CN118109498A - 用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统 - Google Patents
用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118109498A CN118109498A CN202311602364.2A CN202311602364A CN118109498A CN 118109498 A CN118109498 A CN 118109498A CN 202311602364 A CN202311602364 A CN 202311602364A CN 118109498 A CN118109498 A CN 118109498A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- grna
- plasmid system
- sequence
- sites
- nnnnn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 71
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 14
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 11
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 claims description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 10
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 9
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000009420 retrofitting Methods 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 101150096273 ADE2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 description 2
- HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N calicheamicin Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](NCC)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@](C/3=C/CSSSC)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- -1 crRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/87—Saccharomyces lactis ; Kluyveromyces lactis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于CRISPR‑Cas9基因组编辑的优化的质粒系统、相应的改造方法、构建载体的方法以及基因编辑方法，以使得优化的质粒系统提高了该系统在菌株的基因编辑中的工作效率和经济性，特别是适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，其中，该优化的质粒系统包括：Cas9表达盒和gRNA表达盒，其中，所述优化的质粒系统仅具有两个酶切位点，所述两个酶切位点分别位于sgRNA的靶向序列的两个连接位点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统、相应的改造方法、构建载体的方法以及基因编辑方法。
背景技术
在靶点基因附近诱导DNA产生双链断裂(Double-Strand Break,DSB)是有效进行编辑基因组的关键因素，DSB的产生可以刺激细胞发生内源性DNA修复反应，并进一步通过同源重组(Homologous Recombination,HR)或易错的非同源末端连接(Non-HomologousEnd Joining,NHEJ)实现DNA序列的修复及替换，从而实现基因编辑的目的。
CRISPR是簇状规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)的简称，它和CRISPR相关蛋白(CRISPR associatedprotein,Cas)共同组成细菌和古细菌普遍存在的适应性免疫系统。
天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成：Cas9、crRNA、tracrRNA。tracrRNA(在CRISPR-Cas9编辑技术中被优化并命名为gRNA scaffold)，它负责与Cas9结合，与重复序列具有同源性。crRNA为引导序列，约20个碱基，具有特异性。其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组合并与Cas9结合后，引导Cas9识别切割目标DNA序列，产生DSB。为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性通过将crRNA和tracrRNA融合后构建的嵌合体RNA(single guideRNA,sgRNA)也进一步方便了CRISPR-Cas9系统的应用。
其中，sgRNA中，gRNA scaffold，也即骨架结构，为sgRNA中负责Cas9结合的固定序列，扮演着tracrRNA的作用。不包括用于引导Cas9靶向DNA的20bp间隔区/靶向序列。而gRNAtargeting sequence，也即sgRNA靶向序列，即PAM序列之前的20个碱基，扮演着crRNA的作用。该序列被克隆到gRNA表达质粒中，但不包括PAM序列或gRNA scaffold序列。
此外，基于CRISPR-Cas9的基因组编辑方法也可以通过对供体DNA(donor DNA)的设计实现对基因组进行无痕编辑，从而避免引入抗性基因等筛选标记物。因此，基于CRISPR-Cas9的基因组编辑系统具有精确、高效和易操作的特点，可以为工程菌株的构建和筛选提供有利帮助。
当然，Cas蛋白在识别基因组靶点时也要求在靶点位置附近存在原间隔序列相邻基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)，这一定程度上限制了靶点的任意性。常用的化脓性链球菌(Streptococcous pyrogenes)来源的Cas9(SpCas9)要求的PAM序列为NGG，这使得在基因组中平均每8bp就可以找到一个SpCas9的靶位。目前，CRISPR-Cas9及其衍生系统已经被广泛应用于包括动植物、酵母和丝状真菌等真核生物，此外该基因编辑系统在原核生物中的应用也在逐步被拓宽，其应用范围几乎渗透了整个中心法则的相关过程。
酿酒酵母是最早应用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的微生物之一，利用固有的同源重组机制，CRISPR-Cas9介导的多个靶点的高效无标记编辑在酿酒酵母中是可能的。除基因敲除/敲入外，CRISPR-Cas9也能在酿酒酵母中实现点突变，启动子替换和染色体融合(Chromosome Fusion)与裂分(Chromosome Spliting)等操作。除了实验室菌株以外，针对CRISPR-Cas9系统在工业酿酒酵母菌株基因组编辑方面的应用也进行了较多优化。
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)是生物技术科学领域非常重要的非酿酒酵母之一，在食品行业中拥有长时间的安全应用历史，是一种生物安全菌株。同时，乳酸克鲁维酵母具有优良的工业规模化生产酶的能力，此外许多药用相关蛋白已在乳酸克鲁维酵母中成功表达，比如哺乳动物蛋白白介素1-P、干扰素α、β-乳球蛋白、溶菌酶和胰岛素前体等。尽管采用常规的基因工程手段也能对乳酸克鲁维酵母菌株进行工程改造，但具有效率低、耗时长、且筛选标记无法循环利用等缺点，因此优化可实现对乳酸克鲁维酵母进行无痕编辑的基于的基因组CRISPR-Cas9编辑方法在基础及应用科学研究方面具有重要意义。
为了在酵母菌株中实现基因编辑，需要在同一细胞中同时表达Cas9蛋白和针对靶基因设计的相应sgRNA。在酵母细胞中，Cas9蛋白和sgRNA通常可以通过质粒来实现共表达。尽管只需要替换sgRNA中约20bp的靶向序列，就可以实现对不同基因位点的精确编辑。然而，用于酵母细胞的CRISPR-Cas9表达质粒中最常用的sgRNA表达盒中通常需要采用可被RNA聚合酶III识别的启动子(如SNR52)和终止子(如SUP4)，使得整个sgRNA表达盒的序列长度超过400bp，因此替换位于启动子和终止子中的20bp靶向序列存在一定的困难，这也阻碍了CRISPR-Cas9基因组编辑方法在酵母中细胞的应用。
大多数早期的研究使用基于PCR的方法进行sgRNA表达载体的装配，如两步重叠式聚合酶链反应、Gibson Assembly或Fast-Cloning等方法。然而，这些方法要求在组装之前通过PCR步骤来获得整个载体骨架，由于大部分用于酵母的质粒通常超过5000bp，因此增加了基因突变的风险和对昂贵的高保真DNA聚合酶的依赖，同时PCR反应使用的长引物也使PCR过程存在一定的困难，此外PCR过程也是一个比较耗时耗能的过程。许多其他的研究则选择合成整个sgRNA表达盒，并通过基于酶切-连接或Golden-Gate的方法插入质粒中，这大大提高了sgRNA表达载体组装的成本，并且合成较长的表达盒也需要更长的时间。上述方法大多费时费力、成本高昂，而且还存在较高的引入突变的风险，因此有必要开发更加快速高效的sgRNA表达载体组装方法。
发明内容
本发明提供一种用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统、相应的改造方法、构建载体的方法以及基因编辑方法，以使得优化的质粒系统提高了该系统在菌株的基因编辑中的工作效率和经济性，特别是适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
为此，本发明提供了以下的技术方案：
本发明提供一种用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统，其特征在于，包括：Cas9表达盒和gRNA表达盒，其中，所述优化的质粒系统的酶切位点为两个，所述两个酶切位点分别位于sgRNA的靶向序列的两个连接位点。
本发明提供的优化的质粒系统，还具有以下的特征：两个所述酶切位点相同，优选地，均为BsaI酶切位点，更优选地，两个所述酶切位点为背靠背设置的两个酶切位点，以能在经BsaI消化处理后保留KlSNR52启动子反义链5’端和sgRNA固定序列正义5’末端的各四个碱基作为黏性末端。
本发明提供的优化的质粒系统，还具有以下的特征：所述优化的质粒系统用于酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑，优选地，用于乳酸克鲁维酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑。
本发明提供的优化的质粒系统，还具有以下的特征：所述优化的质粒系统的命名为pCasM13FR。
本发明提供的优化的质粒系统，还具有以下的特征：对质粒系统pCas9_Kl进行改造得到所述优化的质粒系统，其中，进行的所述改造包括：移除质粒系统pCas9_Kl中所有的原有BsaI酶切位点；引入两个前述的酶切位点；进一步地，所述改造还包括：
将SpCas9蛋白内第147位的天冬氨酸突变成酪氨酸，将第411位的脯氨酸突变成异亮氨酸；和/或在所述gRNA表达盒的上下游分别引入用于进行菌落PCR验证和测序的通用引物的引物结合位点，优选地，上游的引物结合位点为引物M13F(-47)和M13F的结合位点，下游的引物结合位点为引物M13R(-48)和M13R的结合位点。
