JP2023161039A - ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

【課題】ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子の提供。【解決手段】本発明は、細胞への１つもしくは複数のｍＲＮＡ（治療用ｍＲＮＡ、例えば、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡなど）の送達に有用である、ペプチド含有複合体／ナノ粒子に関する。本発明は例えば、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、前記ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、前記細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、ｍＲＮＡ送達複合体を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１７年１０月１６日に出願された仏国特許出願第１７５９６４５号、および２０１８年４月１７日に出願された同第１８５３３７０号の優先権の利益を主張し、それらのすべては、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７３７３７２００１０４２ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１８年１０月１５日、サイズ：３７ＫＢ）。
発明の分野
本発明は、細胞にｍＲＮＡを送達するために有用である、ペプチド含有複合体／ナノ粒子に関する。
本明細書で言及するすべての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、それら全体が本明細書での参照により本明細書に組み入れられている。
外因性のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉが治療上利用可能であるために、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉは、標的細胞、例えば、標的疾患の疾患細胞の内部に効率的に送達されなければならない。一般に、ＲＮＡ送達は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターによって媒介され得る。非ウイルスベクターは、大規模で製造することができ、容易に操作しやすい。しかし、それらは、低い送達効率、一部の場合には細胞毒性を受ける。一方、ウイルスベクターは、親ｍＲＮＡが細胞を効率的に認識および感染させるために発達させた高度に進化した機構を利用する。しかし、それらの送達特性は、操作および改善するには困難な場合がある。よって、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉを標的細胞の内部に効率的に送達するための方法を改善する必要がある。
本出願は、細胞に１つまたは複数のｍＲＮＡ（治療用タンパク質、例えば、腫瘍抑制因子をコードするｍＲＮＡなど）を送達するために有用である、細胞膜透過ペプチドを含む複合体およびナノ粒子を提供する。ｍＲＮＡの細胞内送達により、ｍＲＮＡによってコードされる産物の発現が可能になる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質、欠損タンパク質、または非機能的タンパク質の機能的バリアントをコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、複合体およびナノ粒子は、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、例えば、内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患関連内因性遺伝子、例えば、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。
一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。
一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ａ）ｍＲＮＡを含む第１の溶液をＣＰＰを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップであって、第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、もしくはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整される（ａｄｊｕｓｔｅｄ）、ステップと；ｂ）第３の溶液をインキュベートして、ｍＲＮＡ送達複合体の形成を可能とするステップとを含むプロセスによって調製される、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の溶液は、滅菌水中にｍＲＮＡを含む、および／または第２の溶液は、滅菌水中にＣＰＰを含む。一部の実施形態では、第３の溶液は、ステップｂ）でインキュベートした後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整される。
一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡが、治療用タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、治療用タンパク質によって、欠損しているかもしくは異常であるタンパク質が置き換えられるか、既存の経路が増強されるか、新規機能もしくは活性がもたらされるか、または分子もしくは生物が干渉される。
一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ＲＮＡｉをさらに含む、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードし、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とし、ＲＮＡの発現は、疾患または状態と関連する。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号７５または７６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号１５～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号４１～５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号５３～７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号７９または８０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、ｍＲＮＡに共有結合によって連結している。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、細胞膜透過ペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核内局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体またはその断片、多糖類およびターゲティング分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、そのＮ末端に共有結合によって連結しているアセチル基を含む。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドは、細胞膜透過ペプチドのＣ末端に共有結合によって連結している１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝状Ｃ１～Ｃ６アルキル、一級または二級アミン、オシド（ｏｓｉｄｉｃ）誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核内局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体またはその断片、多糖類およびターゲティング分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、そのＣ末端に共有結合によって連結しているシステアミド基を含む。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、ｍＲＮＡ送達複合体内の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、連結によりターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、ｍＲＮＡ送達複合体は、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、下方調節のために発癌遺伝子を標的とする。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、細胞膜透過ペプチドのｍＲＮＡに対するモル比は、約１：１～約１００：１の間である。
一部の実施形態では、上記のｍＲＮＡ送達複合体のいずれかによれば、ｍＲＮＡ送達複合体の平均直径（ａｖｅｒａｇｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ）は、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍの間である。
一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体を含むコアを含むナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、コアは、１つまたは複数の追加の、上記の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体を含む。一部の実施形態では、コアは、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、下方調節のために発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡｉを含む複合体中にある。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。
一部の実施形態では、上記のナノ粒子のいずれかによれば、ナノ粒子中の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、連結によりターゲティング部分に連結している。
一部の実施形態では、上記のナノ粒子のいずれかによれば、コアは、末梢細胞膜透過ペプチド（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むシェルにより被覆されている。一部の実施形態では、末梢細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、末梢細胞膜透過ペプチドは、配列番号１～８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、シェル内の末梢細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、連結によりターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。
一部の実施形態では、上記のナノ粒子のいずれかによれば、ナノ粒子の平均直径は、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍの間である。
一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体または上記の実施形態のいずれかによるナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子中にある。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体を調製する方法であって、細胞膜透過ペプチドを１つまたは複数のｍＲＮＡと組み合わせるステップを含み、それによってｍＲＮＡ送達複合体を形成する方法が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドとｍＲＮＡは、それぞれ、約１：１～約１００：１のモル比で組み合わされる。一部の実施形態では、組み合わせるステップは、ｍＲＮＡを含む第１の溶液をＣＰＰを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップであって、第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、もしくはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整され、第３の溶液が、ｍＲＮＡ送達複合体の形成を可能とするようにインキュベートされる、ステップを含む。一部の実施形態では、第１の溶液は、滅菌水中にｍＲＮＡを含む、および／または第２の溶液は、滅菌水中にＣＰＰを含む。一部の実施形態では、第３の溶液は、インキュベートした後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整され、ｍＲＮＡ送達複合体を形成する。
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、細胞を上記の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体または上記の実施形態のいずれかによるナノ粒子と接触させるステップを含み、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞をｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞をｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ
ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞をｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、造血前駆細胞、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、心臓細胞、肝細胞、肺前駆細胞、または神経細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、それが発現される個体における免疫応答をモジュレートすることができるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ＲＮＡｉを細胞に送達するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、個体の疾患を処置する方法であって、個体に上記の実施形態のいずれかによる医薬組成物の有効量を投与するステップ含む方法が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、膀胱内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内、または経口投与を介して投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、注射によって、血管壁または血管壁を囲む組織中に投与される。一部の実施形態では、注射は、ニードルを有するカテーテルを介するものである。
一部の実施形態では、上記の疾患を処置する方法のいずれかによれば、疾患は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、血液疾患、心疾患、血管疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、肝臓疾患、肺疾患、筋肉疾患、タンパク質欠損疾患、リソソーム蓄積症、神経学的疾患、腎臓疾患、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベル異常によって特徴付けられる疾患からなる群から選択される。
一部の実施形態では、疾患は、タンパク質欠損疾患である。一部の実施形態では、医薬組成物は、疾患に寄与する欠損タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、疾患は、異常なタンパク質よって特徴付けられる。一部の実施形態では、医薬組成物は、疾患に寄与する非機能的タンパク質の機能的バリアントをコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり、医薬組成物は、固形腫瘍を処置するために有用な腫瘍抑制タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、がんは、肝臓、肺、腎臓、結腸直腸、または膵臓のがんである。一部の実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍であり、医薬組成物は、血液悪性腫瘍を処置するために有用な腫瘍抑制タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、がんの発症および／または進行に関与する発癌遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子中にある。
一部の実施形態では、上記の疾患を処置する方法のいずれかによれば、疾患は、ウイルス感染症であり、医薬組成物は、ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、上記の疾患を処置する方法のいずれかによれば、疾患は、遺伝性疾患であり、医薬組成物は、遺伝性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、上記の疾患を処置する方法のいずれかによれば、疾患は、老化または変性疾患であり、医薬組成物は、老化または変性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、上記の疾患を処置する方法のいずれかによれば、疾患は、線維性または炎症性疾患であり、医薬組成物は、線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。
一部の実施形態では、上記の疾患を処置する方法のいずれかによれば、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体および／または上記の実施形態のいずれかによるナノ粒子を含む組成物を含むキットが提供される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、前記ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、前記細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、ｍＲＮＡ送達複合体。
(項目２)
細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、前記ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、
ａ）前記ｍＲＮＡを含む第１の溶液を前記ＣＰＰを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップであって、前記第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、もしくはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整される、ステップと；
ｂ）前記第３の溶液をインキュベートして、前記ｍＲＮＡ送達複合体の形成を可能とするステップと
を含むプロセスによって調製される、ｍＲＮＡ送達複合体。
(項目３)
細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、前記ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、前記ｍＲＮＡが、治療用タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体。
(項目４)
細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、前記ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ＲＮＡｉをさらに含む、ｍＲＮＡ送達複合体。
(項目５)
前記ｍＲＮＡが、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードし、前記ＲＮＡｉが、ＲＮＡを標的とし、前記ＲＮＡの発現が、前記疾患または状態に関連する、項目４に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目６)
前記細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである、項目１から５のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目７)
前記細胞膜透過ペプチドが、前記ｍＲＮＡに共有結合によって連結している、項目１から６のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目８)
前記細胞膜透過ペプチドが、そのＮ末端に共有結合によって連結しているアセチル基を含む、項目１から７のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目９)
前記細胞膜透過ペプチドが、そのＣ末端に共有結合によって連結しているシステアミド基を含む、項目１から８のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目１０)
前記ｍＲＮＡ送達複合体における前記細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部が、連結によりターゲティング部分に連結している、項目１から９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目１１)
前記細胞膜透過ペプチドの前記ｍＲＮＡに対するモル比が、約１：１～約１００：１の間である、項目１から１０のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目１２)
前記ｍＲＮＡ送達複合体の平均直径が、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍの間である、項目１から１１のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
(項目１３)
項目１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体を含むコアを含むナノ粒子。
(項目１４)
前記コアが、１つまたは複数の追加の、項目１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体をさらに含む、項目１２に記載のナノ粒子。
(項目１５)
前記コアが、ＲＮＡｉをさらに含む、項目１３または１４に記載のナノ粒子。
(項目１６)
前記ＲＮＡｉが、下方調節のために発癌遺伝子を標的とする、項目１５に記載のナノ粒子。
(項目１７)
前記コアが、末梢細胞膜透過ペプチドを含むシェルにより被覆されている、項目１３から１６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
(項目１８)
前記末梢細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、項目１７に記載のナノ粒子。
(項目１９)
項目１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体または項目１３から１８のいずれか一項に記載のナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
(項目２０)
項目１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体を調製する方法であって、前記細胞膜透過ペプチドを１つまたは複数のｍＲＮＡと組み合わせるステップを含み、それによって前記ｍＲＮＡ送達複合体を形成する方法。
(項目２１)
前記細胞膜透過ペプチドおよび前記ｍＲＮＡが、それぞれ、約１：１～約１００：１のモル比で組み合わされる、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記組み合わせるステップが、前記ｍＲＮＡを含む第１の溶液を前記ＣＰＰを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップであって、前記第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、もしくはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整され、前記第３の溶液が、前記ｍＲＮＡ送達複合体の形成を可能とするようにインキュベートされる、ステップを含む、項目２０または２１に記載の方法。
(項目２３)
前記第１の溶液が、滅菌水中に前記ｍＲＮＡを含む、および／または前記第２の溶液が、滅菌水中に前記ＣＰＰを含む、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記第３の溶液が、インキュベートした後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整されて、前記ｍＲＮＡ送達複合体を形成する、項目２２または２３に記載の方法。
(項目２５)
１つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、前記細胞を項目１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体または項目１３から１８のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップを含み、前記ｍＲＮＡ送達複合体または前記ナノ粒子が、前記１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、方法。
(項目２６)
個体の疾患を処置する方法であって、前記個体に項目１９に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
(項目２７)
前記疾患が、がん、糖尿病、自己免疫疾患、血液疾患、心疾患、血管疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、肝臓疾患、肺疾患、筋肉疾患、タンパク質欠損疾患、リソソーム蓄積症、神経学的疾患、腎臓疾患、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベル異常によって特徴付けられる疾患からなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
(項目２８)
前記疾患が、タンパク質欠損疾患である、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
前記疾患が、がんである、項目２７に記載の方法。
(項目３０)
前記医薬組成物が、前記がんの発症および／または進行に関与する発癌遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
前記個体がヒトである、項目２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目３２)
項目１から１２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体および／または項目１３から１８のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む組成物を含むキット。
(項目３３)
個体のがんを処置する方法であって、前記個体に腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡの有効量を投与するステップを含み、前記腫瘍抑制タンパク質が、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４、またはＶＨＬから選択される腫瘍抑制遺伝子に対応する、方法。
(項目３４)
前記個体に発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの有効量を投与するステップをさらに含む、項目３３に記載の方法。
(項目３５)
前記発癌遺伝子が、ＫＲＡＳを含む、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記ｓｉＲＮＡが、ＫＲＡＳの変異体形態を標的とし、ＫＲＡＳの前記変異体形態が、ＫＲＡＳのコドン１２または６１上に変異を含む、項目３５に記載の方法。
(項目３７)
前記腫瘍抑制遺伝子が、ＰＴＥＮおよびＴＰ５３から選択される、項目３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
前記がんが、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される、項目３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目３９)
前記個体が、前記腫瘍抑制遺伝子に異常を含む、項目３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目４０)
前記個体が、前記発癌遺伝子に異常を含む、項目３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
個体の疾患または状態を処置する方法であって、治療用タンパク質またはその組換え形態をコードするｍＲＮＡの有効量を投与するステップを含み、前記治療用タンパク質が、アルファ１アンチトリプシン、フラタキシン、インスリン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、成長因子、ホルモン、ジストロフィン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α，α－ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼインヒビター、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼを含む）、アデノシンデアミナーゼ、およびアルブミンからなる群から選択される、方法。
図１Ａ～図１Ｆは、異なる緩衝液におけるＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡナノ粒子平均サイズ特徴付けを示す。ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、滅菌水（Ａ）、５％スクロース（Ｂ）または５％グルコース（Ｃ）で希釈した。ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、滅菌水（Ｄ）、５％スクロース（Ｅ）または５％グルコース（Ｆ）中に希釈した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）による測定につき３分間２５℃で決定した。
図２Ａ～図２Ｂは、異なる細胞培養培地におけるＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡナノ粒子の平均サイズ特徴付けを示す。ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ（Ａ）およびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ（Ｂ）粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、ＤＭＥＭ５０％またはｐＨ７．４（５０ｍＭ）中に希釈した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）による測定につき３分間２５℃で決定した。
図３Ａ～図３Ｄは、異なる塩条件におけるＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡナノ粒子の平均サイズ特徴付けを示す。ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ（Ａ、Ｃ）およびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ（Ｂ、Ｄ）粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、ＮａＣｌ（４０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ）またはＰＢＳ（２０％および５０％）中に希釈した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）による測定につき３分間２５℃で決定した。
図４Ａ～図４Ｂは、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡナノ粒子の平均サイズ特徴付け血清条件を示す。ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ（Ａ）およびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ（Ｂ）粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、５０％血清（ＦＣＳ）の存在または非存在下でスクロース５％中に希釈した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）による測定につき３分間２５℃で決定した。
図５は、異なる緩衝液条件でインキュベートしたＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡナノ粒子で処置したＨｅｐＧ２細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。２４ウェルプレートにおいて培養したＨｅｐＧ２細胞に、０．５μｇまたは１．０μｇのルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ナノ粒子をトランスフェクトした。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体を滅菌水中に形成させ、滅菌水、５％グルコース、５％スクロース、２０％ＰＢＳ（２０％および５０％）、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（４０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ）またはＤＭＥＭ（５０％）を含む異なる緩衝液中に希釈した。トランスフェクション３０時間後にルシフェラーゼ発現をモニターし、無処置細胞に対応するＲＬＵ（ルミネセンス（ｌｕｍｉｎｅｃｅｎｃｅ））のパーセンテージとして結果を報告した。
図６Ａ～図６Ｂは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に関するＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の評価を示す。１０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ａ）およびＡＤＧＮ－１０６／ｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ｂ）粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、異なる緩衝液（スクロース５％、グルコース５％、ＮａＣｌ ８０ｍＭまたはＰＢＳ ２０％最終濃度）中に希釈した。マウスは、１００μｌ ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体のＩＶ注射を受けた。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現は、３および６日目にバイオルミネセンスイメージングによってモニターした。また、肝臓におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。
図７は、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に関するＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の評価を示す。１０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ａ）およびＡＤＧＮ－１０６／ｌｕｃ ｍＲＮＡ（Ｂ）粒子を滅菌水中に形成させ、次いで、異なる緩衝液（スクロース５％、グルコース５％、ＮａＣｌ ８０ｍＭまたはＰＢＳ ２０％最終濃度）中に希釈した。マウスは、１００μｌ ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体のＩＶ注射を受けた。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現は、３および６日目にバイオルミネセンスイメージングによってモニターした。
図８Ａ～図８Ｂは、異なる細胞型におけるＰＴＥＮ発現のウエスタンブロット解析を示す。ＰＴＥＮのレベルを、膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞において評価した。図８Ａに示す通り、ＰＴＥＮ発現のレベルは、ＰＴＥＮ抗体を使用したウエスタンブロットによって評価し（上パネル）、ＰＴＥＮタンパク質バンドは、β－アクチンに対して正規化した（下パネル）。図８Ｂは、０．５μｇおよび１．０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体をトランスフェクトしたがん細胞型におけるＰＴＥＮ発現のウエスタンブロット解析を示す。トランスフェクション４８時間後に、細胞を解析した。
図９は、がん細胞増殖におけるＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、１μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置し、細胞増殖は、フローサイトメトリーアッセイによって６日間の期間にわたって測定した。
図１０は、がん細胞増殖におけるＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、０．５μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置し、細胞増殖は、フローサイトメトリーアッセイによって６日間の期間にわたって測定した。
図１１は、がん細胞のアポトーシス率におけるＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体（１μｇ ｍＲＮＡ）で処置した。細胞アポトーシス率（パーセンテージとして表現）は、トランスフェクション７２時間後に、ＡＰＯ ＢｒＤｕキットを使用したフローサイトメトリーによって測定した。
図１２は、がん細胞における細胞周期増殖におけるＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体（１μｇ ｍＲＮＡ）で処置した。トランスフェクション７２時間後に、細胞周期ステージは、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色キットを使用したフローサイトメトリーによって測定した。
図１３は、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＥＮ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６）の効力を示す。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）を植え込んだ。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。６群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、裸のｍＲＮＡ １０ｕｇ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１００／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＡＤＧＮ－１００／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）、ＡＤＧＮ－１０６／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）およびＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ６）を注射されたマウスに識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、７、１４、２０、２６および３３日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
図１４Ａ～図１４Ｃは、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＥＮ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６）の効力を示す。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。６群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、裸のｍＲＮＡ １０ｕｇ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１００／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＡＤＧＮ－１００／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）、ＡＤＧＮ－１０６／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）およびＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ６）を注射されたマウスに識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、７、１４、２０、２６および３３日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。図１４Ａおよび図１４Ｂは、３３日目における異なる群のバイオルミネセンスイメージングおよび総ルミネセンスの定量を示す。３３日目に、動物を屠殺し、腫瘍を収集した。図１４Ｃは、対応する腫瘍を示す。
図１５Ａ～図１５Ｃは、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＥＮ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６）の効力、および転移発生における影響を示す。実験を始める前に、腫瘍発達のために６週間の期間を置いた。２群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、およびＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇを注射されたマウス（Ｇ２）と同定した。動物に、０日目および３日目の日にＩＶ尾静脈注射した。０および７日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。図１５Ａは、対照および処置群における１日目および７日目のバイオルミネセンスイメージングを示す。図１５Ｂは、図１５Ｂに報告された選択された表面に基づく、０日目および７日目における異なる群の総ルミネセンスの定量を示す。
図１６Ａ～図１６Ｂは、ＡＤＧＮ－１０６媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ送達後の、異なる細胞型におけるＫＲＡＳレベルのウエスタンブロット解析を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、１０ｎＭおよび４０ｎＭのＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ粒子で処置した。図１６Ａは、トランスフェクション４８時間後の、異なる細胞型におけるＫＲＡＳのレベルのウエスタンブロット解析を示す。ＫＲＡＳタンパク質バンドは、β－アクチンに対して正規化した。図１６Ｂは、がん細胞増殖におけるＡＤＧＮ媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、ＡＤＧＮ－１０６：ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ複合体（１０ｎＭ、４０ｎＭ）で処置し、細胞増殖は、フローサイトメトリーアッセイによってトランスフェクション５日後に測定した。
図１７Ａ～図１７Ｂは、膵臓腫瘍マウスモデルにおける、ＡＤＧＮ－１０６を使用したｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの共投与の影響を示す。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。４群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）およびＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳ用量０．５ｍｇ／ｋｇ；ＡＤＧＮ－１０６／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）を注射されたマウスに識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。図１７Ａは、０、７、１４、２０および２６日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価したことを示す。図１７Ｂは、２６日目における異なる群のバイオルミネセンスイメージングを示す。
図１８は、ＡＤＧＮ－１００／ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおける第ＶＩＩＩ因子レベルを示す。０日目および５０日目における、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ－１００／ｓｉＦＶＩＩＩ、複合体（ｓｉＦＶＩＩＩ用量１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｕｇ）１００μｌのＩＶ注射によって、肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の一過性ノックダウンを得た。対照マウス、群Ｎ１は、裸のｓｉＲＮＡ ｓｉＦＶＩＩＩ １０ｕｇを含有する１００μｌのＩＶ注射を受け、無処置群Ｃ１は、１００μｌの食塩水緩衝液を受けた。次に、処置なし（Ｇ１）、ならびにＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（１０μｇ）（Ｇ２）、ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６（１０μｇ）（Ｇ３）および裸のＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ（１０μｇ）（Ｇ４）による１０および６０日目の注射による処置に対応する、４つの異なる群（１群当たり３匹の動物）に動物を分けた。５日毎に、血液試料において第ＶＩＩＩ因子Ｅｌｉｓａキットを使用して、第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。
図１９は、ＡＤＧＮ／ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ複合体で処置された異なるマウス群の組織学的解析を示す。食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ－１００／ｓｉＦＶＩＩＩ複合体（ｓｉＦＶＩＩＩ用量１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｕｇ）１００μｌの０日目および５０日目におけるＩＶ注射によって、肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の一過性ノックダウンを得た。対照マウス（群Ｎ１）は、裸のｓｉＲＮＡ ｓｉＦＶＩＩＩ １０ｕｇを含有する１００μｌのＩＶ注射を受け、マウス形態群Ｃ１（ｍｉｃｅ ｆｏｒｍ ｇｒｏｕｐ Ｃ１）は、無処置群として１００μｌの食塩水緩衝液を受けた。処置なし（Ｇ１）、ならびにＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（１０μｇ）（Ｇ２）およびＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６（１０μｇ）（Ｇ３）による１０および６０日目の注射による処置に対応する４つの異なる群（１群当たり３匹の動物）に、注射された動物を分けた。９０日目に、動物を屠殺し、肝臓を収集し、肝臓組織学検査によって解析した。肝臓組織の薄切片をヘマトキシリンで染色し、２００×光学顕微鏡で（２００ ｌｉｇｈｔ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）解析した。
図２０は、Ｌｕｃ２を発現するＰＡＮＣ－１およびＳＫＶＯ－３細胞におけるＡＤＧＮ－１００媒介性ルシフェラーゼ遺伝子編集を示す。２４ウェルプレートにおいて培養されたＰＡＮＣ－１およびＳＫＶＯ－３細胞に、ＡＤＧＮ－１００／ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ（０．２μｇ／２μｇまたは０．５μｇ／５μｇ）をトランスフェクトした。ＡＤＧＮ／ＣＲＩＳＰＲ複合体を滅菌水中に形成させ、５％スクロース中に希釈した。対照として、細胞は、裸のＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ（０．５μｇ／５μｇ）で処置したか、またはＲＮＡｉＭＡＸ ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ（０．５μｇ／５μｇ）をトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後にルシフェラーゼ発現をモニターし、無処置細胞に対応するＲＬＵ（ルミネセンス）のパーセンテージとして結果を報告する。
図２１Ａおよび図２１Ｂは、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてＡＤＧＮ－１００を使用した、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ（ｍＲＮＡ ＣＡＳ９：Ｌｕｃ ｇＲＮＡ）の共投与の影響を示す。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。食塩水溶液を注射された対照マウス、およびＡＤＧＮ－１００／５μｇ ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／１５μｇ Ｌｕｃ ｇＲＮＡを注射されたマウスの２群にマウスを分けた。０、７および１４日目に、動物にＩＶ尾静脈注射した。図２１Ａは、０、１４、２０および２８日目にバイオルミネセンスイメージングによって評価された腫瘍サイズ、ならびに３３日目に収集された対応する腫瘍を示す。図２１Ｂは、図２１Ａに示されている領域に基づく、０、７、１４、２０および２８日目における２群の総ルミネセンスの定量を示す。
図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＡＤＧＮペプチドと複合体を形成しているＰＴＥＮ ｍＲＮＡをトランスフェクトされたがん細胞における、ＰＴＥＮ発現のレスキューおよびアポトーシス経路の活性化を示す。図２２Ａは、異なる細胞型におけるＰＴＥＮ発現のウエスタンブロット解析を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、前立腺がん（ＰＣ３）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）におけるＰＴＥＮのレベルを評価した。トランスフェクション４８時間後に、細胞を解析した。図２２Ｂは、がん細胞のアポトーシス率におけるＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。細胞アポトーシス率（パーセンテージとして表現）は、トランスフェクション７２時間後に、ＡＰＯ ＢｒＤｕキットを使用したフローサイトメトリーによって測定した。
図２３は、ＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクション後のがん細胞増殖の阻害を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）細胞は、１μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ複合体で処置し、細胞増殖は、フローサイトメトリーアッセイによって６日間の期間にわたって測定した。
図２４は、がん細胞における細胞周期増殖におけるＡＤＧＮ媒介性ＰＴＥＮ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）細胞は、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体（１μｇ ｍＲＮＡ）で処置した。トランスフェクション７２時間後に、細胞周期ステージは、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色キットを使用したフローサイトメトリーによって測定した。
図２５Ａおよび図２５Ｂは、がん細胞の増殖における、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とするｓｉＲＮＡによるＡＤＧＮ媒介性トランスフェクションの影響を示す。図２５Ａは、トランスフェクション４８時間後の、ＡＤＧＮ媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ送達後の異なる細胞型におけるＫＲＡＳレベルのウエスタンブロット解析を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）細胞は、１０ｎＭおよび４０ｎＭのＡＤＧＮ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ粒子で処置した。ｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。ＫＲＡＳタンパク質バンドは、β－アクチンに対して正規化した。図２５Ｂは、フローサイトメトリーアッセイによって６日間の期間にわたって測定された細胞増殖を示す。 図２５Ａおよび図２５Ｂは、がん細胞の増殖における、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とするｓｉＲＮＡによるＡＤＧＮ媒介性トランスフェクションの影響を示す。図２５Ａは、トランスフェクション４８時間後の、ＡＤＧＮ媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ送達後の異なる細胞型におけるＫＲＡＳレベルのウエスタンブロット解析を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、ヒト神経膠腫（Ｕ２５）、前立腺がん（ＰＣ３）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）細胞は、１０ｎＭおよび４０ｎＭのＡＤＧＮ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ粒子で処置した。ｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。ＫＲＡＳタンパク質バンドは、β－アクチンに対して正規化した。図２５Ｂは、フローサイトメトリーアッセイによって６日間の期間にわたって測定された細胞増殖を示す。
