CN105950613B - 一种体外快速组装非磷酸化dna片段的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，属于基因工程技术领域。本发明在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性‑退火‑切割‑连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在1.5h内一次可以实现2‑4个非磷酸化DNA片段的高效快速的无缝组装。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效组装上，可引入丰富的组合突变多样性，进行快速定向进化和合成生物学操作。

Description

一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法

技术领域

本发明涉及一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

上个世纪分子生物学领域显著的成就是限制性内切酶和DNA连接酶的发现，奠定了体外DNA重组构建的基础技术。DNA重组技术极大的促进了人们在基因的结构、功能领域的认识，为酶工程、代谢工程和合成生物学的快速发展奠定了基础。然而，在实际的操作过程中，由于受制于限制性酶切位点，DNA片段的重组构建，特别是多个片段的组装构建，传统的常规酶切连接技术就显得捉襟见肘。酶切位点的数量限制，特别是繁琐缓慢的分步克隆重组操作根本难以满足现代代谢工程和合成生物学中复杂的代谢途径和调控元件的快速组装构建。因此，构建一种不依赖序列的DNA快速重组技术显得尤为迫切。

随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，能够产生粘性末端的单链核酸外切酶被发现，由此建立起来的不依赖序列和连接的克隆重组技术(SLIC)应运而生并且在代谢工程和合成生物领域快速发展和应用。例如，最经典的方法，是基于T5核酸外切酶和T4DNA聚合酶的LIC系统，该系统作为一种高效的方法被应用于大规模的基因克隆及载体构建。该方法在设计PCR扩增引物时需添加特定长度(≥15nt)的与邻近重组的DNA片段(载体)末端同源的序列作为重组区段，这段区域可以不受序列的限制。PCR扩增制备好需要组装构建的片段后，利用T4DNA聚合酶或者T 5核酸外切酶的3'-5'和5'-3'外切酶活性，水解单链使载体和克隆片段末端产生5'或者3'末端突出的单链粘性末端。该反应产物在退火条件下而不需要连接酶的作用即可通过突出的粘性末端发生较为稳定的配对复性，并借助于宿主大肠杆菌内的DNA修复系统重新环化成新的质粒。随后在此基础上改进的技术，例如一步等温组装反应等，通过在反应中加入DNA聚合酶(聚合活性补齐缺口)和DNA连接酶(缺口补平)，由T5核酸外切酶产生的单链DNA突出端，相互结合并由DNA聚合酶延伸补齐缺口，最后由连接酶把缺口修复补平形成完整的DNA双链，这使得不依赖序列的克隆技术效率进一步显著提高。然而，上述方法中，核酸外切酶产生的单链长度不可精确地控制，导致短片段不适宜组装，并且4个片段以上的组装效率急剧下降；并且涉及三种酶。

与此同时，大量的利用其它序列特异性的核酸内切酶接到的组装方法也发展迅速，例如Golden Gate组装和单链缺口切割酶组装，尽管这种组装技术可以快速实现一步组装6-10个基因片段，然而依然受到限制性酶切位点的限制，特别是组装构建的片段重组区域会留下一段6-10bp疤痕序列，这极大限制了它在应用。再者，酵母介导的体内同源重组技术也相应发展起来，该方法在设计PCR引物扩增目标片段时，需添加一定长度(≥40nt)的与邻近重组的DNA片段(载体)末端同源的序列作为同源重组区段，这段区域可以不受序列的限制。所有带有同源末端序列的片段和酵母载体一同电转酿酒酵母，可以在酵母体内一次实现多达25个基因片段的组装，并且无序列依赖性和无痕重组。这一技术对合成生物学和代谢工程的发展相当有吸引力。但是，由于需要的同源区域较长，极大的增加了引物的合成费用，特别是对于非酿酒酵母途径的构建，比较复杂和耗时(长达10-15天)。近期，一种基于耐热DNA聚合酶和连接酶体外快速组装DNA的方法DATEL被提出，在需要组装构建的目标片段两末端引入同源臂序列，采用热循环进行变性-退火-切割-连接的方式，实现快速体外DNA组装构建。在2h内一次可以实现2-6个片段的高效快速的无缝组装。此外，可通过在引物中引入兼并突变序列实现PCR扩增后获得含有不同突变区域的DNA片段，进而通过该组装方法实现对基因DNA的组装突变构建。然而，这一技术不仅需要对各片段预先进行磷酸化处理，增加了实验的步骤，且三种酶在Taq DNA连接酶缓冲液体系中无法同时达到较高的反应速率从而加长了反应的时间。因此，迫切需要开发一种操作简单、节省时间的体外不依赖序列且可以高通量操作和无痕的组装技术以满足现代快速发展的合成生物学。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，可快速组装2-4个基因片段。

