CN104845964A - 一种利用hu蛋白有效提高rca扩增效率的方法 - Google Patents
一种利用hu蛋白有效提高rca扩增效率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104845964A CN104845964A CN201510198272.1A CN201510198272A CN104845964A CN 104845964 A CN104845964 A CN 104845964A CN 201510198272 A CN201510198272 A CN 201510198272A CN 104845964 A CN104845964 A CN 104845964A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rca
- albumen
- protein
- dna
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种利用HU蛋白有效提高RCA扩增效率的方法，包括：HU蛋白的制备与纯化；使用TempliPhi DNA测序模板扩增试剂盒，按照试剂盒的说明进行变性操作和培育操作，通过在滚环扩增过程中添加一定浓度的非特异性DNA结合蛋白HU蛋白，然后分别将RCA扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。本发明可以显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售RCA试剂盒的进一步优化。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域的一种HU蛋白的应用，具体涉及一种利用HU蛋白有效提高RCA扩增效率的方法。
【背景技术】
为了取代PCR技术或弥补它的不足，近十几年来发展起来了一些新的核酸扩增技术，其中滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)因其简单高效的特点受到极大的重视。RCA是一种基于连接酶连接、引物延伸、与链置换扩增反应的恒温核酸扩增方法。该方法不仅可以扩增环状DNA、RNA，也可以实现全基因组DNA的扩增，目前在SNPs的检测、蛋白质芯片的检测、核酸的测序等方面有广泛的应用前景。
在自然界中，诸如质粒或病毒等环型DNA分子的复制，通常都是通过滚环扩增的机理实现的。在滚环扩增的过程中，在dNTPs存在的条件下，将随机引物退火至环状DNA模板的多个位点，然后在phi29DNA聚合酶的作用下产生多个复制叉，使得环状DNA模板循环扩增，形成由上千个反复衔接的环型DNA链的拷贝构成的DNA联聚分子，从而提高合成速度和产量，实现模板的指数扩增。这种方法可以直接扩增DNA和RNA，因而在核酸检测中具有极大的应用价值和潜力。
尽管RCA技术的应用已经愈加广泛，该技术依然存在一些亟待解决的问题。其中最显著的就是反应过程中产生非特异性扩增的问题，实际上，即使是在最佳的反应条件下，如对随机引物进行优化，也不能彻底消除该反应过程中产生的非特异性扩增产物，尤其是在使用的DNA模板复杂或者含量低的情况下。这些非特异性扩增多是由于在反应过程中一些位点形成引物二聚体导致错配而产生的，。其次就是灵敏度的问题，虽然使用较高浓度的高反应活性连接酶也有利于提高灵敏度，但同时也会使非特异性成环的概率增加。所以，如何做到高灵敏度和高特异性是RCA技术极具挑战性的问题。
单链DNA结合蛋白(single-strand DNA blinding protein，SSB)是一类结合在单链DNA上的蛋白。细胞的所有的生命形式及大部分病毒都需要此类蛋白，其在DNA进行复制、转录及修复等生理过程中起着重要作用。在dsDNA(双链DNA)解旋时SSB蛋白结合在ssDNA(单链DNA)上，使其保持稳定，以防ssDNA重新配对成双链或被核酸酶降解，从而对ssDNA起到相应的保护作用；除了对ssDNA二级结构的作用之外，SSB还能促进同源的核苷酸链进行配对。SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增。
使用随机六聚体和噬菌体phi29DNA聚合酶来对质粒或基因组DNA进行滚环扩增(RCA)，这种方法已经越来越多的被用于DNA测序中的模板扩增中。Mikawa T等人已经发现，源于嗜热菌HB8的单链结合蛋白SSB的突变体蛋白TthSSB可以在RCA反应过程中提高模板扩增的效率。此外，TthSSB突变体蛋白增强phi29DNA聚合酶的特异性。他们将分别将天然的和发生突变的TthSSB在大肠杆菌中进行了过度表达，并对其进行了纯化至同质；发现在体外，这些蛋白质可特异性与单链DNA结合。在RCA反应过程中，通过与单链DNA结合，TthSSB突变蛋白可以明显地缩短phi29DNA聚合酶合成一段DNA片段时所需的延伸时间。此外，TthSSB突变体蛋白基本上消除了在RCA反应过程中产生的非特异性的DNA产物。
与真核染色质类似，细菌染色体也需同多种蛋白结合，才能被有效高度压缩，并有序排列。而来源于大肠杆菌菌株U93的组蛋白样蛋白(HU)，作为一种与DNA非特异性结合的蛋白，在细菌染色体的压缩和排列过程中扮演了重要角色。它除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，还能对DNA的结构起到一些特殊的作用，如DNA的弯曲、基因转录调控、起始于复制原点的复制、核蛋白复合物在装配时所需的位点特异性重组反应，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制的翻译起始等。HU是由两个同源亚基HupA和HupB组成，是最保守的核酸结合蛋白，可非特异性结合双链DNA，也有发现其对于缺口和弯曲的DNA有特定偏好。HU蛋白不但能像结合单链DNA的SSB蛋白一样与单链DNA结合，同时还能结合双链的DNA。目前从尚未见有HU蛋白对RCA扩增影响的相关报道。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种。