本发明提供的优化的质粒系统，还具有以下的特征：所述sgRNA中待设计的序列为20nt spacer靶向序列+NGG(PAM)；进一步地，基于所述待设计的序列设计用于扩增的一对引物从5’到3’端分别为：
gRNA-F:AATC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
gRNA-R:AAAC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
其中gRNA-F与gRNA-R中的N(20)为反向互补序列，且gRNA-F的N(20)与gRNA的20ntspacer一致。
本发明还提供一种得到前述的优化的质粒系统的方法，其特征在于：对质粒系统pCas9_Kl进行改造得到所述优化的质粒系统，其中，进行的所述改造包括：移除质粒系统pCas9_Kl中所有的原有BsaI酶切位点；引入前述的酶切位点；进一步地，所述改造还包括：将SpCas9蛋白内第147位的天冬氨酸突变成酪氨酸，将第411位的脯氨酸突变成异亮氨酸；和/或在所述gRNA表达盒的上下游分别引入用于进行菌落PCR验证和测序的通用引物的引物结合位点，优选地，上游的引物结合位点为引物M13F(-47)和M13F的结合位点，下游的引物结合位点为引物M13R(-48)和M13R的结合位点。
本发明提供的得到前述的优化的质粒系统的方法，还具有如下的特征：所述sgRNA中待设计的序列为20nt spacer靶向序列+NGG(PAM)；更进一步地，基于所述待设计的序列设计用于扩增的一对引物从5’到3’端分别为：
gRNA-F:AATC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
gRNA-R:AAAC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN，
其中gRNA-F与gRNA-R中的N(20)为反向互补序列，且gRNA-F的N(20)与sgRNA的20nt spacer一致。
本发明还提供一种构建载体的方法，其特征在于：以前述的优化的质粒系统为出发载体进行构建。
本发明提供的构建载体的方法，还具有如下的特征，包括：
(1)将所述出发载体经酶切处理并纯化后得到线性载体骨架待用；
(2)根据基因编辑中预定结合的靶序列，设计靶向序列，并根据所述靶向序列设计一对24-nt引物进行退火；
(3)将(1)中的所述线性载体骨架与(2)中退火后的退火产物混合后进行连接反应；
(4)将(3)得到的所述连接产物进行转化并鉴定得到正确的质粒，即为构建的所述载体。
本发明还提供一种CRISPR-Cas9基因组的编辑方法，其特征在于：利用前述的优化的质粒系统为出发载体构建新的载体；利用所述新的载体进行基因编辑。
本发明提供的编辑方法，其特征在于：根据前述的构建载体的方法构建得到所述新的载体。
本发明提供的基因编辑方法，还具有如下的特征：
A.进行基因敲除时可设计带提前终止密码的90bp供体DNA；
B.进行基因敲除时可设计带500-1000bp同源臂的供体DNA；
C.进行基因片段插入时可设计带500-1000bp同源臂的供体DNA。
发明作用与效果
(1)对改造前后两种质粒的gRNA-Cas9共表达载体的构建方法成本进行比较，表明基于pCasM13FR和24nt引物对的载体组装相对于基于pCas9_Kl和PCR方法的载体组装方法在引物合成成本、酶的消耗成本及总耗时方面明显更少；同时由于已连接的质粒具有更高的转化效率，前者相对于后者具有更高的转化子数目、更高的转化子阳性率；由于构建过程避免使用PCR，因此具有更低的突变风险；
(2)改造后构建的载体，进行基因编辑，敲除改造的效率达93.75-100％。
附图说明
图1为pCas9_Kl质粒图谱；
图2为pCasM13FR质粒图谱；
图3为以CasM13FR(pCasM13FR)为新的出发载体构建新的gRNA-Cas9共表达载体的策略示意图；
图4为构建新的gRNA-Cas9共表达载体的大肠杆菌DH5α感受态细胞转化后的结果图；
图5为构建新的gRNA-Cas9共表达载体的验证结果图；
图6为实施例1中基因编辑敲除ADE2基因后的转化结果图；
图7为对实施例中敲除ADE2基因的验证结果图。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供的优化的质粒系统，用于CRISPR-Cas9基因组编辑，包括：Cas9表达盒和gRNA表达盒，其中，所述优化的质粒系统仅具有两个酶切位点，所述两个酶切位点分别位于sgRNA的靶向序列的两个连接位点。通过两个这种酶切位点，使得能够通过退火酶切实现靶向序列的替换，从而构建新的Cas9和gRNA供表达载体。
进一步地，两个所述酶切位点相同，优选地，均为BsaI酶切位点，更优选地，两个所述酶切位点为背靠背设置的酶切位点，也即反向的两个BsaI酶切位点。
本发明的所述优化的质粒系统，优选用于酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑，更适宜地，用于乳酸克鲁维酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑。
进一步地，本发明的所述优化的质粒系统的图谱如图2所述，命名为pCasM13FR(CasM13FR)。
具体地，本发明的上述优化的质粒系统，由对质粒系统pCas9_Kl(质粒图谱如图1所示)进行改造得到，其中，进行的所述改造包括：
(1)移除质粒系统pCas9_Kl(原出发载体)中所有的原有BsaI酶切位点，避免BsaI酶切位点对载体骨架的切割：具体地，通过点突变的方式移除，4个BsaI酶切位点突变的引物见表2。
(2)在靶向序列的两个连接位点引入两个新的酶切位点，具体地，是引入两个背靠背的BsaI酶切位点，如此，在经BsaI消化处理后可保留KlSNR52启动子反义链5’端和sgRNA的固定序列的正义5’末端的各四个碱基作为黏性末端。
进一步地，所述改造还包括以下：
(3)将SpCas9蛋白内第147位的天冬氨酸突变成酪氨酸(简称D147Y点突变)，将第411位的脯氨酸突变成异亮氨酸(简称P411I点突变)，具体地，通过两轮标准点突变流程先后实现D147Y点突变和P411I点突变，D147Y和P411I点突变所用的引物见表2。
(4)在所述gRNA表达盒的上下游分别引入用于进行菌落PCR验证和测序的通用引物的引物结合位点，优选地，上游的引物结合位点为引物M13F(-47)和M13F的结合位点，下游的引物结合位点为引物M13R(-48)和M13R的结合位点。
在一具体示例中，Cas9的表达盒包含ScRNR2启动子、Cas9的ORF(含核定位序列及His tag)及ScCYC1终止子；
gRNA表达盒包含KlSNR52启动子、20bp protospacer序列(间隔序列，也即sgRNA的靶向序列，含两个背靠背的BsaI位点)、sgRNA骨架、KlSNR52终止子。
通过上述四步构建过程并测序验证后的载体命名为CasM13FR。
以优化的质粒系统，具体地，以CasM13FR为新的出发载体构建新的gRNA-Cas9共表达载体，策略参见图3，具体步骤如下：
(1)将所述出发载体经酶切处理并纯化后得到线性载体骨架待用：
A.酶切体系:10×CutSmart Buffer 5μL，未酶切质粒1-2μg，BsaI 1μL，补水至50μL。
B.酶切程序:37℃，2h。
(2)设计待设计序列：为了能实现预定基因编辑，需要根据基因编辑中预定结合的靶序列设计待设计序列，也即靶向序列
+PAM序列，并根据该待设计序列设计一对24-nt引物进行退火：
在CRISPOR(tefor.net)http://crispor.tefor.net/网站上完成gRNA待设计序列的设计与筛选。设计的gRNA待设计序列为20nt spacer+NGG(PAM)，即N(20)NGG，N指任意核苷酸；
根据设计的gRNA待设计序列，设计载体构建所需的两条24nt引物，分别在其正向和反向引物的5’端添加AATC和AAAC，如下所示：
gRNA-F:AATC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
gRNA-R:AAAC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
其中gRNA-F与gRNA-R中的N(20)为反向互补序列，且gRNA-F的N(20)与gRNA的20ntspacer一致。
从引物合成公司订购设计的引物，对拿到的引物进行引物退火：
将拿到的引物稀释至10μM，向PCR管中分别加入gRNA-F和gRNA-R各10μL，混合后离心至管底，按以下程序进行退火得到退火产物：
95℃,3min；72℃,30s；65℃,2min；60℃,2min；55℃,2min；50℃,2min；16℃,hold。
(3)将(1)中的所述线性载体骨架与(2)中退火后的退火产物混合后进行以下连接反应：
A.反应体系：10×Buffer 1μL，将酶切后得到的质粒20-50ng，退火产物1μL，T4DNA连接酶0.2μL，加水至10μL。
B.反应程序：16℃,60min。
(4)将(3)得到的所述连接产物进行转化并鉴定得到正确的质粒，即为构建的所述载体，具体地：
1)转化E.coli：
取商品化E.coli DH5α/Top10感受态细胞30-50μL，加入所有连接产物后混匀，按说明书要求完成转化过程。在含50mg/L卡纳霉素的LB平板上筛选，过夜培养。
3)菌落PCR鉴定：
A.引物：M13F(-47)+gRNA-R；
B.反应体系：10μL反应体系(1μL 10×Buffer，正反向引物各0.4μL，dNTP 1μL，TaqDNA聚合酶0.1μL，蘸取单菌落作为模板DNA供体，加ddH2O补足体积至10μL)；
C.反应程序：95℃ 5min；95℃ 20s，55-65℃ 20s，72℃ 30s，25-35cycle；72℃,5min；16℃,hold；
D.实验方法：挑取单菌落用于在反应体系吹打后将枪头打入加入了500μL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基的离心管或多孔板中，37℃条件下培养。做好标记。
3)单菌落送测序：
选取PCR产物条带大小在～500bp且较亮的单菌落的培养物用于测序，测序确认正确的菌落可以用于后续质粒提取和菌株转化过程。
另外，基于新的质粒系统构建的载体进行基因编辑时，可以如下：
A.进行基因敲除时可设计带提前终止密码的90bp供体DNA，此方法旨在引入提前终止的密码子，干扰蛋白质的翻译过程，进而实现基因失活；此方法具有设计简单、流程少、操作方便、省时省力和对基因组改变小等优点；
B.进行基因敲除时可设计带500-1000bp同源臂的供体DNA，此方法可去除部分或全部的基因编码序列，实现基因敲除的目的，具有阳性效率高等优点，该方法是目前比较通用的基因敲除手段；
C.进行基因片段插入时可设计带500-1000bp同源臂的供体DNA。
实施例1
本实施例，以K.lactis菌株中ADE2编码基因KLLA0_E02685g的敲除为例，进行说明。
1.引物设计：
按前文所述方法设计了Kl_ADE2敲除的gRNA待设计序列，并设计了其对应的一对24nt引物如下(另见表2)：
Kl_ADE2-gF：AATCGGGTAGAGTGAATTCCCTGG
Kl_ADE2-gR：AAACCCAGGGAATTCACTCTACCC
2.按前文所述的构建方法，用新的出发载体构建组装了用于Kl_ADE2敲除的gRNA-Cas9共表达载体，也即新的载体：
如图4中大肠杆菌DH5α感受态细胞转化后的平板所示，新的载体构建方法可以获得较高的转化效率。
进一步以M13F(-47)和Kl_ADE2-gR为引物随机挑取8个单菌落进行了菌落PCR验证，验证结果如图5所示，所有的样品都得到了对应的单一条带，进一步以通用引物M13F对上述单菌落提取的质粒进行了测序，新合成的质粒序列与设计序列完全一致，表明该方法具有极高的准确率。提取质粒后测定浓度冻存于-20℃备用。