本发明的方法，首先对需要组装的DNA片段进行PCR以获得具有重叠末端的亚片段，所得亚片段经包括变性、退火、切割、连接的热循环反应进行重组。

所述对需要组装的DNA片段进行PCR，是根据设定的DNA片段的组装顺序，针对每个需要重组的DNA片段(靶基因)分别设计正反向两条引物，用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有20-40bp的序列完全匹配，使扩增得到的各亚片段之间具备体外组装的同源臂。

所述热循环反应在缓冲液中进行；缓冲液的pH为7.2-7.6，含有终浓度为1.0-1.5mM NAD⁺、2.0-10.0mM Mg²⁺。

所述热循环反应在MTL缓冲液(Modified Taq DNALigase Buffer)中进行；10×MTL缓冲液含有200mM pH7.2的Tris-HCl、250mM KCl、50mM MgCl₂、15mM NAD⁺、1％Triton X-100(即含有终浓度20.0mM的Tris-HCl、25.0mM KCl、5.0mM MgCl₂、1.5mM NAD⁺、0.1％TritonX-100)。所述的切割由具有5'-3'外切酶活性的耐热DNA聚合酶Taq DNA聚合酶催化；所述的连接由具有单链无间隙缺口连接功能的耐热DNA连接酶催化；所述方法中不需要对DNA片段和PCR所用的引物进行磷酸化处理。

在本发明的一种实施方式中，所述的DNA连接酶为Taq DNA连接酶。

所述热循环反应中变性温度为94℃，退火温度为50℃；切割温度为68℃，切割时间5-30min；连接温度50℃，连接时间5min；热循环数为1-5个循环。

在本发明的一种实施方式中，所述热循环反应中变性温度为94℃，退火温度为50℃；切割温度为68℃，切割时间10min；连接温度50℃，连接反应时间5min；热循环数为3。

在本发明的一种实施方式中，所述用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有30bp的序列完全匹配。

在本发明的一种实施方式中，所述热循环反应具体是：取制备好的亚片段各50ng，同时加入1.5μl 10×MTL缓冲液，0.2μl Taq DNApolymerase，1μl Taq DNAligase，补足水至15μl体系；按如下程序反应：94℃2min，(94℃30s，50℃1min，68℃10min，50℃5min)×3，66℃10min。

本发明方法，与DATEL相比，由于无需pfu DNA聚合酶，减少了将DNA片段或引物进行磷酸化处理的步骤，且通过对反应缓冲液的优化将切割时间由30min减少至10min，大大节约了时间。

本发明方法可用于DNA重组构建、合成途径的组装、蛋白组装进化和代谢途径组合改造等，所得产物可以保存在-20℃或者直接进行转化感受态细胞。

所述的亚片段可以是结构基因、载体。

本技术采用耐热缺口连接酶和DNA聚合酶介导的体外重组DNA片段技术。根据设定的组装顺序，向合成引物中引入相应的同源序列，借助变性退火温度循环，DNA聚合酶的外切酶活性和连接酶活性实现DNA的无痕组装。参见图1，用于组装的片段两端分别含有20-30bp的同源序列与邻近组装的片段一致，采用PCR热循环反应体系，DNA经94℃变性后退火至50-60℃，同源臂互补匹配结合，随后形成如图中所示的“flap”结构，“flap”可以为5'或者3'末端序列，此时每个结合部位有1/2的概率出现全为5'末端序列，这时此部分多出的“flap”序列借助Taq DNA聚合酶5'-3'外切酶活性在68℃下反应进行切除，形成具有缺口的契合链，再借助耐热Taq DNA连接酶在50℃进行缺口补平连接，从而形成完整的重组片段。此技术由于采用的均为耐热酶，可以进行多次热循环反应(变性-退火-切割-连接)以增加重组体。

本发明克服了已有报道的组装技术序列限制，效率低，耗时长和成本高等因素，在1.5h内一次可以实现2-4个片段的高效快速的无缝组装。本发明可用于常规的DNA重组构建，并实现高通量操作，特别适合于对酶基因和合成途径的体外高效进化改造上，引入丰富的组合突变多样性。

附图说明

图1所示为本体外组装技术的原理示意图，是利用耐热Taq连接酶和Taq DNA聚合酶，体外快速组装多个非磷酸化片段。

图2所示为PCR验证两个片段(gfp和pUC19)组装的正确率，箭头所示为正确组装的gfp目标条带。

图3所示为本组装技术中不同成分缓冲液对组装效率的影响。

图4所示为PCR验证三个片段(gfp、kan和pUC19)组装的正确率，箭头所示为正确组装的目标条带(1.5kb)。

图5所示为本组装技术快速组装四个DNA片段示意图。

图6所示为PCR验证四个片段(coaA、dfp、coaD和pUC19)组装的正确率，箭头所示为正确组装的目标条带(2.5kb)。

序列表中为核苷酸序列信息说明

(1)SEQ ID NO.1为绿色荧光蛋白编码基因gfp的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.2为卡那霉素编码基因kan的核苷酸序列；

(3)SEQ ID NO.3为大肠杆菌来源的辅酶A合成途径基因coaA编码序列；

(4)SEQ ID NO.4为大肠杆菌来源的辅酶A合成途径基因dfp编码序列；

(5)SEQ ID NO.5为大肠杆菌来源的辅酶A合成途径基因coaD编码序列。

具体实施方式

实施例1对组装技术的反应系统优化

以绿色荧光蛋白基因gfp(序列如SEQ ID NO:1所示)和pUC19载体为例，进行组装反应缓冲液优化。首先对组装反应的pH、Mg²⁺和NAD+这三种组分进行优化，根据gfp片段和载体序列设计带有30bp同源臂的gfp扩增引物，和一对载体pUC19扩增引物。引物如下所示：

puc19-F：TTCTTCTCCCTTACCCATGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT

puc19-R：TGGATGAACTATACAAATAACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG

gfp-P30F：CATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAA

gfp-P30R：CGACGGCCAGTTATTTGTATAGTTCATCCA

以引物puc19-F(序列如SEQ ID NO:6所示)和puc19-R PCR(序列如SEQ ID NO:7所示)扩增制备组装反应用的载体片段pUC19；采用引物gfp-P30F(序列如SEQ ID NO:8所示)和gfp-P30R(序列如SEQ ID NO:9所示)扩增gfp基因片段，PCR反应体系如下：2×预混superpfu mix(杭州宝赛生物)25μl，上下游引物各1μl(10μM)，模板核酸1μl(10ng)，加水补足50μl。反应程序为：94℃4min预变性；【94℃30s变性，58℃30s，72℃】×32；72℃5min。PCR结束后，反应液各添加1μlDpnI限制性内切酶，混匀后在37℃孵育30min消化模板DNA。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。上述制备的载体和PCR片段采用NaNoDrop 2000测定核酸浓度。

组装反应操作，按如下体系配置组装反应液15μl体系：1.5μl 10×反应缓冲液，50ng gfp片段，50ng pUC19载体，0.2μl Taq DNApolymerase，1μl Taq DNAligase，补足水至15μl体系。按如下热循环程序反应：94℃2min，【94℃30s，45℃1min，68℃10min，50℃5min】×3，60℃10min。热循环反应结束后。产物可以保存在-20℃，或者直接转化感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄霉素的LB平板，37℃过夜培养后，对长出的克隆进行菌落PCR验证和测序。