本发明是这样实现的：一种利用特异性DNA结合蛋白HU蛋白同时提高滚环扩增灵敏度和特异性的方法包括以下步骤：
(1)使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒：
A.变性：以环状DNA作为模板，在5μl样品缓冲液中加入1ng环状DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液，待用；
B.培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μl试剂盒中提供的Phi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5μl预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在各RCA反应液中分别加入浓度为4.0±0.4ng/μl的HU蛋白0.1μl-10μl；各RCA反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；分别3μl RCA产物以1％琼脂糖凝胶取3μl反应混合液于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
进一步地，所述步骤B中，HU蛋白是直接一次性加入至反应体系所需组分中。
本发明的优点在于：通过在RCA反应过程中分别加入浓度为4.0±0.4ng/μl的HU蛋白0.1μl-10μl，可以显著地提高滚环扩增的效率，同时明显增强滚环扩增的灵敏度和特异性，实现了对市售RCA试剂盒的进一步优化。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明实施例1中的S-PAGE电泳检测图。
图2是本发明实施例2中HU蛋白的活性检测图。
图3是本发明实施例3中浓度为4.4ng/ul的HU蛋白对RCA扩增效率的影响结果图。
图4是本发明实施例3中浓度为4.4ng/ul HU蛋白对RCA扩增效率的影响结果图。
图5是本发明实施例4中浓度为4.0ng/ul的HU蛋白对RCA扩增效率的影响结果图。
图6是本发明实施例4中浓度为4.0ng/ul的HU蛋白对RCA扩增效率的影响结果图。
【具体实施方式】
下面结合各实施例对本发明进行详细阐述说明，但本发明保护范围不局限于各实施例所述内容，且各实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：非特异性DNA结合蛋白HU蛋白的制备
(1)、取来源于大肠杆菌U93的HU的2个亚基的基因片段即HUα和HUβ亚基，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，分别插入已经使用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切后并纯化的pET-22b载体中，通过连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-HUα和pET-22b-HUβ；
(2)、将构建好的重组载体pET-22b-HUα和pET-22b-HUβ分别转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，之后取含重组质粒的阳性菌株并加入LB液体培养基中过夜培养，接着菌液按1％比例接种到50ml的LB培养液中，放入37℃摇床培养至其OD值为0.6～0.8；然后加入IPTG，并放入37℃摇床中诱导表达3小时，摇床转速为160rpm；
(3)、取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质，并通过SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，结果如图1(图1中：M是蛋白分子量Marker；M左侧为待检测蛋白的电泳条带)所示的蛋白为水溶性的、且大小正确即10.5kDa，从而筛选到所释放的蛋白为水溶性且大小正确的阳性菌株即所需阳性菌株；
(4)、利用上述操作(2)与(3)的操作培养获得大量所需阳性菌株，菌液经3000×g离心15min，收集大肠杆菌菌体，于-70℃冷冻放置过夜，备用；将收集到的大肠杆菌菌体悬浮在裂解缓冲液(组分为：0.05M Tris、0.2M氯化钠、0.01M EDTA、10％V/v甘油、pH 7.5)，冰上超声裂解菌体，裂解液经27000×g离心15min，于上清液中加入10％终浓度0.35％的PEI和终浓度0.75M的NaCl，4℃放置至核酸沉淀，之后17000×g离心20min，于上清液中添加饱和硫酸铵至其体积分数为50％，在4℃放置1h，接着17000×g离心15min，去沉淀，上清液中加入硫酸铵至完全饱和，然后17000×g离心30min，取硫酸铵沉淀溶解在缓冲液(组分：0.02M Tris、0.001M EDTA、0.1M NaCl、10％V/v甘油、pH 7.5)，透析36h，换液三次；透析后的溶液上样至强阳离子交换柱，用透析缓冲液NaCl梯度洗脱，收集0.2M和0.25M的NaCl洗脱峰，并以弱阳离子交换柱、0.25M NaCl梯度洗脱该洗脱峰，得到HU蛋白原液；将HU蛋白原液于85℃下加热20min后以转速14000×g、4℃下离心20min，取上清液即得纯化后的HU蛋白原液，加入甘油至其体积分数为50％，-20℃保存待用。