3.Kl_ADE2敲除的所需的线性DNA Donor通过Overlap PCR方法来制备，设计的引物如下(另见表2)：
Kl_ADE2-p1：
ACGATACATATATCTCGGCTACCTTC；
Kl_ADE2-p2：
AAGGGTTTTCTGACGTTGTCTTAGTGAAGAAGGTGAACGTKl_ADE2-p3：
TCACTAAGACAACGTCAGAAAACCCTTTATATCGTGTATAAT C；
Kl_ADE2-p4：
TGTGTATGGATGAGATATCCACCGA。
进一步通过两步法Overlap PCR获得线性DNA Donor：
1)分别以p1+p2和p3+p4为引物，以K.lactis基因组DNA为模板扩增得到PCR产物；
反应条件如下：
A.反应体系体积：10μL反应体系(1μL 10×Buffer，正反向引物各0.4μL，dNTP 1μL，高保真DNA聚合酶0.1μL，模板DNA约50ng，加ddH2O补足体积至10μL)
B.反应程序：95℃ 3min；95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，25-35cycle；72℃,5min；16℃,hold.
2)以p1+p4为引物，以上一步反应获得的PCR产物为模板扩增得到PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳确认反应的特异性，反应条件同上；
3)以p1+p4为引物，以上一步反应的特异性产物为模板进行PCR反应，扩大反应体系至200-400μL；
4)采用PCR产物纯化试剂盒纯化上步PCR反应产物，测定浓度后冻存于-20℃备用。
4.采用电转化法转化K.lactis感受态细胞
1)感受态细胞用量：约107个细胞；
2)gRNA-Cas9质粒用量：100-500ng；
3)Donor DNA用量：500-2000ng；
4)击穿电压：1.5kV；
5)筛选平板：含250μg/mL G418的YPD固体培养基。
5.K.lactis转化子鉴定
转化菌株在筛选平板上生长2-3天后可获得肉眼可见单菌落，所有长出的菌落均呈粉红色(图6)，与ADE2基因敲除后对应的性状一致，表明大部分菌落都发生了有效编辑。如图7所示，随机挑取48个单菌提取基因组DNA作为模板，并以Kl_ADE2-vF(TGCACGTGACAGCGAGTTTG)和Kl_ADE2-vR(GGTCGTATCTGCAAGCCTAAGTG)为引物进行了PCR鉴定，其中45个单菌落有明显的与预期一致的条带，另外3个也在对应位置出现了微弱的条带，表明使用新的质粒和对应的方法对K.lactis进行ADE2敲除改造的效率达93.75-100％。
另外，基于pCas9_Kl质粒和PCR方法进行了K.lactis菌株中ADE2编码基因KLLA0_E02685g的敲除，并将对两种gRNA-Cas9共表达载体的组装方法成本进行了如表1的比较，表明基于CasM13FR和24nt引物对的载体组装相对于基于pCas9_Kl和PCR方法的载体组装方法在引物合成成本、酶的消耗成本及总耗时方面明显更少；同时前者相对于后者具有更高的转化子数目、更高的转化子阳性率和更低的突变风险。
并且，基于pCas9_Kl质粒共表达后进行基因编辑的敲除改造结果显示，ADE2敲除改造的效率达，小于使用新的质粒和对应的方法对K.lactis进行ADE2敲除改造的效率(93.75-100％)。
表1两种gRNA-Cas9共表达载体的组装方法成本比较
实施例2
对原pCas9_Kl(pKlCas9)质粒系统，采用PCR方法进行大肠杆菌转化效率，与本发明的实施例1的新系统以及新构建方法做对比：
一、pKlCas9+PCR方法：
以pKlCas9为模板DNA，采用引物ade2pcr-gF1(AATCAGGCGCTGGTATCTTTGGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC)和
引物ade2pcr-gF1
(AAACCACCAAAGATACCAGCGCCTGATTCGAACTGCCGAGAAAGTAAC)在50μLSuperFidelity DNA Polymerase反应体系中按下列程序进行反应：
(1)95℃，3min；
(2)95℃，20s
(3)60℃，20s
(4)72℃，5min
(5)72℃,5min
(6)16℃,hold
(7)PCR产物50μL DpnI反应体系中于37℃反应1h；
(8)将经DpnI处理的全部PCR产物用于转化商业化DH5α感受态细胞，在含50μg/mL卡纳霉素的LB平板上进行筛选。
其中，(2)-(4)循环35次；
二、pCASMFR+新方法：
将10μL引物ade2-gF1(AATCAGGCGCTGGTATCTTTGGTG)与10μL引物ade2-gR1(AAACCACCAAAGATACCAGCGCCT)混合后退火；
取退火后的引物混合物0.5μL与10ng经BsaI处理的pCASMFR在10μL T4 DNAligase连接体系中与16℃连接反应30-60min；
全部连接产物用于转化商业化DH5α感受态细胞，在含50μg/mL卡纳霉素的LB平板上进行筛选。
根据对比，pCASMFR+新方法获得的转化子数目相比pKlCas9+PCR得到的高出2-3个数量级。
(3)用PCR方法+pKlCas9构建的gRNA_Cas9表达载体(旧方法+旧载体)，与实施例1的新方法+pCASMFR构建的gRNA_Cas9(实施例1的新方法+新载体)，用于乳酸克鲁维酵母KlADE2基因敲除转化的进行对比：
除使用的gRNA_Cas9载体不同以外，其他操作条件均相同。为方便区分阳性转化子和阴性转化子，以KlADE2基因敲除作为测试实验，阳性转化子呈粉色，阴性转化子呈白色。结果表明，采用新载体+新方法获得的阳性转化子数目略优于旧载体+旧方法。
本实施例，本文前述提及的引物序列，汇总如表2所示。
*小写字母代表的碱基为突变后的碱基。
pCas9_Kl质粒全序列为SEQ ID NO:27：
ACCGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCTGTGCTTCATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAG
AACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAAT
CTATACTTCTTTTTTGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTA
TTTTTCTAACAAAGCATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGC
GCTCTATAATGCAGTCTCTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCG
TTAAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCAT
AAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCG
AAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATA
TTCTATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAAGTG
ATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTT
CTTCTATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTT
TCGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTT
TTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATAAAAAATGTAG
AGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGGATGG
GTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGAT
ACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGT
AGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGT
CTTCAGAGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTAT
ACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAAGCG
TTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCTGCGC
ACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTGCC
TGTATATATATATACATGAGAAGAACGGCATAGTGCGTGTTTATG
CTTAAATGCAATAAAACAAGGGCGTACAATAAGCTACCGCACCT
TGCTATTTCGGGCAACACCAAGGCATAGAATCCGTTGGTTTGGA
TGTGTTCTCACTTCGTTGGTTCTGCCCTACCCGATAAGTTAGAG
AAATGATGTATAGTGATGATATAGGGGAGACCAAAATGAGGGAA
AGAGGGAAATCGTTATGAACGAAACCAGGGTAACAATGAGCGA
TGACCACGTCTCCCAAGGTTGTCGTTTTAGGATATTGAACCAGG
AAATGCTAGAGGCTGGAATGGCGTAATGGAACCGTGCACTGTG
GTCGAAGGGGATGTTTATTCTTGCAGTTTGGGAAACGTCTCGTG
ATAGGCTCTCACAACATAACGGGCAAACGCCTCTAAGAAATACC
TTGCTTCTTATTAACCCCCAGTAGCTTAGTGGGCGGACCAGGCG
GTCTGCGCGAATTGCCAGAAAACCGAAGTTGTGACAAATAAAA
AAAAGTTACTTTCTCGGCAGTTCGAATCctacaccaggcggaataagtGTT
TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATC
AACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTATTTTTTG
TCACTATTGTTATGTAAAATGCCACCTCTGACAGTATGGAACGC
AAACTTCTGTCTAGTGGATATAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTG
CCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCA
GAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCAT
GATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTAT
AATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGC
AAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACG
CTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTG
TAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTT
TCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATC
ACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGT
TTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGG
GTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAA
TCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTG
AAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGAT
GGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCA
TCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCA
CTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATAT
CCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCT
GCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAG
CGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATA
ACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGC
TGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGC
CATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTG
ATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATG
TTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATC
CTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACG
GCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTG
CAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACA
ATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTT
TTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTAT
ATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGT
GCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGT
CGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTC
GAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATGTCGACAGTCGAACAA
GAAGCAGGCAAAGTTTAGAGCACTGCCCCTCCGCACTCAAAAA
AGAAAAAACTAGGAGGAAAATAAAATTCTCAACCACACAAAC
ACATAAACACATACAAATACAAATACAAGCTTATTTACTTGACAT
CGCGCGATCTTCCACTATTCAGCGCCGTCCGCCCTCTCTCGTGT
TTTTTGTTTACGCGACAACTATGCGAAATCCGGAGCAACGGGCA
ACCGTTTGGGGAAAGACCACACCCACGCGCGATCGCCATGGCA
ACGAGGTCGCACACGCCCCACACCCAGACCTCCCTGCGAGCGG
GCATGGGTACAATGTCCCCGTTGCCACAGACACCACTTCGTAGC
ACAGCGCAGAGCGTAGCGTGTTGTTGCTGCTGACAAAAGAAAA
TTTTTCTTAGCAAAGCAAAGGAGGGGAAGCACGGGCAGATAGC
ACCGTACCATACCCTTGGAAACTCGAAATGAACGAAGCAGGAA
ATGAGAGAATGAGAGTTTTGTAGGTATATATAGCGGTAGTGTTTG
CGCGTTACCATCATCTTCTGGATCTATCTATTGTTCTTTTCCTCAT
CACTTTCCCCTTTTTCGCTCTTCTTCTTGTCTTTTATTTCTTTCTT
TTTTTTAATTGTTCCCTCGATTGGCTATCTACCAAAGAATCCAAA
CTTAATACACGTATTTATTTGTCCAATTACCATGGACAAGAAGTA
CTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGTTGGGCCG
TCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGT
TCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTG
GCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCG
GCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAAT
CGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAA
GGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGG
TGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAA
TATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATAT
ATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGA
CTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCG
GGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGC
GATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCA
GCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCC
AAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCG
AAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCC
TGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAAC
TTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACT
GAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCC
AGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAA
CCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACA
CGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCG
CTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTG
TCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGA
TCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCA
AGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAA
AATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGA
AGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATC
CCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGC
GGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAA
GATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCC
CCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAAT
CAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGA
TAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACT
TTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCT
CTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGT
CAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCT
GGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGA
ACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAA
AAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAG
GATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAA
AATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAG
GACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGA
TAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCT
TCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATAC
AGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGA
GAtAAGCAGtcTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGAT
GGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTC
TCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGC
CAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTA
GCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGT
GGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAAT
ATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGG
GACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGG
GTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGT
TGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTAC
CTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACA
TCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAG
TCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGA
TCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAG
AAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAA
CGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAG
GCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCA
TCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGT
GGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAA
AATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTC
TAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGG
TGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTG
AATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCT
TGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAG
GAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACC
GCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACC
GAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTA
TCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGG
GTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCA
GGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTC
TCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGA
TCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATT
CGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAG
TGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAAC
TGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAA
CCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAA
AAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCT
TGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTG
CAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTT
CTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCG
AAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACA
CTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAA
GAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCT
TACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAA
ACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCA
GCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACA
CCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTC
AATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCG
GTGGAGACGGTGGAGGGCCAAAAAAGAAAAGAAAAGTTGAA
GATGCTTCTGCTCATCATCACCATCACCATCACCATTAAATCCGC
TCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTC
CCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTAT
ATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATG
TAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCT
CGAAGCCGCGGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCGCGGCCG
CCTTATAGCCTCAGGGGGTGAAACACTCCTTCTGGGCTCAAGTG
ACTTTTTGAAATTTCAGCTGAGCCTCAGGTGAGTGAAAGCGCT
CTCAAGACTCAGGTGATGTTTTATAATTCCGGCTGAGCCTCAAG
CGACTTTTTTAAATTTCACTTCAGCCCCAAGAGAGAATTCGCGC
TGCTGAGCCTCAAAAGCGTAAACCACCCCCTGAGCTCAGGGGG
ACTGTTTTTTTGCATATTTCAACACGACATGGGCATTTTGGTTAT
TGGATGTAGAATGGTTGAATAAACGTGATTGTAAAATAGAGTTT
GTAACTACGAATAATTAGTTTTTGAGAAGTTTGGTGAATTTAATA
TTTGTATGAGGAAAGTAAATTTTAATACCTAAATAAACAAAAATA
TATGGTGACGTCGGATCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGC
TGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAA
AATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTAT
AAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCT
CCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCT
CCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGT
ATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTG
CACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAA
CTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCAC
TGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGT
AGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGC
TACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCC
AGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAA
CAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGC
AGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCT。
pCasM13FR质粒全序列为SEQ ID NO:28：
ACCGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCTGTGCTTCATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAATCTATACTTCTTTTTTGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTA
TTTTTCTAACAAAGCATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGC
GCTCTATAATGCAGTCTCTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCG
TTAAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCAT
AAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCG
AAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATA
TTCTATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAAGTG
ATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTT
CTTCTATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTT
TCGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTT
TTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATAAAAAATGTAG
AGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGGATGG
GTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGAT
ACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGT
AGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGT
CTTCAGAGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTAT
ACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAAGCG
TTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCTGCGC
ACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTGCC
TGTCGCCAGGGTTTtcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtCATGAGAA
GAACGGCATAGTGCGTGTTTATGCTTAAATGCAATAAAACAAGG
GCGTACAATAAGCTACCGCACCTTGCTATTTCGGGCAACACCAA
GGCATAGAATCCGTTGGTTTGGATGTGTTCTCACTTCGTTGGTTC
TGCCCTACCCGATAAGTTAGAGAAATGATGTATAGTGATGATATA
GGGGAGAgCAAAATGAGGGAAAGAGGGAAATCGTTATGAACG
AAACCAGGGTAACAATGAGCGATGACCACGTCTCCCAAGGTTG
TCGTTTTAGGATATTGAACCAGGAAATGCTAGAGGCTGGAATGG
CGTAATGGAACCGTGCACTGTGGTCGAAGGGGATGTTTATTCTT
GCAGTTTGGGAAACGTCTCGTGATAGGCTCTCACAACATAACG
GGCAAACGCCTCTAAGAAATACCTTGCTTCTTATTAACCCCCAG
TAGCTTAGTGGGCGGACCAGGCGGTCTGCGCGAATTGCCAGAA
AACCGAAGTTGTGACAAATAAAAAAAAGTTACTTTCTCGGCAG
TTCGAATCcgagaccagtgcataggtctctGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA
GTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACC
GAGTCGGTGCTTTTTTTATTTTTTGTCACTATTGTTATGTAAAATG
CCACCTCTGACAGTATGGAACGCAAACTTCTGTCTAGTGGATAT
AGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGgtcatagctgtttcctgtgtgaaatt
gttatccgctGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGA
CGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTT
AGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGA
TGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAG
ACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATT
GTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGAT
TTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTG
CTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATG
GGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCA
ACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATG
TCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCC
GATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTG
CCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACG
GAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCT
GATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGC
ATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGT
TGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTG
TTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTC
AGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGAT
TTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGA
AAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC
ACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGG
AAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGA
CCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGT
TTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTG
ATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATG
AGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAA
GAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTT
AATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCAT
CTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCG
TCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGAT
ACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACC
CTTAATGTCGACAGTCGAACAAGAAGCAGGCAAAGTTTAGAGC
ACTGCCCCTCCGCACTCAAAAAAGAAAAAACTAGGAGGAAAAT
AAAATTCTCAACCACACAAACACATAAACACATACAAATACAAA
TACAAGCTTATTTACTTGACATCGCGCGATCTTCCACTATTCAGC
GCCGTCCGCCCTCTCTCGTGTTTTTTGTTTACGCGACAACTATGC
GAAATCCGGAGCAACGGGCAACCGTTTGGGGAAAGACCACAC
CCACGCGCGATCGCCATGGCAACGAGGTCGCACACGCCCCACA
CCCAGACCTCCCTGCGAGCGGGCATGGGTACAATGTCCCCGTT
GCCACAGACACCACTTCGTAGCACAGCGCAGAGCGTAGCGTGT
TGTTGCTGCTGACAAAAGAAAATTTTTCTTAGCAAAGCAAAGG
AGGGGAAGCACGGGCAGATAGCACCGTACCATACCCTTGGAAA
CTCGAAATGAACGAAGCAGGAAATGAGAGAATGAGAGTTTTGT
AGGTATATATAGCGGTAGTGTTTGCGCGTTACCATCATCTTCTGG
ATCTATCTATTGTTCTTTTCCTCATCACTTTCCCCTTTTTCGCTCT
TCTTCTTGTCTTTTATTTCTTTCTTTTTTTTAATTGTTCCCTCGATT
GGCTATCTACCAAAGAATCCAAACTTAATACACGTATTTATTTGT
CCAATTACCATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGG
CACAAACAGCGTCGGTTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAG
GTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCC
ACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCC
GGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGG
CGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGA
GATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCA
TAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCAC
GAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGT
ACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTT
GTcGACtcTACTtAcAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGC
TGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGG
GACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCC
AACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATC
AACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGC
TGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCC
TGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGT
CACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCC
GAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATG
ATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGA
CCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGA
GTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCT
GAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACT
TGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAA
GTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCG
GATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTT
ATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGC
TGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCAC
TTTCGACAATGGAAGCATCattCACCAGATTCACCTGGGCGAACT
GCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGA
AAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGAT
ACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCG
CGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAaACtATCACTCCCTGGAAC
TTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCAT
CGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAG
GTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTAT
AACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGA
AAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGG
ACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCT
CAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTG
AAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAAC
GTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGG
ACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCAC
CCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGA
AAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTC
AAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAAC
TGATCAATGGGATCCGAGAtAAGCAGtcTGGAAAGACAATCCTG
GATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCA
GTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGA
AAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACAT
CGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGC
AGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAG
GCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACC
AAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGA
AGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCT
TAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAG
CTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGA
TCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATC
ATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATA
AAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAA
CGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGG
CGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCG
ATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGAT
AAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGA
TCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACAC
CAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTT
ATTACTtTGAAGTCTAAGtTGGTtTCAGATTTCAGAAAGGACTTTC
AGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCAT
GATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAA
ATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGT
GTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATA
GGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAAT
TTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGA
AGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCG
TGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCT
GTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAG
ACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACA
GCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGA
AATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTG
GTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAA
AGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAA
GCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATA
TAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACT
CTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAG
TGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCT
AAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTC
AAAGGtTCTCCaGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGA
ACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGC
GAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAA
GGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGG
AGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTG
GGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACA
GAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACT
GATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACC
TCTCTCAGCTCGGTGGAGACGGTGGAGGGCCAAAAAAGAAAA
GAAAAGTTGAAGATGCTTCTGCTCATCATCACCATCACCATCAC
CATTAAATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCT
GAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAA
GAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACG
CGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGG
TTTTGGGACGCTCGAAGCCGCGGTGAGCAAAAGGCCAGCAAA
AGGCCGCGGCCGCCTTATAGCCTCAGGGGGTGAAACACTCCTT
CTGGGCTCAAGTGACTTTTTGAAATTTCAGCTGAGCCTCAGGTG
AGTGAAAGCGCTCTCAAGACTCAGGTGATGTTTTATAATTCCGG
CTGAGCCTCAAGCGACTTTTTTAAATTTCACTTCAGCCCCAAGA
GAGAATTCGCGCTGCTGAGCCTCAAAAGCGTAAACCACCCCCT
GAGCTCAGGGGGACTGTTTTTTTGCATATTTCAACACGACATGG
GCATTTTGGTTATTGGATGTAGAATGGTTGAATAAACGTGATTGT
AAAATAGAGTTTGTAACTACGAATAATTAGTTTTTGAGAAGTTT
GGTGAATTTAATATTTGTATGAGGAAAGTAAATTTTAATACCTAA
ATAAACAAAAATATATGGTGACGTCGGATCCAGGAACCGTAAAA
AGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGAC
GAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAAC
CCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTC
CCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC
TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGC
TCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAA
GCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGC
GCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACA
CGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGC
AGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGT
GGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGC
GCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCT
CTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTT
GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCT。
pCasM13FR质粒各个组成部分的序列如表3所示：
Cas9的表达盒包含ScRNR2启动子、Cas9的ORF(含核定位序列及His tag)及ScCYC1终止子；
gRNA表达盒包含KlSNR52启动子、20bp protospacer序列(含两个背靠背的BsaI位点)、sgRNA骨架、KlSNR52终止子。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
Claims (13)
1.一种用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统，其特征在于，包括：
Cas9表达盒和gRNA表达盒，
其中，所述优化的质粒系统的酶切位点为两个，两个所述酶切位点分别位于sgRNA的靶向序列的两个连接位点。
2.根据权利要求1所述的优化的质粒系统，其特征在于：
两个所述酶切位点相同，优选地，均为BsaI酶切位点，更优选地，两个所述酶切位点为背靠背设置的两个酶切位点，以能在经BsaI消化处理后保留KlSNR52启动子反义链5’端和sgRNA固定序列正义5’末端的各四个碱基作为黏性末端。
3.根据权利要求1所述的优化的质粒系统，其特征在于：
所述优化的质粒系统用于酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑，优
选地，用于乳酸克鲁维酵母的CRISPR-Cas9基因组编辑。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的优化的质粒系统，其特征在于：
所述优化的质粒系统的命名为pCasM13FR。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的优化的质粒系统，其特征在于：
对质粒系统pCas9_Kl进行改造得到所述优化的质粒系统，
其中，进行的所述改造包括：
移除质粒系统pCas9_Kl中所有的原有BsaI酶切位点；
引入两个权利要求1或2所述的酶切位点；
进一步地，所述改造还包括：
将SpCas9蛋白内第147位的天冬氨酸突变成酪氨酸，将第411位的脯氨酸突变成异亮氨酸；和/或
在所述gRNA表达盒的上下游分别引入用于进行菌落PCR验证和测序的通用引物的引物结合位点，优选地，上游的引物结合位点为引物M13F(-47)和M13F的结合位点，下游的引物结合位点为引物M13R(-48)和M13R的结合位点。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的优化的质粒系统，其特征在于：
所述sgRNA中待设计的序列为20nt spacer靶向序列+NGG(PAM)，；
进一步地，基于所述待设计的序列设计用于扩增的一对引物从5’到3’端分别为：
gRNA-F:AATC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
gRNA-R:AAAC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
其中gRNA-F与gRNA-R中的N(20)为反向互补序列，且gRNA-F的N(20)与gRNA的20ntspacer一致。
7.一种得到权利要求1-6任意一项所述的优化的质粒系统的方法，其特征在于：
对质粒系统pCas9_Kl进行改造得到所述优化的质粒系统，
其中，进行的所述改造包括：
移除质粒系统pCas9_Kl中所有的原有BsaI酶切位点；
引入两个权利要求1或2所述的酶切位点；
进一步地，所述改造还包括：
将SpCas9蛋白内第147位的天冬氨酸突变成酪氨酸，将第411位的脯氨酸突变成异亮氨酸；和/或
在所述gRNA表达盒的上下游分别引入用于进行菌落PCR验证和测序的通用引物的引物结合位点，优选地，上游的引物结合位点为引物M13F(-47)和M13F的结合位点，下游的引物结合位点为引物M13R(-48)和M13R的结合位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述sgRNA中待设计的序列为20nt spacer靶向序列+NGG(PAM)；
更进一步地，基于所述待设计的序列设计用于扩增的一对引物从5’到3’端分别为：
gRNA-F:AATC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN；
gRNA-R:AAAC NNNNN NNNNN NNNNN NNNNN，
其中gRNA-F与gRNA-R中的N(20)为反向互补序列，且gRNA-F的N(20)与sgRNA的20ntspacer一致。
9.一种构建载体的方法，其特征在于：
以权利要求1-6任意一项所述的优化的质粒系统为出发载体进行构建。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括：
(1)将所述出发载体经酶切处理并纯化后得到线性载体骨架待用；
(2)根据基因编辑中预定结合的靶序列，设计靶向序列，并根据所述靶向序列设计一对24-nt引物进行退火；
(3)将(1)中的所述线性载体骨架与(2)中退火后的退火产物混合后进行连接反应；
(4)将(3)得到的所述连接产物进行转化并鉴定得到正确的质粒，即为构建的所述载体。
11.一种CRISPR-Cas9基因组的编辑方法，其特征在于：
利用权利要求1-6任意一项所述的优化的质粒系统为出发载体构建新的载体；
利用所述新的载体进行基因编辑。
12.根据权利要求11所述的编辑方法，其特征在于：
根据权利要求10所述的方法构建得到所述新的载体。
13.根据权利要求11或12所述的基因编辑方法，其特征在于：
A.进行基因敲除时可设计带提前终止密码的90bp供体DNA；
B.进行基因敲除时可设计带500-1000bp同源臂的供体DNA；
C.进行基因片段插入时可设计带500-1000bp同源臂的供体DNA。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022115286538 | 2022-11-30 | ||
| CN202211528653 | 2022-11-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118109498A true CN118109498A (zh) | 2024-05-31 |
Family
ID=91211125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311602364.2A Pending CN118109498A (zh) | 2022-11-30 | 2023-11-28 | 用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118109498A (zh) |
-
2023
- 2023-11-28 CN CN202311602364.2A patent/CN118109498A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110747187B (zh) | 识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白、植物基因组定向编辑载体及方法 | |
| Xing et al. | A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants | |
| CN110358767B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用 | |
| CN105821075A (zh) | 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法 | |
| CN109136248B (zh) | 多靶点编辑载体及其构建方法和应用 | |
| CN104673816A (zh) | 一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用 | |
| CN109943586B (zh) | 一种植物circRNA过表达载体及其构建方法 | |
| CN111057713A (zh) | 一种适用于埃德菌FS110的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用 | |
| CN111004813A (zh) | 一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用 | |
| CN118109498A (zh) | 用于CRISPR-Cas9基因组编辑的优化的质粒系统 | |
| CN117247959A (zh) | 一种基于基因编辑技术的dna克隆技术 | |
| CN105950613B (zh) | 一种体外快速组装非磷酸化dna片段的方法 | |
| CN110982834A (zh) | 一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用 | |
| CN115976086B (zh) | 一种细菌CRISPR-Cas9基因编辑的方法和应用 | |
| CN104404029A (zh) | 一种基于甲基化环状dna分子的突变方法 | |
| CN112501171B (zh) | 两条特异性靶向猪Pax7基因的sgRNA导向序列及应用 | |
| CN115747242B (zh) | 消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用 | |
| CN117070531B (zh) | 水稻OsWAK123基因及其编码蛋白的应用 | |
| CN117866966B (zh) | 一种槟榔u6启动子及其应用 | |
| RU2712497C1 (ru) | Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum | |
| Vilar et al. | Advances in assembling gRNA/Cas9 constructs in genome editing of plants | |
| CN116179576A (zh) | 一种非典型毕赤酵母基因编辑系统及其应用 | |
| CN115960899A (zh) | 茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用 | |
| CN115960867A (zh) | 一种提高基因编辑效率的Cas9突变体及应用 | |
| Yuan et al. | CRISPR-Cas9/Cas12a Systems for efficient genome editing and large genomic fragment deletions in Aspergillus niger |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |