对滚环扩增效率的影响(以重组质粒pUC19-hupB为模板)
1、重组质粒pUC19-hupB的构建：将来源于大肠杆菌的hupB基因插入pUC19质粒中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组质粒pUC19-hupB；
2、变性：以重组质粒pUC19-hupB作为模板，在5μl样品缓冲液中加入1ngpUC19-hupB质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；
3、培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μlPhi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5μl预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在各RCA反应液中分别加入IHF-β蛋白0ng、2.04ng、5.1ng、15.3ng、25.5ng和40.8ng；各RCA反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃。
4、RCA扩增产物检测：取3μlRCA产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在1×TAE和105V电压下电泳25min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图3。
图3各泳道表示：M为1kbDNALadderMarker；0为市售RCA试剂盒的滚环扩增产物；1，2，3，4，5分别表示在反应体系中加入IHF-β蛋白2.04ng、5.1ng、15.3ng、25.5ng和40.8ng。
由图3可以看出：以重组质粒pUC19-hupB为模板时，随着加入的IHF-β量的增加，DNA条带逐渐变粗、变亮，DNA滚环扩增效率显著提高。
实施例4：IHF-β对滚环扩增效率的影响(以单克隆为模板)
1、转化：取20ng重组质粒pUC19-hupB，转化至100μlE.coliBL21感受态细胞，在含有1‰Ampicillin(100μg/ml)的LB平板上培养转化，然后挑取一单菌落的一小部分溶于50μl的无菌水中，混匀，得到单克隆模板；
2、参照实施例3的方法，观察IHF-β对RCA扩增效率的影响；
3、RCA扩增产物检测：待反应结束后，取3μlRCA产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和105V电压下电泳25min，然后在0.5μg/mL溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图4。
图4各泳道表示：M为1kbDNALadderMarker；0为市售RCA试剂盒的滚环扩增产物；1，2，3分别表示在反应体系中加入IHF-β蛋白5.1ng、15.3ng和25.5ng。
由图4可以看出：以单克隆为模板时，随着加入的IHF-β的增加，DNA条带逐渐变粗、变亮，DNA滚环扩增效率显著提高，在达到一定量后，产物的扩增开始受到抑制。
综上可知，本发明通过在RCA反应体系中添加一定浓度的IHF-β，发现在一定条件下，可以显著地提高滚环扩增的效率，在很大程度上解决了RCA技术反应速度慢、灵敏度低等问题。总之，本发明可以显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度。
本发明中所涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)中的IHF-β蛋白基因序列如SEQIDNO：1所示，IHF-β的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，重组质粒pUC19-hupB的基因序列如SEQIDNO：3所示，具体情况参见序列表。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (2)
1.一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，其特征在于：制备RCA反应液，在RCA反应液中加入IHF-β蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，其特征在于：所述RCA反应液中IHF-β蛋白的浓度为0.204～4.08ng/μl。
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| CN104593491A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-06 | 华侨大学 | 一种利用整合宿主因子来提高pcr扩增灵敏度的方法 |
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