JP2022512988A - 尿素サイクルタンパク質および核酸を補充するための細胞外小胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、尿素サイクル障害の治療に対する新規な治療アプローチとして操作された細胞外小胞（ＥＶ）に関する。より具体的には、本発明は、尿素サイクルタンパク質または尿素サイクルタンパク質をコードする核酸のＥＶへの装填を改善し、得られたＥＶを目的の組織および器官に標的化するための種々のタンパク質操作および核酸操作の戦略の使用に関する。

Description

本発明は、尿素サイクル障害の治療に対する新規な治療アプローチとして操作された細胞外小胞（ＥＶ）に関する。より具体的には、本発明は、尿素サイクル関連タンパク質および／または核酸の装填を改善し、得られたＥＶを目的の組織および器官に標的化するための様々なタンパク質および核酸の操作戦略の使用に関する。

尿素サイクルに関与する酵素の遺伝子異常は、窒素含有化合物である尿素の代謝異常をもたらす。変異は、尿素サイクルに関与する様々な酵素および輸送体の欠損をもたらし、尿素サイクル障害を引き起こす。尿素サイクルの酵素または輸送体のいずれかに異常がある個体は、一日最低必要量のために必要な量を超えてアミノ酸を摂取すると、生成されるアンモニアを尿素に変換できなくなる。これらの個体は、高アンモニア血症または毒性のサイクル中間体の蓄積を経験する可能性がある。

尿素サイクル障害（ＵＣＤ）は、尿素の産生に関与する酵素またはミトコンドリア輸送タンパク質の欠損によって引き起こされる代謝の遺伝的誤りであり、毒性レベルのアンモニアの血中への蓄積（高アンモニア血症）をもたらす。最も一般的な尿素サイクル障害は、
●Ｎ－アセチルグルタメートシンターゼ欠損症
●カルバモイルホスフェートシンセターゼ欠損症
●オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症
●シトルリン血症（アルギニノコハク酸シンターゼの欠損症）
●アルギニノコハク酸尿症（アルギニノコハク酸リアーゼの欠損症）
●アルギニン血症（アルギナーゼの欠損症）
●高オルニチン血症、高アンモニア血症、ホモシトルリン尿症（ＨＨＨ）症候群（ミトコンドリアオルニチン輸送体の欠損症）
●ＩＩ型シトルリン血症（アスパルテートグルタメート輸送体であるシトリンの欠損症）
●リジン尿性タンパク質不耐症（ｙ＋Ｌアミノ酸輸送体１の変異）
●オロト酸尿症（酵素ウリジンモノホスフェートシンターゼＵＭＰＳの欠損症）である。

ＵＣＤサブタイプとしては、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）のＸ連鎖変異および対応する欠損によって引き起こされるもの、ならびにアルギニノサクシネートシンセターゼ（ＡＳＳ）、カルバミルホスフェートシンセターゼ（ＣＰＳ）、アルギニノサクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ（ＡＲＧ）、Ｎ－アセチルグルタメートシンセターゼ（ＮＡＧＳ）、オルニチントランスロカーゼ（ＨＨＨ）、およびアスパルテートグルタメート輸送体（シトリン）に対応する欠損を有する常染色体劣性変異によって引き起こされるものが挙げられる。これらは稀な疾患であり、米国内の全体的な推定発症率は約３５，０００出生数に１人である。対象が、他の明らかな原因がない中で、高アンモニア血症に適合する兆候および症状を伴うアンモニア濃度＞１００μｍｏｌ／Ｌの高アンモニア事象を経験する場合にＵＣＤが疑われ、一般に遺伝子検査によって確認される。

ＡＳＡだけでなく、その他のＵＣＤも、稀な遺伝障害と考えられる。ＡＳＡは、酵素であるアルギニノサクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）の欠損または欠乏によって特徴付けられる。ＡＳＬは、２つの代謝経路、すなわち、ｉ）アンモニアを解毒する肝臓系の尿素サイクル、およびｉｉ）Ｌ－アルギニンから一酸化窒素を合成するシトルリン－一酸化窒素サイクルに重要である。ＡＳＬ欠損症患者は、出生直後または後年のいずれかに存在し、高アンモニア血症および重度の神経学的表現型を有する多臓器疾患を特徴とする。ＡＳＡは、２番目に多い尿素サイクル障害であり、目下、対症療法のみが利用可能であるため、現在、これらの患者の医学的ニーズは満たされていない。

ＵＣＤ症状の重症度およびタイミングは、欠損症の重症度に従って変化し、特異的な酵素または輸送体の欠損、および関連遺伝子の特異的変異に応じて、軽度から極度にまで及ぶ場合がある。ＵＣＤ患者は、難治性疾患を伴う早期新生児期に、または小児期のいずれかの時点で、または感染症、外傷、手術、妊娠／分娩、または食事の変化などの増悪事象の後の成人期でさえ、存在する場合がある。急性高アンモニア血症のエピソードは、いずれの年齢でも脳症のリスクを伴い、神経学的損傷をもたらし、時には致死的であるが、慢性の重篤とまではいかない高アンモニア血症でさえ、認知症をもたらす場合がある。したがって、ＵＣＤは、あらゆる年齢にわたって神経学的異常ならびに知的障害および発達障害の有意な発症と関連している。新生児発症疾患のＵＣＤ患者は、後年の患者と比較して、特に認知症および死亡の可能性が高い。

尿素サイクル障害の治療法は現在存在しないため、これは著しく満たされていない医学的ニーズを示す。尿素サイクルに関する障害の治療は、症状を管理することを目的とした生涯にわたるプロセスである。肝臓移植を検討する患者もいるが、主な疾患管理戦略は、食事によるタンパク質摂取を減らすための食事制限によるものである。アンモニア捕捉化合物による薬物治療は、ＵＣＤを治療するために広く用いられるが、治癒ではなく、単に症状を管理するに過ぎない。フェニル酪酸ナトリウムもしくはブフェニル、安息香酸ナトリウム、経口ラクツロース、およびネオスポリンは、アンモニアを捕捉するか、または結腸内の細菌によるアンモニア産生を妨げるのに役立つ可能性があるが、これらの治療は、重度の副作用を伴い、かつ比較的小さい治療域を有することが多い。多くの場合、マルチビタミン、カルシウム、および抗酸化サプリメントも処方される。

医薬品グレードのＬ－シトルリンサプリメントは、カルバモイルホスフェートシンセターゼ（ＣＰＳ）およびオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症に使用され、またＬ－アルギニンは、アルギニノサクシネートシンターゼ欠損症およびシトルリン血症の場合に使用されて、尿素サイクルの酵素を触媒し、そして最適なアンモニア除去を支持する。制酸剤は、酸逆流および胃痛など、これらの薬物の胃腸副作用を緩和するために使用されることが多い。

タンパク質生物製剤（その内、１つの重要であるが、しばしば不十分なクラスのＵＣＤ用薬物は、酵素補充治療（ＥＲＴ）である）およびＲＮＡ治療薬などのバイオ医薬品は、尿素サイクル障害を治療するためのより有効な代替手段を提供する場合がある。しかしながら、ＥＲＴは、リソソーム区画に関する酵素欠損症の治療に活性であるが、ＥＲＴが細胞内環境にアクセスすることができないため、ＵＣＤの実行可能な選択肢ではない。ｍＲＮＡは、同じ問題のうちのいくつかを抱えており、すなわち、細胞内空間へのアクセスが原形質膜によって厳しく制限されている。

エクソソームは、様々なタイプの生体分子カーゴの優れた担体であることが示されており、血液脳関門を通過すると考えられているが、治療用タンパク質および／またはｍＲＮＡをインビボ送達するためのそれらの実際の有用性はささいな問題ではなく、思慮深い小胞操作を必要とする。

核酸に基づく治療薬は、急速に臨床的有用性に近づいている。遺伝子治療、ｍＲＮＡに基づく治療薬、短いオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡに基づく治療薬は、ＲＮＡ治療薬ランドスケープ内の過剰なモダリティ内のいくつかの例にすぎない。裸核酸、典型的にはＲＮＡは、急速なクリアランス、ヌクレアーゼ活性、器官特異的分布の欠如、および細胞取り込みの低い有効性によりインビボで送達することが困難であるため、通常、特殊な送達ビヒクルが、生体活性送達を達成する手段として必須である。これは、肝臓標的および非肝臓標的、ならびにｍＲＮＡおよび遺伝子治療などの高分子量ＲＮＡ治療薬の両方の場合である。

従来技術のＥＶ装填技術は、典型的には、タンパク質または核酸（ＮＡ）のいずれかをＥＶに装填する際に非常に非効率的である。第１に、従来技術の装填システムは、タンパク質および／またはＮＡカーゴのいずれかとＥＶの可変的装填をもたらし、第２に、装填されるＥＶは、小胞当たり少数のタンパク質および／またはＮＡコピーを装填される（これらの問題に伴う欠点は、より詳細に以下で論じられる）。

従来技術の装填技術は、通常、タンパク質治療薬カーゴまたはＮＡ剤のＥＶへの外因性装填に依存する。従来、このタンパク質はＥＶとは別個に産生され、通常はエレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって、別個に産生され精製されたＥＶに装填される。この方法は、いくつかの欠点を有し、すなわち、（ｉ）ＥＶおよび治療薬カーゴを別個に産生するための商品のコストが、商品化に対しては高額になる可能性があり、（ｉｉ）外因性装填技法は、ＥＶ自体の完全性および機能に悪影響を及ぼす可能性があり、（ｉｉｉ）精製および下流処理は、多ステップの困難で労働集約型である可能性があり、また（ｉｖ）外因的に装填される複雑なタンパク質は、立体構造変化および不安定かつ／または不正確な翻訳後修飾の問題を呈し、潜在的に活性の低下につながる可能性がある。

同様に、おそらく、（ｉ）ｍＲＮＡおよび他のコードＲＮＡ分子の装填が非効率かつ可変であること、（ｉｉ）核酸がＥＶから放出されないため、従来技術によって送達されるｍＲＮＡは細胞に到達すると翻訳されないこと、および（ｉｉｉ）場合によっては、次善のＥＶ産生細胞源が使用されることがあるため、従来技術のＮＡ装填システムは、典型的には、核酸カーゴの機能的で生体活性な送達を達成しない。かかる従来技術の１つは、米国特許出願第１４／５０２，４９４号に記載される、いわゆるＴＡＭＥＬシステムである。ＴＡＭＥＬシステムは、上述の欠点の全てを抱え、さらに、このシステムが、望ましくない免疫反応を引き起こす可能性があるバクテリオファージ由来のＲＮＡ結合タンパク質に依存するという事実を抱えている。

したがって、主に、効率的な装填および送達の欠如のため、および部分的には、ＥＶの部分的な肝脾生体内分布パターンにより、肝疾患の文脈において特に問題となる免疫毒性のため、ＴＡＭＥＬシステムは、ＥＶへの装填およびその後の臨床的に関連する量の生体活性核酸の送達には適していない。

これらの可変的で低レベルの装填は、装填されるわずかな核酸がその後放出される可能性が低く、したがって生体活性ではないという事実、または実際に装填されるわずかなタンパク質が適切に翻訳後修飾されないか、もしくは活性に最適な立体構造へと適切に折り畳まれないという事実と組み合わされて、従来技術のシステムが多くの欠点を有し、かつ臨床的に関連する量の生体活性核酸または生体活性タンパク質の装填および送達に好適ではないことを意味している。本発明は、これらの重大な欠点を克服し、ＵＣＤの影響を受ける肝臓ならびに他の組織および器官への非毒性様式での生体活性治療薬の送達を可能にする。

本発明は、尿素サイクル障害の治療に対する新規な治療アプローチとして操作された細胞外小胞（ＥＶ）に関する。より具体的には、本発明は、尿素サイクルタンパク質または尿素サイクルタンパク質をコードする核酸のＥＶへの装填を改善し、得られたＥＶを、非毒性様式で、目的の組織および器官に、特にＵＣＤの影響を受ける肝臓ならびに他の組織および器官系に対して標的化するための様々なタンパク質操作および核酸操作の戦略の使用に関する。

したがって、本発明の目的は、ＥＶの操作に伴う上記で特定した問題を克服し、これらのＥＶを全く新しい分野、すなわちＵＣＤの治療に適用することである。本発明は、ＵＣＤ用のＥＶに基づく治療薬のいくつかの重要な態様、すなわち、複合体、タンパク質薬物カーゴおよび／または核酸薬物カーゴのＥＶへの充填および装填、ＥＶ自体の薬物動態の最適化、ＥＶの再生効果の利用、ならびにインビボでの薬物カーゴ（この場合、尿素サイクルタンパク質および／または尿素サイクルタンパク質をコードする核酸）の標的細胞への生体活性送達に対処する。

本発明は、新規のＥＶ操作技術を利用して、ＵＣＤを治療するのに必要な複合体、およびしばしば非常に大きな尿素サイクルタンパク質または尿素サイクルタンパク質をコードするＮＡ（ｍＲＮＡなど）を、生体活性な状態および構成で、パッケージングおよび装填することによって、これを達成する。

さらに、本発明は、ＮＡカーゴを適切な組織または器官内に装填および放出するために新規のＥＶ操作技術を利用することによって、ＮＡカーゴの装填および放出に伴う問題を克服する。これは、ＥＶへの非常に効率的な装填だけでなく、当該ＮＡの効果的な放出を確実にするために、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド構築物の先進的操作によって達成される。これは、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）結合ドメインおよび少なくとも１つのＥＶ濃縮ポリペプチドを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）を提供することによって達成される。ＮＡ結合ドメインは、有利なことに、いくつかのコピーで存在する場合があり、各ＮＡカーゴ分子も、複数のコピーで存在する場合があり、どのコピーも、ＮＡ結合ドメイン用の複数の結合部位を有する。重要なことに、融合ポリペプチドの一部を形成し、かつＮＡカーゴ分子との相互作用に関与するＮＡ結合ドメインは、放出可能なＮＡ結合ドメインであり、これは、ＮＡカーゴ分子のそれらの結合が可逆的で放出可能な相互作用であることを意味する。本発明者らが認識しているように、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との結合の放出可能な性質は特に有利であり、ＥＶ産生細胞におけるＮＡカーゴ分子の過剰発現は、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との相互作用を可能にするのに十分に高い局所濃度を可能にする一方で、標的位置（標的細胞内など）のＮＡ結合分子のより低い濃度が、ＮＡ分子の効率的な放出を可能にし、その生体活性送達を可能にする。