分别对不同缓冲液下(不同pH、Mg²⁺浓度和NAD+浓度)转化长出的克隆进行计数和PCR验证，随机挑取部分转化重组子送样测序。结果如图2所示，对每个组装反应的转化子中随机选取的192个菌落PCR结果显示，所有的转化子均成功的组装，进一步测序结果也证实了本发明的组装技术实现了两个片段的100％正确率的重组。进一步对长出的克隆数量进行统计分析，结果如图3所示，加入pH 7.0-pH 8.0不同反应缓冲液，发现组装反应在加入pH7.2的反应缓冲液时的组装效率最高(其中pH 7.6的缓冲液为原始Taq DNA连接酶缓冲液)；10×缓冲液中加入不同浓度的NAD⁺(为Taq DNA连接酶的辅因子)，发现组装反应在15mM NAD⁺的反应缓冲液时的组装效率最高；10×缓冲液中加入不同浓度的Mg²⁺(为Taq DNA聚合酶的依赖性离子)，发现组装反应在50mM Mg²⁺的反应缓冲液时的组装效率最高。我们将pH7.2，含有15mM NAD+，50mM Mg²⁺的优化后缓冲液命名为10×MTL缓冲液(Modified TaqDNALigase Buffer)，即热循环反应的初始体系中含有终浓度20.0mM的Tris-HCl、25.0mMKCl、5.0mM MgCl₂、1.5mM NAD⁺、0.1％Triton X-100)。在此缓冲液中，组装效率最高，为每微克DNA产生12460个菌落形成单位(CFU)。

实施例2应用本发明的组装技术快速组装3个片段

为了验证组装多个片段的效率和正确率，以绿色荧光蛋白基因gfp、卡那霉素基因kan(序列如SEQ ID NO:2所示)和pUC19载体为例，进行3个片段的组装(图4)。引物信息如下：

GK/pUC19-F:ATGAGTTCTTCTAAGTCATAGCTGTTTCCT

GK/pUC19-R:TGGATGAACTATACAAATAACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG

GK/gfp-F:CATGATTACGCCATGGGTAAGGGAGAAGAA

GK/gfp-R:TTGAATATGGCTCATTTATTTGTATAGTTCATCCA

GK/kan-F:AATAACTGGCCGTCGATGAGCCATATTCAACGGGAAAC

GK/kan-R:AGGAAACAGCTATGACTTAGAAGAACTCATCGAGCATC

以引物GK/pUC19-F(序列如SEQ ID NO:10所示)和GK/pUC19-R(序列如SEQ ID NO:11所示)PCR扩增制备组装反应用的载体片段pUC19；采用引物GK/gfp-F(序列如SEQ ID NO:12所示)和GK/gfp-R(序列如SEQ ID NO:13所示)扩增gfp基因片段；采用引物GK/kan-F(序列如SEQ ID NO:14所示)和GK/kan-R(序列如SEQ ID NO:15所示)扩增kan基因片段，按上述PCR反应体系和程序操作，结束后反应液各添加1μlDpnI限制性内切酶，混匀后在37℃孵育30min消化模板DNA。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。上述制备的载体和PCR片段采用NaNoDrop 2000测定核酸浓度。

组装反应操作，按如下体系配置组装反应液15μl体系：1.5μl 10×MTL缓冲液，DNA插入片段和相应的载体各50ng(3个片段组装：pUC19载体、gfp和kan)，0.2μl Taq DNApolymerase，1μl Taq DNAligase，补足水至15μl体系。按如下PCR程序反应：94℃2min，【94℃30s，50℃1min，68℃10min，50℃5min】×3，60℃10min。热循环反应结束后。产物直接转化感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养后，对长出的克隆进行统计分析，3个片段的组装效率达到每微克DNA产生830个菌落形成单位数(CFU)。经过随机挑去部分转化子进行PCR验证和DNA测序分析，结果显示，3个片段的组装正确率达到75％(图4)。本部分实施例说明，本发明技术可以快速高效的无痕组装三个DNA片段。

实施例3应用本组装技术快速组装4个片段

为了验证本组装方法多个片段的组装能力，采用大肠杆菌来源的辅酶A途径基因进行4个片段的组装应用。将该途径的3个基因coaA(序列如SEQ ID NO:3所示)、dfp(序列如SEQ ID NO:4所示)、coaD(序列如SEQ ID NO:5所示)进行串联表达，表达载体为(如图5所示)，并按此顺序设计组装进载体pUC19中。本实施例的引物信息如下：