図２６Ａ～図２６Ｃは、膵臓腫瘍マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍体積および体重における、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡによるＡＤＧＮ媒介性トランスフェクションの影響を示す。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）を植え込んだ。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。６群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、裸のｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＫＲＡＳを標的とする裸のｓｉＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）、ＡＤＧＮ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）およびＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ６）を注射されたマウスに識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、５、１２、１７、２２、２８日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。 図２６Ａ～図２６Ｃは、膵臓腫瘍マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍体積および体重における、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡによるＡＤＧＮ媒介性トランスフェクションの影響を示す。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）を植え込んだ。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。６群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、裸のｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ２）、ＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）、ＫＲＡＳを標的とする裸のｓｉＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ４）、ＡＤＧＮ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ５）およびＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ６）を注射されたマウスに識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、５、１２、１７、２２、２８日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
図２７Ａおよび図２７Ｂは、異なる細胞型におけるＰ５３発現のウエスタンブロット解析を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞におけるｐ５３のレベルを評価した。図２７Ａに示す通り、Ｐ５３発現のレベルは、Ｐ５３抗体を使用したウエスタンブロットによって評価し（上パネル）、Ｐ５３タンパク質バンドは、β－アクチンに対して正規化した（下パネル）。図２７Ｂは、０．５μｇおよび１．０μｇ Ｐ５３ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体をトランスフェクトされたがん細胞型におけるＰ５３発現のウエスタンブロット解析を示す。トランスフェクション４８時間後に、細胞を解析した。
図２８は、がん細胞増殖におけるＡＤＧＮ媒介性Ｐ５３ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、前立腺がん（ＰＣ３）、卵巣がん（ＳＫＯＶ３）およびヒト線維芽細胞（ＨＳ６８）の細胞は、１μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置し、細胞増殖は、フローサイトメトリーアッセイによって６日間の期間にわたって測定した。
図２９は、がん細胞のアポトーシス率におけるＡＤＧＮ媒介性Ｐ５３ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、前立腺がん（ＰＣ３）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）細胞は、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体（１μｇ ｍＲＮＡ）で処置した。細胞アポトーシス率（パーセンテージとして表現）は、トランスフェクション７２時間後に、ＡＰＯ ＢｒＤｕキットを使用したフローサイトメトリーによって測定した。
図３０は、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＰ５３ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６）の効力を示す。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）を植え込んだ。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。３群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、裸のｍＲＮＡ １０ｕｇ（Ｇ２）およびＡＤＧＮ－１００／１０μｇ Ｐ５３ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）を注射されたマウスに識別した。動物に、５日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、７、１４および２０日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
図３１Ａ～図３１Ｂは、がん細胞増殖におけるＡＤＧＮ媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）、前立腺がん（ＰＣ３）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）細胞は、１０ｎＭまたは４０ｎＭの、ＡＤＧＮ－１０６とコドン１２（Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ）または６１（Ｑ６１Ｋ）における変異を標的とするＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡとの複合体で処置した。ＡＤＧＮ－１０６との複合体において単一のＳｉＲＮＡまたはＳｉＲＮＡの混合物を使用した。フローサイトメトリーアッセイによってトランスフェクション６日後に細胞増殖を測定した。
図３２は、がん細胞増殖におけるＰ５３（腫瘍抑制因子）またはＰＴＥＮ（腫瘍抑制因子）ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ（発癌遺伝子）ｓｉＲＮＡのＡＤＧＮ媒介性共送達の影響を示す。膵がん（ＰＡＮＣ－１）（パネルＡ）および卵巣がん（ＳＫＯＶ３）（パネルＢ）細胞は、それぞれＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ ＰＴＥＮ（０．２５μｇ － ５．７ｎＭ）、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ Ｐ５３（０．５μｇ － １１．５ｎＭ）およびＡＤＧＮ １０６／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（Ｇ１２Ｄ／Ｇ１２Ｃ）（５ｎＭ）で処置した。トランスフェクション後８日間の期間にわたって細胞増殖を測定した。
図３３は、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ／Ｇ１２Ｄ ｓｉＲＮＡの組合せを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１０６）の効力を示す。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）を植え込んだ。実験を始める前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。３群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、裸のｓｉＲＮＡ １０ｕｇ（Ｇ２）およびＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ Ｇ１２Ｄ／Ｇ１２Ｃ ｓｉＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（Ｇ３）を注射されたマウスに識別した。動物に、５日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、７、１４および２０日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
図３４は、ＩＶおよび皮下（ＳＱ）にＡＤＧＮ－１００／ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡで処置されたマウスにおける第ＶＩＩＩ因子レベルを示す。０日目の食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中の、第ＶＩＩＩ因子エクソン１を標的とするＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ、複合体（用量０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｕｇ）１００μｌのＩＶ注射によって、肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の永続的ノックダウンを得た。群Ｇ１由来の対照マウスは、無処置群として１００μｌの食塩水緩衝液のＩＶ注射を受けた。１０日後に、処置なし（Ｇ２）、ならびにＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ ／ＡＤＧＮ－１００ ２０μｇ（Ｇ３）、４０μｇ（Ｇ４）、５０μｇ（Ｇ５）、ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６ ２０μｇ（Ｇ６）、４０μｇ（Ｇ７）、５０μｇ（Ｇ８）による１０日目のＳＱ注射、およびＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ ／ＡＤＧＮ－１００ １０μｇ（Ｇ９）によるＩＶ注射による処置に対応する８つの異なる群（１群当たり３匹の動物）に、ＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ Ｆ ＶＩＩＩを注射された動物を分けた。５日毎に第ＶＩＩＩ因子Ｅｌｉｓａキットを使用して、血液試料における第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。
図３５は、複数用量のＡＤＧＮ－１００／ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡによりＳＱで処置されたマウスにおける第ＶＩＩＩ因子レベルを示す。０日目の食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中の、第ＶＩＩＩ因子エクソン１を標的とするＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ、複合体（用量０．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｕｇ）１００μｌのＩＶ注射によって、肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の永続的ノックダウンを得た。群Ｇ１由来の対照マウスは、無処置群として１００μｌの食塩水緩衝液のＩＶ注射を受けた。１０日後に、ＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ Ｆ ＶＩＩＩを注射された動物に、初期ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００用量をＳＱ注射（４０μｇ単回ＳＱ注射）した。初期投与２週間後に、動物を５つの異なる群（１群当たり４匹の動物）に分け、異なる用量のｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ １００複合体：ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００ １０μｇ（Ｇ３、Ｑ２Ｗ）、２０μｇ（Ｇ４、Ｑ３Ｗ）、３０μｇ（Ｇ５、Ｑ４Ｗ）および４０μｇ（Ｇ６、Ｑ４Ｗ）によるＳＱ注射によって処置した。Ｅｌｉｓａ発色性第ＶＩＩＩ因子活性アッセイを使用して、第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。
図３６は、ヒト骨肉腫細胞Ｇ２９２細胞におけるＡＤＧＮ媒介性ｅＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクションを示す。ヒト骨肉腫細胞は、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置し、ｅＧＦＰ発現のレベルは、フローサイトメトリーアッセイによって７日間の期間にわたって測定した。
図３７は、ヒト骨肉腫細胞Ｇ２９２細胞におけるＡＤＧＮ媒介性Ｐ５３ ｍＲＮＡトランスフェクションを示す。ヒト骨肉腫細胞は、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置し、Ｐ５３ ＷＴ発現のレベルは、ウエスタンブロットアッセイによって７２時間後に定量した。
図３８は、ヒト骨肉腫細胞Ｇ２９２細胞増殖におけるＡＤＧＮ媒介性Ｐ５３ ｍＲＮＡトランスフェクションの影響を示す。ヒト骨肉腫細胞は、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１．０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置し、細胞増殖は、ＭＴＴアッセイによって７日間の期間にわたって測定した。
図３９は、マウスにおける噴霧化投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に関するＡＤＧＮ－１０６の評価を示す。１０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１０６／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水／スクロース５％緩衝液中に形成させた。マウスは、１００μｌ ＡＤＧＮ－ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体の非外科的気管内投与を受けた。ｍＲＮＡ Ｌｕｃ発現は、６時間後および２４時間後にバイオルミネセンスイメージングによってモニターした。
図４０は、マウスにおける噴霧化投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に関するＡＤＧＮ－１０６の評価を示す。１０μｇ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１０６／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水／スクロース５％緩衝液中に形成させた。マウスは、１００μｌ ＡＤＧＮ－ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体の非外科的気管内投与を受け、次いで、２４時間目に動物を屠殺し、バイオルミネセンスによってルシフェラーゼ発現に関して異なる器官を解析した。
図４１は、ヒト骨肉腫細胞Ｇ２９２細胞におけるＡＤＧＮ媒介性ｅＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクションを示す。ヒト骨肉腫細胞は、ｍＲＮＡまたは５ｍｏＵ ｍＲＮＡ（０．５μｇおよび１．０μｇ）のいずれかを含有するＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体で処置した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体は、トランスフェクションに先立ち、１０％または２５％ＳＶＦの非存在下または存在下で３時間インキュベートした。ｅＧＦＰ発現のレベルは、フローサイトメトリーアッセイによって６日目に測定した。
図４２は、膵臓腫瘍マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＰ５３ ｍＲＮＡと組み合わせたＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡによるＡＤＧＮ媒介性トランスフェクションの影響を示す。
図４３は、膵臓腫瘍マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍体積における、アブラキサンと組み合わせたＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよび／またはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡによるＡＤＧＮ媒介性トランスフェクションの影響を示す。
本出願は、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）および１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、複合体およびナノ粒子であって、ＣＰＰが、１つまたは複数のｍＲＮＡ（治療産物、例えば、腫瘍抑制因子をコードするｍＲＮＡなど）の細胞への送達に適する、複合体およびナノ粒子を提供する。複合体およびナノ粒子は、複数のｍＲＮＡを含むことができる。ｍＲＮＡは、例えば、治療用タンパク質（例えば、腫瘍抑制因子、免疫モジュレーターなど）をコードするｍＲＮＡを含むことができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、複合体およびナノ粒子は、標的組織、例えば、疾患組織、例えば、腫瘍に優先的に局在する。一部の実施形態では、複合体およびナノ粒子は、ＲＮＡｉ、例えば、内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患関連内因性遺伝子、例えば、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。
したがって、本出願は、一態様では、さらに下文でより詳細に説明される新規ｍＲＮＡ送達複合体およびナノ粒子を提供する。
別の態様では、細胞膜透過ペプチドを使用してｍＲＮＡを細胞に送達する方法が提供される。別の態様では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を局所組織、器官または細胞に送達する方法が提供される。別の態様では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む本明細書に記載の複合体またはナノ粒子を対象に投与することによって疾患または障害を処置する方法が提供される。
細胞膜透過ペプチドと、１つまたは複数のｍＲＮＡとを（例えば、複合体およびナノ粒子の形態で）含む医薬組成物、および疾患を処置するためのそれらの使用も提供される。
一部の態様では、ｍＲＮＡ送達複合体、ナノ粒子および医薬組成物は、有意な毒性をもたらさないが、１つまたは複数のｍＲＮＡの個体への効率的な送達を促進するという利点を有する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体およびナノ粒子の投与によって、有意なサイトカイン応答（例えば、非特異的サイトカイン応答）および／または有意な非特異的炎症応答が誘導されない。
定義
本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、当業者により理解されている当技術分野の用語であり、変異体またはバリアント形態と区別される、自然界に存在する生物、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、自然界に存在するものから逸脱するパターンを有する質を呈することを意味すると解釈されたい。
用語「天然に存在しない」または「操作された」は、交換可能で使用され、人手の関与を示す。核酸分子またはポリペプチドに言及するときのこれらの用語は、核酸分子またはポリペプチドには、それらが自然界で天然に会合している、自然界では見出されるような、少なくとも１つの他の成分が、少なくとも実質的にないことを意味する。
「相補性」は、核酸が従来のワトソン・クリック塩基対合または他の非従来型のどちらかにより別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成することができることを指す。相補性パーセントは、ある核酸分子中の、別の（ａ ｓｅｃｏｎｄ）核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる残基の、パーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補性である）。「完全に相補性の」は、核酸配列の連続する残基の全てが、別の核酸配列内の同数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補性の」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチドもしくはそれより多いヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドが鋳型ＤＮＡから（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされているポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称されることもある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
用語「対象」、「個体」および「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために交換可能で使用される。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。ｉｎ ｖｉｖｏで得られたまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの後代も包含される。
用語「治療剤」、「治療可能薬剤」または「処置剤」は、交換可能で使用され、対象へ投与されるといくらかの有益な効果を付与する分子または化合物を指す。有益な効果には、診断を下すことをできるようにすること；疾患、症状、障害または病態の軽減；疾患、症状、障害または状態の発現を低減させるまたは予防すること；および疾患、症状、障害または病態を一般に抑えることが含まれる。
本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」は、治療的利益を含むがこれに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、処置中の１つもしくは複数の疾患、状態もしくは症状の、治療に関連するあらゆる改善、または処置中の１つもしくは複数の疾患、状態もしくは症状に対する、治療に関連するあらゆる効果を意味する。
用語「有効量」または「治療有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分である薬剤の量を指す。治療有効量は、処置を受ける対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与方法などのうちの１つまたは複数に依存して変わり得、当業者は治療有効量を容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング方法のいずれか１つにより検出用の画像をもたらす用量にも当てはまる。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、撮像されるべき組織、およびそれが運ばれる物理的送達システムのうちの１つまたは複数に依存して変わり得る。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指示がない限り、複数形の言及を含む。
本明細書での「約」値またはパラメーターへの言及は、その値またはパラメーター自体に関する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
本発明の組成物および方法は、本明細書に記載の本発明の本質的要素および制限、ならびに本明細書に記載のまたは別様に有用なあらゆる追加のまたは必要に応じた構成要素、成分または制限を含むこともあり、それからなることもあり、またはそれから本質的になることもある。
別段の断り書きがない限り、専門用語は、従来の慣習に従って使用される。
ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉ
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、これらに限定されないが、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質またはペプチド、細胞膜透過ペプチド、分泌タンパク質、形質膜タンパク質、細胞質タンパク質または細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒトの疾患に関連したタンパク質、ターゲティング部分またはいかなる治療指標も特定されていないにもかかわらず、研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされているタンパク質を含むいくつかの標的カテゴリーのうちのいずれかから選択される目的のポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする領域ならびに米国特許第９，０６１，０５９号および同第９，２２１，８９１号（そのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれている）に記載されているｍＲＮＡのいずれかによる連結しているヌクレオシドの領域を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、参照ポリペプチドのポリペプチドバリアントをコードする。一部の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと同じかまたは同様の活性を有することができる。あるいは、バリアントは、参照ポリペプチドに対して変化した活性（例えば、増加したまたは減少した）を有することができる。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載のおよび当業者に公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメーターによって決定した場合、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、生物製剤をコードする。本明細書で使用される場合、「生物製剤」は、本明細書で提供される方法によって産生され、重篤なまたは生命を脅かす疾患または医学的状態を処置する、治癒させる、軽減する、予防する、または診断するために使用することができる、ポリペプチドベースの分子である。生物製剤としては、本発明に従って、これらに限定されないが、とりわけ、アレルゲン抽出物（例えば、アレルギー注射および試験用）、血液成分、遺伝子治療産物、移植に使用されるヒト組織または細胞産物、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、および免疫モジュレーターが挙げられる。一部の実施形態では、生物製剤は、現在販売されているかまたは開発中である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、抗体またはその断片（例えば、抗原結合性断片）をコードする。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、現在販売されているかまたは開発中である。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、および一本鎖分子）、および抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において「抗体」と交換可能で使用される。本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在し得る天然に存在する変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。
本明細書でのモノクローナル抗体は、具体的には、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片を含む。本明細書での目的のキメラ抗体としては、これらに限定されないが、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；ナノボディ；一本鎖抗体分子ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと指定される重鎖を含む免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つのクラスのうちのいずれかが、本発明のｍＲＮＡによってコードされ得る。サブクラス、ガンマおよびミューをコードするポリヌクレオチド配列も含まれる。したがって、抗体のサブクラスのうちのいずれかが、部分的または全体的にコードされ得、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡにおいてコードされる抗体またはその断片を利用して、血液、心臓血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科学、内分泌学、胃腸、医療イメージング、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器、感覚および抗感染を含むが、これらに限定されない治療分野における状態または疾患を処置する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡにコードされている抗体またはその断片は、モノクローナル抗体および／またはそのバリアントである。抗体のバリアントとしては、これらに限定されないが、置換バリアント、保存アミノ酸置換、挿入バリアント、欠失バリアントおよび／または共有結合誘導体も挙げられ得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡにコードされている抗体またはその断片は、免疫グロブリンＦｃ領域である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡにコードされている抗体またはその断片は、バリアント免疫グロブリンＦｃ領域である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡにコードされている抗体またはその断片は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８，２１７，１４７号に記載されているバリアント免疫グロブリンＦｃ領域を有する抗体である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、ワクチンをコードする。本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、特定の疾患または感染性病原体に対する免疫を改善する生物学的調製物である。一部の実施形態では、ワクチンは、現在販売されているかまたは開発中である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされているワクチンを利用して、これらに限定されないが、心臓血管、ＣＮＳ、皮膚科学、内分泌学、腫瘍学、免疫学、呼吸器、および抗感染などの多くの治療分野における状態または疾患を処置する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、現在販売されているかまたは開発中である。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、（ａ）欠損しているかもしくは異常であるタンパク質を置き換えるか；（ｂ）既存の経路を増強するか；（ｃ）新規機能もしくは活性をもたらすか；または（ｄ）分子もしくは生物に干渉するのに有用である。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、限定しないが、抗体ベースの薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質足場、酵素、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解剤が挙げられる。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、（ａ）標的に非共有結合によって結合すること、例えば、ｍＡｂ；（ｂ）共有結合に影響を及ぼすこと、例えば、酵素；または（ｃ）特異的の相互作用なしに活性を発揮すること、例えば、血清アルブミンによって作用する。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、組換えタンパク質である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされている治療用タンパク質を利用して、これらに限定されないが、血液、心臓血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科学、内分泌学、遺伝学、泌尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍学、および免疫学、呼吸器、感覚および抗感染などの多くの治療分野における状態または疾患を処置する。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、限定されないが、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１３４Ｌ）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン２３（ＩＬ２３）、インターロイキン３６γ（ＩＬ３６γ）、およびＣｏＡムターゼが挙げられる。
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、欠損しているかまたは異常であるタンパク質を置き換える。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、限定されないが、アルファ１アンチトリプシン、フラタキシン、インスリン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、成長因子、ホルモン、ジストロフィン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、α－ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼインヒビター、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼを含む）、アデノシンデアミナーゼ、およびアルブミン、ならびにこれらの組換え形態が挙げられる。
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、既存の経路を増強する。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、限定されないが、エリスロポエチン、エポエチン－α、ダルベポエチン－α、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、ヒト濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ルトロピン－α、Ｉ型アルファ－インターフェロン、インターフェロン－α２ａ、インターフェロン－α２ｂ、インターフェロン－αｎ３、インターフェロン－β１ａ、インターフェロン－β１ｂ、インターフェロン－γ１ｂ、インターロイキン２（ＩＬ２）、表皮胸腺細胞活性化因子（ＥＴＡＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、第ＶＩＩａ因子、活性化プロテインＣ、サケカルシトニン、ヒト副甲状腺ホルモンペプチド（例えば、残基１～３４）、インクレチン模倣体（例えば、エキセナチド）、ソマトスタチン類似体（例えば、オクトレオチド）、組換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ２）、組換えヒト骨形成タンパク質７（ｒｈＢＭＰ７）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トリプシン、および組換えＢ型ナトリウム利尿ペプチドが挙げられる。
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、新規機能または活性を提供する。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、限定されないが、Ａ型ボツリヌス毒素、Ｂ型ボツリヌス毒素、コラゲナーゼ、ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ビバリルジン、ストレプトキナーゼ、およびアニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）が挙げられる。
一部の実施形態では、治療用タンパク質は、分子または生物に干渉する。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、限定されないが、抗ＶＥＧＦＡ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗体、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ１の改変されたＦｃ部分との間の融合タンパク質、インターロイキン１（ＩＬ１）受容体アンタゴニスト、抗ＴＮＦα抗体、ＣＤ２結合タンパク質、抗ＣＤ１１ａ抗体、α４β１およびα４β７インテグリン抗体の抗α４－サブユニット、抗補体タンパク質Ｃ５抗体、抗胸腺細胞グロブリン、キメラ（ヒト／マウス）ＩｇＧ１、ＣＤ２５のアルファ鎖に結合するヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ、抗ＣＤ３抗体、抗ＩｇＥ抗体、呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質のＡ抗原部位に結合するヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ４１結合ペプチド、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリン受容体に結合するキメラ（ヒト／マウス）ｍＡｂ ７Ｅ３のＦａｂ断片、ならびに毒液毒素（ｖｅｎｏｍ ｔｏｘｉｎ）に結合し中和するＩｇＧのＦａｂ断片が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に作動可能に連結することによって作製され得る。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」とは、治療用タンパク質および荷電タンパク質が細胞に導入されたときに複合体の発現を可能にするように接続されていることを指す。本明細書で使用される場合、「荷電タンパク質」は、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を有するタンパク質を指す。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成において荷電タンパク質に共有結合によって連結される。一部の実施形態では、表面電荷の全アミノ酸または表面アミノ酸に対する比は、およそ０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）をコードする。一部の実施形態では、ＣＰＰは、１つまたは複数の検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、シグナル配列を含む。本明細書で使用される場合、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列を使用して、細胞膜透過ポリペプチドの分泌をシグナル伝達することができる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされているＣＰＰは、翻訳された後に複合体を形成することができる。一部の実施形態では、複合体は、細胞膜透過ポリペプチドに連結されている、例えば、共有結合によって連結されている荷電タンパク質を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされているＣＰＰは、第１のドメインおよび第２のドメインを含む。一部の実施形態では、第１のドメインは、超荷電ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、第２のドメインは、タンパク質結合パートナーを含む。本明細書で使用される場合、「タンパク質結合パートナー」は、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞膜透過ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーの細胞内結合パートナーをさらに含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ポリペプチドは、ｍＲＮＡが導入される細胞から分泌されることが可能である。一部の実施形態では、細胞膜透過ポリペプチドは、第１の細胞を透過することも可能である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされているＣＰＰは、第２の細胞を透過することができる。一部の実施形態では、第２の細胞は、第１の細胞と同じ領域に由来するか、または異なる領域に由来し得る。一部の実施形態では、領域は、組織および器官を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、第２の細胞は、第１の細胞の近位または遠位にある。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンパク質結合パートナーを含む細胞膜透過ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、タンパク質結合パートナーとして、これらに限定されないが、抗体、超荷電抗体または機能的断片が挙げられる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンパク質結合パートナーを含む細胞膜透過ポリペプチドが導入される細胞に導入され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、分泌タンパク質をコードする。分泌タンパク質は、本明細書または米国特許公開第２０１００２５５５７４号に記載のものから選択することができ、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
一実施形態では、これらは、大量の有益なヒト遺伝子産物の製造において使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、形質膜のタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、細胞質タンパク質または細胞骨格タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、細胞内膜結合タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、核タンパク質をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、ヒトの疾患に関連するタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、現在知られていない治療機能を有するタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、ターゲティング部分をコードする。これらには、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するかまたは特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体が含まれる。好適なタンパク質結合パートナーとして、これらに限定されないが、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが挙げられる。さらに、ｍＲＮＡを用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分もしくは生体分子の合成および細胞外局在化を指向することができる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを使用して、ポリペプチドライブラリーを生成することができる。これらのライブラリーは、それぞれ、様々な構造または化学修飾デザインを含有する、ｍＲＮＡの集団の生成から生じ得る。この実施形態では、ｍＲＮＡの集団は、本明細書に教示されるかまたは当技術分野で公知の抗体もしくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、および他のポリペプチドを含むが、これらに限定されない複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、標的細胞または培養物への直接導入に好適であり得、これにより次にはコードされたポリペプチドを合成し得る。
ある特定の実施形態では、それぞれ異なるアミノ酸修飾（複数可）を有するタンパク質の複数のバリアントは、薬物動態、安定性、生体適合性、および／もしくは生物学的活性、または発現レベルなどの生物物理学的特性の点で最善のバリアントを決定するために、産生および試験され得る。そのようなライブラリーは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０９を超える可能なバリアント（１つまたは複数の残基の置換、欠失、および１つまたは複数の残基の挿入を含むが、これらに限定されない）を含有し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）または抗ウイルス性ペプチド（ＡＶＰ）をコードする。ＡＭＰおよびＡＶＰは、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚、および哺乳動物などであるが、これらに限定されない広範な動物から単離され、説明されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００９； ３７ （Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３３－７）。例えば、抗菌性ポリペプチドは、抗菌性ペプチドデータベース（ａｐｓ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＡＰ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２００９； ３７ （Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３３－７）、ＣＡＭＰ：
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ－Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ （ｗｗｗ．ｂｉｃｎｉｒｒｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ／）；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１０； ３８ （Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７７４－８０）、米国特許第５，２２１，７３２号、米国特許第５，４４７，９１４号、米国特許第５，５１９，１１５号、米国特許第５，６０７，９１４号、米国特許第５，７１４，５７７号、米国特許第５，７３４，０１５号、米国特許第５，７９８，３３６号、米国特許第５，８２１，２２４号、米国特許第５，８４９，４９０号、米国特許第５，８５６，１２７号、米国特許第５，９０５，１８７号、米国特許第５，９９４，３０８号、米国特許第５，９９８，３７４号、米国特許第６，１０７，４６０号、米国特許第６，１９１，２５４号、米国特許第６，２１１，１４８号、米国特許第６，３００，４８９号、米国特許第６，３２９，５０４号、米国特許第６，３９９，３７０号、米国特許第６，４７６，１８９号、米国特許第６，４７８，８２５号、米国特許第６，４９２，３２８号、米国特許第６，５１４，７０１号、米国特許第６，５７３，３６１号、米国特許第６，５７３，３６１号、米国特許第６，５７６，７５５号、米国特許第６，６０５，６９８号、米国特許第６，６２４，１４０号、米国特許第６，６３８，５３１号、米国特許第６，６４２，２０３号、米国特許第６，６５３，２８０号、米国特許第６，６９６，２３８号、米国特許第６，７２７，０６６号、米国特許第６，７３０，６５９号、米国特許第６，７４３，５９８号、米国特許第６，７４３，７６９号、米国特許第６，７４７，００７号、米国特許第６，７９０，８３３号、米国特許第６，７９４，４９０号、米国特許第６，８１８，４０７号、米国特許第６，８３５，５３６号、米国特許第６，８３５，７１３号、米国特許第６，８３８，４３５号、米国特許第６，８７２，７０５号、米国特許第６，８７５，９０７号、米国特許第６，８８４，７７６号、米国特許第６，８８７，８４７号、米国特許第６，９０６，０３５号、米国特許第６，９１１，５２４号、米国特許第６，９３６，４３２号、米国特許第７，００１，９２４号、米国特許第７，０７１，２９３号、米国特許第７，０７８，３８０号、米国特許第７，０９１，１８５号、米国特許第７，０９４，７５９号、米国特許第７，１６６，７６９号、米国特許第７，２４４，７１０号、米国特許第７，３１４，８５８号、および米国特許第７，５８２，３０１号に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により組み込まれている。
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、１つまたは複数のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）による細胞融合および／またはウイルス侵入をブロックすることができる。例えば、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０またはｇｐ４１の膜貫通サブユニットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含むかまたはそれからなり得る。ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０またはｇｐ４１のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、Ｋｕｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００８）． ”ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，” Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。
一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を有し得る。
他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、カプシド結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含むかまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、カプシド結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を有し得る。
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ二量体化をブロックし、機能的タンパク質へのウイルスプロタンパク質の切断（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇ－ｐｏｌプロセシング）を阻害し、それによって、１つまたは複数のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）の放出を阻止することができる。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。
他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、プロテアーゼ結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含むかまたはそれからなり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、ウイルス性病原体に対して向けられるｉｎ ｖｉｔｒｏで進化したポリペプチドを含み得る。
抗菌性ポリペプチド（ＡＭＰ）は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、および腫瘍／がん細胞を含むが、これらに限定されない広範な微生物に対して広域スペクトルの活性を有する可変長、可変配列および可変構造の小ペプチドである（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｚａｉｏｕ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ２００７； ８５：３１７を参照のこと）。ＡＭＰが広範囲にわたる迅速に発生する殺滅活性を有し、低レベルの誘導耐性および相伴う広範囲の抗炎症効果を潜在的に有することが示されている。
一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、１０ｋＤａ未満、例えば、８ｋＤａ、６ｋＤａ、４ｋＤａ、２ｋＤａ、または１ｋＤａ未満であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、約６～約１００個のアミノ酸、例えば、約６～約７５個のアミノ酸、約６～約５０個のアミノ酸、約６～約２５個のアミノ酸、約２５～約１００個のアミノ酸、約５０～約１００個のアミノ酸、または約７５～約１００個のアミノ酸からなる。ある特定の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、約１５～約４５個のアミノ酸からなり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的にカチオン性である。