さらに、本発明は、好適な薬物動態と再生特性との最適なバランスを提供する細胞源からの特定の分子特性を有するＥＶの予期せぬ選択およびプロファイリングだけでなく、種々のＵＣＤで治療活性を有する追加のタンパク質および核酸成分を含むＥＶを提供することも含む。本発明の発明者らは、部分的にはそれらの生体内分布パターンに起因して、また部分的にはカーゴタンパク質を最適な生体活性立体構造に維持するのに役立つ熱ショックタンパク質などのそれらの天然成分、ならびに他の再生成分のいくつかの結果として、ＥＶがＵＣＤ酵素および／または輸送体のための最適な送達ビヒクルに相当することを認識している。様々な細胞源はまた、ＵＣＤタンパク質／核酸を装填したＥＶを産生するために好ましいことが証明されており、したがって、本発明は、これらの通常治療不可能な疾患への新規アプローチを提供する。重要なことに、本発明は、完全に新規の角度からＵＣＤに取り組む問題にアプローチする。ＵＣＤは、典型的には、基質の毒性蓄積を捕捉または低減するための低分子アプローチでのみ対処される。近年、遺伝子療法を用いてこの疾患群に対処しようとする暫定的な試みがなされている。ＥＶおよびエクソソームが効率的な送達モダリティを構成することができるという予期しなかった認識は、タンパク質またはＮＡ補充治療薬カーゴのための革新的な装填および送達技術によって可能になる、本発明の重要な態様である。ＥＶはまた、ウイルス媒介遺伝子治療と併せてまたはその後に非常に好適な補完治療介入を構成する場合がある。ＥＶの良好な安全性および忍容性プロファイルは、慢性反復治療を可能にし、これは、標的器官の代謝回転が経時的にウイルス送達導入遺伝子の喪失をもたらす遺伝子治療の設定においてかなり重要であり、ＥＶ媒介性ＵＣＤ治療を使用して達成することができる当該ＮＡまたはタンパク質の補給を必要とする。

第１の態様において、したがって、本発明は、尿素サイクルタンパク質を補充するための細胞外小胞（ＥＶ）に関する。これは、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質、および／または尿素サイクルタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、典型的にはｍＲＮＡもしくはｐＤＮＡ、もしくはウイルスゲノムもしくは同様のものを装填した操作されたＥＶを使用することによって達成される。

第２の態様において、本発明はまた、尿素サイクルタンパク質に融合したＥＶタンパク質を含むポリペプチド構築物、および／または核酸（ＮＡ）結合ドメインに融合したＥＶタンパク質（互換的に、ＥＶ濃縮ポリペプチドもしくはエクソソームポリペプチドもしくはＥＶポリペプチドもしくはＥＶタンパク質もしくは同様のものと呼ばれる）を含むポリペプチド構築物に関し、このドメインは、ＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＥＶへの輸送を補助するために使用される。

第３の態様において、本発明はまた、本発明のポリペプチド構築物のうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド構築物に関し、これは本発明のポリペプチド構築物のうちの１つ以上を発現するＥＶ産生細胞を産生するために細胞へと導入されてもよい。

本発明はまた、（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物をＥＶ産生細胞に導入することと、（ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド構築物をＥＶ産生細胞内で発現することであって、それによって、ＵＣＤタンパク質としての直接発現または該ポリペプチド構築物の補助で装填されるポリヌクレオチド（ｍＲＮＡまたは任意の他のコードＲＮＡもしくはＤＮＡ分子など）からの発現のいずれかを通して、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質を含む該ＥＶを生成することと、を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のＥＶの産生方法にも関する。

本発明はまた、（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物、および／または（ｉｉ）本発明の少なくとも１つのポリペプチド構築物、および／または（ｉｉｉ）本発明の少なくとも１つのＥＶを含む細胞にも関する。

第４の態様において、本発明はまた、
（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物、および／または
（ｉｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチド構築物、および／または
（ｉｉｉ）本発明による少なくとも１つのＥＶと、
薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む医薬組成物であって、任意選択で、尿素サイクル障害の治療に使用される１つ以上の追加化合物をさらに含む医薬組成物に関する。

本発明は、１つ以上の尿素サイクル障害の治療に使用するための、本発明のＥＶおよび／または本発明の医薬組成物に関する。本発明はまた、医療で使用するため、好ましくは、１つ以上の尿素サイクル障害の治療で使用するための、（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物、（ｉｉ）本発明による少なくとも１つのポリペプチド構築物、（ｉｉｉ）本発明による少なくとも１つのＥＶ、（ｉｖ）本発明による少なくとも１つの細胞、および／または（ｖ）本発明による医薬組成物にも関する。

本発明はまた、疾患または障害の治療方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明によるＥＶを投与することを含む、方法にも関する。

本発明による融合ポリペプチド構築物を使用して、典型的にはＵＣＤタンパク質をコードするＮＡカーゴ分子を装填したＥＶの概略図。 本発明によるポリペプチド装填戦略を使用したＵＣＤタンパク質分子を装填したＥＶの概略図。 ＴＡＭＥＬ装填構築物（ＣＤ６３－ＭＳ２）と比較した、本発明の例示的構築物（ＣＤ６３－ＰＵＦ）によるレポーター核酸（ＮａｎｏＬｕｃ ｍＲＮＡ）のＥＶへの装填の比較有効性を示す棒グラフ。レポーターｍＲＮＡのエクソソームへの送達は、対照融合構築物ＣＤ６３－ＭＳ２と比較した場合、融合構築物ＣＤ６３－ＰＵＦの使用によって著しく改善される。 異なるＥＶ操作されたアプローチを使用したＥＶ媒介性タンパク質送達によるＵＣＤタンパク質のインビトロ送達を示すグラフ。操作され、修正されたＥＶは、生体活性濃度で生体活性ＵＣＤタンパク質を送達することができる。 エクソソームに装填されたＡＬＳ酵素が触媒活性であることを示すＡＳＬ操作されたエクソソームによるＥＶのフマレート産生を示す棒グラフ。 ＡＬＳ操作されたエクソソームで処理したＡＳＬノックアウトマウスの血中アンモニアレベルを示すグラフ。結果は、尿素サイクル酵素を含有するように操作されたエクソソームのインビボ送達が、アンモニアレベルを健常個体のレベルまで低減させることができることを実証する。

配列表の説明
配列番号１：Ｐｕｆ５３１タンパク質配列
配列番号２：ＰＵＦ ｍＲＮＡ ｌｏｃ／ＰＵＦｅｎｇタンパク質配列
配列番号３：ＰＵＦｘ２タンパク質配列
配列番号４：Ｃａｓ６タンパク質配列
配列番号５：Ｈｉｓアプタマータンパク質配列
配列番号６：ＴＡＴアプタマータンパク質配列
配列番号７：ヒトＡＳＬタンパク質配列

タンパク質およびポリヌクレオチドカーゴ分子の選択的設計だけでなく、生体活性ＥＶ集団のプロファイリングとも結び付いた本発明のＥＶ操作技術を使用することによって、本発明は、ＵＣＤ用のＥＶに基づく治療薬のいくつかの重要な態様に対処する。重要なことに、ＵＣＤ治療のためのＥＶ媒介送達技術の適用は、治療レベルのＵＣＤタンパク質または対応するＮＡを含むように操作され修正される場合、ＥＶがこれらの複雑な疾患、しばしば肝脳疾患に好適な送達モダリティを構成するという本発明の発明者による認識に基づくものである。選択されたＥＶ産生細胞源からのＥＶおよび特定の分子プロファイルを有するＥＶは、この疾患群における治療活性を駆動するのに特に良好に適している。本発明のＥＶの非毒性および非免疫原性は、インビボでのＵＣＤの治療活性に重要な因子である。明らかに、肝疾患に罹患している対象は、免疫毒性バクテリオファージタンパク質を含む送達ビヒクルの投与に耐えることは不可能であることになり、同様に、他の非ＥＶに基づく送達ビヒクルは、同じ問題、すなわち、すでに肝機能が損なわれている患者では肝毒性と関連付けられることになる。

便宜上および明確にするために、本明細書で使用されるある特定の用語を収集し、かつ以下に説明する。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

本発明の特徴、態様、実施形態、または代替物がマーカッシュ群に関して説明される場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群メンバーの任意の個々のメンバーまたは下位群に関しても説明されることを認識するであろう。当業者は、本発明がそれによってもまた、マーカッシュ群メンバーの個々のメンバーまたは下位群の任意の組み合わせに関しても記載されることをさらに認識するであろう。加えて、本発明の態様および／または実施形態の１つに関連して説明される実施形態および特徴は、本発明の全ての他の態様および／または実施形態にも準用されることに留意されたい。

例えば、本明細書に記載の尿素サイクルタンパク質は、例えば、かかる尿素サイクルタンパク質を含むＥＶと関連して、本明細書の他の全ての態様、教示、および実施形態、例えば、かかる尿素サイクルタンパク質を含むＥＶの産生方法に関する態様および／もしくは実施形態、または本明細書のポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチド構築物に関する態様と開示され、関連し、かつ適合性があると理解されるべきである。さらに、本明細書で特定される全てのポリペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドを融合するための従来の戦略を使用して、ポリペプチド構築物中で自由に組み合わせることができる。非限定的な例として、本明細書に記載の全ての尿素サイクルタンパク質は、任意の組み合わせで１つ以上のＥＶ濃縮ポリペプチドと自由に組み合わせてもよい。また、本明細書のあらゆる尿素サイクルタンパク質は、ポリペプチド、および／または２つ以上の尿素サイクルタンパク質を含む対応するポリヌクレオチド、構築物を生成するために、任意の他の尿素サイクルタンパク質と組み合わせてもよい。さらに、あらゆる特徴（例えば、マーカッシュ群のあらゆるメンバー）は、あらゆる他の特徴（例えば、任意の他のマーカッシュ群のあらゆるメンバー）と自由に組み合わせることができる。加えて、本明細書の教示が単数形のＥＶおよび／または別個の天然ナノ粒子様小胞としてのＥＶを指す場合、当然のことながら、全てのかかる教示は、複数のＥＶおよびＥＶの集団に同様に関連し、かつ適用可能である。一般的所見として、本発明による尿素サイクルタンパク質、ＥＶ濃縮ポリペプチド、組織標的化部分、ペプチドおよび／またはポリペプチド、ＥＶ産生細胞源、ならびに全ての他の態様、実施形態、および代替物は、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、あらゆる可能な組み合わせで自由に組み合わせられてもよい。

さらに、本発明の任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列（それぞれアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列）は、任意の所与の分子がそれに関連する所望の技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび配列から大幅に逸脱してもよい。それらの生物学的特性が維持される限り、本出願によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列は、可能な限り高い配列同一性が好ましいが（例えば、６０％、７０％、８０％、または例えば９０％以上）、天然配列と比較して最大５０％（任意の配列アラインメントまたは配列相同性ツール、例えば、ＢＬＡＳＴを使用して計算される）逸脱してもよい。例えば、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質と少なくとも１つのＥＶ濃縮ポリペプチドとの組み合わせ（融合）は、それぞれのポリペプチドのある特定のセグメントが置き換えられてもよく、かつ／または修飾されてもよく、かつ／または配列が他のアミノ酸伸長の挿入によって中断されてもよいことを暗示し、重要な特性（例えば、尿素サイクルタンパク質の天然の効果、ＥＶ搬送および濃縮、標的化特性など）が保存されている限り、天然配列からの逸脱が考慮に入れられてもよいことを意味する。したがって、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に同様の論法が当然適用される。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質に関連して本明細書で言及される全ての配列番号は、単なる例として、単なる情報と見なされ、全てのペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、当業者がそれらを理解することになるように、通常の意味を付与されるものとする。したがって、上述のように、当業者はまた、本発明が、本明細書で言及される特定の配列番号だけでなく、その変異体および誘導体も包含することも理解するであろう。本明細書で言及される全てのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドは、当業者によって理解されるように、それらの従来の意味に従って解釈されるべきである。

「細胞外小胞」または「ＥＶ」または「エクソソーム」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の形態の細胞から入手可能な任意のタイプの小胞、例えば、微小小胞（例えば、細胞の原形質膜から脱落する任意の小胞）、エクソソーム（例えば、エンド－リソソーム経路またはエクソソームを産生する任意の他の細胞経路に由来する任意の小胞）、アポトーシス体（例えば、アポトーシス細胞から入手可能）、マイクロ粒子（例えば、血小板に由来し得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球および単球から誘導可能）、プロスタトソーム（例えば、前立腺癌細胞から入手可能）、またはカルディオソーム（例えば、心臓細胞から誘導可能）などに関すると理解されたい。エクソソームおよび／または微小小胞、特にＡＲＲＤＣ１媒介性微小小胞（ＡＲＭＭ）は、特に好ましいＥＶを表すが、他のＥＶは、様々な環境でも有利である場合がある。

ＥＶは、送達または輸送ビヒクルとして作用することができる任意のタイプの脂質系構造（小胞形態を有するか、または任意の他のタイプの好適な形態を有する）であってもよい。有利なことに、ＥＶは、人工リポソームまたは人工脂質ナノ粒子ではない。

ＥＶのサイズは、大幅に変化し得るが、ＥＶは、典型的には、ナノサイズの流体力学半径、すなわち、１０００ｎｍ未満の半径を有する。エクソソームは、多くの場合、３０～３００ｎｍ、典型的には３０～２００ｎｍのサイズを有し、非常に好適なサイズ範囲である、５０～２５０ｎｍの範囲などのサイズを有する。明らかに、ＥＶは、インビボ、エクスビボ、およびインビトロの両方の任意の細胞型に由来し得る。本発明の好ましいＥＶはエクソソームおよび／または微小小胞であるが、他のＥＶも様々な環境では有利である場合がある。別の好ましい実施形態において、ＥＶは、好ましくは、羊膜由来細胞、ワルトンゼリー由来細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、および胎盤由来細胞から入手可能である。さらに、「ＥＶ」および／または「エクソソーム」および／または「微小小胞」という用語は、細胞外小胞模倣物、例えば、膜押出、超音波処理、または他の技法などを通じて得られる細胞膜に基づく小胞またはＥＶに基づく小胞に関するとも理解されるべきである。