其中，强阳离子交换柱采用SP琼脂糖凝胶柱，弱阳离子交换柱采用lCM-琼脂糖柱。
将制备所得纯化后的HU蛋白原液进行SDS-PAGE分析，结果也如图1所示，大小约为10.5kDa，纯度为95％左右，且纯化后的HU蛋白原液浓度为：4.0±0.4ng/μl。
且将本发明制备所得的非特异性DNA结合蛋白的DNA序列交由经金斯瑞测序公司进行测序，测序结果表明，制备所得的非特异性DNA结合蛋白的DNA序列与现有文献报道的HU蛋白一致；GenBank:NC010079.1其序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所所示，从而说明制备所得的非特异性DNA结合蛋白即为HU蛋白。
实施例2：HU蛋白的活性检测
以环状的双链DNA作为底物对上述制备的HU蛋白进行活性检测，使用shift buffer(20mM Tris-HCl、pH7.5、1mM EDTA)与蛋白以及环状DNA为底物构建10ul反应体系。
反应体系：
将各反应组分混合后室温静置10min，之后使用1％琼脂糖凝胶进行核酸电泳，观察HU蛋白活性检测结果。
电泳结果见图2(图2中各甬道表示如下，M：DNA分子量Marker；1：环状DNA模板(T)与shift buffer(SB)混合液；2：T与SB混合液体系内加入0.2μl HU蛋白原液(稀释5倍)；3：T与SB混合液体系内加入2μl HU蛋白原液(稀释5倍)；4：T与SB混合液体系内加入1μl HU蛋白原液；5：T与SB混合液体系内加入1.8μl HU蛋白原液；6：T与SB混合液体系内加入2μlHU蛋白原液；7：T与SB混合液体系内加入2.5μl HU蛋白原液；8：T与SB混合液体系内加入3μl HU蛋白原液；9：T与SB混合液体系内加入3.5μlHU蛋白原液；10：T与SB混合液体系内加入4μl HU蛋白原液；11：T与SB混合液体系内加入4.5μl HU蛋白原液；12：T与SB混合液体系内加入5μlHU蛋白原液)，由图2可见在加入HU蛋白后，HU蛋白与环状的双链DNA结合，随着HU蛋白加入量的增加，DNA条带逐渐上移，表明本发明制备的HU蛋白有活性并且与环状的双链DNA相互作用。
实施例3：HU蛋白对RCA扩增效率的影响(以质粒PUC19为模板)
使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒：
①变性：以PUC19质粒作为模板，取1ng该质粒与5ul样品缓冲液混合，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温。
②培育：将5ul反应缓冲液与0.2ul试剂盒中提供的Phi29DNA聚合酶，混匀后冰上暂存，得到预混合液；取5ul所得预混合液于①中已冷却的变性后样品液中，混匀后30℃下水浴4-18h，测浓度，DNA产量在1.25-1.75ug之间，之后65℃加热10min，冷却至4℃。
且水浴前，在混合液中加入由实施例1得到的HU蛋白，加入HU蛋白的浓度为4.4ng/ul，同法进行扩增。
水浴18h后分别取3ul体系中的反应混合液于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
电泳结果分别见图3(图3中，M是DNA分子量Marker；M左侧为在RCA反应体系中加入不同量的HU蛋白得到的RCA扩增产物；0：市售RCA试剂盒的扩增产物；1：RCA反应体系内加入0.2ul HU蛋白；2：RCA反应体系内加入0.5ul HU蛋白；3：RCA反应体系内加入1.5ul HU蛋白；4：RCA反应体系内加入2.5ul HU蛋白；5：RCA反应体系内加入4ul HU蛋白)与图4(图4中，M是DNA分子量Marker；M左侧为在RCA反应体系中加入不同量的HU蛋白得到的RCA扩增产物；0：市售RCA试剂盒的扩增产物；1：RCA反应体系内加入0.2ul HU蛋白；2：RCA反应体系内加入0.5ul HU蛋白；3：RCA反应体系内加入1.5ul HU蛋白；4：RCA反应体系内加入2.5ul HU蛋白)，由图3与图4可见，随着加入的HU蛋白的量的增加，DNA滚环扩增效率随之显著增加。
实施例4：HU蛋白对RCA扩增效率的影响(以单克隆为模板)
使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒：
①转化：取2μl PET-22b质粒，转化E coli BL21，之后在含有1‰Ampicillin(100ug/ml)的LB平板上培养转化，然后挑取一单菌落的一小部分溶于50ul的无菌水，混匀，得到单克隆；以得到的单克隆为模板。
②参照实施例2的方法，观察HU蛋白对RCA扩增效率的影响；待反应结束后，取3ul体系中的反应混合液于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
电泳结果见图5(图5中，M是DNA分子量Marker；M左侧为在RCA反应体系中加入不同量的HU蛋白得到的RCA扩增产物；0：市售RCA试剂盒的扩增产物；1：RCA反应体系内加入0.5ul HU蛋白；2：RCA反应体系内加入1.5ul HU蛋白；3：RCA反应体系内加入2.5ul HU蛋白；4：RCA反应体系内加入4ul HU蛋白)和图6(图6中，M是DNA分子量Marker；M左侧为在RCA反应体系中加入不同量的HU蛋白得到的RCA扩增产物；0：市售RCA试剂盒的扩增产物；1：RCA反应体系内加入0.5ul HU蛋白；2：RCA反应体系内加入1.5ul HU蛋白；3：RCA反应体系内加入2.5ul HU蛋白；4：RCA反应体系内加入4ul HU蛋白)。可知，以单克隆为模板时，随着加入HU蛋白量的增加后，RCA扩增效率随之逐渐提高，并且加入的HU蛋白的量存在最佳区间；同时，在超过最佳区间后，随着HU蛋白加入量的增加，非特异性扩增受到抑制，非特异性扩增产物随之明显减少。
本发明通过在RCA过程中加入HU蛋白，发现在一定条件下，其可以显著地促进RCA扩增的效率。也就是说：在RCA反应过程中，HU亚基同源二聚体(HUα，HUβ)不但能显著地提高灵敏度，而且能有效抑制非特异性片段的扩增。本发明的应用，将明显提高RCA技术的扩增效率，并有效解决其存在非特异性产物污染的问题。
最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术实施方法而非限制，尽管参照了较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通实验人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
Claims (2)
1.一种利用HU蛋白有效提高RCA扩增效率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒：
A.变性：以环状DNA作为模板，在5μl样品缓冲液中加入1ng环状DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液，待用；
B.培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μl试剂盒中提供的Phi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预混合酶液，将5μl预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在各RCA反应液中分别加入浓度为4.0±0.4ng/μl的HU蛋白0.1μl-10μl，并加入无菌水至终体积相同；各RCA反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；分别3μl RCA产物以1％琼脂糖凝胶取3μl反应混合液于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
2.如权利要求1所述的一种利用HU蛋白有效提高RCA扩增效率的方法，其特征在于：所述步骤B中，HU蛋白是直接一次性加入至反应体系所需组分中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510198272.1A CN104845964A (zh) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | 一种利用hu蛋白有效提高rca扩增效率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510198272.1A CN104845964A (zh) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | 一种利用hu蛋白有效提高rca扩增效率的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104845964A true CN104845964A (zh) | 2015-08-19 |
Family
ID=53845953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510198272.1A Pending CN104845964A (zh) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | 一种利用hu蛋白有效提高rca扩增效率的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104845964A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105441424A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-30 | 华侨大学 | 一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101072884A (zh) * | 2004-10-21 | 2007-11-14 | 新英格兰生物实验室公司 | 修复核酸用于改进的扩增 |
| CN104388419A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-03-04 | 戚智青 | 一种高效扩增核酸分子的方法 |
-
2015
- 2015-04-24 CN CN201510198272.1A patent/CN104845964A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101072884A (zh) * | 2004-10-21 | 2007-11-14 | 新英格兰生物实验室公司 | 修复核酸用于改进的扩增 |
| CN104388419A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-03-04 | 戚智青 | 一种高效扩增核酸分子的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIN INOUE等: "Improvements of rolling circle amplification (RCA) efficiency and accuracy using Thermus thermophilus SSB mutant protein", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105441424A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-30 | 华侨大学 | 一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103789292B (zh) | 一种赖氨酸脱羧酶、制备方法及其应用 | |
| CN102061283B (zh) | 一株产精氨酸脱亚胺酶的重组菌的构建及其定向改造方法 | |
| Zylicz-Stachula et al. | Modified ‘one amino acid-one codon’engineering of high GC content TaqII-coding gene from thermophilic Thermus aquaticus results in radical expression increase | |
| CN102660570B (zh) | 一种提高酶热稳定性的方法 | |
| WO2014205882A1 (zh) | 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用 | |
| Fang et al. | Characterization and application of a thermophilic Argonaute from archaeon Thermococcus thioreducens | |
| Tang et al. | Exploitation of cold‐active cephalosporin C acylase by computer‐aided directed evolution and its potential application in low‐temperature biosynthesis of 7‐aminocephalosporanic acid | |
| CN105087517B (zh) | 一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法 | |
| CN104531637A (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用 | |
| CN104845964A (zh) | 一种利用hu蛋白有效提高rca扩增效率的方法 | |
| Ping et al. | Whole‐cell biosynthesis of cytarabine by an unnecessary protein‐reduced Escherichia coli that coexpresses purine and uracil phosphorylase | |
| CN116376871A (zh) | 一种热稳定型酯酶EstF及其突变体与应用 | |
| Gyohda et al. | Purification and characterization of the R64 shufflon-specific recombinase | |
| CN102703400A (zh) | 热启动dna聚合酶及其应用 | |
| CN118139979A (zh) | 具有hepn结构域的酶 | |
| CN106520814A (zh) | 一种热稳定性核酸酶及其制备方法 | |
| Huang et al. | Elimination of editing plasmid mediated by theophylline riboswitch in Zymomonas mobilis | |
| CN105200074B (zh) | 一种利用dna非特异性结合蛋白hu蛋白构建克隆载体的方法 | |
| CN105505893A (zh) | 动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1,2-双加氧酶、其编码基因及其制备方法 | |
| Zhou et al. | Mannanase Man23 mutant library construction based on a novel cell‐free protein expression system | |
| CN103740661B (zh) | 一种提高酶热稳定性的方法 | |
| Askora et al. | In vitro characterization of the site-specific recombination system based on genus Habenivirus ϕRSM small serine integrase | |
| CN105200037A (zh) | 一种利用非特异性结合蛋白来提高基于pcr的基因合成技术灵敏度的方法 | |
| CN102021191A (zh) | 一种体外进化β-葡聚糖酶的方法 | |
| CN103740659A (zh) | 一种提高酶热稳定性的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150819 |