一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的に両親媒性であり得る。ある特定の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、実質的にカチオン性および両親媒性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陰性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陰性細菌に対して細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組合せに対して細胞増殖抑制性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組合せに対して細胞傷害性であり得る。ある特定の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組合せに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍またはがん細胞（例えば、ヒト腫瘍および／またはがん細胞）に対して細胞傷害性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍またはがん細胞（例えば、ヒト腫瘍および／またはがん細胞）に対して細胞増殖抑制性であり得る。ある特定の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍またはがん細胞（例えば、ヒト腫瘍またはがん細胞）に対して細胞傷害性および細胞増殖抑制性であり得る。一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）は、分泌ポリペプチドであり得る。
一部の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、デフェンシンを含むかまたはそれからなる。例示的なデフェンシンとしては、これらに限定されないが、α－デフェンシン（例えば、好中球デフェンシン１、デフェンシンアルファ１、好中球デフェンシン３、好中球デフェンシン４、デフェンシン５、デフェンシン６）、β－デフェンシン（例えば、ベータ－デフェンシン１、ベータ－デフェンシン２、ベータ－デフェンシン１０３、ベータ－デフェンシン１０７、ベータ－デフェンシン１１０、ベータ－デフェンシン１３６）、およびθ－デフェンシンが挙げられる。他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、カテリシジン（例えば、ｈＣＡＰ１８）を含むかまたはそれからなる。
抗ウイルス性ポリペプチド（ＡＶＰ）は、広範なウイルスに対して広域スペクトルの活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである。例えば、Ｚａｉｏｕ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ２００７； ８５：３１７を参照されたい。ＡＶＰは、広範囲にわたる迅速に発生する殺滅活性を有し、低レベルの誘導耐性および相伴う広範囲の抗炎症効果を潜在的に有することが示されている。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、１０ｋＤａ未満、例えば、８ｋＤａ、６ｋＤａ、４ｋＤａ、２ｋＤａ、または１ｋＤａ未満である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、約６～約１００個のアミノ酸、例えば、約６～約７５個のアミノ酸、約６～約５０個のアミノ酸、約６～約２５個のアミノ酸、約２５～約１００個のアミノ酸、約５０～約１００個のアミノ酸、または約７５～約１００個のアミノ酸を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、約１５～約４５個のアミノ酸を含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的に両親媒性である。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性および両親媒性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組合せに対して細胞増殖抑制性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組合せに対して細胞傷害性である。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組合せに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍またはがん細胞（例えば、ヒトがん細胞）に対して細胞傷害性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍またはがん細胞（例えば、ヒトがん細胞）に対して細胞増殖抑制性である。ある特定の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍またはがん細胞（例えば、ヒトがん細胞）に対して細胞傷害性および細胞増殖抑制性である。一部の実施形態では、抗ウイルス性ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込む。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、ｍＲＮＡ、例えば、二機能性修飾ＲＮＡまたはｍＲＮＡに組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシド抗がん剤としては、これらに限定されないが、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ＦＴＯＲＡＦＵＲ（登録商標）（テガフールおよびウラシルの組合せ）、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、および６－メルカプトプリンが挙げられる。
いくつかの細胞傷害性ヌクレオシド類似体は、臨床で使用されるか、または抗がん剤として臨床試験の対象になっている。そのような類似体の例としては、これらに限定されないが、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、デシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、クラドリビン、クロファラビン、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシンおよび１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシンが挙げられる。そのような化合物の別の例は、リン酸フルダラビンである。これらの化合物は、全身投与され得、これらに限定されないが、増殖している正常細胞を上回る腫瘍細胞に対する特異性がほとんどまたは全くないなどの、細胞傷害性薬剤に典型的な副作用を有し得る。
細胞傷害性ヌクレオシド類似体のいくつかのプロドラッグも当技術分野において報告されている。例としては、これらに限定されないが、Ｎ４－ベヘノイル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、およびＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。一般に、これらのプロドラッグは、主に肝臓および体循環において活性薬物に変換され、腫瘍組織における活性薬物の選択的放出をほとんどまたは全く示すことができない。例えば、５’－デオキシ－５－フルオロシチジン（最終的に、５－フルオロウラシル）のプロドラッグであるカペシタビンは、肝臓および腫瘍組織内の両方で代謝される。「生理学的条件下で容易に加水分解可能なラジカル」を含有する一連のカペシタビン類似体は、Ｆｕｊｉｕら（米国特許第４，９６６，８９１号）によって特許請求されており、参照により本明細書に組み込まれている。Ｆｕｊｉｕによって説明されるこの一連のカペシタビン類似体は、５’－デオキシ－５－フルオロシチジンのＮ４アルキルおよびアラルキルカルバミン酸塩を含み、これらの化合物が正常な生理学的条件下で加水分解によって活性化されて、５’－デオキシ－５－フルオロシチジンをもたらすことを暗示する。
一連のシタラビンＮ４－カルバミン酸塩が、Ｆａｄｌら（参照により本明細書に組み込まれているＰｈａｒｍａｚｉｅ． １９９５， ５０， ３８２－７）によって報告されており、そこで、化合物は、肝臓および血漿においてシタラビンに変換するように設計された。参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００４／０４１２０３は、ゲムシタビンのプロドラッグを開示しており、そこで、プロドラッグのうちのいくつかは、Ｎ４－カルバミン酸塩である。これらの化合物は、ゲムシタビンの胃腸毒性を克服するように設計されており、無傷プロドラッグを胃腸管から吸収した後に、肝臓および血漿における加水分解放出によってゲムシタビンを提供するよう意図された。Ｎｏｍｕｒａら（参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００３， １１， ２４５３－６１）は、生体内還元時に、酸性条件下でさらなる加水分解を必要とする中間体を生成して、細胞傷害性ヌクレオシド化合物を生成した１－（３－Ｃ－エチニル－β－Ｄ－リボ－ペントファラノシル）シトシンのアセタール誘導体を記載している。
化学療法薬であり得る細胞傷害性ヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、ピラゾロ［３，４－Ｄ］－ピリミジン、アロプリノール、アザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、６－チオグアニン、アシクロビル、アラ－アデノシン、リバビリン、７－デアザ－アデノシン、７－デアザ－グアノシン、６－アザ－ウラシル、６－アザ－シチジン、チミジンリボヌクレオチド、５－ブロモデオキシウリジン、２－クロロ－プリン、およびイノシン、またはこれらの組合せが挙げられる。
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが、翻訳されない。５’ＵＴＲが転写開始部位で始まり、開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性に関して、ＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が相次いでいる。ＵＴＲの調節フィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）は、本発明のｍＲＮＡに組み込まれ、分子の安定性を増強し得る。特定のフィーチャも組み込まれて、それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方調節を確実にすることができる。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始のために役割を果たすフィーチャを有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲＣＣＡＵＧＧ（配列番号９１）を有し、この配列中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドンの後に別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られるフィーチャを操作することによって、本発明のｍＲＮＡの安定性およびタンパク質産生を増強することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子などの肝臓で発現したｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入を使用して、肝細胞系または肝臓でのｍＲＮＡなどの核酸分子の発現を増強することができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを使用して、その組織での発現を改善することは、筋肉（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）および肺上皮細胞（ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に関して可能である。
他の非ＵＴＲ配列は、５’ＵＴＲ（または３’ＵＴＲ）に組み込まれ得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のｍＲＮＡの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生およびｍＲＮＡレベルを増加させ得る。
３’ＵＴＲは、それらに包理される一続きのアデノシンおよびウリジンを有することが公知である。これらのＡＵリッチなシグネチャーは、高代謝回転率を有する遺伝子において特によく見られる。それらの配列フィーチャおよび機能的特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分けることができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，
１９９５）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ－ＭｙｃおよびＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、２つまたはそれより多い重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）九量体を有する。この種のＡＲＥを含有する分子は、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦ－ａを含む。クラスＩＩＩのＡＲＥは、あまり明確にされていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎおよびミオゲニンは、このクラスの２つの十分に研究された例である。ＡＲＥに結合しているほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが公知であるが、一方、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、中でも注目すべきＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を向上させることが実証されている。ＨｕＲは、３つのクラスすべてのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を操作して核酸分子の３’ＵＴＲに入れることで、ＨｕＲ結合、ひいてはｉｎ ｖｉｖｏでのメッセージの安定化をもたらす。
３’ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用して、本発明のｍＲＮＡの安定性をモジュレートすることができる。特定のｍＲＮＡを操作する場合に、ＡＲＥの１つまたは複数のコピーを導入することによって、本発明のｍＲＮＡの安定性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥが同定されて除去されるかまたは変異されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。本発明のｍＲＮＡを使用するトランスフェクション実験を関連細胞系において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるＡＲＥ操作分子でトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを使用し、トランスフェクションの６時間、１２時間、２４時間、４８時間、および７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるかまたは翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方調節する１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、１つまたは複数のｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、またはｍｉｃｒｏＲＮＡ種を含む。そのような配列は、米国特許公開第２００５／０２６１２１８号および米国特許公開第２００５／００５９００５号に教示されるものなどの任意の公知のｍｉｃｒｏＲＮＡに対応し得、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「種」領域、すなわち、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２～８位の領域における配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン－クリック相補性を有する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ種は、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２～８位または２～７位を含み得る。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ種は、７個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における種相補的部位は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの１位と向き合うアデニン（Ａ）に隣接している。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ種は、６個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における種相補的部位は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの１位と向き合うアデニン（Ａ）に隣接している。例えば、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ， Ｆａｒｈ Ｋ Ｋ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｗ Ｋ， Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ， Ｌｉｍ Ｌ Ｐ， Ｂａｒｔｅｌ Ｄ Ｐ； Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．
２００７ Ｊｕｌ． ６； ２７（１）：９１－１０５を参照されたい。ｍｉｃｒｏＲＮＡ種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列を操作して、本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、問題のｍｉｃｒｏＲＮＡが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低減する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的領域、およびそれらの発現パターンの同定ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９；Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３ （２０１１ Ｄｅｃ． ２０． ｄｏｉ： １０．１０３８／１ｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ２００７ １２９：１４０１－１４１４）。
例えば、核酸分子が、ｍＲＮＡであり、肝臓に送達されることが意図されないが、そこに行き着く場合、次には、肝臓中に豊富なｍｉｃｒｏＲＮＡであるｍｉＲ－１２２は、ｍｉＲ－１２２の１つまたは複数の標的部位が操作されて、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに入れられると、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。異なるｍｉｃｒｏＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入を操作して、ｍＲＮＡの長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに低下させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位」は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的部位もしくはｍｉｃｒｏＲＮＡ認識部位、またはｍｉｃｒｏＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン－クリックハイブリダイゼーション規則に従い得るか、またはｍｉｃｒｏＲＮＡの、ｍｉｃｒｏＲＮＡ部位のもしくはｍｉｃｒｏＲＮＡ部位に隣接する標的配列との任意の安定した会合を反映し得ることを理解されたい。
逆に、本発明のｍＲＮＡの目的のために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位が天然に存在する配列から操作する（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位を除去して、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。複数の組織での発現の調節は、１つまたはいくつかのｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成され得る。
ｍｉｃｒｏＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによって、タンパク質発現を調節することが公知である組織の例としては、これらに限定されないが、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄性細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられる。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ－１３２）などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６）。本発明のｍＲＮＡにおいて、そのようなプロセスに関与するｍｉｃｒｏＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連した細胞型に、または関連生物学的プロセスの環境に、ｍＲＮＡの発現の発現（ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を合わせるために除去または導入され得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲ配列およびｍｉＲ結合部位の一覧が、２０１３年１月１７日出願の米国仮出願第６１／７５３，６６１号の表９、２０１３年１月１８日出願の米国仮出願第６１／７５４，１５９号の表９、および２０１３年１月３１日出願の米国仮出願第６１／７５８，９２１号の表７に列挙されており、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
組織または疾患特異的遺伝子発現を駆動するためのｍｉｃｒｏＲＮＡの使用例が列挙されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｅｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ． ２０１２， ８０：３９３－４０３）。加えて、ｍｉｃｒｏＲＮＡシード部位は、ｍＲＮＡに組み込まれてある特定の細胞における発現を低減させる場合があり、これは、生物学的改善をもたらす。これについての例は、ｍｉＲ－１４２部位のＵＧＴ１Ａ１発現レンチウイルスベクターへの組み込みである。ｍｉＲ－１４２シード部位の存在が造血細胞での発現を低減させ、結果として抗原提示細胞での発現を低減させ、ウイルスによって発現したＵＧＴ１Ａ１に対する免疫応答の非存在をもたらした（いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１０； １３９：９９９－１００７； Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ａｓｅｑｕｉｎｏｌａｚａ ｅｔ ａｌ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１０， １３９：７２６－７２９）。ｍｉＲ－１４２部位の修飾ｍＲＮＡへの組み込みは、造血細胞におけるコードされたタンパク質の発現を低減させることができただけでなく、ｍＲＮＡでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低減または無効にすることもできた。ｍｉＲ－１４２シード部位（１つまたは複数）のｍＲＮＡへの組み込みは、完全なタンパク質欠損を有する患者（Ｉ型ＵＧＴ１Ａ１、ＬＤＬＲ欠損患者、ＣＲＩＭ陰性Ｐｏｍｐｅ患者など）の処置の場合に重要である。
最後に、異なる細胞型におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現パターンの理解を通して、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、特定の細胞型におけるまたは特定の生物学的状態下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の導入によって、組織におけるまたは生物学的状態に関連したタンパク質発現に対して最適となるｍＲＮＡが設計され得る。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡを使用して、トランスフェクション実験を関連細胞系において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位操作ｍＲＮＡ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍＲＮＡ）でトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを使用して、トランスフェクションの６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を操作した分子を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を行い、製剤化されたｍＲＮＡの組織特異的発現の変化を試験することもできる。
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を向上させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して細胞におけるｍＲＮＡ安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。このキャップは、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位のイントロン除去の除去をさらに支援する。
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャップされて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸連結をもたらし得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端（ｅｎｄ）の末端（ｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドおよび／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖も、必要に応じて２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介する５’デキャッピングは、分解のために、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的とし得る。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡの修飾は、デキャッピングを阻止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、よって、ｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル連結の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドが、キャッピング反応中に使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．）のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用して、５’－ｐｐｐ－５’キャップにおけるホスホロチオエート連結をもたらすことができる。α－メチル－ホスホネートおよびセレノ－ホスフェートヌクレオチドなどの追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用することができる。
追加の修飾としては、これらに限定されないが、糖環の２’－ヒドロキシル基におけるｍＲＮＡの５’末端および／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’－Ｏ－メチル化（上述のもの）が挙げられる。複数の別個の５’－キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子の５’キャップを生成することができる。
本明細書において、合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造もしくは機能キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造において、天然の（すなわち、内因性、野生型または生理学的）５’キャップとは異なるが、キャップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）もしくは酵素的に合成されるおよび／または核酸分子に連結され得る。
例えば、抗逆方向キャップ類似体（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結している２つのグアニンを含有し、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基および３’－Ｏ－メチル基（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは同等に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定され得る）を含有する。他方の未修飾グアニンの３’－Ｏ原子は、キャップ化核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７－および３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャップ化核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分をもたらす。
別の例示のキャップはｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシン上に２’－β－メチル基（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）を有する。
キャップ類似体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において相伴う核酸分子のキャッピングを可能にする一方で、転写物の最大２０％がキャップされないままであり得る。これと、内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’－キャップ構造とのキャップ類似体の構造差とは、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、より真正の５’－キャップ構造を生成するために、酵素を使用して、転写後にもキャップされ得る。本明細書で使用される場合、表現「より真正の」は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型のフィーチャを密接に反映するかまたは模倣するフィーチャを指す。すなわち、「より真正の」フィーチャは、先行技術の合成フィーチャもしくは類似体などと比較して、より良好に内因性、野生型、天然もしくは生理学的細胞機能および／もしくは構造を表しているか、または、対応する内因性、野生型、天然もしくは生理学的フィーチャについて１つもしくは複数の点においてより優れた性能を示すものである。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例は、当技術分野で公知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然または生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、キャップ結合タンパク質の強化された結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低下した感受性および／または低下した５’デキャッピングを有するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の５’－５’－三リン酸連結を生じさせることができ、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。そのような構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性および細胞炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造としては、これらに限定されないが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐ（キャップ１）、および７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられる。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは転写後にキャップ化される場合があるため、かつ、このプロセスがより効率的であるため、ほぼ１００％のｍＲＮＡがキャップされ得る。これは、キャップ類似体がｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の過程でｍＲＮＡに連結している場合の約８０％とは対照的である。
本発明に従って、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、これらに限定されないが、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、および２－アジド－グアノシンが挙げられる。
大麦黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）の翻訳エンハンサー配列、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス（ＪＳＲＶ）および／または地方病性鼻腔内腫瘍ウイルス（ｅｎｚｏｏｔｉｃ ｎａｓａｌ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２１２９６４８号を参照されたい）などであるが、これらに限定されない追加のウイルス配列を、操作して、本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで構築物の翻訳を刺激することができる。トランスフェクション実験を関連細胞系において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をトランスフェクションの１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日後にアッセイすることができる。
さらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有し得る本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡが提供される。最初にフィーチャピコルナウイルスＲＮＡとして同定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の非存在下でタンパク質合成を開始する際に重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの唯一のリボソーム結合部位として作用し得、または複数のリボソーム結合部位のうちの１つとしての役割を果たし得る。１つより多くの機能的リボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡは、リボソーム（「マルチシストロン性核酸分子」）によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。ｍＲＮＡにＩＲＥＳが提供されるとき、第２の翻訳可能な領域がさらに必要に応じて提供される。本発明に従って使用することができるＩＲＥＳ配列の例としては、限定されないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。
ＲＮＡプロセシングの間、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテイル）が、安定性を向上させるためにｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の３’末端が切断されて３’ヒドロキシルを遊離させ得る。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、およそ１００～２５０残基長であり得るポリＡテイルを付加する。
一般に、本発明のポリＡテイルの長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリＡテイルは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、および３，０００ヌクレオチドであるかまたはこれらを超える）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約３０～約３，０００個のヌクレオチド（例えば、３０～５０個、３０～１００個、３０～２５０個、３０～５００個、３０～７５０個、３０～１，０００個、３０～１，５００個、３０～２，０００個、３０～２，５００個、５０～１００個、５０～２５０個、５０～５００個、５０～７５０個、５０～１，０００個、５０～１，５００個、５０～２，０００個、５０～２，５００個、５０～３，０００個、１００～５００個、１００～７５０個、１００～１，０００個、１００～１，５００個、１００～２，０００個、１００～２，５００個、１００～３，０００個、５００～７５０個、５００～１，０００個、５００～１，５００個、５００～２，０００個、５００～２，５００個、５００～３，０００個、１，０００～１，５００個、１，０００～２，０００個、１，０００～２，５００個、１，０００～３，０００個、１，５００～２，０００個、１，５００～２，５００個、１，５００～３，０００個、２，０００～３，０００個、２，０００～２，５００個、および２，５００～３，０００個）を含む。
一実施形態では、ポリＡテイルは、ｍＲＮＡ全体の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定のフィーチャもしくは領域の長さ（第１または隣接領域など）に基づくか、またはｍＲＮＡから発現した最終産物の長さに基づいてもよい。
この文脈では、ポリＡテイルは、ｍＲＮＡまたはそのフィーチャよりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長い長さであり得る。ポリＡテイルは、それが属するｍＲＮＡの画分としても設計され得る。この文脈では、ポリＡテイルは、構築物の全長またはポリＡテイルを差し引いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％もしくはそれを超え得る。さらに、結合部位の操作、およびｍＲＮＡのポリＡ結合タンパク質へのコンジュゲーションは、発現を高め得る。
加えて、複数の別個のｍＲＮＡは、ポリＡテイルの３’末端で、修飾されたヌクレオチドを使用して３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）に一緒に連結していてもよい。トランスフェクション実験を関連細胞系において行うことができ、ＥＬＩＳＡによってタンパク質産生をトランスフェクションの１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日後にアッセイすることができる。
本発明のｍＲＮＡおよび本明細書に記載のｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。それらは、医薬において使用するために提供される。例えば、本明細書に記載のｍＲＮＡは、対象に投与することができ、このｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて、対象において治療的または予防的ポリペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の診断、処置または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ｍＲＮＡを含有する細胞またはｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態では、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質とともに、哺乳動物対象の免疫をブーストするタンパク質（複数可）をコードする翻訳可能領域を含有する、１つまたは複数のｍＲＮＡを含有する、組合せ治療薬が本明細書で提供される。例えば、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）をコードする１つまたは複数の核酸を含有する治療薬が本明細書で提供される。特に、そのような組合せ治療薬は、トラスツズマブへの誘導耐性を生じるＨｅｒ２＋乳がん患者において有用である。（例えば、Ａｌｂｒｅｃｈｔ， Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． ２（６）：７９５－８ （２０１０）を参照されたい）。
本明細書に記載のｍＲＮＡを使用して、細胞集団内で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が、本明細書で提供される。そのような翻訳は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、培養下、またはｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。細胞集団を、少なくとも１つのヌクレオシド修飾、および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する組成物の有効量と接触させる。集団を、核酸が細胞集団のうちの１つまたは複数の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような条件下で接触させる。
組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特徴（例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの程度）、および他の決定因子に基づいて与えられる。一般に、組成物の有効量は、細胞内での効率的なタンパク質産生、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりも効率的なタンパク質産生をもたらす。効率の増加は、細胞トランスフェクションの増加（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の持続期間の増加によって実証される）、または宿主細胞の自然免疫応答の低減によって実証することができる。
本発明の態様は、組換えポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を誘導することを必要とする哺乳動物対象において組換えポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ翻訳を誘導する方法を対象とする。その中で、少なくとも１つの構造修飾または化学修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する組成物の有効量は、本明細書に記載の送達方法を使用して対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような量および他の条件下で提供される。核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、１回または１回より多い回数の核酸投与により標的とされ得る。
ある特定の実施形態では、投与されるｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織または生物内に実質的に存在しない機能的活性を提供する、１つまたは複数の組換えポリペプチドの産生を指示する。例えば、欠損した機能的活性は、本来の酵素的、構造的、または遺伝子調節的であり得る。関連する実施形態では、投与されるｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に存在しているが、実質的に不全である機能的活性を増加させる（例えば、相乗的に）１つまたは複数の組換えポリペプチドの産生を指示する。
他の実施形態では、投与されるｍＲＮＡは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に実質的に存在しない１つのポリペプチド（または複数のポリペプチド）を置き換える、１つまたは複数の組換えポリペプチドの産生を指示する。そのような非存在は、コード遺伝子の遺伝子変異またはその制御経路に起因し得る。一部の実施形態では、組換えポリペプチドは、細胞内の内因性タンパク質のレベルを所望のレベルまで増加させ、そのような増加は、内因性タンパク質のレベルを正常未満のレベルから正常なレベルへと、または正常なレベルから過正常なレベルへと至らせ得る。
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、細胞表面の、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、内因性タンパク質の変異が変化した活性または局在化をもたらすことに起因して、対象に対して有害である。加えて、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、細胞表面の、または細胞から分泌される生体部分の活性に、直接的または間接的に拮抗する。拮抗した生物学的部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低密度リポタンパク質）、核酸、炭水化物、志賀毒素および破傷風毒素などのタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素などの小分子毒素が挙げられる。加えて、拮抗した生物学的分子は、細胞傷害性活性または細胞増殖抑制性活性などの望ましくない活性を示す内因性タンパク質であってもよい。
本明細書に記載の組換えタンパク質は、細胞内、潜在的に核などの特定の区画内での局在化のために操作されてもよく、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移行のために操作される。
一部の実施形態では、本発明に従う修飾ｍＲＮＡおよびそれらのコードされたポリペプチドは、次のうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない多様な疾患、障害、および／または状態のいずれの処置に対して使用されてもよい：自己免疫障害（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染性疾患（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ、チクングニヤウイルス、ジカウイルス、インフルエンザウイルス）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経学的障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管新生障害）；増殖性障害（例えば、がん、良性新生物）；呼吸器障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎疾患）；精神障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ系障害（例えば、貧血、血友病）など。
機能不全のまたは異常なタンパク質活性によって特徴付けられる疾患としては、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、およびグルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症が挙げられる。本発明は、本明細書で提供されるｍＲＮＡを含有する核酸または細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象におけるそのような状態または疾患を処置するための方法であって、ｍＲＮＡが、対象の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するかまたはそうでなければそれを克服するタンパク質をコードする、方法を提供する。機能不全のタンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の機能不全のタンパク質バリアントを産生する、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス変異バリアントである。
欠損した（または適正な（正常なまたは生理学的タンパク質機能が生じないほどに実質的に低下した）タンパク質活性によって特徴付けられる疾患としては、嚢胞性線維症、ニーマンピック病Ｃ型、重症型βサラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、および血友病Ａが挙げられる。そのようなタンパク質は、存在しない場合があるか、または本質的に非機能的である。本発明は、本明細書で提供されるｍＲＮＡを含有する核酸または細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象におけるそのような状態または疾患を治療するための方法であって、ｍＲＮＡが、対象の標的細胞から欠損したタンパク質活性を置き換えるタンパク質をコードする、方法を提供する。機能不全のタンパク質の具体的な例は、嚢胞性線維症を引き起こすＣＦＴＲタンパク質の非機能的なタンパク質バリアントを産生する、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のナンセンス変異バリアントである。
したがって、哺乳動物対象の細胞を、ＣＴＦＲポリペプチドの有効量が細胞内に存在するような条件下で、機能的ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有するｍＲＮＡと接触させることによって、哺乳動物対象における嚢胞性線維症を処置する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺などの上皮、内皮および中皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定される；すなわち、肺送達では、ＲＮＡ分子は、吸入による投与のために製剤化される。
別の実施形態では、本発明は、対象の細胞集団に、ゲノム研究によって最近特徴付けられたタンパク質であるＳｏｒｔｉｌｉｎをコードする修飾ｍＲＮＡ分子を用いて導入し、それによって、対象において高脂血症を軽減することによって、対象における高脂血症を処置するための方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、Ｓｏｒｔｉｌｉｎと呼ばれるトランスゴルジ網（ＴＧＮ）膜貫通タンパク質をコードする。遺伝子研究により、５つの個体のうちの１つが、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座において、低レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を持つ素因を与える一塩基多型ｒｓ１２７４０３７４を有することが示されている。人々の約３０％において存在するこのマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ変化させる一方で、集団の約５％において存在するこのマイナー対立遺伝子の２つのコピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ低下させる。このマイナー対立遺伝子の保有者は、心筋梗塞のリスクが４０％低下したことも示されている。マウスにおける機能的ｉｎ
ｖｉｖｏ研究では、マウス肝臓組織内のＳＯＲＴ１の過剰発現が、最大８０％より低い、有意により低いＬＤＬコレステロールレベルをもたらし、ＳＯＲＴ１のサイレンシングがＬＤＬコレステロールをおよそ２００％増加させたことが記載されている（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ Ｋ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｍ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ ｔｏ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｖｉａ ＳＯＲＴ１ ａｔ ｔｈｅ １ｐ１３ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｏｃｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１０； ４６６： ７１４－７２１）。
別の実施形態では、本発明は、造血障害、心血管疾患、腫瘍学、糖尿病、嚢胞性線維症、神経学的疾患、先天性代謝異常、皮膚および全身障害、ならびに失明を処置するための方法を提供する。これらの特定の疾患を処置するための分子標的の同定が記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｄ．， Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， ３．ｓｕｐ．ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｏｔａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）。
感染および／または敗血症を発症するリスクがある対象における感染および／または敗血症を予防する方法であって、そのような予防を必要とする対象に、感染および／または敗血症を予防するのに十分な量で、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）、またはその部分的もしくは完全にプロセシングされた形態をコードするｍＲＮＡ前駆体を含む組成物を投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、感染および／または敗血症を発症するリスクがある対象は、がん患者であり得る。ある特定の実施形態では、がん患者は、コンディショニングレジメンを経験したことがあってもよい。一部の実施形態では、コンディショニングレジメン（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎｔ）は、化学療法、放射線療法、または両方を含むが、これらに限定されない。非限定的な例として、ｍＲＮＡは、プロテインＣ、その酵素前駆体もしくはプレプロタンパク質、プロテインＣの活性化形態（ＡＰＣ）または当技術分野で公知のプロテインＣのバリアントをコードし得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、化学修飾され、細胞に送達される。本発明の化学修飾されたｍＲＮＡ内でコードされ得るポリペプチドの非限定的な例としては、そのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，２２６，９９９号、同第７，４９８，３０５号、同第６，６３０，１３８号に教示されるものが挙げられる。これらの特許は、プロテインＣ様分子、バリアントおよび誘導体を教示し、これらのすべては本発明の化学修飾された分子内でコードされ得る。
対象における感染および／または敗血症を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする対象に、感染および／または敗血症を処置するのに十分な量で、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチド、またはその部分的もしくは完全にプロセシングされた形態をコードするｍＲＮＡ前駆体を含む組成物を投与するステップを含む方法が本明細書でさらに提供される。ある特定の実施形態では、処置を必要とする対象は、がん患者である。ある特定の実施形態では、がん患者は、コンディショニングレジメンを経験したことがある。一部の実施形態では、コンディショニングレジメンは、化学療法、放射線療法、または両方を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、対象は、急性または慢性の微生物感染（例えば、細菌感染）を示す場合がある。ある特定の実施形態では、対象は、治療を受けたことがあってもよくまたは受けていてもよい。ある特定の実施形態では、治療としては、これらに限定されないが、放射線療法、化学療法、ステロイド、紫外線照射、またはそれらの組合せを挙げることができる。ある特定の実施形態では、患者は、微小血管障害を患っている場合がある。一部の実施形態では、微小血管障害は、糖尿病であり得る。ある特定の実施形態では、患者は、創傷を有している場合がある。一部の実施形態では、創傷は、潰瘍であり得る。具体的な実施形態では、創傷は、糖尿病性足部潰瘍であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、１つまたは複数の熱傷創を有し得る。ある特定の実施形態では、投与は、局所であっても全身であってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、皮下であってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、静脈内であってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、経口であってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、局所であってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、吸入によるものであってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、直腸であってもよい。ある特定の実施形態では、投与は、膣であってもよい。
本開示の他の態様は、哺乳動物対象へのｍＲＮＡを含有する細胞の移植に関する。哺乳動物対象への細胞の投与については、当業者に公知であり、局所（ｌｏｃａｌ）移植（例えば、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）または皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈内注射または吸入）、および薬学的に許容される担体中の細胞の製剤を含むが、これらに限定されない。ｍＲＮＡを含有するそのような組成物は、筋肉内に、経動脈的に、腹腔内に、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、内視鏡的に、経皮的に、または髄腔内に投与するために製剤化することができる。一部の実施形態では、組成物は、持続放出のために製剤化されてもよい。
治療剤が投与され得る対象は、疾患、障害、または有害な状態を患っているかまたはそれを発症するリスクがある場合がある。これらに基づいて、対象を特定する、診断する、および分類する方法であって、臨床診断、バイオマーカーレベル、ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）、および当技術分野で公知の他の方法を含んでもよい方法が提供される。
本発明のｍＲＮＡは、創傷の処置、例えば、治癒の遅延を示す創傷の処置に使用されてもよい。創傷の処置を管理するためにｍＲＮＡの投与を含む方法が本明細書で提供される。本明細書における方法は、ｍＲＮＡの投与の前、それと同時、またはその後のいずれかに行われるステップをさらに含んでもよい。例えば、創傷床は、創傷治癒を容易にし、望ましくは創傷の閉鎖を得るために、清浄化および準備される必要があり得る。創傷治癒を促進し、創傷閉鎖を達成するために、以下を含むが、これらに限定されない、いくつかの戦略を使用することができる：（ｉ）必要に応じて、壊死組織を除去するための、酵素などの化学的創傷清拭剤を含む挫滅組織切除、必要に応じて繰り返される、鋭利な挫滅組織切除（死んだまたは感染した組織の創傷からの外科的除去）；（ｉｉ）創傷に湿潤した温かい環境を与え、組織修復および治癒を促進するための創傷被覆材。
創傷被覆材を製剤化する際に使用される材料の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒドロゲル（例えば、ＡＱＵＡＳＯＲＢ（登録商標）；ＤＵＯＤＥＲＭ（登録商標））、ヒドロコロイド（例えば、ＡＱＵＡＣＥＬ（登録商標）；ＣＯＭＦＥＥＬ（登録商標））、泡状物質（例えば、ＬＹＯＦＯＡＭ（登録商標）；ＳＰＹＲＯＳＯＲＢ（登録商標））、およびアルギン酸塩（例えば、ＡＬＧＩＳＩＴＥ（登録商標）；ＣＵＲＡＳＯＲＢ（登録商標））；（ｉｉｉ）細胞分裂および増殖を刺激し、創傷治癒を促進するための追加の成長因子、例えば、神経障害性足部潰瘍の処置のためにＦＤＡによって承認されているヒト組換え血小板由来成長因子である、ベカプレルミン（ＲＥＧＲＡＮＥＸ ＧＥＬ（登録商標））；（ｉｖ）清浄な、治癒していない創傷の被覆を得るために、皮膚移植片が必要であり得る、軟部組織創傷被覆。軟部組織被覆のために使用され得る皮膚移植片の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自家皮膚移植片、死体皮膚移植片、生物工学によって作られた代用皮膚（例えば、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）；ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標））。
ある特定の実施形態では、本発明のｍＲＮＡとしては、ヒドロゲル（例えば、ＡＱＵＡＳＯＲＢ（登録商標）；ＤＵＯＤＥＲＭ（登録商標））、ヒドロコロイド（例えば、ＡＱＵＡＣＥＬ（登録商標）；ＣＯＭＦＥＥＬ（登録商標））、泡状物質（例えば、ＬＹＯＦＯＡＭ（登録商標）；ＳＰＹＲＯＳＯＲＢ（登録商標））、および／またはアルギン酸塩（例えば、ＡＬＧＩＳＩＴＥ（登録商標）；ＣＵＲＡＳＯＲＢ（登録商標））がさらに含まれてもよい。ある特定の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、これらに限定されないが、自家皮膚移植片、死体皮膚移植片、または生物工学によって作られた代用皮膚（例えば、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）；ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標））を含む皮膚移植片とともに使用することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、創傷被覆製剤（ｗｏｕｌｄ ｄｒｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）および／もしくは皮膚移植片とともに適用されてもよく、または、これらに限定されないが、浸漬もしくは散布などの方法を除いて別々に適用されてもよい。
一部の実施形態では、創傷管理のための組成物は、抗菌性ポリペプチド（例えば、抗細菌性ポリペプチド）および／または抗ウイルス性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含んでもよい。抗菌性ポリペプチドの前駆体または部分的もしくは完全にプロセシングされた形態がコードされていてもよい。組成物は、包帯（例えば、粘着包帯）を使用して、投与のために製剤化されてもよい。抗菌性ポリペプチドおよび／または抗ウイルス性ポリペプチドは、被覆組成物と混合されてもよく、または別々に、例えば、浸漬もしくは散布によって適用されてもよい。
本発明の一実施形態では、ｍＲＮＡは、抗体およびそのような抗体の断片をコードし得る。これらは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生されてもよい。抗体は、これらに限定されないが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＭなどの免疫グロブリンの異なるサブクラスもしくはアイソタイプのうちのいずれか、または他のサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明に従って調製され得る例示的な抗体分子および断片としては、これらに限定されないが、免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子およびパラトープを含有し得る免疫グロブリン分子の部分が挙げられる。パラトープを含有する抗体のそのような部分としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）および当技術分野で公知のこれらの部分が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有し得るか、または参照ポリペプチド配列と同様のもしくは似ていない結合特徴を有し得る、バリアント抗体ポリペプチドをコードし得る。
本発明の方法によって得られる抗体は、免疫された動物に由来する非ヒト抗体由来可変領域（複数可）配列、およびヒト抗体由来定常領域（複数可）配列を含む、キメラ抗体であってもよい。加えて、それらは、免疫された動物に由来する非ヒト抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）ならびにヒト抗体に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含む、ヒト化抗体でもあり得る。別の実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞培養プロセスにおいて抗体タンパク質産物の収率を向上させるために有用であり得る。
一実施形態では、抗菌性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを投与することによって、対象における微生物感染（例えば、細菌感染）および／または微生物もしくはウイルス感染に関連する疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を処置するまたは予防するための方法が提供される。前記投与は、抗菌性薬剤（例えば、抗細菌剤）、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドまたは小分子抗菌性化合物と組み合わせてもよい。抗菌性薬剤としては、これらに限定されないが、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗寄生虫剤、および抗プリオン剤が挙げられる。
薬剤は、同時に、例えば、組み合わせた単位用量（例えば、両方の薬剤の共送達を提供する）で投与することができる。薬剤は、これらに限定されないが、数分間、数時間、数日間または数週間の間隔などの特定の時間間隔で投与することもできる。一般に、薬剤は、対象において、並行して生物学的に利用可能、例えば、検出可能であり得る。一部の実施形態では、薬剤は、本質的に同時に、例えば、同時に投与される２つの単位投薬量、または２つの薬剤の組み合わせた単位投薬量で、投与されてもよい。他の実施形態では、薬剤は、別個の単位投薬量で送達されてもよい。薬剤は、任意の順序で、または２つもしくはそれより多い薬剤を含む１つもしくは複数の調製物として、投与されてもよい。好ましい実施形態では、薬剤のうちの１つ、例えば、第１の薬剤の、少なくとも１回の投与は、他方の薬剤、例えば、第２の薬剤の数分、１、２、３、もしくは４時間以内に、またはさらに１もしくは２日以内に行われてもよい。一部の実施形態では、組合せは、相乗的結果、例えば、相加的結果を超える、例えば、相加的結果よりも少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、または５００％高い結果を達成することができる。
細菌感染に関連し得る疾患、障害、または状態としては、以下のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない：膿瘍、放線菌症、急性前立腺炎、エロモナス・ハイドロフィラ、一年生ライグラス中毒、炭疽、細菌性紫斑病、菌血症、細菌性胃腸炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣炎、細菌関連皮膚状態、バルトネラ症、ＢＣＧ腫、ボトリオミセス症、ボツリヌス症、ブラジル紫斑熱、ブローディー膿瘍、ブルセラ症、ブルーリ潰瘍、カンピロバクター症、カリエス、カリオン病、ネコひっかき病、蜂窩織炎、クラミジア感染、コレラ、慢性細菌性前立腺炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、クロストリジウム壊死性腸炎、複合型歯周－歯内病変（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｃ－ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ）、接触伝染性牛肺疫、ジフテリア、ジフテリア性口内炎、エーリキア症、丹毒、喉頭蓋炎（ｐｉｇｌｏｔｔｉｔｉｓ）、丹毒、フィッツヒュー・カーチス症候群、ノミ媒介性斑点熱、腐蹄症（感染性足皮膚炎）、Ｇａｒｒｅ硬化性骨髄炎、淋病、鼠径肉芽腫、ヒト顆粒球性アナプラズマ症、ヒト単球向性エーリキア症、百日咳（ｈｕｎｄｒｅｄ ｄａｙｓ’ ｃｏｕｇｈ）、膿痂疹、後期先天性梅毒性眼病、レジオネラ症、レミエール症候群、ライ病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ節炎、類鼻疽、髄膜炎菌性疾患、髄膜炎菌性敗血症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染、マイコバクテリウムアビウム―イントラセルラーレ（ＭＡＩ）、マイコプラズマ肺炎、壊死性筋膜炎、ノカルジア症、水癌（ｎｏｍａ）（水癌（ｃａｎｃｒｕｍ ｏｒｉｓ）または壊疽性口内炎）、臍炎、眼窩蜂巣炎、骨髄炎、脾臓摘出後重症感染症（ＯＰＳＩ）、ヒツジブルセラ症、パスツレラ病、眼窩周囲蜂巣炎、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ ｃｏｕｇｈ））、ペスト、肺炎球菌肺炎、ポット病、直腸炎、シュードモナス感染、オウム病、膿血症、化膿性筋炎、Ｑ熱、再帰熱（回帰熱）、リウマチ熱、ロッキー山斑点熱（ＲＭＳＦ）、リケッチア症、サルモネラ症、猩紅熱、敗血症、セラチア感染、細菌性赤痢、南部ダニ紅斑病（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｔｉｃｋ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒａｓｈ ｉｌｌｎｅｓｓ）、ブドウ球菌性皮膚剥脱症候群、連鎖球菌咽頭炎、プール肉芽腫、ブタブルセラ症、梅毒、梅毒性大動脈炎、破傷風、毒素性ショック症候群（ＴＳＳ）、トラコーマ、塹壕熱、熱帯性潰瘍、結核、野兎病、腸チフス、チフス、尿路性器結核、尿路感染症、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染、ウォーターハウスフリードリヒセン症候群、偽性結核（エルシニア）症、およびエルシニア症。細菌感染に関連する他の疾患、障害、および／または状態としては、例えば、アルツハイマー病、神経性食欲不振症、喘息、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自己免疫疾患、双極性障害、がん（例えば、結腸直腸がん、胆嚢がん、肺がん、膵がん、および胃がん）、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、冠動脈心疾患、認知症、うつ病、ギランバレー症候群、メタボリックシンドローム、多発性硬化症、心筋梗塞、肥満、強迫性障害、パニック障害、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、脳卒中、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、およびトゥレット症候群を挙げることができる。
本明細書に記載の細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。細菌性病原体としては、これらに限定されないが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、ｃｏａｇｕｌａｓｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｒｅｔｅｕｓ
ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐｓ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓが挙げられる。細菌性病原体としては、耐性細菌感染を引き起こす細菌、例えば、クリンダマイシン耐性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、フルオロキノロン耐性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、多剤耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、多剤耐性Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、多剤耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、多剤耐性Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）も挙げられる。
一実施形態では、本発明の修飾ｍＲＮＡは、１つまたは複数の抗生物質と併せて投与され得る。これらとしては、これらに限定されないが、アクニロックス、アムビゾーム、アモキシシリン、アンピシリン、オーグメンチン、アベロックス、アジスロマイシン、バクトロバン、ベタジン、ベトノベート、ブレファミド（Ｂｌｅｐｈａｍｉｄｅ）、セファクロル、セファドロキシル、セフジニル、セフェピム、セフィックス（Ｃｅｆｉｘ）、セフィキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフロキシム、セフジル（Ｃｅｆｚｉｌ）、セファレキシン、セファゾリン（Ｃｅｐｈａｚｏｌｉｎ）、セプタズ（Ｃｅｐｔａｚ）、クロラムフェニコール、クロルヘキシジン、クロロマイセチン、クローシグ（Ｃｈｌｏｒｓｉｇ）、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダゲル（Ｃｌｉｎｄａｇｅｌ）、クリンダマイシン、クリンダテック（Ｃｌｉｎｄａｔｅｃｈ）、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ジクロシル（Ｄｉｃｌｏｃｉｌ）、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、デュリセフ（Ｄｕｒｉｃｅｆ）、エリスロマイシン、フラマジン（Ｆｌａｍａｚｉｎｅ）、フロキシン（Ｆｌｏｘｉｎ）、フラミセチン、フシジン（Ｆｕｃｉｄｉｎ）、フラダンチン、フシジック（Ｆｕｓｉｄｉｃ）、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲミフロキサシン、イロソン、イオジン（Ｉｏｄｉｎｅ）、レバキン（Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マクサキン（Ｍａｘａｑｕｉｎ）、メフォキシン、メロネム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ミヤンブトール（Ｍｙａｍｂｕｔｏｌ）、マイコスタチン、ネオスポリン、ネトロマイシン（Ｎｅｔｒｏｍｙｃｉｎ）、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、ノリレット（Ｎｏｒｉｌｅｔ）、オフロキサシン、オムニセフ（Ｏｍｎｉｃｅｆ）、オスパモックス（Ｏｓｐａｍｏｘ）、オキシテトラサイクリン、パラキシン（Ｐａｒａｘｉｎ）、ペニシリン、ニューモバックス、ポリファックス（Ｐｏｌｙｆａｘ）、ポビドン、リファジン、リファンピン、リファキシミン、リファナフ（Ｒｉｆｉｎａｈ）、リマクタン、ロセフィン、ロキシスロマイシン、セロマイシン、ソフラマイシン（Ｓｏｆｒａｍｙｃｉｎ）、スパルフロキサシン、スタフレックス（Ｓｔａｐｈｌｅｘ）、タゴシッド、テトラサイクリン、テトラドックス（Ｔｅｔｒａｄｏｘ）、テトラリサル（Ｔｅｔｒａｌｙｓａｌ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、トブラマイシン（Ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、トレカトール（Ｔｒｅｃａｔｏｒ）、タイガシル、バンコシン、ベロセフ（Ｖｅｌｏｓｅｆ）、ビブラマイシン、キシファキサン（Ｘｉｆａｘａｎ）、ザガム（Ｚａｇａｍ）、ジトロテク（Ｚｉｔｒｏｔｅｋ）、ゾデルム（Ｚｏｄｅｒｍ）、ザイマー（Ｚｙｍａｒ）、およびザイボックスが挙げられる。
例示的な抗細菌剤としては、これらに限定されないが、アミノグリコシド（例えば、アミカシン（ＡＭＩＫＩＮ（登録商標））、ゲンタマイシン（ＧＡＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、カナマイシン（ＫＡＮＴＲＥＸ（登録商標））、ネオマイシン（ＭＹＣＩＦＲＡＤＩＮ（登録商標））、ネチルマイシン（ＮＥＴＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、トブラマイシン（ＮＥＢＣＩＮ（登録商標））、パロモマイシン（ＨＵＭＡＴＩＮ（登録商標））、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン）、カルバセフェム（例えば、ロラカルベフ（ＬＯＲＡＢＩＤ（登録商標））、カルバペネム（例えば、エルタペネム（ＩＮＶＡＮＺ（登録商標））、ドリペネム（ＤＯＲＩＢＡＸ（登録商標））、イミペネム／シラスタチン（ＰＲＩＭＡＸＩＮ（登録商標））、メロペネム（ＭＥＲＲＥＭ（登録商標））、セファロスポリン類（第１世代）（例えば、セファドロキシル（ＤＵＲＩＣＥＦ（登録商標））、セファゾリン（ＡＮＣＥＦ（登録商標））、セファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）またはセファロチン（ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）（ＫＥＦＬＩＮ（登録商標））、セファレキシン（ＫＥＦＬＥＸ（登録商標））、セファロスポリン類（第２世代）（例えば、セファクロル（ＣＥＣＬＯＲ（登録商標））、セファマンドール（ＭＡＮＤＯＬ（登録商標））、セフォキシチン（ＭＥＦＯＸＩＮ（登録商標））、セフプロジル（ＣＥＦＺＩＬ（登録商標））、セフロキシム（ＣＥＦＴＩＮ（登録商標）、ＺＩＮＮＡＴ（登録商標））、セファロスポリン類（第３世代）（例えば、セフィキシム（ＳＵＰＲＡＸ（登録商標））、セフジニル（ＯＭＮＩＣＥＦ（登録商標）、ＣＥＦＤＩＥＬ（登録商標））、セフジトレン（ＳＰＥＣＴＲＡＣＥＦ（登録商標））、セフォペラゾン（ＣＥＦＯＢＩＤ（登録商標））、セフォタキシム（ＣＬＡＦＯＲＡＮ（登録商標））、セフポドキシム（ＶＡＮＴＩＮ（登録商標））、セフタジジム（ＦＯＲＴＡＺ（登録商標））、セフチブテン（ＣＥＤＡＸ（登録商標））、セフチゾキシム（ＣＥＦＩＺＯＸ（登録商標））、セフトリアクソン（ＲＯＣＥＰＨＩＮ（登録商標））、セファロスポリン類（第４世代）（例えば、セフェピム（ＭＡＸＩＰＩＭＥ（登録商標））、セファロスポリン類（第５世代）（例えば、セフトビプロール（ＺＥＦＴＥＲＡ（登録商標））、グリコペプチド（例えば、テイコプラニン（ＴＡＲＧＯＣＩＤ（登録商標））、バンコマイシン（ＶＡＮＣＯＣＩＮ（登録商標））、テラバンシン（ＶＩＢＡＴＩＶ（登録商標））、リンコサミド系（例えば、クリンダマイシン（ＣＬＥＯＣＩＮ（登録商標））、リンコマイシン（ＬＩＮＣＯＣＩＮ（登録商標））、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン（ＣＵＢＩＣＩＮ（登録商標））、マクロライド系（例えば、アジスロマイシン（ＺＩＴＨＲＯＭＡＸ（登録商標）、ＳＵＭＡＭＥＤ（登録商標）、ＺＩＴＲＯＣＩＮ（登録商標））、クラリスロマイシン（ＢＩＡＸＩＮ（登録商標））、ジリスロマイシン（ＤＹＮＡＢＡＣ（登録商標））、エリスロマイシン（ＥＲＹＴＨＯＣＩＮ（登録商標）、ＥＲＹＴＨＲＯＰＥＤ（登録商標））、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン（ＴＡＯ（登録商標））、テリスロマイシン（ＫＥＴＥＫ（登録商標））、スペクチノマイシン（ＴＲＯＢＩＣＩＮ（登録商標））、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム（ＡＺＡＣＴＡＭ（登録商標））、ニトロフラン（例えば、フラゾリドン（ＦＵＲＯＸＯＮＥ（登録商標））、ニトロフラントイン（ＭＡＣＲＯＤＡＮＴＩＮ（登録商標）、ＭＡＣＲＯＢＩＤ（登録商標））、ペニシリン系（例えば、アモキシシリン（ＮＯＶＡＭＯＸ（登録商標）、ＡＭＯＸＩＬ（登録商標））、アンピシリン（ＰＲＩＮＣＩＰＥＮ（登録商標））、アズロシリン、カルベニシリン（ＧＥＯＣＩＬＬＩＮ（登録商標））、クロキサシリン（ＴＥＧＯＰＥＮ（登録商標））、ジクロキサシリン（ＤＹＮＡＰＥＮ（登録商標））、フルクロキサシリン（ＦＬＯＸＡＰＥＮ（登録商標））、メズロシリン（ＭＥＺＬＩＮ（登録商標））、メチシリン（ＳＴＡＰＨＣＩＬＬＩＮ（登録商標））、ナフシリン（ＵＮＩＰＥＮ（登録商標））、オキサシリン（ＰＲＯＳＴＡＰＨＬＩＮ（登録商標））、ペニシリンＧ（ＰＥＮＴＩＤＳ（登録商標））、ペニシリンＶ（ＰＥＮ－ＶＥＥ－Ｋ（登録商標））、ピペラシリン（ＰＩＰＲＡＣＩＬ（登録商標））、テモシリン（ＮＥＧＡＢＡＮ（登録商標））、チカルシリン（ＴＩＣＡＲ（登録商標））、ペニシリンの組合せ（例えば、アモキシシリン／クラブラネート（ＡＵＧＭＥＮＴＩＮ（登録商標））、アンピシリン／スルバクタム（ＵＮＡＳＹＮ（登録商標））、ピペラシリン／タゾバクタム（ＺＯＳＹＮ（登録商標））、チカルシリン／クラブラネート（ＴＩＭＥＮＴＩＮ（登録商標））、ポリペプチド（例えば、バシトラシン、コリスチン（ＣＯＬＹ－ＭＹＣＩＮ－Ｓ（登録商標））、ポリミキシンＢ、キノロン系（例えば、シプロフロキサシン（ＣＩＰＲＯ（登録商標）、ＣＩＰＲＯＸＩＮ（登録商標）、ＣＩＰＲＯＢＡＹ（登録商標））、エノキサシン（ＰＥＮＥＴＲＥＸ（登録商標））、ガチフロキサシン（ＴＥＱＵＩＮ（登録商標））、レボフロキサシン（ＬＥＶＡＱＵＩＮ（登録商標））、ロメフロキサシン（ＭＡＸＡＱＵＩＮ（登録商標））、モキシフロキサシン（ＡＶＥＬＯＸ（登録商標））、ナリジクス酸（ＮＥＧＧＲＡＭ（登録商標））、ノルフロキサシン（ＮＯＲＯＸＩＮ（登録商標））、オフロキサシン（ＦＬＯＸＩＮ（登録商標）、ＯＣＵＦＬＯＸ（登録商標））、トロバフロキサシン（ＴＲＯＶＡＮ（登録商標））、グレパフロキサシン（ＲＡＸＡＲ（登録商標））、スパルフロキサシン（ＺＡＧＡＭ（登録商標））、テマフロキサシン（ＯＭＮＩＦＬＯＸ（登録商標））、スルホンアミド類（例えば、マフェニド（ＳＵＬＦＡＭＹＬＯＮ（登録商標））、スルホンアミドクリソイジン（ＰＲＯＮＴＯＳＩＬ（登録商標））、スルファセタミド（ＳＵＬＡＭＹＤ（登録商標）、ＢＬＥＰＨ－１００）、スルファジアジン（ＭＩＣＲＯ－ＳＵＬＦＯＮ（登録商標））、スルファジアジン銀（ＳＩＬＶＡＤＥＮＥ（登録商標））、スルファメチゾール（ＴＨＩＯＳＵＬＦＩＬ ＦＯＲＴＥ（登録商標））、スルファメトキサゾール（ＧＡＮＴＡＮＯＬ（登録商標））、スルファニルイミド（ｓｕｌｆａｎｉｌｉｍｉｄｅ）、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標））、スルフィソキサゾール（ＧＡＮＴＲＩＳＩＮ（登録商標））、トリメトプリム（ＰＲＯＬＯＰＲＩＭ（登録商標））、ＴＲＩＭＰＥＸ（登録商標））、トリメトプリム－スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ－ＳＭＸ）（ＢＡＣＴＲＩＭ（登録商標）、ＳＥＰＴＲＡ（登録商標））、テトラサイクリン系（例えば、デメクロサイクリン（ＤＥＣＬＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、ドキシサイクリン（ＶＩＢＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ミノサイクリン（ＭＩＮＯＣＩＮ（登録商標））、オキシテトラサイクリン（ＴＥＲＲＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、テトラサイクリン（ＳＵＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＡＣＨＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標）Ｖ、ＳＴＥＣＬＩＮ（登録商標））、マイコバクテリアに対する薬物（例えば、クロファジミン（ＬＡＭＰＲＥＮＥ（登録商標））、ダプソン（ＡＶＬＯＳＵＬＦＯＮ（登録商標））、カプレオマイシン（ＣＡＰＡＳＴＡＴ（登録商標））、サイクロセリン（ＳＥＲＯＭＹＣＩＮ（登録商標））、エタンブトール（ＭＹＡＭＢＵＴＯＬ（登録商標））、エチオナミド（ＴＲＥＣＡＴＯＲ（登録商標））、イソニアジド（Ｉ．Ｎ．Ｈ．（登録商標））、ピラジナミド（ＡＬＤＩＮＡＭＩＤＥ（登録商標））、リファンピン（ＲＩＦＡＤＩＮ（登録商標）、ＲＩＭＡＣＴＡＮＥ（登録商標））、リファブチン（ＭＹＣＯＢＵＴＩＮ（登録商標））、リファペンチン（ＰＲＩＦＴＩＮ（登録商標））、ストレプトマイシン）、およびその他（例えば、アルスフェナミン（ＳＡＬＶＡＲＳＡＮ（登録商標））、クロラムフェニコール（ＣＨＬＯＲＯＭＹＣＥＴＩＮ（登録商標））、ホスホマイシン（ＭＯＮＵＲＯＬ（登録商標））、フシジン酸（ＦＵＣＩＤＩＮ（登録商標））、リネゾリド（ＺＹＶＯＸ（登録商標））、メトロニダゾール（ＦＬＡＧＹＬ（登録商標））、ムピロシン（ＢＡＣＴＲＯＢＡＮ（登録商標））、プラテンシマイシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン（ＳＹＮＥＲＣＩＤ（登録商標））、リファキシミン（ＸＩＦＡＸＡＮ（登録商標））、チアンフェニコール、チゲサイクリン（ＴＩＧＡＣＹＬ（登録商標））、チニダゾール（ｔｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ＴＩＮＤＡＭＡＸ（登録商標）、ＦＡＳＩＧＹＮ（登録商標））が挙げられる。
別の実施形態では、抗ウイルス剤、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドまたは小分子抗ウイルス剤と組み合わせて、抗ウイルス性ポリペプチド、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを投与することによって、対象における、ウイルス感染および／またはウイルス感染に関連する疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの症状を処置するまたは予防するための方法が提供される。
ウイルス感染に関連する疾患、障害、または状態としては、これらに限定されないが、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染、伝染性単核球症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、一次ＨＳＶ－１感染（例えば、小児における歯肉口内炎、成人における扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎）、潜在性ＨＳＶ－１感染（例えば、口唇ヘルペスおよび単純ヘルペス）、一次ＨＳＶ－２感染、潜在性ＨＳＶ－２感染、無菌性髄膜炎、伝染性単核球症、巨細胞性封入体病、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性滲出性リンパ腫、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、ライ症候群、麻疹、感染後脳脊髄炎、流行性耳下腺炎、過形成性上皮性病変（例えば、尋常性、扁平、足底および肛門性器疣贅、喉頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症）、子宮頸癌、扁平上皮癌、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、灰白髄炎、狂犬病、細気管支炎、肺炎、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重症細気管支炎、風疹（Ｇｅｒｍａｎ ｍｅａｓｌｅｓ）、先天性風疹、水痘およびヘルペス帯状疱疹が挙げられる。
ウイルス性病原体としては、これらに限定されないが、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、水痘－帯状疱疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、および黄熱病ウイルスが挙げられる。ウイルス性病原体は、耐性ウイルス感染を引き起こすウイルスも含み得る。
例示的な抗ウイルス剤としてはこれらに限定されないが、アバカビル（ＺＩＡＧＥＮ（登録商標））、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ（登録商標））、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）またはアシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）（ＣＹＣＬＯＶＩＲ（登録商標）、ＨＥＲＰＥＸ（登録商標）、ＡＣＩＶＩＲ（登録商標）、ＡＣＩＶＩＲＡＸ（登録商標）、ＺＯＶＩＲＡＸ（登録商標）、ＺＯＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（Ｐｒｅｖｅｏｎ（登録商標）、Ｈｅｐｓｅｒａ（登録商標））、アマンタジン（ＳＹＭＭＥＴＲＥＬ（登録商標））、アンプレナビル（ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標））、アンプリゲン（ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アルビドール、アタザナビル（ＲＥＹＡＴＡＺ（登録商標））、ボセプレビル、シドフォビル、ダルナビル（ＰＲＥＺＩＳＴＡ（登録商標））、デラビルジン（ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標））、ジダノシン（ＶＩＤＥＸ（登録商標））、ドコサノール（ＡＢＲＥＶＡ（登録商標））、エドクスジン、エファビレンツ（ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）、ＳＴＯＣＲＩＮ（登録商標））、エムトリシタビン（ＥＭＴＲＩＶＡ（登録商標））、エムトリシタビン／テノホビル／エファビレンツ（ＡＴＲＩＰＬＡ（登録商標））、エンフビルチド（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標）、ＥＮＴＡＶＩＲ（登録商標））、ファムシクロビル（ＦＡＭＶＩＲ（登録商標））、ホミビルセン（ＶＩＴＲＡＶＥＮＥ（登録商標））、ホスアンプレナビル（ＬＥＸＩＶＡ（登録商標）、ＴＥＬＺＩＲ（登録商標））、ホスカルネット（ＦＯＳＣＡＶＩＲ（登録商標））、ホスホネット、ガンシクロビル（ＣＹＴＯＶＥＮＥ（登録商標）、ＣＹＭＥＶＥＮＥ（登録商標）、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ（登録商標））、ＧＳ９１３７（ＥＬＶＩＴＥＧＲＡＶＩＲ（登録商標））、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標）、ＺＹＣＬＡＲＡ（登録商標）、ＢＥＳＥＬＮＡ（登録商標））、インジナビル（ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標））、イノシン、イノシンプラノベクス（ＩＭＵＮＯＶＩＲ（登録商標））、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、クタプレシン（ｋｕｔａｐｒｅｓｓｉｎ）（ＮＥＸＡＶＩＲ（登録商標））、ラミブジン（ＺＥＦＦＩＸ（登録商標）、ＨＥＰＴＯＶＩＲ（登録商標）、ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、ラミブジン／ジドブジン（ＣＯＭＢＩＶＩＲ（登録商標））、ロピナビル、ロビライド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロク（ＳＥＬＺＥＮＴＲＹ（登録商標）、ＣＥＬＳＥＮＴＲＩ（登録商標））、メチサゾン、ＭＫ－２０４８、モロキシジン、ネルフィナビル（ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標））、ネビラピン（ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標））、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（登録商標））、ペグインターフェロンアルファ－２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））、ペンシクロビル（ＤＥＮＡＶＩＲ（登録商標））、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン（ＣＯＮＤＹＬＯＸ（登録商標））、ラルテグラビル（ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ（登録商標））、リバビリン（ＣＯＰＥＧＵｓ（登録商標）、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）、ＲＩＢＡＳＰＨＥＲＥ（登録商標）、ＶＩＬＯＮＡ（登録商標）およびＶＩＲＡＺＯＬＥ（登録商標））、リマンタジン（ＦＬＵＭＡＤＩＮＥ（登録商標））、リトナビル（ＮＯＲＶＩＲ（登録商標））、ピラミジン、サキナビル（ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）、ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標））、スタブジン、ティーツリーオイル（メラレウカ（ｍｅｌａｌｅｕｃａ）油）、テノホビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、テノホビル／エムトリシタビン（ＴＲＵＶＡＤＡ（登録商標））、チプラナビル（ＡＰＴＩＶＵＳ（登録商標））、トリフルリジン（ＶＩＲＯＰＴＩＣ（登録商標））、トロマンタジン（ＶＩＲＵ－ＭＥＲＺ（登録商標））、バラシクロビル（ＶＡＬＴＲＥＸ（登録商標））、バルガンシクロビル（ＶＡＬＣＹＴＥ（登録商標））、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン（ｖｉｒａｍｉｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ザナミビル（ＲＥＬＥＮＺＡ（登録商標））、およびジドブジン（アジドチミジン（ＡＺＴ）、ＲＥＴＲＯＶＩＲ（登録商標）、ＲＥＴＲＯＶＩＳ（登録商標））が挙げられる。
真菌感染に関連する疾患、障害、または状態としては、これらに限定されないが、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、菌腫、パラコクシジオイデス症、および足白癬が挙げられる。さらに、免疫不全を有するヒトは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｃｏｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、およびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓなどの真菌属による疾患に特に罹患しやすい。他の真菌は、眼、爪、髪、および特に皮膚を攻撃することができ、いわゆる皮膚糸状真菌（ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ）および好角質性真菌と呼ばれ、運動選手の足などの白癬が一般的である多様な状態を引き起こす。菌類胞子もまた、アレルギーの主要な原因であり、異なる分類群からの幅広い真菌が、一部の人々にアレルギー反応を誘起し得る。
真菌性病原体としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ／ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ（例えば、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ（例えば、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ）、およびＭｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ（例えば、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｌｉｃｈｔｈｅｉｍｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）が挙げられる。
例示的な抗真菌剤としては、これらに限定されないが、ポリエン抗真菌薬（例えば、ナタマイシン、リモシジン（ｒｉｍｏｃｉｄｉｎ）、フィリピン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシン（ｃａｎｄｉｃｉｎ）、ハマイシン）、イミダゾール抗真菌薬（例えば、ミコナゾール（ＭＩＣＡＴＩＮ（登録商標）、ＤＡＫＴＡＲＩＮ（登録商標））、ケトコナゾール（ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＯＲＡＬ（登録商標）、ＳＥＢＩＺＯＬＥ（登録商標））、クロトリマゾール（ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）、ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）ＡＦ、ＣＡＮＥＳＴＥＮ（登録商標））、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール（ＥＲＴＡＣＺＯ（登録商標））、スルコナゾール、チオコナゾール）、トリアゾール抗真菌薬（例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール）、チアゾール抗真菌薬（例えば、アバファンギン（ａｂａｆｕｎｇｉｎ））、アリルアミン（例えば、テルビナフィン（ＬＡＭＩＳＩＬ（登録商標））、ナフチフィン（ＮＡＦＴＩＮ（登録商標））、ブテナフィン（ＬＯＴＲＩＭＩＮ（登録商標）ウルトラ）、エキノキャンディン（例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン）、およびその他（例えば、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロックス、トルナフテート（ＴＩＮＡＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＥＳＥＮＥＸ（登録商標）、ＡＦＴＡＴＥ（登録商標））、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５－フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、炭酸水素ナトリウム、アリシン）が挙げられる。
原虫感染に関連する疾患、障害、または状態としては、これらに限定されないが、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、アフリカ睡眠病、アメリカ睡眠病、リーシュマニア症（カラアザール）、バランチジウム症、トキソプラズマ症、マラリア、アカントアメーバ角膜炎、およびバベシア症が挙げられる。
原虫性病原体としては、これらに限定されないが、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔ． ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．、およびＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉが挙げられる。
例示的な抗原虫剤としては、これらに限定されないが、エフロールニチン、フラゾリドン（ＦＵＲＯＸＯＮＥ（登録商標）、ＤＥＰＥＮＤＡＬ－Ｍ（登録商標））、メラルソプロール、メトロニダゾール（ＦＬＡＧＹＬ（登録商標））、オルニダゾール、パロモマイシン硫酸塩（ＨＵＭＡＴＩＮ（登録商標））、ペンタミジン、ピリメタミン（ＤＡＲＡＰＲＩＭ（登録商標））、およびチニダゾール（ＴＩＮＤＡＭＡＸ（登録商標）、ＦＡＳＩＧＹＮ（登録商標））が挙げられる。
寄生虫感染に関連する疾患、障害、または状態としては、これらに限定されないが、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリスアスカリス症（ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉａｓｉｓ）、シャガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、施毛虫症、および鞭虫症が挙げられる。
寄生虫性病原体としては、これらに限定されないが、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ、Ａｎｉｓａｋｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、ウマバエ（ｂｏｔｆｌｙ）、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、南京虫、Ｃｅｓｔｏｄａ、恙虫、Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、鉤虫、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ ｓｅｒｒａｔａ、肝吸虫、Ｌｏａ ｂｏａ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ、蟯虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、ダニ、サナダムシ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、鞭虫、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉが挙げられる。
例示的な抗寄生虫剤としては、これらに限定されないが、抗線虫薬（例えば、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン）、抗条虫薬（例えば、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール）、抗吸虫薬（例えば、プラジカンテル）、抗アメーバ薬（例えば、リファンピン、アンホテリシンＢ）、および抗原虫薬（例えば、メラルソプロール、エフロールニチン、メトロニダゾール、チニダゾール）が挙げられる。
プリオン感染に関連する疾患、障害、または状態としては、これらに限定されないが、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、医原性クロイツフェルトヤコブ病（ｉＣＪＤ）、異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）、家族性クロイツフェルトヤコブ病（ｆＣＪＤ）、孤発性クロイツフェルトヤコブ病（ｓＣＪＤ）、ゲルストマンストロイスラーシャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、クールー病、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、伝達性ミンク脳症（ＴＭＥ）、慢性消耗病（ＣＷＤ）、ネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）、外来性有蹄類脳症（ＥＵＥ）、および海綿状脳症が挙げられる。
例示的な抗プリオン剤としては、これらに限定されないが、フルピルチン、ペントサンポリ硫酸塩（ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｐｈａｔｅ）、キナクリン、および四環式化合物が挙げられる。
本明細書に記載されているように、本発明のｍＲＮＡの有用なフィーチャは、細胞の自然免疫応答をモジュレートする（例えば、低減させる、逃れるまたは回避する）能力である。一態様では、細胞に送達される場合に、参照化合物、例えば、本発明のｍＲＮＡ、または本発明の異なるｍＲＮＡに対応する未修飾ポリヌクレオチドによって誘発される応答と比較して、低減された宿主からの免疫応答をもたらす、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡが本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「参照化合物」は、哺乳動物に投与される場合に、公知の程度、レベルまたは量の免疫刺激を有する自然免疫応答をもたらす任意の分子または物質である。参照化合物は、核酸分子である必要はなく、本発明のｍＲＮＡのいずれかである必要もない。よって、ｍＲＮＡによる免疫応答誘発の回避、それを逃れること、またはその失敗の尺度は、そのような応答を誘発することが知られている任意の化合物または物質と比較することで表すことができる。
用語「自然免疫応答」は、一般に、ウイルス起源または細菌起源の外因性一本鎖核酸に対する細胞応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導に関与する。本明細書で使用される場合、自然免疫応答またはインターフェロン応答は単細胞レベルで作動して、サイトカイン発現、サイトカイン放出、タンパク質合成の全般的阻害、細胞ＲＮＡの全般的破壊、主要組織適合性分子の上方調節、および／またはアポトーシス死の誘導、アポトーシス、抗成長、ならびに自然および適応免疫細胞活性化に関与する遺伝子の遺伝子転写の誘導を引き起こす。Ｉ型ＩＦＮによって誘導される遺伝子の一部としては、ＰＫＲ、ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）、ＯＡＳ（２’，５’－オリゴアデニル酸シンテターゼ）、ＲＮａｓｅ Ｌ、およびＭｘタンパク質が挙げられる。ＰＫＲおよびＡＤＡＲは、それぞれ、翻訳開始およびＲＮＡ編集の阻害をもたらす。ＯＡＳは、ｓｓＲＮＡを分解するためのエンドリボヌクレアーゼＲＮａｓｅ Ｌを活性化するｄｓＲＮＡ依存性シンテターゼである。
一部の実施形態では、自然免疫応答は、Ｉ型またはＩＩ型インターフェロンの発現を含み、そのＩ型またはＩＩ型インターフェロンの発現は、本発明のｍＲＮＡと接触していない細胞からの対照標準と比較して２倍を超えては増加しない。
一部の実施形態では、自然免疫応答は、１つまたは複数のＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現を含み、その１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）ＩＦＮシグネチャー遺伝子の発現は、本発明のｍＲＮＡと接触していない細胞からの対照標準と比較して３倍を超えては増加しない。
一部の状況では、細胞内の自然免疫応答を排除することは有利であり得るが、本発明は、投与の際に、そのような応答を完全には排除することなく、実質的に低減された（有意に低い）インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答をもたらすｍＲＮＡを提供する。
一部の実施形態では、免疫応答は、参照化合物によって誘導される免疫応答と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％を超えて低い。免疫応答自体は、１型インターフェロンの発現もしくは活性レベル、またはトール様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）などのインターフェロン調節遺伝子の発現を決定することによって測定することができる。自然免疫応答の低減は、細胞集団への１回または複数回の投与後に低下した細胞死のレベルを測定することによっても測定することができ；例えば、細胞死は、参照化合物で観察された細胞死の頻度よりも１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％を超えて少ない。さらに、細胞死は、ｍＲＮＡと接触した細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％より少ないか、または０．０１％より少なく、影響を及ぼし得る。
別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、同じ配列を有する未修飾のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド、もしくは一次構築物または参照化合物よりも有意に低い免疫原性である。本明細書で使用される場合、「有意に低い免疫原性」とは、免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施形態では、本用語は、免疫原性における減少倍率を指す。別の実施形態では、本用語は、ｍＲＮＡの有効量が検出可能な免疫応答を誘発することなく投与され得るような減少を指す。別の実施形態では、本用語は、ｍＲＮＡが、組換えタンパク質の発現を検出可能に低減させるのに十分な免疫応答を引き出すことなく繰り返し投与され得るような減少を指す。別の実施形態では、この減少は、ｍＲＮＡが、組換えタンパク質の検出可能な発現を排除するのに十分な免疫応答を引き出すことなく繰り返し投与され得るような減少である。
別の実施形態では、ｍＲＮＡは、その未修飾対応物または参照化合物の２分の１の免疫原性である。別の実施形態では、免疫原性は、３分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、５分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、７分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、１０分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、１５分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、ある倍数分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、５０分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、１００分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、２００分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、５００分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、１０００分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、２０００分の１に低減する。別の実施形態では、免疫原性は、別の倍数分の１に低減する。
免疫原性を決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＦＮアルファ、ＴＮＦ－アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１アルファもしくはベータ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－ベータ、またはＩＬ－８）の分泌を測定すること、ＤＣ活性化マーカー（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現を測定すること、または適応免疫応答に対するアジュバントとして作用する能力を測定することを含む。
本明細書で教示される修飾の組合せを含む本発明のｍＲＮＡは、それらを治療モダリティとしてより好適にするより優れた特性を有し得る。
当技術分野における「全か無か」のモデルは、修飾ｍＲＮＡの治療有用性に関連する生物学的現象を説明するのには全く不十分であることが認められている。本発明者らは、タンパク質産生を改善するために、修飾、または修飾の組合せの性質、修飾のパーセントを考慮し、１つを超えるサイトカインまたは測定基準を調査して特定の修飾ｍＲＮＡの有効性およびリスクプロファイルを判定し得ることを確認した。
本発明の一態様では、未修飾と比較した修飾ｍＲＮＡの有効性を決定する方法は、その発現が本発明の外因性核酸の投与によって誘発される１つまたは複数のサイトカインの測定および分析を含む。これらの値は、未修飾核酸の投与と、またはサイトカイン応答、ポリＩＣ、Ｒ－８４８などの標準的な測定基準もしくは当技術分野で公知の他の標準と比較される。
本明細書で開発される標準的な測定基準の一例は、細胞、組織または生物内で産生されるコードされたポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量の、修飾核酸の投与または修飾核酸との接触の結果として、その発現が細胞、組織または生物内で誘発されるサイトカインの１つまたは複数のレベルまたは量（またはパネル）に対する比の尺度である。そのような比は、本明細書において、タンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比と称される。ＰＣ比が高いほど、修飾核酸（測定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）の有効性はより高い。本発明のサイトカインによる好ましいＰＣ比は、１を超える、１０を超える、１００を超える、１０００を超える、１０，０００を超える、またはそれより大きくてもよい。異なるまたは未修飾の構築物の修飾核酸よりも高いＰＣ比を有する修飾核酸が、好ましい。
ＰＣ比は、ポリヌクレオチドに存在する修飾のパーセントによってさらに修正することができる。例えば、１００％修飾された核酸に対して正規化され、サイトカインの機能（またはリスク）またはサイトカインプロファイルとしてのタンパク質産生が判定され得る。
一実施形態では、本発明は、修飾核酸（ｍＲＮＡ）のＰＣ比を比較することによって、化学的性質、サイトカインまたは修飾のパーセントにわたって、任意の特定の修飾ｍＲＮＡの相対的有効性を決定するための方法を提供する。
タンパク質産生の増加および免疫賦活能の低下を維持する、様々なレベルの核酸塩基置換を含有するｍＲＮＡが産生され得る。任意の修飾ヌクレオチドのその天然に存在するヌクレオチド対応物に対する相対的パーセンテージは、ＩＶＴ反応中に変化し得る（例えば、１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％の５メチルシチジン使用量対シチジン；１００、５０、２５、１０、５、２．５、１、０．１、０．０１％のシュードウリジンまたはＮ１－メチル－シュードウリジン使用量対ウリジン）。また、同じ塩基に対して２つまたはそれより多い異なるヌクレオチドを使用して、異なる比率（例えば、シュードウリジンおよびＮ１－メチル－シュードウリジンの異なる比率）を利用するｍＲＮＡを作製することもできる。ｍＲＮＡは、同時に、５メチルシチジン／シチジンおよびシュードウリジン／Ｎ１－メチル－シュードウリジン／ウリジンの比率などの１つを超える「塩基」位置における混合比率で作製することもできる。修飾ヌクレオチドの比率を変化させて修飾ｍＲＮＡを使用することは、化学的修飾ヌクレオチドへの潜在的曝露を低減するのに有益であり得る。最後に、タンパク質産生もしくは免疫賦活能のいずれかまたはその両方をモジュレートする、ｍＲＮＡへの修飾ヌクレオチドの位置的な導入もまた可能である。これらの改善された特性を実証するそのようなｍＲＮＡの能力を、（本明細書に記載のＰＢＭＣアッセイなどのアッセイを使用して）ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することができ、ｍＲＮＡでコードされたタンパク質の産生およびサイトカインなどの自然免疫認識のメディエーターの両方の測定を通してｉｎ ｖｉｖｏで評価することもできる。
別の実施形態では、ｍＲＮＡとその未修飾対応物との相対的免疫原性は、未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物の所与の量と同じ程度まで、上記応答のうちの１つを引き出すのに必要とされるｍＲＮＡの量を決定することによって、決定される。例えば、同じ応答を引き出すために２倍多いｍＲＮＡが必要とされる場合、そのｍＲＮＡは、未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物の２分の１の免疫原性である。
別の実施形態では、ｍＲＮＡとその未修飾対応物との相対的免疫原性は、同じ量の未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物に対するｍＲＮＡの投与に応じて分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＦＮアルファ、ＴＮＦ－アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１アルファもしくはベータ、ＩＬ－６、ＩＦＮ－ベータ、またはＩＬ－８）の量を決定することによって、決定される。例えば、ｍＲＮＡの２分の１のサイトカインが分泌される場合、そのｍＲＮＡは、未修飾ヌクレオチドの２分の１の免疫原性である。別の実施形態では、刺激のバックグラウンドレベルは、上記の方法において免疫原性を算出する前に減算する。
細胞内または細胞の集団における免疫応答の滴定、低減または排除を実施するための方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、細胞は異なる用量の同じｍＲＮＡと接触させられ、用量応答が評価される。一部の実施形態では、細胞は、同じまたは異なる用量でいくつかの異なるｍＲＮＡと接触させられ、所望の効果をもたらすための最適な組成物を決定する。免疫応答に関して、所望の効果は、細胞の免疫応答を回避すること、逃れることまたは低減させることであり得る。所望の効果は、タンパク質産生の効率を変化させることでもあり得る。
本発明のｍＲＮＡは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１３００３４７５号に記載の方法を使用して免疫応答を低減するために使用されてもよい。
加えて、ある特定の修飾ヌクレオシド、またはその組合せは、本発明のｍＲＮＡに導入される場合、自然免疫応答を活性化する。そのような活性化分子は、ポリペプチドおよび／または他のワクチンと組み合わされる場合、アジュバントとして有用である。ある特定の実施形態では、活性化分子は、ワクチンとして有用であるポリペプチド配列をコードする翻訳可能領域を含有し、よって、自己アジュバントとなる能力を提供する。
一実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、免疫原をコードし得る。免疫原をコードするｍＲＮＡの送達は、免疫応答を活性化し得る。非限定的な例として、免疫原をコードするｍＲＮＡは、複数の自然応答経路を誘発するように細胞に送達され得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２００６３７７号を参照されたい）。別の非限定的な例として、免疫原をコードする本発明のｍＲＮＡは、脊椎動物に対して免疫原性となるのに十分に大きい投与量で脊椎動物に送達され得る（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２００６３７２号および同第２０１２００６３６９号を参照されたい）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、限定されないが、ジカウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）抗原、がんに関連する１つまたは複数の変異を含むＫＲＡＳ抗原、インフルエンザウイルス抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原（ｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、ＵＬ１３１Ａ、およびヘルペスウイルス糖タンパク質（ｇＢ）を含む）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）抗原、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ３）抗原、およびがん関連ネオエピトープを含む免疫原をコードする。
本発明のｍＲＮＡは、ワクチンのためのポリペプチド配列をコードしてもよく、インヒビターをさらに含んでもよい。インヒビターは、抗原提示を損なうおよび／または当技術分野で公知の様々な経路を阻害し得る。非限定的な例として、本発明のｍＲＮＡは、抗原提示を損ない得るインヒビターと組み合わせてワクチンに使用されてもよい（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２０８９２２５号および同第２０１２０８９３３８号を参照されたい）。
一実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡであり得る。自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ送達の効率および封入された遺伝子産物の発現を向上させることができる。一実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で公知の少なくとも１つの修飾を含んでもよい。一実施形態では、自己複製ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡが感染性ウイルス粒子の産生を誘導しないように設計され得る。非限定的な例として、自己複製ＲＮＡは、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許公開第２０１１０３００２０５号および国際公開第２０１１００５７９９号に記載の方法によって設計されてもよい。
一実施形態では、本発明の自己複製ｍＲＮＡは、免疫応答を生じさせることのできるタンパク質をコードし得る。非限定的な例として、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの抗原をコードし得る自己複製ｍＲＮＡであり得る（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許公開第２０１１０３００２０５号、ならびに国際公開第２０１１００５７９９号、同第２０１３００６８３８号および同第２０１３００６８４２号を参照されたい）。
一実施形態では、本発明の自己複製ｍＲＮＡは、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の方法を使用して製剤化することができる。非限定的な例として、自己複製ＲＮＡは、Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ（Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＰＮＡＳ ２０１２；ＰＭＩＤ：２２９０８２９４）に記載の方法によって送達用に製剤化されてもよい。
一実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、両親媒性および／または免疫原性の両親媒性ペプチドをコードし得る。
一実施形態では、本発明のｍＲＮＡの製剤は、両親媒性および／または免疫原性の両親媒性ペプチドをさらに含んでもよい。非限定的な例として、両親媒性および／または免疫原性の両親媒性ペプチドを含むｍＲＮＡは、そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許公開第２０１１０２５０２３７号ならびに国際公開第２０１０００９２７７号および同第２０１０００９０６５号に記載されているように製剤化されてもよい。
一実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、免疫賦活性であり得る。非限定的な例として、ｍＲＮＡは、ポジティブセンスまたはネガティブセンス鎖ＲＮＡウイルスゲノムのすべてまたは一部をコードし得る（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２０９２５６９号および米国特許公開第２０１２０１７７７０１号を参照されたい）。別の非限定的な例では、本発明の免疫賦活性ｍＲＮＡは、本明細書に記載されているおよび／または当技術分野で公知の投与用賦形剤を用いて製剤化されてもよい（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２０６８２９５号および米国特許公開第２０１２０２１３８１２号を参照されたい）。
一実施形態では、本明細書に記載の方法によって製剤化されたワクチンの応答は、治療効果を誘導するための様々な化合物の添加によって強化され得る。非限定的な例として、ワクチン製剤は、ＭＨＣ ＩＩ結合ペプチドまたはＭＨＣ ＩＩ結合ペプチドと類似の配列を有するペプチドを含んでもよい（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２０２７３６５号、同第２０１１０３１２９８号および米国特許公開第２０１２００７０４９３号、同第２０１１０１１０９６５号を参照されたい）。別の例として、ワクチン製剤は、対象においてニコチン残基に対する抗体応答を生じ得る修飾ニコチン化合物を含んでもよい（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２０６１７１７号および米国特許公開第２０１２０１１４６７７号を参照されたい）。
天然に存在する変異体
別の実施形態では、ｍＲＮＡを利用して、生物学的活性の増加、患者の転帰の改善、または保護機能などを含む、疾患修飾活性の改善を有する天然に存在するタンパク質のバリアントを発現することができる。多くのそのような修飾遺伝子が、哺乳動物において記載されている（すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｎａｄｅａｕ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００３ １３：２９０－２９５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｙｕ， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２；８：ｅ１００２６４４；Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９４ ７：１８０－１８４）。ヒトにおける例としては、アポＥ２タンパク質、アポＡ－Ｉバリアントタンパク質（アポＡ－Ｉ Ｍｉｌａｎｏ、アポＡ－Ｉ Ｐａｒｉｓ）、機能亢進性第ＩＸ因子タンパク質（第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ Ａｒｇ３３８Ｌｙｓ）、トランスサイレチン変異体（ＴＴＲ Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ）が挙げられる。アポＥ２（ｃｙｓ１１２、ｃｙｓ１５８）の発現は、アルツハイマー病およびおそらくは心血管疾患などの他の状態に対する易罹患性を低減することによって、他のアポＥアイソフォーム（アポＥ３（ｃｙｓ１１２、ａｒｇ１５８）、およびアポＥ４（ａｒｇ１１２、ａｒｇ１５８））と比較して保護を与えることが示されている（すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９４ ７：１８０－１８４；Ｓｅｒｉｐａ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ． ２０１１ １４：４９１－５００；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１３ ９：１０６－１１８）。アポＡ－Ｉバリアントの発現は、コレステロールの低減を伴っていた（すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ｄｅＧｏｍａ ａｎｄ Ｒａｄｅｒ， ２０１１ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｌ ８：２６６－２７１；Ｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３ ＪＡＭＡ ２９０：２２９２－２３００）。ある特定の集団におけるアポＡ－Ｉのアミノ酸配列は、アポＡ－Ｉ Ｍｉｌａｎｏにおいて（Ａｒｇ１７３がＣｙｓに変更された）およびアポＡ－Ｉ Ｐａｒｉｓにおいて（Ａｒｇ１５１がＣｙｓに変更された）、システインに変更された。位置Ｒ３３８Ｌにおける第ＩＸ因子変異（ＦＩＸ Ｐａｄｕａ）は、約１０倍に増加した活性を有する第ＩＸ因子タンパク質をもたらす（すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ． ２００９ ３６１：１６７１－１６７５；Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２０１２ １２０：４５２１－４５２３；Ｃａｎｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２０１２ １２０：４５１７－２０）。位置１０４または１１９（Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ）におけるトランスサイレチンの変異は、疾患をもたらすＶａｌ３０Ｍｅｔ変異も有する患者に保護を提供することが示されている（すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｒａｉｖａ， Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ． ２００１ １７：４９３－５０３； ＤＡＴＡ ＢＡＳＥ ＯＮ ＴＲＡＮＳＴＨＹＲＥＴＩＮ ＭＵＴＡＴＩＯＮＳ
ｗｗｗ．ｉｂｍｃ．ｕｐ．ｐｔ／ｍｊｓａｒａｉｖａ／ｔｔｒｍｕｔ．ｈｔｍｌ）。それぞれ、Ｍｅｔ１１９およびＨｉｓ１０４変異を有するポルトガル人および日本人のＭｅｔ３０患者の中で、臨床所見および症状の重症度の差異が、分子にさらなる安定性を与える非病原性変異体によって発揮される明らかな保護作用とともに観察される（すべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ （Ｓｕｐｐｌ） ６： Ｓ２０；Ｔｅｒａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． １９９９． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２６４： ３６５－３７０）。これらの保護ＴＴＲ対立遺伝子をコードする修飾ｍＲＮＡは、ＴＴＲアミロイド症患者において発現させることができ、それによって、病原性変異体ＴＴＲタンパク質の効果を低減させる。
本明細書に記載されているように、表現「主溝相互作用パートナー」は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝の面との相互作用、例えば、結合を通して、ＲＮＡリガンドを検出し、それに応答するＲＮＡ認識受容体を指す。したがって、本明細書に記載されているｍＲＮＡなどの修飾ヌクレオチドまたは核酸を含むＲＮＡリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を減少させ、したがって、自然免疫応答を減少させる。
例示的な主溝相互作用、例えば、結合のパートナーは、以下のヌクレアーゼおよびヘリカーゼを含むがこれらに限定されない。膜内において、ＴＬＲ（トール様受容体）３、７、および８は、一本鎖および二重鎖ＲＮＡに応答することができる。細胞質内において、ＤＥＸ（Ｄ／Ｈ）ヘリカーゼおよびＡＴＰａｓｅのスーパーファミリー２クラスのメンバーは、抗ウイルス応答を開始するＲＮＡを感知することができる。これらのヘリカーゼは、ＲＩＧ－Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ）およびＭＤＡ５（メラノーマ分化関連遺伝子５）を含む。他の例としては、遺伝学と生理学の研究所（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）２（ＬＧＰ２）、ＨＩＮ－２００ドメイン含有タンパク質、またはヘリカーゼドメイン含有タンパク質が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質をコードし、このタンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＢＲＣＡ１である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＢＲＣＡ２である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＴＳＣ１である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＴＳＣ２である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子としては、限定されないが、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ （ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４、またはＶＨＬが挙げられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮをコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮは、ヒトＰＴＥＮ配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ００５８２１、ＪＦ２６８６９０、Ｕ９２４３６、ＣＲ４５０３０６、ＡＫ０２４９８６、ＡＫ３１３５８１、Ｕ９６１８０、およびＵ９３０５１ならびにＮＭ＿０００３１４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、ヒトＴＰ５３配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＡＦ０５２１８０、ＮＭ＿０００５４６、ＡＹ４２９６８４、ＢＴ０１９６２２、ＡＫ２２３０２６、ＤＱ１８６６５２、ＤＱ１８６６５１、ＤＱ１８６６５０、ＤＱ１８６６４９、ＤＱ１８６６４８、ＤＱ２６３７０４、ＤＱ２８６９６４、ＤＱ１９１３１７、ＤＱ４０１７０４、ＡＦ３０７８５１、ＡＭ０７６９７２、ＡＭ０７６９７１、ＡＭ０７６９７０、ＤＱ４８５１５２、ＢＣ００３５９６、ＤＱ６４８８８７、ＤＱ６４８８８６、ＤＱ６４８８８５、ＤＱ６４８８８４、ＡＫ２２５８３８、Ｍ１４６９４、Ｍ１４６９５、ＥＦ１０１８６９、ＥＦ１０１８６８、ＥＦ１０１８６７、Ｘ０１４０５、ＡＫ３１２５６８、ＮＭ＿００１１２６１１７、ＮＭ＿００１１２６１１６、ＮＭ＿００１１２６１１５、ＮＭ＿００１１２６１１４、ＮＭ＿００１１２６１１３、ＮＭ＿００１１２６１１２、ＦＪ２０７４２０、Ｘ６００２０、Ｘ６００１９、Ｘ６００１８、Ｘ６００１７、Ｘ６００１６、Ｘ６００１５、Ｘ６００１４、Ｘ６００１３、Ｘ６００１１、Ｘ６００１２、Ｘ６００１０、Ｘ０２４６９、Ｓ６６６６６、ＡＢ０８２９２３、ＮＭ＿００１１２６１１８、ＪＮ９００４９２、ＮＭ＿００１２７６６９９、ＮＭ＿００１２７６６９８、ＮＭ＿００１２７６６９７、ＮＭ＿００１２７６７６１、ＮＭ＿００１２７６７６０、ＮＭ＿００１２７６６９６、およびＮＭ＿００１２７６６９５の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１は、ヒトＢＲＣＡ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿００７２９４、ＮＭ＿００７２９７、ＮＭ＿００７２９８、ＮＭ＿００７３０４、ＮＭ＿００７２９９、ＮＭ＿００７３００、ＢＣ０４６１４２、ＢＣ０６２４２９、ＢＣ０７２４１８、ＡＹ３５４５３９、ＡＹ７５１４９０、ＢＣ０８５６１５、ＢＣ１０６７４６、ＢＣ１０６７４５、ＢＣ１１４５１１、ＢＣ１１５０３７、Ｕ１４６８０、ＡＫ２９３７６２、Ｕ６８０４１、ＢＣ０３０９６９、ＢＣ０１２５７７、ＡＫ３１６２００、ＤＱ３６３７５１、ＤＱ３３３３８７、ＤＱ３３３３８６、Ｙ０８８６４、ＪＮ６８６４９０、ＡＢ６２１８２５、ＢＣ０３８９４７、Ｕ６４８０５、およびＡＦ００５０６８の受託番号を有する（ｗｉｔｈ ｗｉｔｈ）配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２は、ヒトＢＲＣＡ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４７５６８、ＮＭ＿００００５９、ＤＱ８９７６４８、ＢＣ０２６１６０の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１は、ヒトＴＳＣ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４７７７２、ＮＭ＿０００３６８、ＢＣ０７００３２、ＡＢ１９０９１０、ＢＣ１０８６６８、ＢＣ１２１０００、ＮＭ＿００１１６２４２７、ＮＭ＿００１１６２４２６、Ｄ８７６８３、およびＡＦ０１３１６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２は、ヒトＴＳＣ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４６９２９、ＢＸ６４７８１６、ＡＫ１２５０９６、ＮＭ＿０００５４８、ＡＢ２１００００、ＮＭ＿００１０７７１８３、ＢＣ１５０３００、ＢＣ０２５３６４、ＮＭ＿００１１１４３８２、ＡＫ０９４１５２、ＡＫ２９９３４３、ＡＫ２９５７２８、ＡＫ２９５６７２、ＡＫ２９４５４８、およびＸ７５６２１の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＲＢ１は、ヒトＲＢ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿０００３２１、ＡＹ４２９５６８、ＡＢ２０８７８８、Ｍ１９７０１、ＡＫ２９１２５８、Ｌ４１８７０、ＡＫ３０７７３０、ＡＫ３０７１２５、ＡＫ３００２８４、ＡＫ２９９１７９、Ｍ３３６４７、Ｍ１５４００、Ｍ２８４１９、ＢＣ０３９０６０、ＢＣ０４０５４０、およびＡＦ０４３２２４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、タンパク質をコードし、ここで、タンパク質の欠損は疾患または障害をもたらす。一部の実施形態では、タンパク質は、フラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質はアルファ１アンチトリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、タンパク質をコードし、個体におけるタンパク質の発現により、個体におけるタンパク質に対する免疫応答がモジュレートされる。一部の実施形態では、タンパク質は、抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の増加が生じる。一部の実施形態では、抗原は自己抗原であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の減少が生じる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、抗体またはその抗原結合性断片をコードする。一部の実施形態では、抗体は、治療用抗体である。一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、抗体は、疾患関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、レポーターｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ
５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ
ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をさらに含むか、またはＲＮＡｉと組み合わせて使用されるべきである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉとしては、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患関連遺伝子、例えば、がん関連遺伝子、例えば、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、スムーズンド遺伝子である。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ｒａｓＫである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、発癌遺伝子を標的とし、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、ＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１に変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異体形態を特異的に標的とするが、ＫＲＡＳの野生型形態は標的としない。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１に変異を含む。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの複数の変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、複数の変異体形態は、ＫＲＡＳの複数の異常を含み、ＫＲＡＳの複数の異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に少なくとも２つまたはそれより多い変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの複数の異常は、ＫＲＡＳのコドン１２および６１に少なくとも２つまたはそれより多い変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ
Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、およびＱ６１Ｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）および第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）を含む複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含み、第１のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第１の変異体形態を標的とし、第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第２の変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡｉおよび／または第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの野生型形態を標的としない。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に変異を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１に変異を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、コドン１２に変異を含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、コドン６１に変異を含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋから選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）、第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）、および第３のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む、複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第１の変異体形態を標的とし、第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第２の変異体形態を標的とし、第３のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第３の変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に変異を含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３ＤおよびＱ６１Ｋからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳ変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含み、第３の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８３）、５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３（アンチセンス）（配列番号８４）、５’－ＧＡＡＧＵＧＣＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴ－３’（センス）（配列番号８６）、５’－ＧＵＣＵＣＧＧＵＧＵＡＧＣＡＣＵＵＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８７）、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８８）および／または５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８９）の配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号８３、８４、８６～８９を有する配列から選択される核酸配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓを標的とする配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、例えば、Ａｃｕｎｚｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１７ Ｍａｙ ２３；１１４（２１）：Ｅ４２０３－Ｅ４２１２に開示されているｓｉＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、そのそれぞれが本出願において完全に組み込まれている、ＷＯ２０１４０１３９９５、ＪＰ２０１３２１２０５２、ＷＯ２０１４１１８８１７、ＷＯ２０１２１２９３５２、ＷＯ２０１７１７９６６０、ＪＰ２０１３５４４５０５、ＵＳ８００８４７４、ＵＳ７７４５６１１、ＵＳ７５７６１９７、ＵＳ７５０７８１１に開示されているＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、限定されないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを含む。用語「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内にある場合に、標的遺伝子または配列の発現を（例えば、干渉ＲＮＡ配列に相補的であるｍＲＮＡの分解を媒介するまたはその翻訳を阻害することによって）低減または阻害することができる、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、二重鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡ）を指し、よって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的である一本鎖ＲＮＡまたは２本の相補鎖によってもしくは単一の自己相補鎖によって形成された二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子もしくは配列との実質的もしくは完全同一性を有してもよく、またはミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含んでもよい。干渉ＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子、またはその部分配列に対応することができる。干渉ＲＮＡは、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、長さが約１５～６０、１５～５０、または５～４０（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には、長さが約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチドの干渉ＲＮＡを含み、好ましくは長さが約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドである（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、長さが１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチド、好ましくは、長さが約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチドであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが約１５～６０、１５～５０、１５～４０、５～３０、５～２５、または１９～２５塩基対、好ましくは長さが約８～２２、９～２０、または１９～２１塩基対である）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’オーバーハングおよび５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例としては、限定されないが、一方の鎖がセンス鎖であり、他方が相補アンチセンス鎖である、２本の別個の鎖状分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センス領域とアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結されている、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに２つまたはそれより多いループ構造と自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有するステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子であって、環状ポリヌクレオチドがｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされて活性二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる、環状一本鎖ポリヌクレオチド分子が挙げられる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学合成される。ｓｉＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮａｓｅ ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒでのより長いｄｓＲＮＡ（例えば、長さが約２５ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡ）の切断によって生成することもできる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡを生物学的に活性なｓｉＲＮＡにプロセシングする（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｔ． ＵＳＡ， ９９：９９４２－９９４７ （２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９９： １４２３６ （２００２）；Ｂｙｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｅｈＮｏｔｅｓ， １０（ｌ）：４－６ （２００３）；Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３ １：９８１ － ９８７ （２００３）；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３：２２６９－２２７１ （２００１）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３：８２ （１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、長さが少なくとも５０ヌクレオチド～約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドである。ｄｓＲＮＡは、長さが１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチドもの長さであってもよく、またはそれより長くてもよい。ｄｓＲＮＡは、全遺伝子転写産物または部分遺伝子転写産物をコードし得る。ある特定の事例では、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされてもよい（例えば、自動的にフォールディングしてヘアピンループを有する二重鎖になる配列として転写される）。低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを生じさせるＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によって切断されてｓｉＲＮＡになり、次いで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、結合しているｓｉＲＮＡと適合するｍＲＮＡと結合し、そのｍＲＮＡを切断する。ＲＮＡｉの好適な長さとしては、限定されないが、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対が挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、対応する標的遺伝子に実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一）である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡｉである。ＲＮＡｉの好適な長さとしては、限定されないが、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対が挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、対応する標的遺伝子に実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一）である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、がんなどの疾患に関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、疾患は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍などのがんであり、干渉ＲＮＡは、がんに関与するタンパク質、例えば、がんの進行を調節することに関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、がんに関与する発癌遺伝子を標的とする。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、免疫応答を負に調節することに関与するタンパク質をコードするＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡを特異的に標的とする。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを標的とする。一部の実施形態では、負の共刺激分子としては、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、およびＣＴＬＡ－４が挙げられる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）は、真核細胞に見られる短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。ｍｉｃｒｏＲＮＡ分子は、他のＲＮＡと比較して、非常に少ないヌクレオチド（平均２２）を有する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列に結合する転写後調節因子であり、通常、翻訳の抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。ヒトゲノムは、１０００を超えるｍｉＲＮＡをコードし得、これらは、約６０％の哺乳動物遺伝子を標的とし得、多くのヒト細胞型において豊富に存在する。ｍｉＲＮＡの好適な長さとしては、限定されないが、約５～約２００ヌクレオチド、または約０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対が挙げられる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、対応する標的遺伝子に実質的に相補的（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一）である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み込むことによって修飾される。
ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉの修飾
一部の実施形態では、本明細書に記載のいずれかのｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は修飾されている。修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉは、当技術分野における問題のうちの１つまたは複数を回避する構造的および／または化学的フィーチャ、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度、半減期および／またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質の局在化を最適化し、ならびに免疫応答および／または分解経路などの有害な生物応答を回避しながら、核酸ベースの治療薬を最適化するために有用であるフィーチャを有する。ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉの修飾は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉを含むヌクレオシドのヌクレオシド塩基および／または糖部分上に存在し得る。
修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子ならびにその調製についてのいくつかの例を教示する代表的な米国特許および特許出願としては、これらに限定されないが、米国特許第８８０２４３８号、米国特許出願第２０１３／０１２３４８１号が挙げられ、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、組織における安定性および／またはクリアランス、受容体の取り込みおよび／または動態、組成物による細胞へのアクセス、翻訳機構とのエンゲージメント、半減期、翻訳効率、免疫回避、タンパク質産生能、分泌効率（該当する場合）、循環へのアクセシビリティ、タンパク質の半減期ならびに／または細胞の状態、機能および／もしくは活性のモジュレーションを改善するために修飾されている。
ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間連結に対して（例えば、連結リン酸に対して／ホスホジエステル連結に対して／ホスホジエステル骨格に対して）、いずれかの有用な修飾を含み得る。例えば、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉの主溝、または核酸塩基の主溝の面は、１つまたは複数の修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基（例えば、主溝の面の）の１つまたは複数の原子は、必要に応じて置換されたアミノ、必要に応じて置換されたチオール、必要に応じて置換されたアルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）で置き換えまたは置換され得る。ある特定の実施形態では、修飾（例えば、１つまたは複数の修飾）は、糖およびヌクレオシド間の連結のそれぞれに存在する。本発明による修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）への修飾、例えば、リボフラニシル環の２’ＯＨの２’Ｈ（トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそのハイブリッド）への置換であり得る。さらなる修飾が、本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、修飾は核酸塩基上に存在し、プソイドウリジンまたはＮ１－メチルプソイドウリジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）でも５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）でもない。
一部の実施形態では、複数の修飾は、修飾された核酸中またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉの１つもしくは複数の個々のヌクレオシドもしくはヌクレオチド中に含まれる。例えば、ヌクレオシドへの修飾は、核酸塩基および糖への１つまたは複数の修飾を含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉは、主溝の面で化学的に修飾され、それによって、自然免疫応答を引き起こし得る主溝の結合パートナー相互作用を妨害する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、主溝の相互作用パートナー、例えば、結合パートナーの核酸との結合を妨害するヌクレオチドを含み、主溝の相互作用パートナーに対するヌクレオチドの結合親和性は低下している。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、化学的修飾を含有するヌクレオチドを含み、主溝の相互作用パートナーに対するヌクレオチドの結合は変化している。一部の実施形態では、化学的修飾は、核酸塩基の主溝の面に位置し、化学的修飾は、ピリミジン核酸塩基の原子をアミン、ＳＨ、アルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）で置き換えることまたは置換することを含み得る。一部の実施形態では、化学的修飾は、ヌクレオチドの糖部分に位置する。一部の実施形態では、化学的修飾は、核酸のリン酸骨格に位置する。一部の実施形態では、化学的修飾は、核酸の主溝の面の電気化学を変更する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、化学的修飾を含有するヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、対応する未修飾核酸によって誘導される細胞の自然免疫と比較して、細胞の自然免疫応答を低減する。
修飾は、様々な別個の修飾であり得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されており、コード領域、隣接領域および／または末端領域は、１つ、２つ、またはそれより多い（必要に応じて異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチドの修飾を含有し得る。
一部の実施形態では、細胞に導入された修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉは、未修飾ポリヌクレオチドと比較して、分解の低下および／または細胞の自然免疫もしくはインターフェロン応答の低下を示し得る。ＲＮＡ。修飾としては、これらに限定されないが、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化 脱リン酸化、コンジュゲーション、逆連結（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｌｉｎｋａｇｅ）など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾された塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または広範囲のレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基、またはコンジュゲートされた塩基による置き換え、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位での）または糖の置き換え、および（ｄ）ホスホジエステル連結の修飾または置き換えを含むヌクレオシド間連結の修飾が挙げられる。そのような修飾がｍＲＮＡの翻訳に干渉する（すなわち、例えば、ウサギの網状赤血球におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいて、修飾の欠如に対して５０％またはそれを超える翻訳の低下をもたらす）程度までには、本明細書に記載の方法および組成物に対して、修飾は好適ではない。本明細書に記載の方法に関して有用な修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子の具体例としては、これらに限定されないが、修飾されたまたは非天然のヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡ分子が挙げられる。修飾されたヌクレオシド間連結を有する修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子としては、とりわけ、ヌクレオシド間連結においてリン原子を有さないものが挙げられる。他の実施形態では、合成の、修飾さえたＲＮＡは、そのヌクレオシド間連結においてリン原子を有する。
修飾されたヌクレオシド間連結の非限定的な例として、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、および逆極性を有するものを含み、ヌクレオシド単位の隣接する対は、３’～５’から５’～３’または２’～５’から５’～２’に連結している。様々な塩、混合された塩および遊離酸形態も含まれる。
その中にリン原子を含まない修飾されたヌクレオシド間連結は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合型ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるヌクレオシド間連結を有する。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する核酸およびヘテロ原子ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオシド、特に、上記で言及された米国特許第５，４８９，６７７号の－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして公知］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－および－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［天然ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－と表される］、および上記で言及された米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格（上記特許の両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げた核酸配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、上記で言及された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、１つまたは複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書で取り上げた核酸は、２’位に以下の：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含み得、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換されたまたは置換されていないＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ここで、ｎおよびｍは、１～約１０である。一部の実施形態では、修飾されたＲＮＡは、２’位に以下の：Ｃ１～Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、リポーター基、インターカレーター、ＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、または修飾されたＲＮＡの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。一部の実施形態では、修飾には、２’メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６－５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。別の例示的な修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても公知のＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の例示的な修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾もまた、核酸配列の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上のまたは２’－５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位において作製することができる。修飾されたＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有することもできる。
非限定的な例として、本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子としては、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートもしくはヌクレオシドを含む非天然塩基、またはそれらの任意の組合せを含む少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドが挙げられ得る。
一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン（Ｉ）、５－メチルシトシン（ｍ５Ｃ）、プソイドウリジン（ψ）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍ５Ｃ）、およびＮ１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ（１）ψ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である。
一部の実施形態では、修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子は、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）の修飾または置換を含む。修飾されたヌクレオシドは、他の合成および天然核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアノシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）、２－（ハロ）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、２－（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２－（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６－（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル、２－（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、４－（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３－ジアゾール－１－アルキル）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、ウラシル－５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５－ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）プソイドウラシル、５－（メチル）プソイドウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）－４（チオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－４（チオ）プソイドウラシル、５－（アルキル）－２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５－（メチル）－２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）－プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）プソイドウラシル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、ツベルシジン、イソグアノシン、イノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザ－イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３－（メチル）イソカルボスチリリル、５－（メチル）イソカルボスチリリル、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、７－（アザ）インドリル、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９－（メチル）－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、２，４，５－（トリメチル）フェニル、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンゾイミダゾール、４－（メチル）ベンゾイミダゾール、６－（アゾ）チミン、２－ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６－（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６－（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－置換プリン、０６－置換プリン、置換１，２，４－トリアゾール、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、または任意のＯ－アルキル化もしくはＮ－アルキル化されたその誘導体を含む。修飾されたヌクレオシドはまた、コンジュゲートされた部分、例えば、リガンドを含む天然塩基を含む。
さらに修飾された核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，
Ｐ． ｅｄ． Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００８に開示されているもの；２００９年３月２６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３８，４２５に開示されているもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８－８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３によって開示されているものが挙げられる。
上記の修飾された核酸塩基および他の修飾核酸塩基のいくつかの調製について教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびにそれぞれがその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５７，１９１号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２号；同第６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および同第７，４９５，０８８号、ならびにやはりその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，７５０，６９２号が挙げられる。
本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子に関して使用するための別の修飾は、ＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みを増強させる１つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートをＲＮＡに化学的に連結させることを伴う。リガンドは、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉを投与する場合に特に有用であり得る。そのような部分としては、これらに限定されないが、コレステロール部分などの脂質部分（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
１９８９， ８６： ６５５３－６５５６）、コール酸（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ．
Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（そのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ
ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート）（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７－３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｉｓｈｒａ
ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３－９３７）が挙げられる。
本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、５’キャップをさらに含み得る。本明細書に記載の態様の一部の実施形態では、修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子は、５’－５’三リン酸連結を使用して、ＲＮＡ分子の５’末端に連結している修飾されたグアニンヌクレオチドを含む５’キャップを含む。本明細書で使用される場合、用語「５’キャップ」は、例えば、５’ジグアノシンキャップ、メチレン－ビス（ホスホネート）部分を有するテトラホスフェートキャップ類似体（例えば、Ｒｙｄｚｉｋ， Ａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ７（２２）：４７６３－７６を参照されたい）、ホスホロチオエート修飾（例えば、Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｊ． ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＲＮＡ １４（６）：１１１９－１１３１を参照されたい）、非架橋酸素のための硫黄置換を有するキャップ類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ－Ｎｏｇａｌｓｋａ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， （２００７） ＲＮＡ １３（１０）： １７４５－１７５５を参照されたい）、Ｎ７－ベンジル化ジヌクレオシドテトラホスフェート類似体（例えば、Ｇｒｕｄｚｉｅｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） ＲＮＡ １０（９）：１４７９－１４８７を参照されたい）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） ＲＮＡ ９（９）： １１０８－１１２２およびＳｔｅｐｉｎｓｋｉ， Ｊ． ｅｔ
ａｌ．， （２００１） ＲＮＡ ７（１０）：１４８６－１４９５を参照されたい）を含む他の５’キャップ類似体を包含することを意図する。そのような一実施形態では、５’キャップ類似体は、５’ジグアノシンキャップである。一部の実施形態では、修飾されたＲＮＡは、５’三リン酸を含まない。
５’キャップは、ｍＲＮＡを認識してリボソームに付着し、翻訳を開始するのに重要である。また、５’キャップは、修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉを５’エキソヌクレアーゼ媒介性の分解から保護する。修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子が５’キャップを含むことは絶対条件ではなく、よって、他の実施形態では、修飾されたｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子は５’キャップを欠く。しかし、５’キャップを含む修飾されたｍＲＮＡの半減期が長く、翻訳効率が上昇するため、本明細書では、５’キャップを含む修飾されたＲＮＡが好ましい。
本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡ分子は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含み得る。非翻訳領域は、開始コドン（５’）の前および停止コドン（３’）の後のＲＮＡ領域であり、したがって、翻訳機構により翻訳されない。非翻訳領域は、リボヌクレアーゼおよびＲＮＡ分解に関与する他のタンパク質に干渉し得るので、１つまたは複数の非翻訳領域を有するＲＮＡ分子の修飾によりｍＲＮＡの安定性が改善され得る。加えて、５’および／または３’非翻訳領域を有するＲＮＡの修飾は、ｍＲＮＡへのリボソーム結合を変更する結合タンパク質によって翻訳効率を向上させ得る。３’ＵＴＲを有するＲＮＡの修飾を使用して、ＲＮＡの細胞質局在化を維持することができ、細胞の細胞質内で翻訳が生じ得る。一実施形態では、本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡは、５’ＵＴＲも３’ＵＴＲも含まない。別の実施形態では、修飾されたｍＲＮＡは、５’または３’ＵＴＲのいずれかを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの両方を含む。一実施形態では、５’および／または３’ＵＴＲは、細胞中（例えば、ネズミアルファ－グロビン３’ＵＴＲ）において高い安定性を有することが公知のｍＲＮＡから選択される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはその両方は１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡは、コザック配列をさらに含む。「コザック配列」とは、コンセンサス（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号９２）を有する真核生物のｍＲＮＡ上の配列を指し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドンの後に別の「Ｇ」が続く。コザックコンセンサス配列は、リボソームによって認識され、ポリペプチドの翻訳が開始される。典型的には、転写物の５’末端の近位にある翻訳機構によって出会う最初のＡＵＧコドンで開始する。しかし、場合によっては、このＡＵＧコドンは、リーキースキャニングと呼ばれるプロセスでバイパスできる。ＡＵＧコドン付近にコザック配列が存在することにより、正確なポリペプチドの翻訳が生じるように、翻訳開始部位としてそのコドンが強化される。さらに、コザック配列を修飾されたＲＮＡに付加すると、たとえ、開始コドンに関する曖昧さがないとしても、さらに効率のよい翻訳が促進される。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたＲＮＡは、翻訳を開始する所望の部位でコザックコンセンサス配列をさらに含み、正確な長さのポリペプチドを生成する。一部のそのような実施形態では、コザック配列は１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子は、「ポリ（Ａ）テイル」をさらに含み、これは、アデニンヌクレオチドの３’ホモポリマーテイルを指し、長さが変動してもよく（例えば、少なくとも５つのアデニンヌクレオチド）、最大数百のアデニンヌクレオチドとなってもよい。３’ポリ（Ａ）テイルを含むことによって、修飾されたＲＮＡを細胞中の分解から保護することができ、また、核外局在化が促進され、翻訳効率が向上する。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは１～５００の間のアデニンヌクレオチドを含み、他の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００のアデニンヌクレオチド、またはそれより多くを含む。一実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、１～１５０の間のアデニンヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、９０～１２０の間のアデニンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルは、１つまたは複数の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載の修飾されたｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ分子への１つまたは複数の修飾により、細胞中において修飾されたＲＮＡ分子の安定性がさらに増すと考えられている。そのような修飾によって翻訳が可能となり、かつ／または修飾によって修飾されたＲＮＡに対する細胞の自然免疫応答もしくはインターフェロン応答を低下させるか、もしくは悪化させない限り、そのような修飾は本明細書での使用が具体的に企図される。一般に、修飾されたｍＲＮＡの安定性が高いほど、その修飾されたｍＲＮＡからより多くのタンパク質が産生され得る。典型的には、細胞タンパク質がＡＵリッチ領域に動員され、転写物のポリ（Ａ）テイルの除去が刺激されるので、哺乳動物のｍＲＮＡにＡＵリッチ領域が存在すると転写物が不安定になる傾向がある。修飾されたＲＮＡのポリ（Ａ）テイルが欠失することにより、ＲＮＡ分解が増加し得る。よって、一実施形態では、本明細書に記載の修飾されたＲＮＡは、ＡＵリッチ領域を含まない。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ＡＵＵＵＡ配列要素を実質的に欠いている。
細胞膜透過ペプチドを含む複合体およびナノ粒子
一部の態様では、本発明は、１つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達するための、細胞膜透過ペプチドを含む複合体およびナノ粒子を提供する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のｍＲＮＡと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のｍＲＮＡのうち少なくとも１つと非共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のｍＲＮＡのそれぞれと非共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のｍＲＮＡのうち少なくとも１つと共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のｍＲＮＡのそれぞれと共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはタンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されている（例えば、ここで、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、ＲＮＡｉをさらに含むか、またはＲＮＡｉと組み合わせて投与される（例えば、細胞にＲＮＡｉを送達するための細胞膜透過ペプチドを含む複合体またなナノ粒子と組み合わせて投与される）。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、第１のタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ、および第２のタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、第１の内因性遺伝子を標的とする第１のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、および第２の内因性遺伝子を標的とする第２のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉである。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とする。
一部の態様では、本発明は、細胞に１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達するための細胞膜透過ペプチドを含む複合体およびナノ粒子を提供する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のうち少なくとも１つと非共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のそれぞれと非共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のうち少なくとも１つと共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のそれぞれと共有結合によって複合体を形成している。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、内因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、内因性遺伝子は、疾患または状態に関与する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、第１の内因性遺伝子を標的とする第１のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、および第２の内因性遺伝子を標的とする第２のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。
細胞膜透過ペプチド
本発明のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子中の細胞膜透過ペプチドは、様々なｍＲＮＡを有する、安定した複合体およびナノ粒子を形成することができる。本明細書に記載のいずれのｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子におけるいずれの細胞膜透過ペプチドが、このセクションに記載のいずれの細胞膜透過ペプチド配列を含んでいても、またはそれらからなってもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞膜透過ペプチドを含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在するｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在し、ｍＲＮＡと会合している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ナノ粒子の中間層中に存在する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ナノ粒子の表面層中に存在する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。ＷＯ２０１４／０５３８７９には、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８１には、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８２には、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１２／１３７１５０には、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８０には、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１６／１０２６８７には、ＡＤＧＮ－１００ペプチドが開示されており、米国特許出願公開第２０１０／００９９６２６号には、ＣＡＤＹペプチドが開示されており、および米国特許第７，５１４，５３０号には、ＭＰＧペプチドが開示されており、これらの開示は、それら全体が本明細書での参照により本明細書に組み入れられている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ６Ｘ７Ｘ３Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号１）を含むＶＥＰＥＰ－３細胞膜透過ペプチドを含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、（互いに独立して）Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ３は、（互いに独立して）ＦまたはＷであり、Ｘ４は、（互いに独立して）Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＴまたはＳであり、Ｘ７は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ８は、存在しないか、ＦまたはＷであり、Ｘ９は、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＬであり、Ｘ１１は、Ｋ、ＷまたはＲであり、Ｘ１２は、ＲまたはＦであり、およびＸ１３は、ＲまたはＫである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＷＸ４ＥＸ２ＷＸ４Ｘ６Ｘ７Ｘ３ＰＲＸ１１ＲＸ１３（配列番号２）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ３は、ＦまたはＷであり、Ｘ４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＴまたはＳであり、Ｘ７は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ８は、存在しないか、ＦまたはＷであり、Ｘ９は、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＬであり、Ｘ１１は、Ｋ、ＷまたはＲであり、Ｘ１２は、ＲまたはＦであり、およびＸ１３は、ＲまたはＫである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＦＥＲＷＦＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号３）、Ｘ１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号４）、Ｘ１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＫ（配列番号５）、Ｘ１ＲＷＷＥＫＷＷＴＲＷＰＲＫＲＫ（配列番号６）、またはＸ１ＲＷＹＥＫＷＹＴＥＦＰＲＲＲＲ（配列番号７）を含み、これらの配列中のＸ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、細胞膜透過ペプチドが、１０位のアミノ酸の非天然アミノ酸による置換、２位と３位のアミノ酸間への非天然アミノ酸の付加、および２つの非天然アミノ酸間への炭化水素連結の付加により修飾されている、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＸ１４ＷＷＥＲＷＷＲＸ１４ＷＰＲＫＲＫ（配列番号８）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、およびＸ１４は、非天然アミノ酸であり、ならびに２つの非天然アミノ酸間に炭化水素連結がある。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＸ５Ｘ１０Ｘ３ＷＸ６Ｘ７ＷＸ８Ｘ９Ｘ１０ＷＸ１２Ｒ（配列番号９）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ３は、ＦまたはＷであり、Ｘ５は、ＲまたはＳであり、Ｘ６は、ＲまたはＳであり、Ｘ７は、ＲまたはＳであり、Ｘ８は、ＦまたはＷであり、Ｘ９は、ＲまたはＰであり、Ｘ１０は、ＬまたはＲであり、およびＸ１２は、ＲまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＲＷＷＲＬＷＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号１０）、Ｘ１ＬＷＷＲＲＷＷＳＲＷＷＰＲＷＲＲ（配列番号１１）、Ｘ１ＬＷＷＳＲＷＷＲＳＷＦＲＬＷＦＲ（配列番号１２）、またはＸ１ＫＦＷＳＲＦＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号１３）を含み、これらの配列中のＸ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、細胞膜透過ペプチドが、５位または１２位のアミノ酸の非天然アミノ酸による置換、および２つの非天然アミノ酸間への炭化水素連結の付加により修飾されている、配列番号１および９～１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＲＷＷＸ１４ＬＷＷＲＳＷＸ１４ＲＬＷＲＲ（配列番号１４）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－アラニンまたはセリンであり、およびＸ１４は、非天然アミノ酸であり、ならびに２つの非天然アミノ酸間に炭化水素連結がある。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア中のｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在し、ｍＲＮＡと会合している。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子の中間層中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子の表面層中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ＶＥＰＥＰ－６細胞膜透過ペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ｘ１ＬＸ２ＲＡＬＷＸ９ＬＸ３Ｘ９Ｘ４ＬＷＸ９ＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１５）、Ｘ１ＬＸ２ＬＡＲＷＸ９ＬＸ３Ｘ９Ｘ４ＬＷＸ９ＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１６）およびＸ１ＬＸ２ＡＲＬＷＸ９ＬＸ３Ｘ９Ｘ４ＬＷＸ９ＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらの配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＦまたはＷであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ４は、Ｓ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ５は、ＬまたはＷであり、Ｘ６は、ＷまたはＲであり、Ｘ７は、ＫまたはＲであり、Ｘ８は、Ａであるか、または存在せず、およびＸ９は、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＬＸ２ＲＡＬＷＲＬＸ３ＲＸ４ＬＷＲＬＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１８）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＦまたはＷであり、Ｘ３は、Ｌ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ４は、Ｓ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ５は、ＬまたはＷであり、Ｘ６は、ＷまたはＲであり、Ｘ７は、ＫまたはＲであり、およびＸ８は、Ａであるか、または存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＬＸ２ＲＡＬＷＲＬＸ３ＲＸ４ＬＷＲＬＸ５Ｘ６ＫＸ７（配列番号１９）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＦまたはＷであり、Ｘ３は、ＬまたはＷであり、Ｘ４は、Ｓ、ＡまたはＮであり、Ｘ５は、ＬまたはＷであり、Ｘ６は、ＷまたはＲであり、Ｘ７は、Ａであるか、または存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＸ２ＬＷＲＬＬＷＸ３（配列番号２０）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＸ２ＬＷＲＬＬＷＸ３Ａ（配列番号２１）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ４ＲＸ２ＬＷＲＬＷＲＸ３Ａ（配列番号２２）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＸ２ＬＷＲＬＷＲＸ３Ａ（配列番号２３）、Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ５ＲＡＬＷＲＬＬＷＸ３Ａ（配列番号２４）、およびＸ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ４ＲＮＬＷＲＬＬＷＸ３Ａ（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらの配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、ＳまたはＴであり、Ｘ３は、ＫまたはＲであり、Ｘ４は、Ｌ、ＣまたはＩであり、およびＸ５は、ＬまたはＩである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号２６）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号２７）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＷＲＫＡ－システアミド（配列番号２８）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＷＲＫＡ－システアミド（配列番号２９）、Ａｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＡＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号３０）、およびＡｃ－Ｘ１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＮＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号３１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらの配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、８位と１２位の２つの残基間に炭化水素連結をさらに含む、配列番号１５～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３２）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＲＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３３）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＳＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３４）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＳＳＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３５）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３６）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＲＬＬＲＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３７）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＳＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３８）、Ａｃ－Ｘ１ＬＦＬＡＲＷＲＬＬＳＳＳＬＷＳＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３９）、およびＡｃ－Ｘ１ＬＦＡＲＳＬＷＲＬＬＲＳＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらの配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、下付の（ｉｎｆｅｒｉｏｒ）「Ｓ」が後ろにある残基は、前記炭化水素連結により連結している残基である。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア中のｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在し、ｍＲＮＡと会合している。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子の中間層中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子の表面層中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ３Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号４１）を含むＶＥＰＥＰ－９細胞膜透過ペプチドを含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｌであるか、または存在せず、Ｘ３は、Ｒであるか、または存在せず、Ｘ４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１１は、Ｗであるか、または存在せず、Ｘ１２は、Ａであるか、Ｒであるか、または存在せず、およびＸ１３は、ＷまたはＦであり、ならびにＸ３が存在しない場合には、Ｘ２、Ｘ１１およびＸ１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＲＷＷＬＲＷＡＸ６ＲＷＸ８Ｘ９Ｘ１０ＷＸ１２ＷＸ１３Ｒ（配列番号４２）を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ２は、Ｌであるか、または存在せず、Ｘ６は、ＳまたはＰであり、Ｘ８は、ＦまたはＡであり、Ｘ９は、Ｓ、ＬまたはＰであり、Ｘ１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ１２は、ＡまたはＲであり、およびＸ１３は、ＷまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号４３）、Ｘ１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号４４）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号４５）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号４６）、Ｘ１ＲＷＷＬＲＷＡＰＲＷＦＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号４７）、およびＸ１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらの配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＷＷＸ４Ｘ５ＷＡＸ６Ｘ７Ｘ８ＲＸ１０ＷＷＲ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、この配列中、Ｘ１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ４は、ＲまたはＧであり、Ｘ５は、ＷまたはＳであり、Ｘ６は、Ｓ、ＴまたはＰであり、Ｘ７は、ＷまたはＰであり、Ｘ８は、ＡまたはＲであり、およびＸ１０は、ＳまたはＲである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ１ＷＷＲＷＷＡＳＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号５０）、Ｘ１ＷＷＧＳＷＡＴＰＲＲＲＷＷＲ（配列番号５１）、およびＸ１ＷＷＲＷＷＡＰＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、これらの配列中のＸ１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア中のｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在し、ｍＲＮＡと会合している。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子の中間層中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子の表面層中に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号５３）を含むＡＤＧＮ－１００細胞膜透過ペプチドを含み、この配列中、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、または存在せず、およびＸ２～Ｘ８は、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ１ＫＷＲＳＸ２Ｘ３Ｘ４ＲＷＲＬＷＲＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＲ（配列番号５４）を含み、この配列中、Ｘ１は、βＡであるか、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ２は、ＡまたはＶであり、Ｘ３は、またはＬであり、Ｘ４は、ＷまたはＹであり、Ｘ５は、ＶまたはＳであり、Ｘ６は、Ｒ、ＶまたはＡであり、Ｘ７は、ＳまたはＬであり、およびＸ８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５５）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５６）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号５７）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号５８）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、炭化水素連結により連結している３つまたは６つの残基により隔てられている２つの残基を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＫＷＲＳＳＡＧＷＲＳＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５９）、ＫＷＲＳＳＡＧＷＲＷＲＳＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号６０）、ＫＷＲＳＡＧＷＲＳＷＲＬＷＲＶＲＳＳＷＳＲ（配列番号６１）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号６２）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号６３）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＲＳＳＷＳＲ（配列番号６４）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＳＲＳＷＳＲ（配列番号６５）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＳＲＳＷＳＳＲ（配列番号６６）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号６７）、ＫＷＲＳＳＡＬＹＲＳＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号６８）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＳＬＷＲＳＳＡＬＹＳＲ（配列番号６９）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＳＡＬＹＳＳＲ（配列番号７０）を含み、これらの配列中、下付の「Ｓ」で示された残基は、炭化水素連結により連結している。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア中のｍＲＮＡ送達複合体中に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア中に存在し、ｍＲＮＡと会合している。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子の中間層中に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子の表面層中に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ＣＰＰのＮ末端に連結している１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＮ末端に共有結合によって連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核内局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、およびターゲティング分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に連結しているアセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に連結しているアセチル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に連結しているステアリル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に共有結合によって連結しているアセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に共有結合によって連結しているアセチル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に共有結合によって連結しているステアリル基を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ＣＰＰのＣ末端に連結している１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＣ末端に共有結合によって連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝状Ｃ１～Ｃ６アルキル基、一級または二級アミン、オシド誘導体（ｏｓｉｄｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核内局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖類、およびターゲティング分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＣ末端に連結しているシステアミド基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＣ末端に共有結合によって連結しているシステアミド基を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ステープル化されている。本明細書において使用する場合の「ステープル化」は、ペプチド中の２残基間の化学的連結を指す。一部の実施形態では、該ペプチドの２アミノ酸間に化学的連結を含むＣＰＰは、ステープル化されている。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸は、３つまたは６つのアミノ酸により隔てられている。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸は、３つのアミノ酸により隔てられている。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸は、６つのアミノ酸により隔てられている。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸の各々は、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸の各々は、Ｒである。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸の各々は、Ｓである。一部の実施形態では、化学的連結により連結している２つのアミノ酸の一方は、Ｒであり、他方は、Ｓである。一部の実施形態では、化学的連結は、炭化水素連結である。
細胞膜透過ペプチドを含む複合体