ＥＶの医学的および科学的な使用および用途を説明する場合、当業者には、本発明は通常、複数のＥＶ、すなわち、数千、数百万、数十億、またはさらには数兆のＥＶを含み得るＥＶの集団に関することが明らかであろう。以下の実験セクションから分かるように、ＥＶは、単位体積当たり（例えば、ｍｌ当たり）１０^５、１０^８、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１８、１０^２５、１０^３０個のＥＶ（しばしば「粒子」と称される）、またはより大きい、より小さい、もしくは中間である、任意の他の数の濃度で存在し得る。同じように、例えば、ある特定の尿素サイクルタンパク質を含むＥＶに関する「集団」という用語は、かかる集団を一緒に構成する複数の実体を包含すると理解されるべきである。言い換えれば、個々のＥＶは、複数で存在する場合、ＥＶ集団を構成する。したがって、当然、本発明は、当業者に明らかであるように、個々のＥＶおよびＥＶを含む集団の両方に関する。インビボで適用される場合のＥＶの投薬量は、当然、治療される疾患、投与経路、目的の尿素サイクルタンパク質の活性および効果、ＥＶに存在する任意の標的化部分、医薬製剤などに応じて、大幅に変化し得る。

「ＥＶ濃縮ポリペプチド」、「ＥＶタンパク質」、「ＥＶポリペプチド」、「エクソソームポリペプチド」および「エクソソームタンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、かつポリペプチド構築物（典型的には、ＥＶ濃縮タンパク質に加えて、尿素サイクルタンパク質、またはＵＣＤタンパク質をコードするＮＡカーゴ分子に結合するＮＡ結合ドメインを含む）を好適な小胞構造、すなわち好適なＥＶに輸送するために利用することができる任意のポリペプチドに関すると理解されたい。より具体的には、これらの用語は、融合タンパク質構築物をＥＶなどの小胞構造に輸送、搬送、または往復することを可能にする任意のポリペプチドを含むと理解されたい。かかるエクソソームポリペプチドの例は、例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体としても知られる）およびそのエンドソーム選別ドメイン、すなわち、トランスフェリン受容体エンドソーム選別ドメイン、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８（シンデカン－１）、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、ＡＡＲＤＣ１、パルミトイル化シグナル（Ｐａｌｍ）、シンテニン（シンテニン－１としても知られる）、シンテニンのＮ末端部分、Ｌａｍｐ２ｂ、シンデカン－２、シンデカン－３、シンデカン－４、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＴＳＧ１０１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７（ＣＤ４７は、アルファ、ベータまたはデルタ位置のいずれかで融合されてもよい）、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＡＲＲＤＣ１、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、他のエクソソームポリペプチド、ならびにこれらの任意の断片、誘導体、ドメイン、または組み合わせであるが、ポリペプチド構築物をＥＶに輸送することができる多数の他のポリペプチドが、本発明の範囲内に含まれる。典型的には、本発明の多くの実施形態において、少なくとも１つのＥＶ濃縮ポリペプチドは、尿素サイクルタンパク質またはＵＣＤタンパク質をコードするＮＡに結合するＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド構築物に含まれ、この融合ポリペプチド構築物は、有利なことに、リンカー、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、多量体化ドメイン、放出ドメインなどを含む様々な他の成分も含んでもよい。有利なことに、ＵＣＤタンパク質またはＮＡ結合ドメインがその適切な立体構造に適合することを可能にするために、リンカーおよび多量体化ドメインを用いてもよく、したがって改善された生体活性を有するＵＣＤタンパク質を送達するか、または装填が困難な核酸に対して、核酸結合の改善、したがって核酸装填の改善を可能にする。

「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」もしくは「ＮＡ」もしくは「ＮＡカーゴ分子」または同様の用語は、本明細書において互換的に使用され、一本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ、およびｍＲＮＡ、プラスミドなどの他のポリヌクレオチド、または例えばウイルスゲノムなどの任意の他のＲＮＡもしくはＤＮＡベクターを含む群から選択される任意の核酸を説明するために使用されてもよい。ＮＡは、典型的には、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質をコードするが、他のペプチドまたはポリペプチドもコードしてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、ＮＡカーゴ分子の装填を補助するためにＥＶに存在する融合タンパク質を形成するため、少なくとも１つのエクソソームポリペプチドがＮＡ結合ドメインに融合する。かかる融合タンパク質はまた、それらの機能（複数可）を最適化するための様々な他の成分を含んでもよく、リンカー、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、多量体化ドメインなどを含み、これらの利点は上述の通りである。

「ＮＡ結合ドメイン」または「ＮＡ結合ポリペプチド」または「ＮＡ結合タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ヌクレオチドの伸長に結合することができる任意のドメインに関する。ＮＡ結合ドメインは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡのミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）、特定のタイプのＮＡ（ｍＲＮＡなど）、環状ＲＮＡもしくはＤＮＡ、リボザイム、ミニ環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡなどに結合してもよい。さらに、ＮＡ結合ドメイン（複数可）は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆ、２’－ＣＥ、２’－ＥＡ ２’－ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ－ＤＮＡなどの化学修飾ヌクレオチドに結合してもよい。

有利なことに、本発明は、全て真核生物の間で高度に保存され、したがって、患者に送達された場合に有害な免疫応答を引き起こす可能性が低いＮＡ結合タンパク質を使用する。さらに、本発明のＮＡ結合ドメインは、ＮＡの特定の配列、反復などのドメイン、またはステムループもしくはヘアピンなどのＮＡモチーフのいずれかにも結合してもよい。ＮＡ結合ドメインのかかる結合部位は、目的のＮＡカーゴ分子内に天然に存在する場合があり、かつ／または、ＥＶ装填および生体活性送達をさらに増強するためにＮＡカーゴ分子内へと操作されてもよい。核酸に対するＮＡ結合ドメインの結合親和性は、核酸がＥＶへ往復するのに十分な高い親和性で結合されるが、結合の親和性は、核酸が標的細胞に一旦送達されると生体活性であるように、その後の標的細胞内への核酸の放出を防止するほど高くないようなものである。したがって、重要なことに、かつ従来技術とは完全に対照的に、本発明は、放出可能なＮＡ結合ドメインの補助によりＮＡカーゴ分子を装填したＥＶに関し、該ＮＡ結合ドメインは、エクソソームポリペプチドとの融合ポリペプチドの一部を形成する。本発明のＮＡ結合ドメインは、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間のプログラム可能で修正可能な親和性を可能にするように選択されており、ＮＡ結合ドメインと少なくとも１つのＮＡカーゴ分子とを含む融合ポリペプチドを含むＥＶの産生を可能にし、融合ポリペプチド構築物のＮＡ結合ドメインは、プログラム可能で可逆的で修正可能な様式でＮＡカーゴ分子と相互作用し、ＥＶおよび／または標的細胞で、または該細胞と関連して、ＥＶへの装填およびＮＡカーゴ分子の放出の両方を可能にする。これは、単に、ＭＳ２タンパク質を使用してｍＲＮＡ分子をエクソソームに装填することを可能にするが、ＭＳ２タンパク質がｍＲＮＡに依然として結合しており、その放出およびその後の翻訳を阻害する従来技術とは完全に対照的である。

ＮＡ結合ドメインを利用する本発明の実施形態において、ＮＡ結合ドメインは、ＰＵＦタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（Ｃａｓ）、特にＣａｓ６およびＣａｓ１３、ならびに様々なタイプのＮＡ結合アプタマーから選択されてもよい。本発明は、ＰＵＦタンパク質という用語を使用して、任意の種、例えば、ＰＵＭ１の重複であるヒトＰｕｍｉｌｉｏホモログ１（ＰＵＭ１）、ＰＵＭｘ２もしくはＰＵＦｘ２など、または任意のＰＵＦ（ＰＵＭ）タンパク質から入手可能な任意のＮＡ結合ドメインに由来する全ての関連タンパク質およびかかるタンパク質のドメイン（ＰＵＭタンパク質とも称される場合がある）を包含する。ＰＵＦタンパク質は、典型的には、８つの連続したＰＵＦ反復の存在を特徴とし、該反復は各々約４０個のアミノ酸からなり、２つの関連配列であるＣｓｐ１およびＣｓｐ２に隣接することが多い。各反復は、芳香族および塩基性の残基を含有する「コアコンセンサス」を有する。ＰＵＦ反復のクラスター全体がＲＮＡ結合に必要である。注目すべきことに、この同じ領域は、タンパク質共調節因子とも相互作用し、かつＰＵＦタンパク質変異体の欠損をかなりの程度まで救済するのに十分であり、これにより、ＰＵＦタンパク質は、本発明で使用される変異に非常に適する。さらに、ＰＵＦタンパク質は、ＮＡカーゴ分子に好適な親和性で結合する放出可能なＮＡ結合ドメインの非常に好ましい例であり、それによって、ＰＵＦタンパク質のＮＡカーゴへの放出可能な可逆的結合を可能にする。ＰＵＦタンパク質は、ほとんどの真核生物で見出され、胚発生および発達に関与する。ＰＵＦは、ＲＮＡに結合する１つのドメインを有し、該ドメインは一般に３６個のアミノ酸を含有する８つの反復からなり、これは、本特許出願においてＲＮＡ結合に典型的に利用されるドメインである。各反復は、特定のヌクレオチドに結合し、通常、アミノ酸１３からのスタッキング相互作用との特異性を付与するのは１２位および１６位のアミノ酸である。天然に存在するＰＵＦは、ヌクレオチドのアデノシン、ウラシルおよびグアノシンに結合することができ、操作されたＰＵＦは、ヌクレオチドのシトシンにも結合することができる。したがって、該システムはモジュール式であり、ＰＵＦドメインが結合する８ヌクレオチド配列は、反復ドメインの結合特異性を切り替えることによって変更することができる。したがって、本発明によるＰＵＦタンパク質は、天然であってもよく、またはＲＮＡ分子内の任意の場所に結合するように操作されてもよく、あるいは、異なる配列に対して異なる結合親和性を有するＰＵＦタンパク質を選択し、該ＲＮＡ分子を操作して該配列を含有することもできる。配列特異的な様式で１６ヌクレオチドに結合する、さらに操作されたＰＵＦドメインが存在し、これを利用してＮＡカーゴ分子に対する特異性をさらに増加させることもできる。したがって、ＰＵＦドメインは、異なる親和性および配列長で任意の配列に結合するように修正することができ、これにより、本発明による任意のＲＮＡカーゴ分子に対して該システムを高度にモジュール式にし、かつ適応可能にする。本発明に従ってＮＡ結合ドメインとして使用され得るＰＵＦタンパク質ならびにその領域および誘導体には、ＰＵＦタンパク質の以下の非限定的リストが含まれる。全てＣ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のＦＢＦ、ＦＢＦ／ＰＵＦ－８／ＰＵＦ－６、－７、－１０、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＰｕｍｉｌｉｏ、全てＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰｕｆ５ｐ／Ｍｐｔ５ｐ／Ｕｔｈ４ｐ、Ｐｕｆ４ｐ／Ｙｇｌ０１４ｗｐ／Ｙｇｌ０２３ｐ、Ｐｕｆ５ｐ／Ｍｐｔ５ｐ／Ｕｔｈ４ｐ、Ｐｕｆ５ｐ／Ｍｐｔ５ｐ／Ｕｔｈ４ｐ、Ｐｕｆ３ｐ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ由来のＰｕｆＡ、ヒトＰＵＭ１（Ｐｕｍｉｌｌｏ１、時としてＰＵＦ－８Ｒとしても知られる）およびその任意のドメイン、少なくとも２つのＰＵＭ１由来のＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド、例えばＰＵＦ－６Ｒ、ＰＵＦ－９Ｒ、ＰＵＦ－１０Ｒ、ＰＵＦ－１２Ｒ、ＰＵＦ－１６Ｒなどの任意の切断または修飾ＰＵＦタンパク質、またはそれらの誘導体、ならびにＸｅｎｏｐｕｓ由来のＸ－Ｐｕｆ１。本発明による特に好適なＮＡ結合ＰＵＦは、以下を含む。ＰＵＦ５３１、ＰＵＦ ｍＲＮＡ ｌｏｃ（時として操作されたＰＵＦまたはＰＵＦｅｎｇと称される）、および／またはＰＵＦｘ２、ならびにそれらの任意の誘導体、ドメイン、および／または領域。ＰＵＦ／ＰＵＭタンパク質は、ヒト起源であるものが選択されてもよいため、非常に有利であり、これは本発明の有利な実施形態である。

ＭＳ２タンパク質などのバクテリオファージ起源のタンパク質ではなく、ヒト起源のタンパク質は、有害な免疫応答を誘発する可能性が低いため、有益である。さらに、ＭＳ２は、バクテリオファージ起源のステムループと相互作用し、これは、ＰＵＦタンパク質とは異なって、選択したＮＡ分子に原核ＮＡ配列およびモチーフを導入する必要があることを暗示する。明らかに、バクテリオファージ起源および構造のステムループ構造のこの挿入は、ｍＲＮＡ翻訳を妨げ、非機能的ｍＲＮＡカーゴ分子をもたらすか、またはさらに免疫毒性を引き起こす場合がある。

したがって、有利な実施形態において、本発明は、エクソソームタンパク質に融合した真核生物ＮＡ結合タンパク質に関する。好ましい実施形態において、ＮＡ結合ドメイン（複数可）は、タンパク質のＰＵＦファミリー、例えば、ＰＵＦ５３１、操作されたＰＵＦ、および／またはＰＵＦｘ２由来であり、これらの全ては有利にヒト起源である。重要なことに、ＰＵＦタンパク質は、好ましくは、ＰＵＦタンパク質の配列特異性に起因して、ＮＡ薬物カーゴの高度に制御された特異的装填を可能にするｍＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのＥＶ媒介性送達に使用される。好ましい実施形態において、ＰＵＦタンパク質（複数可）は、有利なことに、膜貫通型または可溶性エクソソームタンパク質のいずれかと組み合わされる。有利な融合タンパク質構築物には、以下の非限定的な例が含まれる。ＣＤ６３－ＰＵＦ５３１、ＣＤ６３－ＰＵＦｘ２、ＣＤ６３－操作されたＰＵＦ（あるいは、ＰＵＦｅｎｇまたはＰＵＦ ｍＲＮＡ ｌｏｃとして知られる）、ＣＤ８１－ＰＵＦ５３１、ＣＤ８１－ＰＵＦｘ２、ＣＤ８１－操作されたＰＵＦ、ＣＤ９－ＰＵＦ５３１、ＣＤ９－ＰＵｘ２、ＣＤ９－操作されたＰＵＦ、および好ましくは、１つ、２つ以上のＰＵＦタンパク質に融合したテトラスパニンエクソソームタンパク質に基づく他の膜貫通に基づく融合タンパク質。ＰＵＦタンパク質および少なくとも１つの可溶性エクソソームタンパク質を含む有利な融合タンパク質としては、以下の非限定的な例が挙げられる。ＣＤ６３－ＰＵＦ、シンテニン－ＰＵＦ５３１、シンテニン－ＰＵｘ２、シンテニン－操作されたＰＵＦ、シンデカン－ＰＵＦ５３１、シンデカン－ＰＵｘ２、シンデカン－操作されたＰＵＦ、Ａｌｉｘ－ＰＵＦ５３１、Ａｌｉｘ－ＰＵｘ２、Ａｌｉｘ－操作されたＰＵＦだけでなく、ＰＵＦタンパク質に融合した任意の他の可溶性エクソソームタンパク質。