COA/puc19-F：TGATGGCGAAGTTAGCGTAGGTCATAGCTGTTTCCT

COA/puc19-R：CTCTTTTATACTCATTACGAGCCGGAAGCATAAAG

COA/coaA-F:TGCTTCCGGCTCGTAATGAGTATAAAAGAGCAAACGTTAAT

COA/coaA-R:ACCGGCCAGGCTCATTTATTTGCGTAGTCTGACCTCTTCT

COA/dfp-F:AGACTACGCAAATAAATGAGCCTGGCCGGTAAAAAAATCG

COA/dfp-R:CGCCCGTTTTTGCATTTAACGTCGATTTTTTTCATCATAA

COA/coaD-F:AAAAATCGACGTTAAATGCAAAAACGGGCGATTTATCCGG

COA/coaD-R:CAGCTATGACCTACGCTAACTTCGCCATCAGCGCC

载体pUC19采用引物COA/puc19-F(序列如SEQ ID NO:16所示)和COA/puc19-R(序列如SEQ ID NO:17所示)进行PCR扩增。三个DNA片段coaA、dfp、coaD分别采用相应的引物对(序列分别如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23所示)进行扩增制备。按上述PCR反应体系和程序操作，结束后反应液各添加1μlDpnI限制性内切酶，混匀后在37℃孵育30min消化模板DNA。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。上述制备的载体和PCR片段采用NaNoDrop 2000测定核酸浓度。

组装反应操作，按如下体系配置组装反应液15μl体系：1.5μl 10×MTL缓冲液，三个DNA片段coaA、dfp、coaD各50ng，50ng pUC19载体，0.2μl Taq DNApolymerase，1μl TaqDNAligase，补足水至15μl体系。按如下PCR程序反应：94℃2min，【94℃30s，50℃1min，68℃10min，50℃5min】×3，60℃10min。热循环反应结束后。产物直接转化感受态细胞，涂布含100μg/ml氨苄霉素的LB平板，37℃过夜培养后，对长出的克隆进行统计分析，对4个片段的组装(5.1kb)效率达到每微克DNA产生450个菌落形成单位(CFU)。进行菌落PCR验证和测序。如图6所示，PCR验证结果显示，大约55％左右的克隆显示组装插入的片段条带偏小或无条带(不正确的组装)，而45％的克隆显示正确大小的目标条带。进一步测序分析显示，所有PCR验证的正确条带的克隆均成功实现了正确无误的组装。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种体外快速组装非磷酸化DNA片段的方法，其特征在于，所述方法首先对需要组装的DNA片段进行PCR以获得具有重叠末端的亚片段，所得亚片段经包括变性、退火、切割、连接的热循环反应进行重组；所述热循环反应在MTL缓冲液中进行；10×MTL缓冲液含有200mMpH7.2的Tris-HCl、250mM KCl、50mM MgCl₂、15mM NAD⁺、1％Triton X-100；所述的切割由具有5'-3'外切酶活性的耐热DNA聚合酶Taq DNA聚合酶催化；所述的连接由具有单链无间隙缺口连接功能的耐热DNA连接酶催化；所述方法中不需要对DNA片段和PCR所用的引物进行磷酸化处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对需要组装的DNA片段进行PCR，是根据设定的DNA片段的组装顺序，针对每个需要重组的DNA片段分别设计正反向两条引物，用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有20-40bp的序列完全匹配，使扩增得到的各亚片段之间具备体外组装的同源臂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热循环反应中变性温度为94℃，退火温度为50℃；切割温度为68℃，切割时间5-30min；连接温度50℃，连接时间5min；热循环数为1-5个循环。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述热循环反应中变性温度为94℃，退火温度为50℃；切割温度为68℃，切割时间10min；连接温度50℃，连接反应时间5min；热循环数为3。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述用于扩增相邻的需要重组的DNA片段的引物之间有30bp的序列完全匹配。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热循环反应具体是：取制备好的亚片段各50ng，同时加入1.5μl 10x MTL缓冲液，0.2μl Taq DNA polymerase，1μl Taq DNAligase，补足水至15μl体系；按如下程序反应：94℃2min，(94℃30s，50℃1min，68℃10min，50℃5min)×3，66℃10min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚片段为结构基因或者载体。

8.权利要求1-7任一所述的方法在DNA重组构建、合成途径的组装、蛋白组装进化或者代谢途径组合改造方面的应用。

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