ＰＵＦタンパク質が標的ＮＡカーゴ分子に対する修正可能な配列特異性を有するという事実から、それらは、エクソソームポリペプチドパートナー（複数可）に融合するための理想的なＮＡ結合ドメインになる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、ＥＶには、放出可能なＮＡ結合ドメイン（エクソソームタンパク質との融合タンパク質の一部として）を使用してＮＡカーゴ分子が装填され、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子との間の相互作用は、有利なことに標的ヌクレオチド配列に対する特異性に基づくものであり、標的ヌクレオチド二次構造に基づくものではない（二次構造が配列特異性を可能にしないため）。好ましい実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、ＮＡ結合ドメインとして選択されるＰＵＦタンパク質の標的ヌクレオチド配列を含むように操作され、かつ／または該配列を天然に含む。かかる標的ヌクレオチド配列は、上述のように、例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部であってもよく、またはｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＤＮＡなどの任意のＮＡカーゴ分子に導入されてもよく、ＰＵＦタンパク質がＮＡカーゴ分子に結合することを可能にする。ＮＡカーゴ分子のＰＵＦ結合部位は、典型的には、単に４つのヌクレオチドおよびステムループを組み合わせて認識するＭＳ２などの多くの他のＲＮＡ結合タンパク質によって結合する配列よりも長いため、標的結合部位のヌクレオチドの好ましい伸長は、ＮＡ結合ドメインの修正可能な配列特異性の必要性に応じて、例えば５つのヌクレオチド（ｎｔ）、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、または２０ｎｔ以上の長さであってさえもよい。好ましい実施形態において、ＰＵＦタンパク質は、長さが６ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１２ｎｔ、または１６ｎｔである、天然および／または人工的に存在するＮＡカーゴ分子結合部位に特異的である。

ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド（Ｃａｓ）は、ＮＡ結合ドメインの別の群を表し、特にＣａｓ６およびＣａｓ１３、ならびに任意の他のＲＮＡ結合Ｃａｓ分子を含んでもよい。Ｃａｓ６は、前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と高い親和性で結合し、後に例えばＣａｓ９へと組み込むためにそれを処理する。ＲＮＡ分子の切断速度を調節し、高度に規定することができるため、ＲＮＡ分子とＣａｓ６との会合時間も非常に正確な様式で規定することができ、これは本発明の目的に重要である。ＲＮＡ切断の効率を増減させるよう変異したＣａｓ６またはＣａｓ１３の変異型を使用してもよい。ＲＮＡ結合の親和性を増減少させるように変異したＣａｓ６またはＣａｓ１３の変異型を使用してもよい。これは、例えば、ＲＮＡカーゴ分子がレシピエント細胞で放出される場合の利点となるであろう。次いで、規定された会合時間を調節して小胞内でＲＮＡ分子を放出することができるが、産生細胞では放出しない。Ｃａｓ６が認識することができるＲＮＡ配列を、目的のＮＡ分子に挿入するように操作することができる。Ｃａｓ１３は、その規定されたＲＮＡ標的にのみ結合し、それを分解しないように操作することができる。ＳｇＲＮＡ分子の配列を変更することによって、Ｃａｓ１３－ｓｇＲＮＡ複合体を、２０～３０ヌクレオチド間の任意のＲＮＡ配列に結合するように調節することができる。さらに、ＰＵＦタンパク質の場合と同様に、Ｃａｓタンパク質は、ＮＡカーゴ分子に好適な親和性で結合する放出可能なＮＡ結合ドメインの非常に好ましい例であり、それによって、ＮＡカーゴへのＣａｓタンパク質の放出可能な可逆的な結合を可能にする。ＰＵＦに基づくＮＡ結合ドメインと同様に、Ｃａｓタンパク質は、標的ＮＡカーゴ分子に対するプログラム可能で修正可能な配列特異性を有する、放出可能で不可逆的なＮＡ結合ドメインを表し、より低い総親和性でより高い特異性を可能にし、それによって、ＮＡカーゴのＥＶへの装填、および標的位置でのＮＡカーゴの放出の両方を可能にする。

ＮＡアプタマー結合ドメインは、本発明によるＮＡ結合ドメインの別の群である。かかるＮＡアプタマー結合ドメインとは、ＮＡに基づくアプタマーが特異的に結合することができるドメイン、領域、アミノ酸の伸長、またはポリペプチドもしくはタンパク質全体である。アプタマーは、抗体のその標的抗原に対する親和性と同様に、二次および／または三次構造を形成し、分子を認識するＲＮＡ配列である。したがって、これらのＲＮＡ分子は、高い親和性で特定のアミノ酸配列を認識することができる。ＲＮＡアプタマーは、特定のアミノ酸配列を認識するために特定のヌクレオチド配列をＮＡ分子に挿入することによって本発明に適用される。かかるアミノ酸配列は、エクソソーム担体ポリペプチド内に、および／またはエクソソーム担体ポリペプチドの隣に操作され、アプタマー（ＮＡカーゴ分子に、および／またはＮＡカーゴ分子の隣に操作されている）がそれに結合することを可能にし、それによって、エクソソームポリペプチドの補助を受けて、ＮＡカーゴ分子をＥＶに往復することができる。好適な特徴を有する２つのアプタマーは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）アミノ酸の伸長に対して高い親和性を有するＨｉｓ－アプタマー、およびＨＩＶ Ｔａｔドメインに対するアプタマーである。アプタマー配列（複数可）は、好ましくは、ｍＲＮＡの３’および／もしくは５’非翻訳領域、または非コードＲＮＡの非特異的領域に挿入される。２つ以上のアプタマーを１つのＮＡカーゴ分子に組み合わせて、エクソソーム担体タンパク質に対する特異性および結合活性を増加させることもできる。重要なことに、本発明の全てのＮＡ結合ドメインは、ＮＡカーゴ分子、例えばｍＲＮＡへのプログラム可能、配列特異的、可逆的、放出可能な結合を提供し、これは、従来技術で見出されたＲＮＡへの高親和性、不可逆的結合とは完全に対照的である。本発明の好ましい実施形態において、ＮＡ結合ドメインは、それらの容易にプログラム可能な性質および配列特異性と、ＮＡカーゴ分子へのそれらの可逆的で放出可能な結合とを組み合わせたため、ＰＵＦタンパク質またはＣａｓタンパク質のいずれかである。重要なことに、ＮＡ結合ドメインとしてのＣａｓタンパク質およびＰＵＦタンパク質の配列特異性は、好ましくは標的ＮＡ分子の少なくとも６ｎｔ、好ましくは少なくとも８ｎｔとの相互作用に基づくものであり、低親和性相互作用と組み合わせると、ＮＡカーゴ分子の高生産的ＥＶ媒介性送達を可能にする。ＮＡカーゴ分子の少なくとも６ｎｔの結合部位は、好ましくは、ヌクレオチドの連続配列中に存在する。したがって、ＮＡカーゴ分子の結合部位は、長さが２つのコドンに対応することが好ましい。

「ＵＣＤタンパク質」または「尿素サイクルタンパク質」または同様の用語は、本明細書において互換的に使用され、尿素サイクルタンパク質の群に属する任意のポリペプチド、すなわち、尿素サイクルに参加する一部を形成する酵素および他のタンパク質に関すると理解されるべきである。ＵＣＤタンパク質の非限定的な例としては、Ｎ－アセチルグルタメートシンターゼ、カルバモイルホスフェートシンセターゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、カルバミルホスフェートシンセターゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノサクシネートシンセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ（アルギニノサクシネートリアーゼとしても知られる）、アルギナーゼ、ミトコンドリアオルニチン輸送体、オルニチントランスロカーゼ、シトリンなどが挙げられる。

本発明は、少なくとも１つの核酸（ＮＡ）結合ドメインおよび少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）に関し、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインは、ＰＵＦ、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、および／またはＮＡアプタマー結合ドメインのうちの１つ以上であってもよい。ＮＡ結合ドメインの存在の結果、ＥＶは、典型的にＵＣＤタンパク質をコードする少なくとも１つのＮＡカーゴ分子を典型的にさらに含む。通常、あらゆるＥＶに含まれるＮＡカーゴ分子の数は、相当な数であり、これは、通常、所与のＥＶ集団にわたって非常に低い装填効果および極めて可変的な装填を達成する従来技術よりも明らかな改善である。本発明の場合、融合ポリペプチド構築物の本発明の設計は、少なくとも１つのＮＡカーゴ分子が（融合ポリペプチドの補助を受けて）非常に効率的にＥＶ内に輸送され、有意に改善された放出プロセスが続くことを意味する。ＮＡ結合ドメイン（融合ポリペプチドに含まれる）とＮＡカーゴ分子との結合の放出可能な性質は、標的細胞内および／または標的細胞付近での生体活性ＮＡ分子の送達を可能にしながら、ＥＶ産生細胞（ＮＡカーゴ分子が通常過剰発現する）におけるＮＡカーゴ分子の結合を可能にするため、本発明の重要な態様である。

したがって、従来技術と違って、ＮＡ結合ドメインとＮＡカーゴ分子とのプログラム可能な、より低い親和性の相互作用により、本発明は、ＥＶ産生細胞でＥＶを効率的に装填することが可能になり、一方でＮＡカーゴ分子とＮＡ結合ドメインとの相互作用のより低い親和性および放出可能な性質が非常に有利である好適な場所（典型的には標的細胞内）で、ＮＡカーゴの放出も可能になる。さらに、ＭＳ２を単に４ｎｔおよびステムループに結合する高親和性ＲＮＡ結合タンパク質として開示する従来技術と違って、本発明は、より長く、かつそれによってより特異的な、例えば、６ｎｔ長、または８ｎｔ長のヌクレオチドの伸長への配列特異的、低親和性または中親和性の結合を可能にする。

結合部位のより長い長さは、様々な修正された結合親和性を有する結合部位を生成する様々な異なる変異を導入することを可能にし、したがって、上述のプログラム可能なより低い親和性の相互作用を生じる。例えば、６または８ヌクレオチドの領域に単一点変異を導入すると、結合親和性がわずかに修正される一方で、ＭＳ２のより短い４ヌクレオチド結合領域内の単一変異でさえ、ＲＮＡに対するＭＳ２の結合親和性に有意に影響を及ぼすことが知られている。核酸に対するタンパク質の結合親和性に影響を及ぼす１つ以上の変異を導入するために、核酸のより長い長さは、より多くの範囲を提供する。同様に、結合されるヌクレオチドのより長い伸長を必要とすることは、より長いヌクレオチド配列と相互作用することができ、したがって、それらの相互作用するアミノ酸を変異させ、かつこの場合も様々な結合親和性を有するより広い範囲の可能なタンパク質変異体を産生するためのより多くの可能性を提供することができる、より多くのアミノ酸をもたらす。ＰＵＦ、Ｃａｓ６、およびＣａｓ１３のより長いヌクレオチド結合部位、ならびにより大きなタンパク質結合部位の両方は、ＭＳ２タンパク質またはＭＳ２ ＲＮＡ配列の変異によって達成することができるよりも大きな範囲の親和性を変異によって達成できる利点を提供する。したがって、このより長い配列は、核酸および／または結合タンパク質を操作して、そのカーゴ核酸の放出を改善するために必要な場合に、特異的に目的の個々のカーゴに結合親和性を調整するより大きな可能性を提供する。上で論じたように、ヌクレオチドカーゴへの結合の親和性を制御し、したがってヌクレオチドカーゴの放出性を修正および制御する能力は、生体活性核酸の送達および放出をもたらす従来技術に優る本発明の著しい利点である。重要なことに、上述したように、ＥＶ生体分布パターンは、バクテリオファージタンパク質の相当な量の蓄積を肝臓にもたらし、それによって、機能障害を有する肝臓系を既に患っている患者の肝機能に及ぼす悪影響の増大を促進するため、バクテリオファージタンパク質によって刺激される免疫毒性は、肝臓に関与する疾患の場合に特に問題となる。

さらなる実施形態において、ＥＶは、器官、組織、または細胞標的化ペプチドおよび／もしくはポリペプチドをさらに含んでもよい。ＣＮＳ症状を有する特定のＵＣＤにおいて重要であり得る、ＥＶを脳およびＣＮＳに輸送するのに有効であることが証明されている標的化ペプチドの一例は、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）ペプチドであるが、他のペプチドおよびポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。重要なことに、組織標的化ペプチドおよび／またはポリペプチドは、尿素サイクルポリペプチド（ならびに任意選択でＵＣＤタンパク質および／または対応するコードＮＡカーゴ分子の増強装填用のＥＶ濃縮ポリペプチド）も含むポリペプチド構築物中に含まれてもよく、かつ／またはＥＶ中に別個のポリペプチド構築物として存在してもよい。標的化ペプチドおよび／またはポリペプチドが別個のポリペプチド構築物の一部である場合、ＥＶへの効率的な装填を確実にするために、好ましくは、エクソソームタンパク質に融合される。

本発明によるＥＶが少なくとも１つの標的化部分を含む場合、該標的化部分は、目的の細胞、組織、器官、および／または区画への標的送達のために、ＥＶプラス関連ポリペプチドまたはポリヌクレオチドカーゴを標的とすることができる。標的化部分は、融合ポリペプチド自体に含まれてもよく、これは、膜貫通ドメインを有するエクソソームポリペプチドを使用する場合に特に有利であり、ＥＶの表面上の標的化部分の表示を可能にする。標的化部分は、タンパク質、ペプチド、抗体、ナノボディ、アルファボディ、一本鎖断片、または抗体もしくは結合剤の任意の他の誘導体などであってもよい。標的化部分はまた、ＥＶに含まれる別個のポリペプチド構築物の一部も形成してもよい。さらに、本発明のＥＶに含まれる融合ポリペプチドは、生体活性送達を増強するための様々な追加の部分も含んでもよい。かかる部分および／またはドメインは、機能ドメインの以下の非限定的な例を含んでもよい。（ｉ）融合ポリペプチドを二量体化、三量体化、または多量体化してＥＶ形成を増強し、かつ／または装填を向上させる多量体化ドメイン、（ｉｉ）例えばＵＣＤタンパク質とエクソソームタンパク質との間で、またはエクソソームタンパク質とＮＡ結合ドメインとの間で、立体障害を回避し、柔軟性を提供するための上述のリンカー、（ｉｉｉ）融合ポリペプチドの特定の部分の放出（例えばＵＣＤタンパク質および／またはＵＣＤタンパク質をコードするＮＡカーゴを放出する）に有用な自己切断活性を有する、インテインのようなシス切断エレメントなどの放出ドメイン、（ｉｖ）レシピエント細胞におけるＲＮＡの放出を向上させるためのＲＮＡ切断ドメイン、例えばＣａｓ６、Ｃａｓ１３などのヌクレアーゼをコードするドメイン、（ｖ）ＨＡ２、ＶＳＶＧ、ＧＡＬＡ、Ｂ１８などのエンドソーム脱出ドメイン、および／または（ｖｉ）核局在化シグナル（ＮＬＳ）。組織標的化部分は、治療ペプチドと同じポリペプチド構築物中に含まれ得る、および／または別個のポリペプチド構築物として存在する、組織標的化ペプチドおよび／またはポリペプチドであってもよい。

一実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ミニ環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはウイルスゲノムを含む群から選択されてもよいが、ＵＣＤで補充する必要があるＵＣＤタンパク質をコードすることができる限り、本発明によるＥＶには本質的に任意のタイプのＮＡ分子を含むことができる。一本鎖および二本鎖の両ＮＡ分子が本発明の範囲内であり、ＮＡ分子は、天然に存在する場合がある（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）、または２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｆ、２’－ＣＥ、２’－ＥＡ２’－ＦＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ホスホロチオエート、トリシクロ－ＤＮＡなどの化学修飾ヌクレオチドを含んでもよい化学合成されたＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子とすることができる。重要なことに、本発明は、ＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ウイルスゲノムなど）の内因性装填に非常に好適であるが、ＥＶ産生細胞を当該ＮＡ分子に曝露することによって、および／またはＮＡカーゴ分子をＥＶ自体と共インキュベーションもしくは製剤化することによって装填されてもよい外因性ＮＡ分子の装填にも適用可能である。

ＮＡカーゴ分子は、直鎖状、環状であってもよく、かつ／または任意の二次構造および／もしくは三次構造および／もしくは他の構造を有してもよい。ＮＡカーゴ分子は、以下のうちの１つ以上を含んでもよい。（ｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位であって、かかる部位は任意選択で組織および／もしくは細胞型特異的である部位、（ｉｉ）ポリＡテールもしくはステムループなどの少なくとも１つの安定化ドメイン、または（ｉｉｉ）５’および／もしくは３’末端の少なくとも１つのハイブリッドＵＴＲ。

本発明の実施形態において、本発明によるＮＡカーゴ分子は、（ｉ）融合ポリペプチドのＮＡ結合ドメインの少なくとも１つの結合部位、および（ｉｉ）治療用ＵＣＤタンパク質（複数可）をコードするポリヌクレオチドドメインを含む。好ましい実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、少なくとも２つの結合部位、さらにより好ましくは、より多い数、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはさらに多い数の結合部位を含む。本発明者らは、１～８個の結合部位を含むことにより、カーゴの放出および生体活性送達に悪影響を及ぼすことなく、ＥＶ内へのＮＡカーゴ分子の最適な装填をもたらすことを認識している。ＮＡ結合ドメインの結合部位は、３’および／もしくは５’ＵＴＲ内に、および／もしくは隣接して遺伝子操作され、かつ／または配列最適化によって、ＮＡカーゴ分子のコード領域内に配置することができる。

ＮＡカーゴ分子（すなわち、当該ＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド）およびＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチド構築物の両方の設計は、例えば標的細胞および／または特定の器官、組織、および体内区画への装填、放出、および生体活性送達の鍵である。上述のように、本発明で利用されるＮＡ結合ドメインは、免疫刺激および毒性を引き起こすことを回避するため、非常に有利であり、これは、ＥＶがＵＣＤタンパク質および／または対応するＮＡカーゴを肝臓に送達することを意図しているため、特に重要であり、これはすでに尿素サイクル障害自体の影響によって含まれる。本発明者らは、特に有利な実施形態が、少なくとも１つのＮＡ結合ドメイン（すなわち、各側に少なくとも１つのＮＡ結合ドメイン）によって両側に隣接する少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むＥＶであることを発見した。あるいは、様々な事例において、ＮＡ結合ドメインは、例えば、外因性装填を増強するためにＥＶの外側にＮＡ結合ドメインを表示することが望ましい場合に、少なくとも１つの位置（例えば、ＣＤ６３の小胞外ループ上）にあるエクソソームポリペプチドへと挿入されることによる場合がある。エクソソームポリペプチドは、Ｃおよび／またはＮ末端に直接隣接してもよいが、最も有利な設計の１つは、エクソソームポリペプチド（複数可）およびＮＡ結合ドメイン（複数可）の両方の活性維持のために間隔および柔軟性を提供するために、エクソソームポリペプチドとＮＡ結合ドメインとの間にリンカーペプチドおよび／または切断ポリペプチドドメイン（インテインなど）を含むことである（またはＵＣＤタンパク質自体のタンパク質送達放出の場合）。かかるリンカーは、有利なことに、特定の数の反復を含有するグリシン－セリン（ＧＳ）リンカーであってもよい。本発明者らは、１～４回の反復のいずれかが最も有利であり、融合ポリペプチドをあまりにも非構造化にすることなく十分な柔軟性を提供することを認識している。上述したように、ＮＡカーゴ分子の外因性装填を伴う適用では、ＥＶは、好ましくは、エクソソーム表面上のＮＡ結合ドメインを曝露するために、そのＮ末端、および／またはそのＣ末端、および／またはエクソソームポリペプチドの任意の小胞外（すなわち、ＥＶの外側に存在する）領域にある少なくとも１つのＮＡ結合ドメインに融合された少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。

本発明はまた、装填、放出、および生体活性送達の高効率を確保するための鍵である、ＮＡカーゴ分子の様々な本発明の修正にも関する。例えば、直鎖状または環状のいずれかであるようにＮＡカーゴ分子を設計することによって、装填効率および安定性などの態様を増減させることができる。さらに、配列の設計を最適化することによって、ＮＡカーゴの二次構造および三次構造に影響を及ぼすことも可能であり、標的ＮＡへのＮＡ結合ドメインの容易なアクセスを促進することにより、装填をさらに促進することができる。

さらに別の有利な実施形態において、ＮＡカーゴ分子は、装填の増強、放出の改善、組織特異的活性の増大、および／またはＮＡカーゴ分子の安定性の増大のいずれかによって、効力を増大させる追加の部分を含んでもよい。例えば、ＮＡカーゴ分子は、以下のうちの１つ以上を含んでもよい。（ｉ）ｍｉＲＮＡ結合に対する部位であって、かかる部位は任意選択で、優先細胞および／または組織特異的活性を駆動するための組織および／または細胞型特異的である、ｍｉＲＮＡ結合部位、（ｉｉ）長いＰｏｌｙＡテールまたは２つ以上のＰｏｌｙＡテール（例えば、２または３またはさらには４つのＰｏｌｙＡテール）などの少なくとも１つの安定化ドメイン、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ分解を阻害するための５’および／または３’ＵＴＲ内の少なくとも１つのステムループ構造、（ｉｖ）ＮＡカーゴ分子の転写を駆動するためのＲＮＡポリメラーゼ、（ｖ）ｍＲＮＡ安定性を増加させるためのコドン最適化配列、（ｖｉ）ｍＲＮＡ翻訳効率を増加させるための５’および／または３’末端の少なくとも１つのハイブリッドＵＴＲ、および／または（ｖｉｉ）リボザイム（複数可）。

上述のように、ＮＡカーゴ分子（すなわち、ＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド）は、有利なことに、（ｉ）ＥＶへの共局在化用のＮＡ結合ドメインに対する少なくとも１つの結合部位、および（ｉｉ）治療用ＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチドドメインを含んでもよい。ＮＡカーゴ分子は、有利なことに、少なくとも１つの結合部位とコードＮＡ成分との間の切断部位をさらに含んでもよい。ＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチドは、ＮＡ結合ドメインとＮ－および／もしくはＣ末端で隣接する少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含んでもよく、かつ／または少なくとも１つのＮＡ結合ドメインがＥＶポリペプチド配列に挿入される。

本発明によるＥＶは、融合ポリペプチドの補助を受けて、ＮＡカーゴ分子を装填し、融合ポリペプチドは通常、ＮＡカーゴ分子に結合し、ＥＶに輸送する少なくとも１つのＮＡ結合ドメインに融合したエクソソームポリペプチドを含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、装填は、ＥＶ産生細胞内でのＥＶの形成に伴って生じる、またはＮＡカーゴ分子（複数可）を操作されたＥＶとインキュベーションすることによって外因的に生じると推測される。融合ポリペプチドは、通常、ＮＡカーゴ分子（ＥＶ産生細胞で共発現したｍＲＮＡ分子など）に結合し、次いでこれをＥＶとして産生細胞から分泌される小胞内に輸送してもよい。すでに述べたように、ＮＡカーゴ分子は、融合ポリペプチド（内因性装填）と同じＥＶ産生細胞で発現してもよく、かつ／またはＥＶが形成され、そして任意選択で精製されると、ＥＶに外因的に装填されてもよい。ＮＡカーゴのＥＶ産生細胞における共発現は、ＥＶ産生が単一ステップで単一細胞において行われるため、非常に有利な実施形態であり、これにより該プロセスのスケーリングを可能にし、かつ上流および下流の両処理を簡素化する。ＮＡカーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは任意の他のＵＣＤタンパク質をコードするＮＡ分子など）は、融合ポリペプチドと同じポリヌクレオチド構築物から発現してもよく、または別のポリヌクレオチド構築物から発現してもよい。両方法は、利点を有する。１つの構築物の使用は、融合ポリペプチドおよびＮＡカーゴ分子の両方が一緒に翻訳／転写されることを確実にする一方で、２つ以上の構築物の使用は、２つの成分の差次的発現、例えば、融合ポリペプチドまたはＮＡカーゴ分子のいずれかのより高レベルの発現を可能にする。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドおよび／またはＮＡカーゴ分子が発現するポリヌクレオチド構築物（複数可）は、有利なことにＥＶ産生細胞に安定して導入され、ＮＡを装填したＥＶの一貫した、再現可能かつ高収率の産生を可能にする。安定な細胞の作成、好ましくは、続いて単一細胞をクローニングし、ＥＶ産生用の単一細胞クローンを得ることは、ＵＣＤタンパク質を含む融合ポリペプチドをＥＶに装填するためと同様に、コードＮＡ分子の装填に重要である。好ましい実施形態において、ＥＶ産生細胞は、融合ポリペプチドおよびＮＡカーゴ分子を含む２シストロン性ベクターまたはマルチシストロン性ベクター（構築物またはポリヌクレオチドなどとしても知られる）を用いて安定的にトランスフェクションおよび／または形質導入される。かかる２シストロン性またはマルチシストロン性の構築物は、例えば、（ｉ）ＮＡ結合ドメインおよびエクソソームタンパク質を含む融合ポリペプチド、ならびに（ｉｉ）目的のＮＡカーゴ分子、例えば、ｍＲＮＡまたは任意の他のタイプのコードＮＡカーゴ分子の両方の発現を可能にする、誘導可能なプロモーター、ＩＲＥＳエレメント（複数可）または２Ａペプチド結合を含んでもよい。２シストロン性またはマルチシストロン性のベクターを使用することに加えて、複数または双方向プロモーターは、本発明によるＥＶに装填される目的の２つの成分をコードする単一の構築物を安定的に挿入するための別の扱いやすい方法を表す。明らかに、代替の実施形態において、２つ以上の構築物（例えば、プラスミド）もまた、ＥＶ産生細胞にトランスフェクションおよび／または形質導入されてもよいが、単一の構築物の使用は、融合ポリペプチド（したがって、ＮＡ結合ドメイン）およびＮＡカーゴ分子自体の等モル濃度を可能にする場合があるため、有利である場合がある。重要なことに、本発明のＥＶ産生細胞は、通常、少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物を過剰発現するように設計され、これは、ＥＶ産生細胞内で好適な濃度でのＮＡカーゴ分子の適切な産生を可能にし、それによって、ＮＡ結合ドメインのＮＡ分子への可逆的で放出可能な結合を可能にする。ポリヌクレオチド（複数可）の過剰発現は、ＥＶ産生細胞において比較的高いＵＣＤタンパク質融合ポリペプチドまたはＵＣＤタンパク質をコードするＮＡカーゴ分子の濃度を生じることを可能にすると同時に、ＮＡカーゴ分子の濃度がより低い標的細胞におけるＮＡカーゴ分子の放出を可能にする重要なツールである。これは、ＰＵＦおよびＣａｓタンパク質に特に関連する。

上述したように、ＥＶは典型的には単一の小胞としてではなく、実質的に複数の小胞に存在し、したがって、本発明はＥＶの集団にも関する。有利な実施形態において、かかる集団全体にわたるＥＶ当たりのＮＡカーゴ分子の平均数は、ＥＶ当たり平均１個超のＮＡカーゴ分子、好ましくはＥＶ当たり１０個超のＮＡカーゴ分子、さらにより好ましくはＥＶ当たり１００個超のＮＡカーゴ分子である。しかしながら、集団全体を通して、任意のＮＡカーゴ分子を含まないＥＶも存在し、したがって、本発明は、ＥＶ当たり平均１（１）個未満のＮＡカーゴ分子を含むＥＶ集団にも関する場合がある。

重要なことに、従来技術は典型的には、非常に非効率的な様式で、ＲＮＡカーゴのＥＶのごく一部への装填をもたらすにすぎない。例えば、ＴＡＭＥＬシステムは、実質的にゼロから１未満のパーセンテージの単一ＥＶの装填をもたらす。ＴＡＭＥＬシステムの発明者らは、ＴＡＭＥＬシステムを使用する場合、ＲＮＡ分子のエクソソームへの装填が最大で７倍増強されることを報告する一方で、本発明は、（ｉ）融合タンパク質内に存在するＮＡ結合ドメインを有しない、かつ／またはＮＡカーゴ分子内にＮＡ結合ドメインの結合部位を有しないＥＶ、（ｉｉ）融合タンパク質自体を有しないＥＶ（例えば、図２に示すように）、（ｉｉｉ）ＮＡカーゴ分子でのみ受動的に装填される未操作ＥＶ、ならびに／または（ｉｖ）任意の所与の内部ＮＡ対照分子と比較して、典型的には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２５倍、しかし、しばしば少なくとも５０倍、および好ましくは少なくとも７０倍、例えば、ｍＲＮＡおよび他のＮＡカーゴ分子の生産的装填を向上する。したがって、本発明は、ＥＶの所与の集団にかなりより多くのＮＡカーゴ分子を装填する方法を提供し、かつ重要なことに、本発明は、従来技術と比較して有意により高い割合のＥＶを装填することも可能にする。一実施形態において、本発明は、ＥＶ集団に関し、全ＥＶの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および／または少なくとも９５％が、当該ＮＡカーゴ分子を含む。上述のように、本発明と、例えば米国特許出願第１４／５０２，４９４号および他の従来技術文書との重要な違いは、ＥＶの全集団にわたる融合ポリペプチドの非効果的で、かつ重要なことに、不均一な分布に関する。例えば、米国特許出願第１４／５０２，４９４号で使用されるＭＳ２タンパク質は、ＥＶのごく一部にのみ存在し、これは、ＥＶ集団にわたってｍＲＮＡカーゴの不均一に分布した装填をもたらす。逆に、本発明の融合タンパク質は、ＥＶ集団全体にわたって均一に分布し、これは、本質的に、あらゆるＥＶが、本発明による少なくとも１つの融合ポリペプチド、および通常は少なくとも１つのＮＡカーゴ分子を含むことを意味する。したがって、一実施形態において、本発明は、本質的に２つのＥＶ下位集団を含むＥＶ組成物に関し、（ｉ）第１のＥＶ下位集団は、ＥＶ当たり平均２個以上の融合ポリペプチド（ＮＡ結合ドメインおよびエクソソームポリペプチドを含む）を含み、（ｉｉ）第２のＥＶ下位集団は、ＥＶ当たり平均２個以上の融合ポリペプチドと組み合わされる当該ＮＡカーゴ分子を含む。対照的に、従来技術、例えば米国特許出願第１４／５０２，４９４号は、ＥＶ当たり非常に少ない融合ポリペプチド、典型的には１０個のＥＶ当たり１個未満の融合ポリペプチドを含むＥＶを教示し、これは、該融合タンパク質に依存するＮＡカーゴ分子の生産的な装填および送達が、本出願の場合よりも有意に低いことを明らかに示す。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、従来技術がＥＶへの融合タンパク質のより高い装填を達成できなかった理由は、ＭＳ２および類似の非真核生物タンパク質がエクソソームへと効率的に往復しないという事実、および／またはそれらが毒性を引き起こすという事実に起因すると推測され、２つの問題は本発明によって対処される。

ＵＣＤタンパク質を装填した場合の本発明のＥＶは、ＥＶ当たりポリペプチド構築物（すなわち、エクソソームタンパク質に任意選択で融合したＵＣＤタンパク質）の少なくとも１つのコピーを含んでよい。より好ましくは、本発明の単一のＥＶは、（ｉ）ポリペプチド構築物の少なくとも１０コピー、（ｉｉ）ポリペプチド構築物の少なくとも５０コピー、および／または（ｉｉｉ）ポリペプチド構築物の少なくとも１００コピーを含んでもよい。

本発明のポリペプチド構築物は、少なくとも１つのＥＶ濃縮ポリペプチド、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、シンテニン、Ｌａｍｐ２Ｂ、Ｌａｍｐ２Ａ、シンデカン、Ａｌｉｘ、ＣＤ４７、パルミトイル化ドメイン（複数可）、ミリストイル化ドメイン（複数可）、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両方のレベルで治療用尿素サイクルタンパク質に作用可能に連結することができる任意の他のＥＶ濃縮ポリペプチドを１つのポリペプチド構築物内に組み合わせた少なくとも１つの治療用尿素サイクルタンパク質を含む。

上述のように、本発明によるＥＶに含まれるポリペプチド構築物（複数可）は、尿素サイクルタンパク質のＥＶへの内部移行を促進するために、有利な実施形態において、少なくとも１つのＥＶ濃縮ポリペプチドを含むように操作されてもよい。かかるＥＶ濃縮ポリペプチドは、本質的に任意のＥＶポリペプチド、例えば、以下のＥＶ濃縮ポリペプチド群から選択され得る。ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン－１、シンテニン－２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＲＲＤＣ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、パルミトイル化ドメイン、ミリストイル化ドメイン、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｈｓｐ７０、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、それらの任意の誘導体および／またはドメイン、ならびにそれらの任意の断片、誘導体、ドメイン、または組み合わせ。任意のＵＣＤタンパク質は、融合タンパク質において、本発明の任意のＥＶ濃縮ポリペプチドと組み合わされてもよい。さらに有利なことに、本発明のポリペプチド構築物は、ＵＣＤタンパク質カーゴが切断され、したがって、インテインの自己切断活性によってＥＶ濃縮ポリペプチドから放出されることを可能にするインテインをさらに含んでもよい。

本発明のさらなる実施形態において、尿素サイクルタンパク質またはかかるＵＣＤタンパク質をコードするＮＡ分子は、Ｎ－アセチルグルタメートシンターゼ、カルバモイルホスフェートシンセターゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノサクシネートシンセターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、ミトコンドリアオルニチン輸送体、オルニチントランスロカーゼ、シトリン、ｙ＋Ｌアミノ酸輸送体１、ウリジンモノホスフェートシンターゼ、またはこれらの任意の断片、誘導体、ドメイン、または組み合わせを含む群から選択される。

上述のように、別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインおよび少なくとも１つのエクソソームポリペプチドを含む本発明の融合ポリペプチドに関し、少なくとも１つのＮＡ結合ドメインは、ＰＵＦ、Ｃａｓ、および／またはＮＡアプタマー結合ドメインのうちの１つ以上である。有利な実施形態において、融合ポリペプチドは、任意選択で、特定の機能を有するポリペプチドを付与する追加の領域、ドメイン、配列、および／または部分をさらに含んでもよい。融合ポリペプチドに含まれる追加のドメインの非限定的な例としては、（ｉ）多量体化ドメイン、（ｉｉ）リンカー、（ｉｉｉ）放出ドメイン、（ｉｖ）ＲＮＡ切断ドメイン、（ｖ）エンドソーム脱出部分、（ｖｉ）プロテアーゼ特異的切断部位、（ｖｉｉ）インテイン、（ｖｉｉｉ）標的化部分、および／または（ｉｘ）インテインなどの自己切断ドメインが挙げられる。

多量体化ドメインは、融合ポリペプチドの二量体化、三量体化、または任意のより高次の多量体化を可能にし、これは、融合ポリペプチドのＥＶへの選別および搬送を増加させ、かつＥＶ産生細胞によって産生される小胞の収率の増加にも寄与する場合がある。リンカーは、融合ポリペプチド構築物、および対応するポリヌクレオチド構築物にも増加した柔軟性を提供するのに有用であり、立体障害の回避および融合ポリペプチドの機能維持を確実にするためにも使用されてもよい。元の融合ポリペプチドからの特定の部分またはドメインの放出を可能にするために、放出ドメインが融合ポリペプチド構築物に含まれてもよい。これは、融合ポリペプチドの部分の放出がＮＡカーゴの生体活性送達を増加させることになる場合、および／またはより小さな構築物の一部の場合に融合ポリペプチドの特定の機能がより良好に働く場合、特に有利である。好適な放出ドメインは、インテインなどのシス切断配列、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧＲ、ＥｏｓＦＰ、ｔｄＥｏｓＦＰ、ｍＥｏｓ２、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＧＦＰ様Ｄｅｎｄｒａタンパク質のＤｅｎｄｒａおよびＤｅｎｄｒａ２、ＣＲＹ２－ＣＩＢＮなどの光誘導性の単量体または二量体の放出ドメインであってもよい。ＮＡカーゴの切断を引き起こすために、ＮＡ切断ドメインも有利に融合ポリペプチドに含まれてもよい。ＮＡ切断ドメインの非限定的な例としては、Ｃａｓ６、Ｃａｓ１３、操作されたＰＵＦヌクレアーゼ、部位特異的ＲＮＡヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼが挙げられる。さらに、本発明の融合ポリペプチドは、エンドソーム脱出を駆動し、それによってＥＶ自体およびＥＶ ＮＡカーゴ分子の生体活性送達を増強するエンドソーム脱出ドメインも含んでもよい。送達を増強するための別の戦略は、ＥＶを細胞、組織、および／または器官、または他の体内区画に標的化することである。標的化は、例えば、標的化ペプチドの使用などの様々な手段によって達成することができる。かかる標的化ペプチドは、数アミノ酸長～数百アミノ酸長のいずれか、例えば３～１００アミノ酸、３～３０アミノ酸、５～２５アミノ酸の間隔のいずれか、例えば７アミノ酸、１２アミノ酸、２０アミノ酸などであってもよい。本発明の標的化ペプチドはまた、受容体、受容体リガンドなどの全長タンパク質を含んでもよい。さらに、本発明による標的化ペプチドは、抗体および抗体誘導体、例えば、モノクローナル抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、他の抗体ドメインなども含んでもよい。

本発明の特に好ましい実施形態において、ポリペプチド構築物は、ＬＡＭＰ２ｂ－ＡＳＬ、ＣＤ４７アルファ－ＡＳＬ、ＣＤ４７ベータ－ＡＳＬ、ＣＤ４７デルタ－ＡＳＬおよび／またはＣＤ４７ガンマ－ＡＳＬ（ＣＤ４７アルファ／ベータ／ガンマ／デルタは、ＣＤ４７タンパク質のより切断された型を順番に表す）を含む融合タンパク質を使用して管腔外に呈するＡＳＬタンパク質を含む。あるいは、本発明の他の同等に好ましい実施形態において、ポリペプチド構築物は、ＣＤ６３－インテイン－ＡＳＬおよび／またはＰａｌｍ－インテイン－ＡＳＬ（Ｐａｌｍはパルミトイル化配列である）を含む融合タンパク質を使用して管腔内に呈するＡＳＬタンパク質を含む。本発明のＥＶはまた、これらの管腔外および管腔内に呈するタンパク質構築物のあらゆる組み合わせを含んでもよい。さらに、好ましい実施形態におけるＡＳＬタンパク質は、任意の他の尿素サイクルタンパク質によって補充されてもよい。尿素サイクルタンパク質／尿素サイクルタンパク質をコードするポリヌクレオチドの管腔内装填の利点は、タンパク質／ポリヌクレオチドがＥＶ内に封入されることによって分解から保護され、それによってカーゴ分子の半減期を延長することである。

パルミトイル化は、タンパク質が細胞基質と細胞内／原形質膜との間で動的に再局在することを可能にする可逆的プロセスであるため、パルミトイル化配列の使用は特に有利である。これの効果は２倍である、すなわち、第１に、ＥＶ産生細胞において、ポリペプチドが最初にＥＶを産生しない膜に位置する場合、その後、ＥＶを産生することができる異なる細胞下膜に再局在し、したがって、最終的にＥＶに組み込まれる産生ポリペプチド構築物の濃度を増加させることができるように、本発明のポリペプチド構築物を産生細胞内でリサイクルすることを可能にし、第２に、ＥＶが標的細胞に送達されると、脂肪酸を脱パルミトイル化酵素によって除去することができ、したがって、カーゴを遊離の非付着形態で送達することができ（必ずしもインテインまたはそれに組み込まれる他の切断メカニズムを必要とせずに）、送達されたカーゴタンパク質がその最適な生体活性確認を得るため、増強された治療効果を示すことを可能にする。したがって、パルミトイル化を利用することは、ＥＶ産生細胞の上流処理中に、カーゴをＥＶに位置決めするように作用するだけでなく、関連する標的位置でカーゴの放出を可能にするという驚くべきかつ予期しない二重の役割を有する。

さらに別の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物に関する。かかるポリヌクレオチド構築物は、様々なベクターを使用して、インビボ、エクスビボ、および／またはインビトロで必然的に発現される場合がある。本発明によるポリヌクレオチド構築物を含む好適なベクターとしては、さらに別の態様において、プラスミド、ミニ環、任意のタイプの実質的に環化されたポリヌクレオチド、ウイルス（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、および／またはカプシドフリーウイルスおよび／またはウイルスゲノムなど）、直鎖ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡポリヌクレオチド、天然メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ならびに／または典型的には、免疫原性を低減し、ｍＲＮＡ安定性を増強させるための５－メチルシチジンおよびシュードウリジンなどの修飾ヌクレオシドを含む修飾ｍＲＮＡが挙げられる。

本発明によるポリヌクレオチド構築物は、ポリヌクレオチドに特定の官能性を付与するための１つ以上の部位またはドメインをさらに含んでもよい。例えば、ポリヌクレオチド構築物の安定性は、安定化ドメイン、例えば、ポリＡテールまたはステムループの使用を通じて増強され、ポリヌクレオチド構築物はまた、任意選択で細胞型特異的誘導性プロモーター、リンカーなどであってもよい特定のプロモーターによっても制御される場合がある。安定化ポリＡテールを保持するｍＲＮＡの切断をもたらすために、ポリＡテールは、ｍＲＮＡカーゴ分子のＣａｓ６またはＣａｓ１３切断部位の上流に挿入されてもよい。これは、カーゴｍＲＮＡがインビボでの安定性を増加させ、その結果より多くのタンパク質が単一のカーゴｍＲＮＡから翻訳され、したがってＥＶ当たりより高い治療生体活性が送達されることを可能にするという利点を有する。

本発明はまた、（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物、および／または（ｉｉ）本発明の少なくとも１つのポリペプチド構築物、および／または（ｉｉｉ）本発明の少なくとも１つのＥＶを含む細胞にも関する。

用語「供給源細胞」もしくは「ＥＶ供給源細胞」もしくは「親細胞」もしくは「細胞供給源」もしくは「ＥＶ産生細胞」、または任意の他の同様の用語は、好適な条件下、典型的には細胞培養においてＥＶを産生することができる任意のタイプの細胞に関するものと理解されるべきである。細胞培養は、インビボ、エクスビボ、および／またはインビトロでの懸濁培養、接着培養、または任意の他のタイプの培養系を含んでもよい。本発明による供給源細胞はまた、例えば、後続の翻訳、および、例えば、肝臓でのＥＶのインビボ産生のために、対象へのポリヌクレオチド構築物の送達を介して、インビボでエクソソームを産生する細胞も含んでもよい。

一般に、ＥＶは、本質的に任意の細胞源に由来してもよく、初代細胞源であっても、または不死化細胞株であってもよい。ＥＶ供給源細胞は、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）ならびに任意の方法によって得られる他の幹細胞、ならびに任意の成人細胞供給源を含む、任意の胚性、胎児性、および成人体細胞性幹細胞の型であってもよい。本発明による供給源細胞は、幅広い範囲の細胞および細胞株、例えば、間葉系幹細胞または間質細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトンゼリー、周産期組織、絨毛膜、胎盤、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから入手可能）、線維芽細胞、羊膜細胞、より具体的には、様々な初期マーカー、骨髄抑制細胞、Ｍ２偏光マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞などを任意選択で発現する羊膜上皮細胞から選択することができる。特定の目的の細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、微小血管またはリンパ内皮細胞などの内皮細胞株、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、異なる起源のＭＳＣ、羊膜細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、羊水穿刺を通じて、または胎盤、気道または肺胞上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などから得られる任意の細胞が挙げられる。また、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞（ＤＣ）などの免疫細胞も本発明の範囲内であり、また本質的にＥＶを産生することができる任意のタイプの細胞も本明細書に包含される。

神経学的疾患を治療する場合、例えば一次ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および神経前駆細胞を供給源細胞として利用することを意図してもよい。供給源細胞は、治療される患者にとって、本来は同種、自己のいずれでも、または異種であってさえもよく、すなわち、細胞は、患者自身に由来してもよく、または無関係、適合もしくは不適合のドナーに由来してもよい。ある特定の状況において、同種細胞は、ある特定の適応症に罹患している患者の自己細胞からは入手可能ではない可能性がある免疫調節効果を提供することができるため、医学的観点から好ましい場合がある。例えば、全身性、末梢性、および／または神経学的炎症を治療する状況において、同種ＭＳＣまたはＡＥは、かかる細胞から入手可能であるＥＶが、例えば、マクロファージおよび／または好中球表現型切り替え（それぞれ、炎症促進性Ｍ１またはＮ１表現型から抗炎症性Ｍ２またはＮ２表現型へ）を介して免疫調節を可能にする場合があるため、好ましい場合がある。本発明による最も有利な供給源細胞は、ＭＳＣ、羊膜由来細胞、羊膜上皮（ＡＥ）細胞、任意の周産期細胞、および／または胎盤由来細胞であり、これらは全て、哺乳動物起源であり、最も好ましくはヒト起源である。ＥＶが由来する細胞株は、接着細胞または懸濁細胞であってもよく、安定細胞株または単一クローンとして生成してもよい。

一実施形態において、本発明は、ＭＳＣ、ＡＥ細胞または胎盤由来細胞、いわゆるＭＳＣ－ＥＶ、ＡＥ－ＥＶ、およびＰ－ＥＶから得られるＥＶに関する。かかる細胞は、様々な異なるＵＣＤにおけるそれらの治療活性を増強するために、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質を含む有意な数のコピー、すなわちかなりの複数のポリペプチド構築物を含む、本発明によるＥＶの産生を可能にするように見えるため、特に好ましい。「内因的に操作された」という用語は、ＥＶ産生細胞が、細胞機構の補助を受けてＥＶ内に組み込まれる治療用尿素サイクルタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を含有するように遺伝子操作されることを意味する。上述の細胞源は好ましい実施形態であるが、本発明は、任意のＥＶ産生細胞源、すなわち、ＥＶを産生することができる任意の細胞に関する。上述の細胞源はまた、生体活性ＵＣＤタンパク質をコードするＮＡカーゴ分子を含むＥＶの産生においても非常に効率的である。

ＭＳＣ－ＥＶ、ＡＥ－ＥＶ、およびＰ－ＥＶ、ならびに様々な他のＥＶ産生細胞源は、予想外なことに、保持された治療活性、すなわち、酵素活性、または該治療尿素サイクルタンパク質が行う任意の他の活性を有する、正しく折り畳まれたＵＣＤタンパク質および／またはかかるＵＣＤタンパク質をコードするＮＡ分子の多数のコピーを担持する能力を有する。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの特性は、ＥＶ、特にエクソソーム内で見出される高含有量の熱ショックタンパク質、特に熱ショック７０ｋｄａタンパク質８（遺伝子ＨＳＰＡ８によってコードされるＨｓｐ７０－８としても知られる）の結果であると推測される。有利なことに、ＥＶ内へと存在および／または操作されてもよい他の熱ショックタンパク質としては、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、および／またはＨｓｐ６０が挙げられる。

さらなる実施形態において、本発明によるＥＶは、意外にも、再生効果および免疫調節効果だけでなく、ＵＣＤの治療に好適な薬物動態プロファイルとも関連していると思われる様々なタンパク質マーカーに対して陽性であるように選択される。最も生体活性の高いＥＶは、以下のポリペプチドのうちの１つ（多くの場合、少なくとも３つ）に対して陽性である。ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＳＳＥＡ４、ＣＤ１３３、ＣＤ２４、および例えばＨｓｐ７０ファミリー由来のタンパク質などの熱ショックタンパク質ファミリー由来の種々のタンパク質。

重要なことに、本発明のＥＶへのＮＡカーゴ分子の装填を補助する治療用尿素サイクルタンパク質および／または融合タンパク質は、該タンパク質のＥＶへの内因性装填の結果として、正しく折り畳まれる。正しい折り畳みは、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ＥＶに含まれる熱ショックタンパク質の結果であると推測され、これは、当該タンパク質の正しい折り畳みを維持するのに役立つ場合がある。

さらにさらなる態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド構築物、ポリヌクレオチド構築物、またはベクターのうちの１つ以上を含む細胞に関する。任意のタイプのＥＶ産生細胞は、本発明の目的に有用である場合があり、そしてかかるＥＶ産生細胞は、インビトロ、例えば細胞培養、または任意のエクスビボもしくはインビボ系のいずれかに存在する場合がある。本発明による細胞は、ＥＶの持続的で、堅固で、かつ一貫した産生を可能にするために、任意選択で、不死化されてもよく、かつ／または任意選択で、少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物（またはかかる少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物を含む任意のベクター）で安定してトランスフェクションもしくは形質導入されてもよい。

上述のように、好ましい実施形態において、本発明のＥＶ産生細胞は、（ｉ）ＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチドおよび（ｉｉ）ＮＡカーゴ分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物（複数可）、または治療用ＵＣＤタンパク質を含む少なくとも１つのポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチドを用いて、安定的にトランスフェクションおよび／または形質導入される。非常に好ましい実施形態において、ＥＶ産生細胞は、単一細胞クローンのクローン選択を可能にするクローン選択プロトコルに曝露される。したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明は、融合ポリペプチドおよびＮＡカーゴ分子の両方を含むＥＶを産生するために安定してトランスフェクションおよび／または形質導入されるＥＶ産生細胞の単一細胞クローン集団に関する。単一クローンは、限定希釈法、単一細胞選別、単一細胞プリンティング、および／またはクローニングシリンダーを使用する個々の細胞の単離を使用して得られてもよい。

本発明の好ましい実施形態において、ＥＶ産生細胞は、少なくとも１つの治療用尿素サイクルタンパク質を含む少なくとも１つのポリペプチド構築物、該ポリペプチド構築物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物および／または少なくとも１つのベクターを含む。本発明の細胞は、典型的には、ポリヌクレオチド構築物（プラスミド、ｍＲＮＡ、直鎖ＤＮＡ分子、ウイルスまたはウイルスゲノムなどのベクターの形態で存在し得る）を含むように操作され、これは、細胞機構によって対応するポリペプチド構築物へと発現し、それによって細胞により産生されるＥＶ、通常はエクソソームおよび／または微小小胞へと組み込まれる。したがって、細胞は通常、最初にポリヌクレオチド構築物（または該構築物を含むベクター）を含み、一旦ポリペプチド構築物の発現および翻訳が完了すると、細胞は、ポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチド構築物の両方を含むことになり、これは通常、ＥＶ媒介性エクソサイトーシスを介して細胞から分泌され、あらゆるＥＶは、ポリペプチド構築物の複数のコピーを含む。

本発明のＥＶ産生細胞は、好ましくは、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質およびＥＶ産生細胞に安定して挿入される少なくとも１つのＥＶ濃縮ポリペプチドを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物を含む。安定して（遺伝的に）操作されたＥＶ産生細胞源の作成は、再現可能な治療効果を有し、そして化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）の観点から再現可能な同一性を有するＥＶの一貫した高収率産生の鍵である。安定した細胞は、通常、例えば、ｈＴＥＲＴ不死化、ウイルス不死化、および／または条件付き不死化の戦略を用いて不死化される。大規模でのＥＶ産生を可能にするために、ＥＶ産生細胞は、ある特定の数の集団倍加（ＰＤＬ）、好ましくは少なくとも２０ＰＤＬ、より好ましくは少なくとも５０ＰＤＬ、さらにより好ましくは少なくとも７０ＰＤＬ、さらにより好ましくは少なくとも１００、またはさらに少なくとも２００ＰＤＬを通して安定して（好ましくは好適なベクターに）ポリヌクレオチド構築物を含むことが好ましい。

本発明の好ましい態様において、ＥＶ産生細胞によって産生されるＥＶの少なくとも５０％または６０％、好ましくは少なくとも７０％または８０％、さらにより好ましくは９０％または９５％以上は、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質を含むポリペプチド構築物および／または少なくとも１つのＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物（ｍＲＮＡなど）を含む。

本発明の別の好ましい態様において、ＥＶ産生細胞によって産生されるＥＶは、少なくとも１０、２０、３０、または４０コピー、好ましくは少なくとも５０コピーの尿素サイクルタンパク質および／または少なくともＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物（ｍＲＮＡなど）を、より好ましくは少なくとも７０、８０、または１００コピー含む。

したがって、１つの有利な実施形態において、本発明は、ＥＶの集団を含む組成物に関し、ＥＶの少なくとも５０％、６０％、または７０％が、治療用尿素サイクルタンパク質および／または少なくとも１つのＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物（ｍＲＮＡなど）に対して陽性であり、より好ましくは、ＥＶの少なくとも７５％が、治療用尿素サイクルタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドに対して陽性であり、さらにより好ましくは、ＥＶの少なくとも９０％が、治療用尿素サイクルタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドに対して陽性であり、かつ／またはさらにより好ましくは、ＥＶの少なくとも９５％が、治療用尿素サイクルタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドに対して陽性である。

重要なことに、ＥＶ産生細胞を最適化するための本発明の操作戦略は、ＥＶへの尿素サイクルタンパク質（複数可）の非常に効率的な装填をもたらす。典型的には、本発明によるあらゆるＥＶは、ポリペプチド構築物（したがって、尿素サイクルタンパク質）の少なくとも５～１０コピーを含むが、より多くの場合、当該尿素サイクルタンパク質の１０コピーをはるかに上回り、例えば、約２０～３０コピー、または３０～５０コピー、または５０コピーも上回り、例えば、約７５コピーまたは約１００コピーを含む。明らかに、これは、治療効果にとって非常に重要であり、最適な操作戦略およびＥＶプロファイルだけでなく、かかるＥＶを産生および採取するための本発明方法も意図的に選択しなければ達成できない。同様に、ＥＶは、少なくとも１つのＵＣＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物（ｍＲＮＡなど）を含んでもよく、好ましくは、ＥＶ当たり２以上のコピーだが、当然、さらにより好ましくは、ＥＶ当たり１１コピー以上、または好ましくはさらに多くのコピー（ＥＶ当たり２０、５０、または１００を上回るようなコピー）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、全てのＥＶがｍＲＮＡまたは対応するタンパク質などの薬物分子を含むわけではなく、例えば、２個のＥＶのうち１個が薬物分子を含んでもよく、または１０個のＥＶのうち１個が薬物分子を含んでもよい。安全性および忍容性、ならびにそれによるＥＶの広範な治療指標のおかげで、ＥＶのいくつかは薬物カーゴを含まない場合があるが、薬理効果を媒介するために必要なＥＶの用量は、単に粒子（ＥＶ）数を増加させることによって容易に達成することができる。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の複数のＥＶ、少なくとも１つのポリペプチド構築物、少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または少なくとも１つのベクター、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にさらに関する。重要なことに、本明細書の全ての生物学的成分（ＥＶ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞など）は、有利なことに単独で、あるいは任意の組み合わせで一緒に医薬組成物に含まれてもよい。通常、本発明の医薬組成物は、ＥＶの集団ならびに好適な医薬担体、添加剤および／または賦形剤を含む。

別の実施形態において、医薬組成物は、有利なことに、フェニル酪酸ナトリウムすなわちブフェニル、安息香酸ナトリウム、ラクツロース、Ｌ－シトルリンおよびＬ－アルギニンなどの薬剤ならびに／またはこれらの任意の誘導体をさらに含んでもよい。これらのタイプの組み合わせは、ＥＶが機能性尿素サイクルタンパク質を送達した後、その効果がかかる薬剤によって増強されるため、高度な相乗治療効果をもたらす場合がある。当然ながら、本発明の医薬組成物は、尿素サイクル蓄積障害の治療に特に好適であるが、尿素サイクルに関与する他の疾患も、本明細書の発明を使用して治療される場合がある。

本発明はまた、（ｉ）本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物をＥＶ産生細胞に導入することと、（ｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物によってコードされる少なくとも１つのポリペプチド構築物をＥＶ産生細胞内で発現することと、それによって、ＵＣＤタンパク質としての直接発現を通して、または該ポリペプチド構築物の補助で装填されるポリヌクレオチドからの発現を介してのいずれかで、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質を含む該ＥＶを生成することと、を含む、本発明のＥＶの産生方法にも関する。この方法は、外因性装填と比較して、内因性装填と称される。ＥＶの外因性装填と比較した内因性装填の利点は、薬物産生プロセスの収率低下および不必要な複雑さをもたらす複数の製造ステップを回避することである。この装填効率の改善は、タンパク質およびポリヌクレオチドカーゴの両装填に同様に適用される。例えば、天然ｍＲＮＡの内因性装填は、外因性装填法による修飾ヌクレオシドを典型的に含む人工ｍＲＮＡの装填よりもはるかに単純である。さらに、内因性装填により、タンパク質カーゴがエクソソームに装填される前に適切に翻訳後修飾されることが可能になる。翻訳後修飾は、タンパク質が最適な三次構造または四次構造を採択するために必要であるため、内因性装填されたタンパク質は、送達されると最適な確認になり、したがって、送達されるとより大きな治療効果を有する。

ある特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチド構築物が使用される一方で、他の実施形態において、２つ以上のポリヌクレオチド構築物が使用される。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、ポリヌクレオチド構築物が導入されたＥＶ産生細胞（ＥＶの目的および使用に応じて、一時的または安定的に）は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド構築物を含むＥＶ（エクソソームなど）を産生すると推測される。次いで、ＥＶは、任意選択で、典型的には細胞培養培地から収集され、任意選択で、特定の使用前にさらに精製され得る。有利な実施形態において、該方法によって産生されるＥＶは、ＮＡカーゴ分子をさらに含み、これは、融合ポリペプチド構築物の補助を受けてＥＶに装填される。典型的には、単一ＥＶはＮＡカーゴ分子のいくつかのコピーを含むが、単一ＥＶはまた、２つ以上のタイプのＮＡ薬物カーゴ分子を含んでもよい。

本発明のＥＶおよび／または本発明の医薬組成物は、１つ以上の尿素サイクル障害を治療するために使用することができる。加えて、本発明による医薬組成物は、医療に使用するために、好ましくは１つ以上の尿素サイクル障害の治療に使用するためにも適用することができる。

追加の態様において、本発明は、（ｉ）ＥＶ、（ｉｉ）少なくとも１つのポリペプチド構築物、（ｉｉｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物、（ｉｖ）少なくとも１つのベクター、および／または（ｉｖ）少なくとも１つのＥＶ産生細胞のうちのいずれか１つ以上を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む方法によって、肝臓、脳、および／もしくは末梢細胞、ならびに／または哺乳動物の任意の他の細胞区画における尿素サイクルタンパク質の量を増加させるために使用することができる。さらに、本発明は、ＵＣＤの治療を必要とする対象においてＵＣＤを治療する方法であって、（ｉ）本発明によるＥＶの集団を含む医薬組成物を提供するステップと、（ｉｉ）ＥＶを患者に投与するステップと、を含む方法にも関する。重要なことに、上述のように、治療的介入は、代替的に、ＥＶ、ポリペプチド構築物、ポリヌクレオチド構築物、細胞、および／またはかかるポリヌクレオチド構築物を含むベクターのいずれかを患者に投与することを含んでもよい。これは、様々な送達ベクター、例えば、脂質ナノ粒子、またはポリマーもしくはペプチドに基づく送達ベクターを用いて実行することができる。組成物、ＥＶ、ポリヌクレオチド、および／またはポリペプチド構築物は、様々な投与経路を介して対象に投与されてよく、例えば、本発明によるＥＶは、様々な異なる投与経路、例えば、耳介（耳）、口腔、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内（ｉｎｔｒａ－ａｂｄｏｍｉｎａｌ）、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、心臓内、軟骨内、尾内（ｉｎｔｒａｃａｕｄａｌ）、海綿体内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ）、腔内、脳内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内（歯）、冠動脈内、海綿体内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｕｓ ｃａｖｅｒｎｏｓｕｍ）、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、胸膜内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、脊髄内、滑膜内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、急速静注、静脈内点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオン導入、灌注、喉頭、鼻、経鼻胃、密封包袋技法、眼科用、経口、口腔咽頭、他の、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（吸入）、球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓膜、尿管、尿道、および／もしくは膣内投与、ならびに／または上記投与経路の任意の組み合わせを介して、ヒトまたは動物の対象に投与されてもよく、典型的には、治療される疾患および／またはＥＶ、ポリペプチドＵＣＤタンパク質および／もしくは当該ＮＡカーゴ分子の特徴、またはＥＶ集団自体に依存する。

本発明は、標的細胞を、本発明による少なくとも１つのＥＶおよび／または本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチド構築物と接触させることを含む、少なくとも１つのカーゴタンパク質またはＮＡ分子を細胞内送達するためのインビトロ方法においても利用されてもよい。かかる方法は、有利なことに、インビトロおよび／またはエクスビボで行われてもよい。該方法は、標的細胞を、本発明による少なくとも１つのＥＶ、またはより一般的には、本発明によるＥＶの集団と接触させるステップを含んでもよい。さらに、本発明によるＮＡカーゴ分子の送達方法は、本明細書の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、任意の生物系（ヒトなど）に存在する細胞に導入することも含み得る。

実施例１－ＥＶへのｍＲＮＡの装填
図３は、ＴＡＭＥＬ装填構築物（ＣＤ６３－ＭＳ２）と比較した、本発明の例示的構築物（ＣＤ６３－ＰＵＦ）によるレポーター核酸（ＮａｎｏＬｕｃ ｍＲＮＡ）をＥＶに装填する比較有効性を示す。

レポーターｍＲＮＡ（ｍＲＮＡに組み込まれたＰＵＦ結合部位またはＭＳ２結合部位のいずれかを備えたＮａｎｏＬｕｃレポーターｍＲＮＡ）を安定的に産生する細胞を、さらに、ＣＤ６３－ＰＵＦまたはＣＤ６３－ＭＳ２構築物のいずれかでそれぞれトランスフェクションした。ＥＶを産生し、これらの細胞から精製し、ＥＶに装填されたレポーターｍＲＮＡの濃度を、ＮａｎｏＬｕｃレポーターを使用して測定した。エクソソームタンパク質ＣＤ６３は、エクソソーム／ＥＶに搬送され、該エクソソームタンパク質がＲＮＡ結合タンパク質（この場合、ＰＵＦまたはＭＳ２のいずれか）に融合するため、対応する結合部位がＲＮＡ結合タンパク質によって結合され、したがって融合タンパク質と共にＥＶに同時に装填されるｍＲＮＡをもたらす。

ＣＤ６３－ＭＳ２構築物により、ＥＶへの生体活性ｍＲＮＡの装填は６倍増加する。対照的に、ＣＤ６３－ＰＵＦ構築物では、ＥＶへの生体活性ｍＲＮＡの装填が１６９倍増加する。ハウスキーピングｍＲＮＡであるＧＡＰＤＨの装填と比較して倍率増加を計算する。これは、ＣＤ６３－ＰＵＦ構築物が、ＴＡＭＥＬ ＣＤ６３－ＭＳ２装填システムと比較して、ＥＶへの生体活性ｍＲＮＡの装填の著しい改善を達成することを示す。上で論じたように、ｍＲＮＡがＭＳ２の強力な結合から放出されないため、Ｃ６３－ＭＳ２装填構築物は、生体活性ｍＲＮＡを装填することができないと考えられ、これは、翻訳されるとしても、適切に翻訳されないことを意味する。図３のデータは、本発明のＣＤ６３－ＰＵＦ構築物がこの問題を克服し、従来技術と比較して有意により高いレベルの生体活性ｍＲＮＡをＥＶに送達することを示す。

実施例２－ＥＶへの尿素サイクルタンパク質の装填
尿素サイクルタンパク質ＡＬＳ（アルギニノサクシネートリアーゼ）を装填したＨＥＫ細胞から得られたＥＶの尿素サイクル障害のモデルに及ぼす効果を、尿素生成アッセイを使用して測定し、その結果を図４に示す。

尿素生成アッセイ方法
野生型－Ｈｕｈ７細胞を、ウェル当たり１０ｋの細胞で、無血清系で培養した。１０００、１００００、および１０００００ＥＶ／細胞の濃度でＣＤ６３－インテイン－ＡＳＬでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞由来のＥＶを、野生型－Ｈｕｈ７細胞と共に４８時間インキュベーションした。試料を洗浄し、０．５ｍＭ、１ｍＭ、または５ｍＭの塩化アンモニウムと共に２４時間インキュベーションした。尿素を上清および溶解物から測定した（上清からのデータが示される）。

塩化アンモニウム中で細胞をインキュベーションすることは、尿素サイクル障害の患者からのものなどの尿素サイクル酵素が欠損している細胞中に蓄積された過剰なアンモニアを模倣するため、本発明で開示されるタンパク質補充療法を試験するための単純なモデルである。

図４は、ＡＳＬを装填したＥＶで処理した細胞が、未処理の細胞よりも有意に多くの尿素を産生することを示す。このことから、ＥＶ処理が、生物学的に有意なレベルで生体活性ＡＳＬを細胞に供給し、次いで、ＥＶによって送達される追加のＡＳＬを用いて有意な量のアンモニアを尿素に変換できることを実証することができる。このことから、尿素サイクルタンパク質を装填したＥＶは、機能性尿素サイクルタンパク質を、それを必要とする細胞に送達することによって、尿素サイクル障害の患者の治療を可能にする非常に良好な可能性を有することがわかる。

実施例３－インビトロでの無細胞ＡＳＬ酵素活性アッセイ
ＡＳＬは、アルギノコハク酸（ＡＳＡ）からアルギニンへの反応を触媒し、副生成物としてフマル酸を生じる。図５は、インビトロ、無細胞ＡＳＬ酵素活性アッセイの結果を示す。ＡＳＬ操作されたエクソソーム対野生型エクソソームおよびＡＳＡ対照処理によるフマル酸の産生を比較した。

透過剤（Ｔｗｅｅｎ２０）で処理した調製物に、基質ＡＳＡ塩（Ｓｉｇｍａ）を添加し、１８または２１分間インキュベーションした。フマル酸濃度を、Ａｂｃａｍから入手可能な比色分析キットを使用して検出した。図５から分かるように、１８分および２１分の両インキュベーション後、ＡＳＡ単独または野生型エクソソームと比較した場合、ＡＳＬ－Ｐａｌｍ－インテインを含有するように操作されたエクソソームによって産生されるフマレートの量が有意に増加した。これは、ＡＳＬタンパク質が活性であり、インテインの切断によって放出されたことを示す。

実施例４－インビボＡＳＬ活性アッセイ
ＡＳＬノックアウトマウスに、ＡＳＬ（Ｐａｌｍ－インテイン－ＡＳＬまたはＣＤ６３－インテイン－ＡＳＬ構築物の一部として）、野生型エクソソーム、またはビヒクル処置を装填したエクソソームを１５日目＋／－１日目に投与した。次いで、血中アンモニア濃度を、アンモニアアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して試験した。ＡＳＬノックアウトマウスモデルは、多くの尿素サイクル障害によって共有される症状である血中アンモニア濃度の増加を示す。

図６は、Ｐａｌｍ－インテイン－ＡＳＬ構築物またはＣＤ６３－インテイン－ＡＳＬ構築物を含有するように操作されたエクソソームが、血中アンモニア濃度を低下させる能力を有したことを明確に示す。特に、Ｐａｌｍ－インテイン構築物は、血中アンモニア濃度を野生型マウスの濃度と同様の濃度まで低下させることができた。これは、インビボのエクソソームによって送達される場合のＡＳＬタンパク質が生物学的に活性であり、かつＡＳＬを装填したエクソソームのインビボ送達が、単回治療のみの後に、ノックアウトマウスの血中アンモニア濃度を健常な濃度まで戻す能力を有したことを示す。

Claims (15)

1. 尿素サイクルタンパク質を補充するための細胞外小胞（ＥＶ）であって、前記ＥＶが、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質および／または尿素サイクルタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むように操作されることを特徴とする、細胞外小胞（ＥＶ）。
2. 前記尿素サイクルタンパク質または尿素サイクルタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アルギニノサクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、ミトコンドリアオルニチン輸送体、アルギニノコハク酸シンターゼ、Ｎ－アセチルグルタメートシンターゼ、カルバモイルホスフェートシンセターゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、シトリン、ｙ＋Ｌアミノ酸輸送体１、ウリジンモノホスフェートシンターゼ、もしくはこれらの任意の断片、誘導体、ドメイン、またはこれらの組み合わせを含む群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載のＥＶ。
3. 前記尿素サイクルタンパク質が、ＥＶ濃縮ポリペプチドを含む融合ポリペプチドに含まれる、請求項１または２に記載のＥＶ。
4. ＥＶ濃縮ポリペプチドおよび核酸（ＮＡ）結合ドメインを含む融合ポリペプチドを含む、請求項１または２に記載のＥＶ。
5. 尿素サイクルタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記融合ポリペプチドの前記ＮＡ結合ドメインの補助を受けて前記ＥＶに輸送される、請求項４に記載のＥＶ。
6. 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ウイルスゲノム、またはプラスミドであってもよい、請求項５に記載のＥＶ。
7. 前記ＮＡ結合ドメインが、ＰＵＦファミリー由来のタンパク質、Ｃａｓ６ファミリー由来のタンパク質、Ｃａｓ１３ファミリー由来のタンパク質、および／もしくは核酸アプタマー結合ドメイン、またはこれらの任意の断片、誘導体、ドメイン、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上である、請求項４～６のいずれか一項に記載のＥＶ。
8. 前記ＥＶ濃縮ポリペプチドが、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、ＡＡＲＤＣ１、パルミトイル化シグナル（Ｐａｌｍ）、シンテニン－１、シンテニン－２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、シンデカン－１、シンデカン－２、シンデカン－３、シンデカン－４、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、他のエクソソームポリペプチド、およびこれらの任意の断片、誘導体、ドメイン、または組み合わせを含む群から選択される、請求項３～７のいずれか一項に記載のＥＶ。
9. 前記融合ポリペプチドが、インテインをさらに含む、請求項３～８のいずれか一項に記載のＥＶ。
10. 前記ＥＶが、少なくとも１つの熱ショックタンパク質をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のＥＶ。
11. 前記ＥＶが、実質的に正しく折り畳まれた少なくとも１つの尿素サイクルタンパク質を含む、請求項１～３または８～１０のいずれか一項に記載のＥＶ。
12. 前記ＥＶが、目的の組織または器官に前記ＥＶを標的化することができる少なくとも１つの組織標的化部分をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＥＶ。
13. 尿素サイクルタンパク質に融合したＥＶ濃縮タンパク質を含むポリペプチド構築物。
14. 前記融合タンパク質が、インテインをさらに含む、請求項１３に記載のポリペプチド構築物。
15. 医薬組成物であって、
    （ｉ）請求項１３もしくは１４に記載の少なくとも１つのポリペプチド構築物、および／または
    （ｉｉ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＥＶと、
    薬学的に許容される賦形剤または担体と、を含む、医薬組成物。

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