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡと会合している、細胞膜透過ペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、ＶＥＰＥＰ－９、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）を含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、会合は、非共有結合である。一部の実施形態では、会合は、共有結合である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体中の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの、１つまたは複数のｍＲＮＡのうちの少なくとも１つに対するモル比は、約１：１～約１００：１の間、または約１：１～約５０：１の間、または約２０：１である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチドおよびＰｅｐ－２ペプチドを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子としては、限定されないが、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４、またはＶＨＬが挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍抑制遺伝子は、ＰＢ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮおよびＴＰ５３から選択される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮは、ヒトＰＴＥＮ配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ００５８２１、ＪＦ２６８６９０、Ｕ９２４３６、ＣＲ４５０３０６、ＡＫ０２４９８６、ＡＫ３１３５８１、Ｕ９６１８０、およびＵ９３０５１ならびにＮＭ＿０００３１４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質ｐ５３をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、ヒトＴＰ５３配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＡＦ０５２１８０、ＮＭ＿０００５４６、ＡＹ４２９６８４、ＢＴ０１９６２２、ＡＫ２２３０２６、ＤＱ１８６６５２、ＤＱ１８６６５１、ＤＱ１８６６５０、ＤＱ１８６６４９、ＤＱ１８６６４８、ＤＱ２６３７０４、ＤＱ２８６９６４、ＤＱ１９１３１７、ＤＱ４０１７０４、ＡＦ３０７８５１、ＡＭ０７６９７２、ＡＭ０７６９７１、ＡＭ０７６９７０、ＤＱ４８５１５２、ＢＣ００３５９６、ＤＱ６４８８８７、ＤＱ６４８８８６、ＤＱ６４８８８５、ＤＱ６４８８８４、ＡＫ２２５８３８、Ｍ１４６９４、Ｍ１４６９５、ＥＦ１０１８６９、ＥＦ１０１８６８、ＥＦ１０１８６７、Ｘ０１４０５、ＡＫ３１２５６８、ＮＭ＿００１１２６１１７、ＮＭ＿００１１２６１１６、ＮＭ＿００１１２６１１５、ＮＭ＿００１１２６１１４、ＮＭ＿００１１２６１１３、ＮＭ＿００１１２６１１２、ＦＪ２０７４２０、Ｘ６００２０、Ｘ６００１９、Ｘ６００１８、Ｘ６００１７、Ｘ６００１６、Ｘ６００１５、Ｘ６００１４、Ｘ６００１３、Ｘ６００１１、Ｘ６００１２、Ｘ６００１０、Ｘ０２４６９、Ｓ６６６６６、ＡＢ０８２９２３、ＮＭ＿００１１２６１１８、ＪＮ９００４９２、ＮＭ＿００１２７６６９９、ＮＭ＿００１２７６６９８、ＮＭ＿００１２７６６９７、ＮＭ＿００１２７６７６１、ＮＭ＿００１２７６７６０、ＮＭ＿００１２７６６９６、およびＮＭ＿００１２７６６９５の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質ＢＲＣＡ１をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１は、ヒトＢＲＣＡ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿００７２９４、ＮＭ＿００７２９７、ＮＭ＿００７２９８、ＮＭ＿００７３０４、ＮＭ＿００７２９９、ＮＭ＿００７３００、ＢＣ０４６１４２、ＢＣ０６２４２９、ＢＣ０７２４１８、ＡＹ３５４５３９、ＡＹ７５１４９０、ＢＣ０８５６１５、ＢＣ１０６７４６、ＢＣ１０６７４５、ＢＣ１１４５１１、ＢＣ１１５０３７、Ｕ１４６８０、ＡＫ２９３７６２、Ｕ６８０４１、ＢＣ０３０９６９、ＢＣ０１２５７７、ＡＫ３１６２００、ＤＱ３６３７５１、ＤＱ３３３３８７、ＤＱ３３３３８６、Ｙ０８８６４、ＪＮ６８６４９０、ＡＢ６２１８２５、ＢＣ０３８９４７、Ｕ６４８０５、およびＡＦ００５０６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質ＢＲＣＡ２をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２は、ヒトＢＲＣＡ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４７５６８、ＮＭ＿００００５９、ＤＱ８９７６４８、ＢＣ０２６１６０の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質ＴＳＣ１をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１は、ヒトＴＳＣ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４７７７２、ＮＭ＿０００３６８、ＢＣ０７００３２、ＡＢ１９０９１０、ＢＣ１０８６６８、ＢＣ１２１０００、ＮＭ＿００１１６２４２７、ＮＭ＿００１１６２４２６、Ｄ８７６８３、およびＡＦ０１３１６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質ＴＳＣ２をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２は、ヒトＴＳＣ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４６９２９、ＢＸ６４７８１６、ＡＫ１２５０９６、ＮＭ＿０００５４８、ＡＢ２１００００、ＮＭ＿００１０７７１８３、ＢＣ１５０３００、ＢＣ０２５３６４、ＮＭ＿００１１１４３８２、ＡＫ０９４１５２、ＡＫ２９９３４３、ＡＫ２９５７２８、ＡＫ２９５６７２、ＡＫ２９４５４８、およびＸ７５６２１の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＲＢ１は、ヒトＲＢ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿０００３２１、ＡＹ４２９５６８、ＡＢ２０８７８８、Ｍ１９７０１、ＡＫ２９１２５８、Ｌ４１８７０、ＡＫ３０７７３０、ＡＫ３０７１２５、ＡＫ３００２８４、ＡＫ２９９１７９、Ｍ３３６４７、Ｍ１５４００、Ｍ２８４１９、ＢＣ０３９０６０、ＢＣ０４０５４０、およびＡＦ０４３２２４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、タンパク質の欠損により疾患または障害が生じる。一部の実施形態では、タンパク質は、フラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、アルファ１アンチトリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と会合している細胞膜透過ペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、ＶＥＰＥＰ－９、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）を含む、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の細胞内送達のためのＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体が提供される。一部の実施形態では、会合は、非共有結合である。一部の実施形態では、会合は、共有結合である。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体中の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの、１つまたは複数のＲＮＡｉのうち少なくとも１つに対するモル比は、約１：１～約１００：１の間、または約１：１～約５０：１の間、または約２０：１である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体は、内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、内因性遺伝子は、疾患または状態に関与する。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）の疾患関連形態を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体は、ＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異体形態を特異的に標的とするが、ＫＲＡＳの野生型形態は標的としない。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１に変異を含む。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体は、ＫＲＡＳの複数の変異体形態を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、複数の変異体形態は、ＫＲＡＳの複数の異常を含み、ＫＲＡＳの複数の異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に少なくとも２つまたはそれより多い変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの複数の異常は、ＫＲＡＳのコドン１２および６１に少なくとも２つまたはそれより多い変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、およびＱ６１Ｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体は、第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）および第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）を含む複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含み、第１のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第１の変異体形態を標的とし、第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第２の変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、第１のＲＮＡｉおよび／または第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの野生型形態を標的としない。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に変異を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１に変異を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、コドン１２に変異を含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、コドン６１に変異を含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態および／または第２の変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋから選択される。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体は、第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）、第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）、および第３のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む、複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第１の変異体形態を標的とし、第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第２の変異体形態を標的とし、第３のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの第３の変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に変異を含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３ＤおよびＱ６１Ｋからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１、第２および第３のＫＲＡＳの変異体形態はそれぞれ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含み、第３の変異体形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８３）、５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３（アンチセンス）（配列番号８４）、５’－ＧＡＡＧＵＧＣＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴ－３’（センス）（配列番号８６）、５’－ＧＵＣＵＣＧＧＵＧＵＡＧＣＡＣＵＵＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８７）、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８８）および／または５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８９）の配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号８３、８４、８６～８９を有する配列から選択される核酸配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓを標的とする配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、例えば、Ａｃｕｎｚｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１７ Ｍａｙ ２３；１１４（２１）：Ｅ４２０３－Ｅ４２１２に開示されているｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、そのそれぞれが本出願において完全に組み込まれている、ＷＯ２０１４０１３９９５、ＪＰ２０１３２１２０５２、ＷＯ２０１４１１８８１７、ＷＯ２０１２１２９３５２、ＷＯ２０１７１７９６６０、ＪＰ２０１３５４４５０５、ＵＳ８００８４７４、ＵＳ７７４５６１１、ＵＳ７５７６１９７、ＵＳ７５０７８１１に開示されているＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含むか、または上記に記載されているＲＮＡｉと組み合わせて投与されるべきである。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、第１のタンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ、および第２のタンパク質をコードする第２のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、第１の内因性遺伝子を標的とする第１のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）および第２の内因性遺伝子を標的とする第２のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含むか、または第１および第２のＲＮＡｉと組み合わせて投与されるべきである。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎ）の第１の変異体形態を標的とする第１のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）および発癌遺伝子の第２の変異体形態を標的とする第２のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含むか、または第１および第２のＲＮＡｉと組み合わせて投与されるべきである。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉである。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とする。一部の実施形態では、複合体および／またはナノ粒子は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉはいずれも、同じ疾患または状態を処置するために有用である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ単独および／またはＲＮＡｉ単独は、疾患または状態を処置するために有効ではないが、組み合わせて使用される場合は、疾患または状態を処置するために有効である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、がんに関与する腫瘍抑制タンパク質をコードし、ＲＮＡｉは、がんに関与する発癌遺伝子を標的とする。
ＣＰＰは、化学的コンジュゲーションを使用して、ｍＲＮＡに共有結合によって会合することができる。例えば、ＣＰＰは、Ｃ末端システアミド／システインまたはＮ末端ベータ－アラニン橋架けのいずれかが関与する架橋を介して、ｍＲＮＡに連結することができる。ｍＲＮＡは、例えば、６－マレイミドヘキサン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの化学を含む、かかる目的のための当技術分野において公知のいずれかの技法を使用して、ペプチド鎖の内側の様々な部分に共有結合によって連結することもできる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含むｍＲＮＡ細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、ＲＮＡｉをさらに含むか、またはＲＮＡｉと組み合わせて投与されるべきである。
一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドおよび複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体であって、複数のｍＲＮＡのそれぞれが、異なるタンパク質をコードし、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、ＲＮＡｉをさらに含むか、またはＲＮＡｉと組み合わせて投与されるべきである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制遺伝子に対応する腫瘍抑制タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、またはＳＴ１４である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、タンパク質の欠損により疾患または障害が生じる、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質はフラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、アルファ１アンチトリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、個体におけるタンパク質の発現により個体におけるタンパク質に対する免疫応答がモジュレートされる、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は抗原である。一部の実施形態では、抗原は疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の増加が生じる。一部の実施形態では、抗原は自己抗原であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の減少が生じる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡが抗体またはその抗原結合性断片をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は治療用抗体である。一部の実施形態では、抗体は二重特異性抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、抗体は、疾患関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡがレポーターｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（５ｍＯＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制遺伝子に対応する腫瘍抑制タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、またはＳＴ１４である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、タンパク質の欠損により疾患または障害が生じる、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質はフラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質はアルファ１アンチトリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、個体におけるタンパク質の発現により、個体におけるタンパク質に対する免疫応答がモジュレートされる、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の増加が生じる。一部の実施形態では、抗原は自己抗原であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の減少が生じる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡが、抗体またはその抗原結合性断片をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は治療用抗体である。一部の実施形態では、抗体は二重特異性抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、抗体は、疾患関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡが、レポーターｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ
５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ
ｍＲＮＡ（５ｍＯＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体は、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、スムーズンド遺伝子である。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ｒａｓＫである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態によるｍＲＮＡ送達複合体は、ＲＮＡｉと組み合わせて投与されるためのものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、細胞にＲＮＡｉを送達するための細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子中にある。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、スムーズンド遺伝子である。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ｒａｓＫである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体の平均サイズ（直径）は、約２０ｎｍ～約１０ミクロンのいずれかの間であり、これは、例えば、約３０ｎｍ～約１ミクロンの間、約５０ｎｍ～約７５０ｎｍの間、約１００ｎｍ～約５００ｎｍの間、１００ｎｍ～２５０ｎｍの間、および約２００ｎｍ～約４００ｎｍの間を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体は、実質的に無毒である。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体のターゲティング部分は、組織または特定の細胞型にｍＲＮＡ送達複合体を向かわせる。一部の実施形態では、組織は、処置を必要とする組織である。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ｍＲＮＡにより処置され得る組織または細胞にｍＲＮＡ送達複合体を向かわせる。
細胞膜透過ペプチドを含むナノ粒子
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのナノ粒子であって、本明細書に記載の１つまたは複数のｍＲＮＡ送達複合体を含むコアを含むナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、複数のｍＲＮＡ送達複合体を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、所定の比率で存在する複数のｍＲＮＡ送達複合体を含む。一部の実施形態では、所定の比率は、より詳細に下記で説明される方法のいずれかにおけるナノ粒子の最も有効な使用を可能にするように選択される。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、１つもしくは複数の追加の細胞膜透過ペプチド、および／または１つもしくは複数の追加のｍＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、１つまたは複数の追加のｍＲＮＡと会合した（共有結合または非共有結合によるなど）１つまたは複数の追加の細胞膜透過ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の細胞膜透過ペプチドは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の追加の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している１つまたは複数の細胞膜透過ペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、ＶＥＰＥＰ－９、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）を含むコアを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、会合は、非共有結合である。一部の実施形態では、会合は、共有結合である。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質をコードし、タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、またはＳＴ１４である。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡは、タンパク質をコードし、タンパク質の欠損により疾患または障害が生じる。一部の実施形態では、タンパク質は、フラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ｍＲＮＡを含み、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるｍＲＮＡ送達複合体に含有されているｍＲＮＡは、レポーターｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｇａｕｓｓｉａ
Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（５ｍＯＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制因子の遺伝子に対応する腫瘍抑制因子タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制因子の遺伝子は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制因子の遺伝子は、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、またはＳＴ１４である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、タンパク質の欠損により疾患または障害が生じる、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質はフラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、アルファ１アンチトリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、個体におけるタンパク質の発現により個体におけるタンパク質に対する免疫応答がモジュレートされる、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は抗原である。一部の実施形態では、抗原は疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の増加が生じる。一部の実施形態では、抗原は自己抗原であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の減少が生じる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、ｍＲＮＡが抗体またはその抗原結合性断片をコードする、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は治療用抗体である。一部の実施形態では、抗体は二重特異性抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、抗体は、疾患関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、ｍＲＮＡがレポーターｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む（またはそれからなる）。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ
Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（５ｍＯＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制因子の遺伝子に対応する腫瘍抑制因子タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制因子の遺伝子は、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制因子の遺伝子は、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、またはＳＴ１４である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、タンパク質の欠損により疾患または障害が生じる、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質はフラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質はアルファ１アンチトリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は第ＩＸ因子である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡがタンパク質をコードし、個体におけるタンパク質の発現により、個体におけるタンパク質に対する免疫応答がモジュレートされる、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の増加が生じる。一部の実施形態では、抗原は自己抗原であり、個体における抗原の発現により、個体における抗原に対する免疫応答の減少が生じる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡが、抗体またはその抗原結合性断片をコードする、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は治療用抗体である。一部の実施形態では、抗体は二重特異性抗体、例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。一部の実施形態では、抗体は、疾患関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡに会合している細胞膜透過ペプチドを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達ナノ粒子であって、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含み、ｍＲＮＡが、レポーターｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ
Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ
ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（５ｍＯＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ＲＮＡｉ、例えば、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、スムーズンド遺伝子である。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ｒａｓＫである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、第１のタンパク質をコードするｍＲＮＡおよび第２のタンパク質を標的とするＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉであり、タンパク質は、疾患または状態を処置するために有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、内因性遺伝子の治療形態に対応する（例えば、ｍＲＮＡは、変異体タンパク質の野生型もしくは機能的形態をコードするか、またはｍＲＮＡは、タンパク質の正常な発現をもたらす）。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞膜透過ペプチドは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞膜透過ペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、ＶＥＰＥＰ－９、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）と、複数のｍＲＮＡとを含むコアを含むナノ粒子であって、複数のｍＲＮＡのそれぞれが、異なるタンパク質をコードする、ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、複数のｍＲＮＡのうち少なくとも１つと会合している１つまたは複数の細胞膜透過ペプチドのうち１つを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、ａ）複数のｍＲＮＡのうち少なくとも１つと会合している１つまたは複数の細胞膜透過ペプチドのうち１つを含む第１の複合体、およびｂ）残りのｍＲＮＡと会合している残りの細胞膜透過ペプチドを含む１つまたは複数の追加の複合体を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子中の１つまたは複数の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。一部の実施形態では、ナノ粒子中に存在する複合体における、細胞膜透過ペプチドの、細胞膜透過ペプチドと会合しているｍＲＮＡに対するモル比は、約１：１～約１００：１の間、または約１：１～約５０：１の間、または約２０：１である。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡのうちの１つは、治療用タンパク質、すなわち、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞膜透過ペプチドは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチドおよびＰｅｐ－２ペプチドを含む。
一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドとｍＲＮＡとを含むコアを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのナノ粒子であって、細胞膜透過ペプチドが、ｍＲＮＡと会合しており、細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む、ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ＰＥＰ－１ペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－２ペプチドは、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、コアを囲む周囲ＣＰＰを含む表面層をさらに含む。一部の実施形態では、周囲ＣＰＰは、コア中のＣＰＰと同じである。一部の実施形態では、周囲ＣＰＰは、コア中のいずれのＣＰＰとも異なる。一部の実施形態では、周囲ＣＰＰは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチドおよびＰｅｐ－２ペプチドを含む。一部の実施形態では、周囲ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、表面層中の末梢細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。一部の実施形態では、ナノ粒子は、該ナノ粒子のコアと表面層との間に中間層をさらに含む。一部の実施形態では、中間層は、中間ＣＰＰを含む。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、コア中のＣＰＰと同じである。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、コア中のいずれのＣＰＰとも異なる。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、これらに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６またはＶＥＰＥＰ－９ペプチド）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチドおよびＰｅｐ－２ペプチドを含む。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子のいずれかによれば、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍであり、これは、例えば、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７５ｎｍ～約６００ｎｍ、約１００ｎｍ～約６００ｎｍ、および約２００ｎｍ～約４００ｎｍを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約１０００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００または１００ｎｍ以下のいずれかである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径（ａｖｅｒａｇｅ ｏｒ ｍｅａｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）は、約２００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約１５０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約１００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約２０ｎｍ～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約３０ｎｍ～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約４０ｎｍ～約３００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、滅菌濾過可能である。
一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約－３０ｍＶ～約６０ｍＶ（例えば、約－３０、－２５、－２０、－１５、－１０、－５、０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５および６０ｍＶ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）である。一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約－３０ｍＶ～約３０ｍＶであり、これは、例えば、約－２５ｍＶ～約２５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約２０ｍＶ、約－１５ｍＶ～約１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約１０ｍＶ、および約－５ｍＶ～約１０ｍＶを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、約０．０５～約０．６（例えば、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５および０．６（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、実質的に無毒である。
修飾
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ターゲティング部分を含み、該ターゲティング部分は、細胞特異的ターゲティングおよび／または核ターゲティングが可能なリガンドである。細胞膜表面受容体および／または細胞表面マーカーは、前記リガンドに高い親和性でおよび好ましくは高い特異性で結合することができる、分子または構造である。前記細胞膜表面受容体および／または細胞表面マーカーは、好ましくは、特定の細胞に特異的であり、すなわち、別の細胞型でではなく、ある細胞型において主として見いだされる（例えば、肝細胞の表面のアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするガラクトシル残基）。細胞膜表面受容体は、リガンド（例えば、ターゲティング部分）および結合分子（例えば、本発明の複合体またはナノ粒子）の細胞ターゲティングおよび標的細胞への内在化を容易にする。本発明に関して使用することができる多数のリガンド部分／リガンド結合パートナーは、文献に広く記載されている。そのようなリガンド部分は、所与の結合パートナー分子とまたは少なくとも１つの標的細胞の表面に局在する結合パートナー分子のクラスと結合する能力を、本発明の複合体またはナノ粒子に付与することができる。好適な結合パートナー分子としては、限定ではないが、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープおよび腫瘍関連マーカーからなる群から選択されるポリペプチドが挙げられる。結合パートナー分子は、さらに、例えば１つまたは複数の糖、脂質、糖脂質、抗体分子もしくは抗体分子の断片、またはアプタマーからなることもあり、あるいはこれらを含むこともある。本発明によれば、リガンド部分は、例えば、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＴ）、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチンのすべてもしくは一部、例えばＪＴＳ１（ＷＯ９４／４０９５８）などのポリペプチドのすべてもしくは一部、抗体もしくはその断片、またはそれらの組合せであってもよい。一部の実施形態では、本発明で使用されるリガンド部分は、７アミノ酸の最小長を有するペプチドまたはポリペプチドである。リガンド部分は、天然ポリペプチドであるか、または天然ポリペプチドに由来するポリペプチドである。「由来する」は、（ａ）天然配列に対する１つもしくは複数の修飾（例えば、１つもしくは複数の残基の付加、欠失および／もしくは置換）、（ｂ）天然に存在しないアミノ酸を含む、アミノ酸類似体、（ｃ）置換されている連結、または（ｄ）当技術分野において公知の他の修飾を含有することを意味する。リガンド部分として役立つポリペプチドは、例えば、マウス抗体の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を併せ持つヒト化抗体などの、様々な起源の配列を融合させることにより得られるバリアントおよびキメラポリペプチドを包含する。加えて、そのようなポリペプチドは、直鎖状または環化構造を（例えば、システイン残基をポリペプチドリガンドの両端に隣接させることにより）有し得る。加えて、リガンド部分として使用されているポリペプチドは、化学的部分の置換または付加によるその原構造の修飾（例えば、グリコシル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基の付加など）を含み得る。本発明は、リガンド部分を検出できるようにする修飾をさらに企図している。このために、検出可能な部分（すなわち、シンチグラフィーの、放射性もしくは蛍光部分、または色素標識など）での修飾を、想定することができる。そのような検出可能な標識を、いずれの従来の技法によりリガンド部分に結合させてもよく、診断目的（例えば、腫瘍細胞のイメージング）に使用してもよい。一部の実施形態では、結合パートナー分子は、抗原（例えば、標的細胞特異的抗原、疾患特異的抗原、操作された標的細胞の表面で特異的に発現される抗原）であり、リガンド部分は、抗体、その断片または最小認識単位（例えば、抗原特異性をなお提示する断片）、例えば、免疫学マニュアル（例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ １９９３， Ｒｏｉｔｔ， Ｂｒｏｓｔｏｆｆ ａｎｄ Ｍａｌｅ， ｅｄ Ｇａｍｂｌｉ， Ｍｏｓｂｙを参照されたい）に詳細に記載されているものである。リガンド部分は、モノクローナル抗体であってもよい。これらの抗原の多くに結合する多くのモノクローナル抗体が既知であり、モノクローナル抗体技術に関して当技術分野において公知の技法を使用して、ほとんどの抗原に対する抗体を調製することができる。リガンド部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）であってもよく、または合成抗体断片（例えば、ＳｃＦｖ）であってもよい。一部の実施形態では、リガンド部分は、全抗体ではなく、抗体断片の中から選択される。補体結合などの全抗体の有効な機能は除去される。ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体断片は、１つまたは複数の他のポリペプチドとの融合体として発現させてよい。最小認識単位は、Ｆｖ断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つまたは複数についての配列に由来し得る。全抗体、およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄＡｂ断片および最小認識単位は一価であり、抗原結合部位を１つしか有さない。一部の実施形態では、リガンド部分は、腫瘍細胞へのターゲティングを可能にし、および腫瘍の状態に関連する分子、例えば、腫瘍特異的抗原、腫瘍細胞において差次的にもしくは過剰発現される細胞タンパク質、またはがん関連ウイルス（ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｍｓ）の遺伝子産物を認識することができ、それらと結合することができる。腫瘍特異的抗原の例としては、乳がんに関連するＭＵＣ－１（Ｈａｒｅｕｖｅｎ ｉ ｅｔ ａｌ．， ９９０， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９， ４７５－４８６）、乳がんおよび卵巣がんに関連する変異ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子によりコードされている産物（Ｍｉｋｉ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６， ６６－７ １；Ｆｕｉｒｅａｌ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６， １２０－ １２２；Ｗｏｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ７８９－７９２）、がんに関連するＡＰＣ（Ｐｏｉａｋｉｓ， １９９５， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ５， ６６－７１）、前立腺がんに関連する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（Ｓｔａｍｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７，
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ３１７， ９０９）、がんに関連する癌胎児抗原（ＣＥＡ）（Ｓｃｈｒｅｗｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０， ２７３８－２７４８）、メラノーマに関連するチロシナーゼ（Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３， ３８６０－３８６４）、メラノーマ細胞において高度に発現されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）の受容体、乳がんおよび膵臓がんに関連するＥｒｂＢ－２（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １， １７０－１７５）、ならびに肝がんに関連するアルファ－フェトプロテイン（Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， ４６ １－４６５）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、リガンド部分は、ＭＵＣ－１抗原を認識すること、およびＭＵＣ－１抗原と結合することができ、したがってＭＵＣ－１陽性腫瘍細胞を標的とすることができる、抗体の断片である。一部の実施形態では、リガンド部分は、ＭＵＣ－１抗原のタンデムリピート領域を認識するＳＭ３モノクローナル抗体のｓｃＦｖ断片である（Ｂｕｒｓｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７， ５４７６－５４８２；Ｇｉｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４３， １０７２－１０７６；Ｄｏｋｕｒｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８４， ７１３－７２８）。腫瘍細胞において差次的にまたは過剰発現される細胞タンパク質の例としては、一部のリンパ系腫瘍において過剰発現されるインターロイキン２（ＩＬ－２）の受容体、肺癌細胞、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍および胃腫瘍において過剰発現されるＧＲＰ（ガストリン放出ペプチド）（Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２， ６６０－６６８）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体、上皮成長因子受容体、Ｆａｓ受容体、ＣＤ４０受容体、ＣＤ３０受容体、ＣＤ２７受容体、ＯＸ－４０、α－ｖインテグリン（Ｂｒｏｏｋｓ
ｅｔ ａｌ， ９９４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４， ５６９）、およびある特定の血管新生成長因子の受容体（Ｈａｎａｈａｎ， １９９７， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７， ４８）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの指標に基づいて、そのようなタンパク質を認識することおよびそのようなタンパク質と結合することができる適切なリガンド部分を定義することは、当業者の範囲内である。例を挙げて説明すると、ＩＬ－２は、ＴＬ－２受容体と結合するための好適なリガンド部分である。線維症および炎症に特異的である受容体の場合、これらは、ＴＧＦベータ受容体またはアデノシン受容体を含み、該受容体は、上記で特定され、本発明の組成物の好適な標的である。多発性骨髄腫の細胞表面マーカーは、これらに限定されないがＣＤ５６、ＣＤ４０、ＦＧＦＲ３、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＥＧＦＲおよびＣＤ３８を含み、本発明の組成物の好適な標的である。これらの細胞表面マーカーと結合する好適なリガンド部分としては、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４０、ＰＲＯ－００１、Ｃｈｉｒ－２５８、ＨｕＬｕｃ６３、抗ＣＤ１３８－ＤＭ１、抗ＩＧＦ１Ｒおよびベバシズマブが挙げられるが、これらに限定されない。
ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉの組成物
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子ならびに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物中の複合体またはナノ粒子の濃度は、約１ｎＭ～約１００ｍＭであり、これは、例えば、約１０ｎＭ～約５０ｍＭ、約２５ｎＭ～約２５ｍＭ、約５０ｎＭ～約１０ｍＭ、約１００ｎＭ～約１ｍＭ、約５００ｎＭ～約７５０μＭ、約７５０ｎＭ～約５００μＭ、約１μＭ～約２５０μＭ、約１０μＭ～約２００μＭ、および約５０μＭ～約１５０μＭを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されている。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体」は、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図したものである。典型的に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤および／または担体は、ヒトはもちろん非ヒト哺乳動物を含む動物における使用について、連邦政府の規制機関、州政府もしくは他の規制機関によって承認された、または米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されている、希釈剤、賦形剤および／または担体である。用語の希釈剤、賦形剤および／または「担体」は、医薬組成物を投与するのに用いる希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような薬学的希釈剤、賦形剤および／または担体は、滅菌液、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成由来のものを含む）であり得る。水、食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を液体希釈剤、賦形剤および／または担体として、特に注射用溶液に利用することができる。好適な薬学的希釈剤および／または賦形剤には、凍結乾燥助剤を含む、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望される場合、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、徐放製剤などの形態をとることができる。好適な薬学的希釈剤、賦形剤および／または担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。製剤は、投与方法に適合しなければならない。適切な希釈剤、賦形剤および／または担体は、当業者には明らかであり、大部分が投与経路に依存する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、組成物中のｍＲＮＡ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集のレベルおよび／または組成物中のｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子によって媒介される細胞内送達の効率に影響を及ぼす。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体によって媒介される凝集および／または送達効率に対する効果の程度および／または方向は、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体の相対量に依存する。
例えば、一部の実施形態では、組成物中の１つまたは複数の濃度での薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体（例えば、塩、糖、化学的緩衝剤、緩衝溶液、細胞培養培地、または担体タンパク質）の存在は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＮａＣｌを含む塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、スクロース、グルコース、およびマンニトールを含む糖である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＨＥＰＥＳを含む化学的緩衝剤である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＰＢＳを含む緩衝溶液である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＤＭＥＭを含む細胞培養培地である。粒子サイズは、粒子サイズを測定するための当技術分野において公知の任意の手段を使用して、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって、決定することができる。例えば、一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のＤＬＳで測定したＺ平均よりも１０％大きい、ＤＬＳで測定したＺ平均を有する凝集物は、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子よりも１０％大きい。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下（例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約７５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む。一部の実施形態では、組成物中の塩の濃度は、約１００ｍＭ以下（例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＭ（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）である。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２５％以下（例えば、約２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約７５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を含む。一部の実施形態では、組成物中の糖の濃度は、約２０％以下（例えば、約１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）である。一部の実施形態では、糖は、スクロースである。一部の実施形態では、糖は、グルコースである。一部の実施形態では、糖は、マンニトールである。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下（例えば、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約７．５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約３％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進しないおよび／またはそれに寄与しない濃度で、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を含む。一部の実施形態では、化学的緩衝剤は、ＨＥＰＥＳである。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、ＨＥＰＥＳを含む緩衝溶液の形態で組成物に添加される。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳを含む溶液は、約５～約９の間（例えば、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、および９（これらの値の間のいずれかの範囲を含む）のいずれか）のｐＨを有する。一部の実施形態では、組成物は、約７５ｍＭ以下（例えば、約７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０ｍＭまたはそれ未満（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）の濃度で、ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、化学的緩衝剤は、リン酸塩である。一部の実施形態では、リン酸塩は、リン酸塩を含む緩衝溶液の形態で組成物に添加される。一部の実施形態では、組成物は、ＰＢＳを含まない。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭである。一部の実施形態では、組成物は、約７０％以下（例えば、約６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０％、またはそれ未満（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）の濃度で、ＤＭＥＭを含む。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約２５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する濃度で、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。一部の実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、膀胱内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内または経口投与用に製剤化される。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置に好適であることが判明した本発明の医薬組成物の投薬量は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、約０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５および１００ｍｇ／ｋｇ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）である。一部の実施形態では、投薬量範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０ｍｇ／ｋｇ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）である。一部の実施形態では、投薬量範囲は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇである。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置に好適であることが判明した本発明の医薬組成物の投薬量は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子の約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４×１０３ｍｇ／ｍ２の範囲内（例えば、約０．０３、０．３、３、３０、３００、３×１０３、４×１０３ｍｇ／ｍ２（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）である。一部の実施形態では、投薬量範囲は、約３ｍｇ／ｍ２～約８００ｍｇ／ｍ２（例えば、約３、３０、３００、６００、８００ｍｇ／ｍ２（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）である。一部の実施形態では、投薬量範囲は、約１８ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２である。
例示的な投薬頻度としては、中断なしで毎週；４週間のうちの３週間、毎週；３週間毎に１回；２週間毎に１回；３週間のうち２週間、毎週が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、医薬組成物は、約２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、６週間毎に１回、または８週間毎に１回、投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、週に少なくとも約１回、２回、３回、４回、５回、６回、または７回（すなわち毎日）のいずれか、投与される。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約６カ月、３カ月、１カ月、２０日、１５日、１２日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日または１日のいずれかより短い。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、８カ月または１２カ月のいずれかより長い。一部の実施形態では、投薬スケジュールに中断がない。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１週間以下である。一部の実施形態では、個体への医薬組成物の投与スケジュールは、全処置に相当する単回投与から、毎日の投与に及ぶ。医薬組成物の投与を、約１カ月から約７年までなどの、長期間にわたって延長することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２または８４ヶ月のいずれかの期間にわたって投与される。
第２の薬剤として使用されるナノ粒子組成物
本明細書に記載の第２の薬剤として使用されるナノ粒子組成物は、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）およびアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む（様々な実施形態では、それらから本質的になる）ナノ粒子を含む。難水溶性薬物（例えば、タキサン）のナノ粒子について、例えば、そのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，９１６，５９６号；同第６，５０６，４０５号；同第６，７４９，８６８号、および同第６，５３７，５７９号；同第７，８２０，７８８号；ならびに米国特許公開第２００６／０２６３４３４号、および同第２００７／００８２８３８号；ＰＣＴ特許出願第ＷＯ０８／１３７１４８号に開示されている。
一部の実施形態では、組成物は、約１０００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、および１００ｎｍ以下のいずれかの平均直径または平均直径（ａｖｅｒａｇｅ ｏｒ ｍｅａｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ）を有するナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約２００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約１５０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約１００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約２０～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均直径または平均直径は、約４０～約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、滅菌濾過可能である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物中のナノ粒子は、例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、または６０ｎｍ以下のいずれか１つを含む、約２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のいずれか１つ）は、例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、または６０ｎｍ以下のいずれか１つを含む、約２００ｎｍ以下の直径を有する。一部の実施形態では、組成物中のナノ粒子の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のいずれか１つ）は、例えば、約２０～約２００ｎｍ、約４０～約２００ｎｍ、約３０～約１８０ｎｍを含む、約２０～約４００ｎｍ、ならびに約４０～約１５０、約５０～約１２０、および約６０～約１００ｎｍのうちのいずれか１つの範囲内にある。
一部の実施形態では、アルブミンは、ジスルフィド結合を形成することができるスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｒａｌ）基を有する。一部の実施形態では、組成物のナノ粒子部分におけるアルブミンの少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のうちのいずれか１つを含む）は、架橋している（例えば、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して架橋している）。
一部の実施形態では、ナノ粒子は、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）で被覆されたタキサン（例えば、パクリタキセル）を含む。一部の実施形態では、組成物は、ナノ粒子形態と非ナノ粒子形態の両方でタキサンを含み、組成物中のタキサンの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれか１つは、ナノ粒子形態である。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサンは、ナノ粒子の約５０重量％より多く、６０重量％より多く、７０重量％より多く、８０重量％より多く、９０重量％より多く、９５重量％より多く、または９９重量％より多く、のうちのいずれか１つを構成する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、非ポリマーマトリックスを有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマー材料（例えば、ポリマーマトリックス）を実質的に含まないタキサンのコアを含む。
一部の実施形態では、組成物は、組成物のナノ粒子部分と非ナノ粒子部分の両方にアルブミンを含み、組成物中のアルブミンの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれか１つは、組成物の非ナノ粒子部分にある。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）とタキサンの重量比は、約１８：１またはそれ未満、例えば、約１５：１またはそれ未満、例えば、約１０：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、組成物中のアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）とタキサンの重量比は、約１：１～約１８：１、約２：１～約１５：１、約３：１～約１３：１、約４：１～約１２：１、約５：１～約１０：１のうちのいずれか１つの範囲内にある。一部の実施形態では、組成物のナノ粒子部分におけるアルブミンとタキサンの重量比は、約１：２またはそれ未満、１：３またはそれ未満、１：４またはそれ未満、１：５またはそれ未満、１：１０またはそれ未満、１：１５またはそれ未満のうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、組成物中のアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）とタキサンの重量比は、約１：１～約１８：１、約１：１～約１５：１、約１：１～約１２：１、約１：１～約１０：１、約１：１～約９：１、約１：１～約８：１、約１：１～約７：１、約１：１～約６：１、約１：１～約５：１、約１：１～約４：１、約１：１～約３：１、約１：１～約２：１、約１：１～約１：１のうちのいずれか１つである。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、上記特徴のうちの１つまたは複数を含む。
本明細書に記載のナノ粒子は、乾燥製剤（例えば、凍結乾燥組成物）中に存在するかまたは生体適合性媒体中に懸濁されていてもよい。好適な生体適合性媒体としては、これらに限定されないが、水、緩衝水性媒体、食塩水、緩衝食塩水、必要に応じてアミノ酸の緩衝化溶液、必要に応じてタンパク質の緩衝化溶液、必要に応じて糖の緩衝化溶液、必要に応じてビタミンの緩衝化溶液、必要に応じて合成ポリマーの緩衝化溶液、および脂質含有エマルションなどが挙げられる。
一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、ヒト血清アルブミンを含む。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、Ｍｒ６５Ｋの高溶解性球状タンパク質であり、５８５アミノ酸からなる。ＨＳＡは、血漿中に最も多く存在するタンパク質であり、ヒト血漿のコロイド浸透圧の７０～８０％を担う。ＨＳＡのアミノ酸配列は、合計１７個のジスルフィド架橋、１つの遊離チオール（Ｃｙｓ３４）および単一のトリプトファン（Ｔｒｐ２１４）を含有する。ＨＳＡ溶液の静脈内使用は、体液喪失性ショック（ｈｙｐｏｖｏｌｕｍｉｃ ｓｈｏｃｋ）の予防および処置に対して（例えば、Ｔｕｌｌｉｓ， ＪＡＭＡ， ２３７， ３５５－３６０， ４６０－４６３， （１９７７）およびＨｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｒｇｅｒｙ， Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ， １５０， ８１１－８１６ （１９８０）を参照されたい）ならびに新生児高ビリルビン血症の処置においては交換輸血と併せて（例えば、Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ， ６， ８５－１２０， （１９８０）を参照されたい）適応されている。他のアルブミン、例えば、ウシ血清アルブミンが企図される。そのような非ヒトアルブミンの使用は、例えば、非ヒト哺乳動物における、例えば、獣医学（飼育ペットおよび農業関連を含む）におけるこれらの組成物の使用との関連で、適当であり得る。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、複数の疎水性結合部位（脂肪酸に対して合計８個、ＨＳＡの内在性リガンド）を有し、様々なタキサン、特に、中性のおよび負電荷を有する疎水性化合物に結合する（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ ｅｄ， ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９６））。２つの高親和性結合部位が、ＨＳＡのサブドメインＩＩＡおよびＩＩＩＡにおいて提示されており、それらは、極性のリガンドフィーチャに対して結合点として機能する、表面付近に荷電リシンおよびアルギニン残基を有する非常に細長く伸びた疎水性ポケットである（例えば、Ｆｅｈｓｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍｃｏｌ．， ３０， ６８７－９２ （１９８ａ）、Ｖｏｒｕｍ， Ｄａｎ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．， ４６， ３７９－９９
（１９９９）、Ｋｒａｇｈ－Ｈａｎｓｅｎ， Ｄａｎ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ．， １４４１， １３１－４０ （１９９０）、Ｃｕｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ５， ８２７－３５ （１９９８）、Ｓｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｅｎｇ．， １２， ４３９－４６ （１９９９）、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５８， ２０９－１５ （１９９ｂ）、およびＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ４５， １５３－２０３ （１９９４）を参照されたい）。パクリタキセルおよびプロポフォールは、ＨＳＡに結合することが示されている（例えば、Ｐａａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６８（７）， ２１８７－９１ （２００ａ）、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４７８（ａ）， ６１－８ （２０００）、Ａｌｔｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ， ４５， １０５３－６ （１９９５）、およびＧａｒｒｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｖ． Ｅｓｐ． Ａｎｅｓｔｅｓｔｉｏｌ． Ｒｅａｎｉｍ．， ４１， ３０８－１２ （１９９４）を参照されたい）。加えて、ドセタキセルは、ヒト血漿タンパク質に結合することが示されている（例えば、Ｕｒｉｅｎ ｅｔ
ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ， １４（ｂ）， １４７－５１ （１９９６）を参照されたい）。
組成物中のアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）は、一般に、タキサンの担体として機能し、すなわち、組成物中のアルブミンは、アルブミンを含まない組成物と比較して、タキサンが水性媒体中でより容易に懸濁されるようにするか、または懸濁の維持を助ける。これにより、タキサンの可溶化のための毒性溶媒（または界面活性剤）の使用を回避することができ、それによって、個体（例えば、ヒト）へのタキサンの投与の１つまたは複数の副作用を低減することができる。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、界面活性剤、例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ）を含む）を実質的に含まない（例えば、含まない）。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、界面活性剤を実質的に含まない（例えば、含まない）。組成物中のＣｒｅｍｏｐｈｏｒまたは界面活性剤の量が、ナノ粒子組成物を個体に投与した場合に個体に１つまたは複数の副作用を引き起こすのに十分でない場合、組成物は「Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒを実質的に含まない」または「界面活性剤を実質的に含まない」。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約２０％未満、１５％未満、１０％未満、７．５％未満、５％未満、２．５％未満または約１％未満のうちのいずれか１つの有機溶媒または界面活性剤を含有する。
本明細書に記載の組成物中のアルブミンの量は、組成物中の他の成分に依存して様々である。一部の実施形態では、組成物は、水性懸濁液中の、例えば、安定なコロイド懸濁液（例えば、ナノ粒子の安定な懸濁液）の形態のタキサンを安定化させるのに十分な量で、アルブミンを含む。一部の実施形態では、アルブミンは、水性媒体におけるタキサンの沈降速度を低下させる量で存在する。粒子含有組成物では、アルブミンの量はまた、タキサンのナノ粒子のサイズおよび密度に依存する。
タキサンが長期間にわたって、例えば、少なくとも約０．１、０．２、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４、３６、４８、６０または７２時間のいずれかにわたって、水性媒体中に懸濁されたままであるならば（例えば、目に見える沈殿または沈降がなければ）、タキサンは、水性懸濁液で「安定化されている」。懸濁液は、一般に、必ずしもそうではないが、個体（例えば、ヒト）への投与に好適である。懸濁液の安定性は、一般に（必ずしもそうではないが）、保管温度（例えば、室温（例えば、２０～２５℃）または冷蔵条件（例えば、４℃））において評価される。例えば、懸濁液の調製の約１５分後に、懸濁液が肉眼に見える綿状沈殿または粒子凝塊形成を示さなければ、または光学顕微鏡下１０００倍で観察したときにそれを示さなければ、懸濁液は保管温度で安定である。安定性は、加速試験条件下で、例えば、約４０℃より高い温度で評価することもできる。
一部の実施形態では、アルブミンは、特定の濃度で水性懸濁液中のタキサンを安定化させるのに十分な量で存在する。例えば、組成物中のタキサンの濃度は、例えば、約０．１～約５０ｍｇ／ｍｌ、約０．１～約２０ｍｇ／ｍｌ、約１～約１０ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ～約８ｍｇ／ｍｌ、約４～約６ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌのいずれかを含む、約０．１～約１００ｍｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、タキサンの濃度は、少なくとも約１．３ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、および５０ｍｇ／ｍｌのいずれかである。一部の実施形態では、アルブミンは、組成物が界面活性剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）を含まないかまたは実質的に含まないように、界面活性剤（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）の使用を回避する量で存在する。
一部の実施形態では、液体形態の組成物は、約０．１％～約５０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．５％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）、約１５％（ｗ／ｖ）、約２０％（ｗ／ｖ）、約３０％（ｗ／ｖ）、約４０％（ｗ／ｖ）、または約５０％（ｗ／ｖ））のアルブミンを含む。一部の実施形態では、液体形態の組成物は、約０．５％～約５％（ｗ／ｖ）のアルブミンを含む。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のアルブミンの重量比、例えば、アルブミンのタキサンに対する重量比は、十分な量のタキサンが細胞と結合するかまたは細胞によって輸送されるような重量比である。様々なアルブミンとタキサンの組合せについて、アルブミンの、タキサンに対する重量比を最適化する必要があるが、一般に、アルブミンの重量比、例えば、アルブミンのタキサンに対する重量比（ｗ／ｗ）は、約０．０１：１～約１００：１、約０．０２：１～約５０：１、約０．０５：１～約２０：１、約０．１：１～約２０：１、約１：１～約１８：１、約２：１～約１５：１、約３：１～約１２：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約９：１である。一部の実施形態では、アルブミンの、タキサンに対する重量比は、約１８：１またはそれ未満、１５：１またはそれ未満、１４：１またはそれ未満、１３：１またはそれ未満、１２：１またはそれ未満、１１：１またはそれ未満、１０：１またはそれ未満、９：１またはそれ未満、８：１またはそれ未満、７：１またはそれ未満、６：１またはそれ未満、５：１またはそれ未満、４：１またはそれ未満、および３：１またはそれ未満のいずれかである。一部の実施形態では、組成物中のアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）とタキサンの重量比は、約１：１～約１８：１、約１：１～約１５：１、約１：１～約１２：１、約１：１～約１０：１、約１：１～約９：１、約１：１～約８：１、約１：１～約７：１、約１：１～約６：１、約１：１～約５：１、約１：１～約４：１、約１：１～約３：１、約１：１～約２：１、約１：１～約１：１のうちのいずれか１つである。
一部の実施形態では、アルブミンは、重大な副作用なしで、組成物を個体（例えば、ヒト）に投与できるようにする。一部の実施形態では、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）は、ヒトへのタキサンの投与の１つまたは複数の副作用を低減するのに有効な量である。用語「タキサンの投与の１つまたは複数の副作用を低減する」は、タキサンによって引き起こされる１つまたは複数の望ましくない作用、およびタキサンを送達するのに使用される送達ビヒクル（例えば、タキサンを注射に好適にする溶媒）によって引き起こされる副作用の低減、軽減、排除、または回避を指す。そのような副作用としては、例えば、骨髄抑制、神経毒性、過敏症、炎症、静脈刺激、静脈炎、疼痛、皮膚刺激、末梢神経障害、好中球減少性熱、アナフィラキシー反応、静脈血栓症、血管外溢出、およびそれらの組合せが挙げられる。しかし、これらの副作用は単に例示的なものであり、タキサンと関連する他の副作用、または副作用の組合せも低減し得る。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（Ｎａｂ－パクリタキセル）を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（Ｎａｂ－パクリタキセル）である。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、直接注射可能な生理的溶液中に分散させることができる、ヒトアルブミンＵＳＰによって安定化されたパクリタキセルの製剤である。好適な水性媒体、例えば、０．９％の塩化ナトリウム注射液または５％のデキストロース注射液中に分散させた場合、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、パクリタキセルの安定なコロイド懸濁液を形成する。コロイド懸濁液中のナノ粒子の平均粒子サイズは、約１３０ナノメートルである。ＨＳＡは水に溶けやすいので、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、例えば、約２ｍｇ／ｍｌ～約８ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌを含む薄い濃度（パクリタキセル０．１ｍｇ／ｍｌ）から濃い濃度（パクリタキセル２０ｍｇ／ｍｌ）の広範囲の濃度で再構成され得る。
ナノ粒子組成物を作製する方法は、当技術分野において公知である。例えば、タキサン（例えば、パクリタキセル）およびアルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）を含有するナノ粒子は、高剪断力の条件下（例えば、音波処理、高圧均質化など）で調製することができる。例えば、これらの方法は、米国特許第５，９１６，５９６号；同第６，５０６，４０５号；同第６，７４９，８６８号；同第６，５３７，５７９号；同第７，８２０，７８８号、ならびにまた、米国特許公開第２００７／００８２８３８号、同第２００６／０２６３４３４号およびＰＣＴ出願第ＷＯ０８／１３７１４８号に開示されている。
簡潔に言えば、タキサン（例えば、パクリタキセル）を有機溶媒中に溶解させ、その溶液をアルブミン溶液に添加することができる。混合物を高圧均質化に供する。次いで、有機溶媒を蒸発によって除去することができる。得られた分散液は、さらに凍結乾燥することができる。好適な有機溶媒としては、例えば、ケトン、エステル、エーテル、塩素化溶媒、および当技術分野において公知の他の溶媒が挙げられる。例えば、有機溶媒は、塩化メチレンまたはクロロホルム／エタノール（例えば、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、または９：１の比を有する）であり得る。
調製方法
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を調製する方法であって、ＣＰＰを１つまたは複数のｍＲＮＡと組み合わせるステップを含み、それによってｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を形成する方法が提供される。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を調製する方法であって、ＣＰＰを１つまたは複数のｍＲＮＡと組み合わせるステップを含む、方法が提供される。
例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を調製する方法であって、ａ）水性媒体中で、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む第１の組成物を、細胞膜透過ペプチドを含む第２の組成物と組み合わせて、混合物を形成するステップ、およびｂ）混合物をインキュベートして、１つまたは複数のｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む複合体を形成するステップとを含み、それによって、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を生成する方法が提供される。一部の実施形態では、水性媒体は、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、または核タンパク質複合体を安定化するための当技術分野において公知の任意の緩衝液を含む、緩衝液である。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む第１の組成物は、凍結乾燥形態の１つまたは複数のｍＲＮＡと好適な担体とを含む固体である。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドを含む第２の組成物は、細胞膜透過ペプチドを約１ｎＭ～約２００μＭ（例えば、約２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭまたは２００μＭ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）の濃度で含む溶液である。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドを含む第２の組成物は、凍結乾燥形態の細胞膜透過ペプチドと好適な担体とを含む固体である。一部の実施形態では、溶液は、水で製剤化される。一部の実施形態では、水は、蒸留水である。一部の実施形態では、溶液は、緩衝液で製剤化される。一部の実施形態では、緩衝液は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを保管するために使用される、当技術分野において公知の任意の緩衝液である。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドの、混合物中で細胞膜透過ペプチドと会合しているｍＲＮＡに対するモル比は、約１：１～約１００：１の間、または約１：１～約５０：１の間、または約２０：１である。一部の実施形態では、混合物は、１つまたは複数のｍＲＮＡと会合している細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を形成するために、例えば、約２０分、３０分、４０分および５０分間のいずれかを含む、約１０分～６０分間、例えば、約２℃～約５℃、約５℃～約１０℃、約１０℃～約１５℃、約１５℃～約２０℃、約２０℃～約２５℃、約２５℃～約３０℃、約３０℃～約３５℃、約３５℃～約４０℃、約４０℃～約４５℃、および約４５℃～約５０℃を含む、約２℃～約５０℃の温度でインキュベートされ、それによって、結果として、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む溶液が得られる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む溶液は、例えば、少なくとも約６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月および６ヶ月間のいずれかを含む、少なくとも約３週間、４℃で、安定した状態を保つ。一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む溶液は、担体の存在下で凍結乾燥される。一部の実施形態では、担体は、例えば、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せを含む、糖であり、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む溶液中に、例えば、約１％～約１０％、約１０％～１５％、約１５％～約２０％を含む、約１％～約２０％（体積当たりの重量）で存在する。一部の実施形態では、担体は、例えば、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンを含む、タンパク質である。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、本明細書に記載のＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号７５～８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のコアおよび少なくとも１つの追加の層を含むナノ粒子を調製する方法であって、ａ）水性媒体中で、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む組成物を、第１の細胞膜透過ペプチドを含む組成物と組み合わせて、第１の混合物を形成するステップ、ｂ）第１の混合物をインキュベートして、１つまたは複数のｍＲＮＡと会合している第１の細胞膜透過ペプチドを含むナノ粒子のコアを形成するステップ、ｃ）水性媒体中で、ｂ）の混合物などのナノ粒子のコアを含む組成物を、第２の細胞膜透過ペプチドを含む組成物と組み合わせて、第２の混合物を形成するステップ、ならびにｄ）第２の混合物をインキュベートして、コアおよび少なくとも１つの追加の層を含むナノ粒子を形成するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、ｅ）水性媒体中で、コアおよび少なくとも１つの追加の層を含むナノ粒子を含む組成物、ならびに第３の細胞膜透過ペプチドを含む組成物を組み合わせて、第３の混合物を形成するステップ、ならびにｆ）第３の混合物をインキュベートして、コアおよび少なくとも２つの追加の層を含むナノ粒子を形成するステップをさらに含む。ますます多くの層を含むナノ粒子の形成に方法を適応させることができることは、理解されたい。一部の実施形態では、水性媒体は、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、または核タンパク質複合体を安定化するための当技術分野において公知の任意の緩衝液を含む、緩衝液である。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む組成物は、複数のｍＲＮＡを含む溶液である。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む組成物は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含む溶液である。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む組成物は、複数のＲＮＡｉ（例えば、複数の遺伝子を標的とする複数のＲＮＡｉ）をさらに含む溶液である。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む組成物は、凍結乾燥形態の１つまたは複数のｍＲＮＡと好適な担体とを含む固体である。一部の実施形態では、第１、第２および／または第３の細胞膜透過ペプチドを含む組成物はそれぞれ、約１ｎＭ～約２００μＭ（例えば、約２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭまたは２００μＭ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）の濃度で細胞膜透過ペプチドを含む溶液である。一部の実施形態では、第１、第２および／または第３の細胞膜透過ペプチドを含む組成物はそれぞれ、凍結乾燥形態の細胞膜透過ペプチドと好適な担体とを含む固体である。一部の実施形態では、溶液は、水で製剤化される。一部の実施形態では、水は、蒸留水である。一部の実施形態では、溶液は、緩衝液で製剤化される。一部の実施形態では、緩衝液は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを保管するために使用される当技術分野において公知の任意の緩衝液である。一部の実施形態では、第１の混合物における第１の細胞膜透過ペプチドのｍＲＮＡに対するモル比は、約１：１～約１００：１の間、または約１：１～約５０：１の間、または約２０：１である。一部の実施形態では、第１、第２および／または第３の混合物は、例えば、約２０分間、３０分間、４０分間および５０分間のいずれかを含む、約１０分～６０分間、例えば、約２℃～約５℃、約５℃～約１０℃、約１０℃～約１５℃、約１５℃～約２０℃、約２０℃～約２５℃、約２５℃～約３０℃、約３０℃～約３５℃、約３５℃～約４０℃、約４０℃～約４５℃および約４５℃～約５０℃を含む、約２℃～約５０℃の温度で、個々にインキュベートされる。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む溶液は、例えば、少なくとも約６週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月および６ヶ月間のいずれかを含む、少なくとも約３週間、４℃で、安定した状態を保つ。一部の実施形態では、ナノ粒子を含む溶液は、担体の存在下で凍結乾燥される。一部の実施形態では、担体は、例えば、スクロース、グルコース、マンニトールおよびこれらの組合せを含む、糖であり、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む溶液中に、例えば、約７．５％～約１７．５％、約１０％～約１５％、および約１２．５％を含む、約５％～約２０％（単位体積当たりの重量）、で存在する。一部の実施形態では、担体は、例えば、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンを含む、タンパク質である。一部の実施形態では、第１、第２および／または第３の細胞膜透過ペプチドは、個々に、本明細書に記載のＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、第１、第２および／または第３の細胞膜透過ペプチドは、個々に、配列番号７５、７６、７７、７８、７９または８０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の複合体、ナノ粒子または組成物を調製する方法は、複合体もしくはナノ粒子を含む組成物に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体（例えば、塩、糖、化学的緩衝剤、緩衝溶液、細胞培養培地、または担体タンパク質）を添加するステップ、または組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の量を調整するステップをさらに含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、組成物中のｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集のレベルおよび／または組成物中のｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子によって媒介される細胞内送達の効率に影響を及ぼす。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体によって媒介される凝集および／または送達効率に対する効果の程度および／または方向は、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体の相対量に依存する。
例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体、ナノ粒子、または組成物を調製する方法は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を添加するステップ、あるいは組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体の濃度とするステップをさらに含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の濃度とする。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の濃度とする。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体は、組成物に添加される、または、組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の濃度とする。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体は、組成物に添加される、または、組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の濃度とする。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体は、組成物に添加される、または、組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の濃度とする。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体は、組成物に添加される、または、組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／もしくは担体の濃度とする。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＮａＣｌを含む塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、スクロース、グルコース、およびマンニトールを含む糖である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＨＥＰＥＳを含む化学的緩衝剤である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＰＢＳを含む緩衝溶液である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、限定されないが、ＤＭＥＭを含む細胞培養培地である。粒子サイズは、粒子サイズを測定するための当技術分野において公知の任意の手段を使用して、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって、決定することができる。例えば、一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子のＤＬＳで測定したＺ平均よりも１０％大きい、ＤＬＳで測定したＺ平均を有する凝集物は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子よりも１０％大きい。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体、ナノ粒子、または組成物を調製する方法は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物に、塩（例えば、ＮａＣｌ）を添加するステップ、あるいは組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下（例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の塩の濃度とするステップをさらに含む。一部の実施形態では、塩（例えば、ＮａＣｌ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約７５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度とする。一部の実施形態では、塩（例えば、ＮａＣｌ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度とする。一部の実施形態では、塩（例えば、ＮａＣｌ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度とする。一部の実施形態では、塩（例えば、ＮａＣｌ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度とする。一部の実施形態では、塩（例えば、ＮａＣｌ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／またはそれに寄与する、組成物中の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度とする。一部の実施形態では、組成物中の塩の濃度は、約１００ｍＭ以下（例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍＭ（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）である。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体、ナノ粒子、または組成物を調製する方法は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物に、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を添加するステップ、あるいは組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２５％以下（例えば、約２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の糖の濃度とするステップをさらに含む。一部の実施形態では、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約７５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）の濃度とする。一部の実施形態では、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）の濃度とする。一部の実施形態では、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）の濃度とする。一部の実施形態では、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）の濃度とする。一部の実施形態では、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）の濃度とする。一部の実施形態では、組成物中の糖の濃度は、約２０％以下（例えば、約１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）である。一部の実施形態では、糖は、スクロースである。一部の実施形態では、糖は、グルコースである。一部の実施形態では、糖は、マンニトールである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体、ナノ粒子、または組成物を調製する方法は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物に、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）を添加するステップ、あるいは組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下（例えば、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の化学的緩衝剤の濃度とするステップをさらに含む。一部の実施形態では、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約７．５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）の濃度とする。一部の実施形態では、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）の濃度とする。一部の実施形態では、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約３％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）の濃度とする。一部の実施形態では、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）の濃度とする。一部の実施形態では、化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しない、組成物中の化学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸塩）の濃度とする。一部の実施形態では、化学的緩衝剤は、ＨＥＰＥＳである。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、ＨＥＰＥＳを含む緩衝溶液の形態で組成物に添加される。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳを含む溶液は、約５～約９の間（例えば、約５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、および９（これらの値の間のいずれかの範囲を含む）のいずれか）のｐＨを有する。一部の実施形態では、組成物は、約７５ｍＭ以下（例えば、約７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０ｍＭまたはそれ未満（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）の濃度で、ＨＥＰＥＳを含む。一部の実施形態では、化学的緩衝剤は、リン酸塩である。一部の実施形態では、リン酸塩は、リン酸塩を含む緩衝溶液の形態で組成物に添加される。一部の実施形態では、組成物は、ＰＢＳを含まない。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体、ナノ粒子、または組成物を調製する方法は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物に、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）を添加するステップ、あるいは組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の細胞培養培地の濃度とするステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）の濃度とする。一部の実施形態では、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）の濃度とする。一部の実施形態では、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）の濃度とする。一部の実施形態では、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）の濃度とする。一部の実施形態では、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）の濃度とする。一部の実施形態では、組成物は、約７０％以下（例えば、約６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０％、またはそれ未満（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）の濃度で、細胞培養培地を含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭである。一部の実施形態では、細胞培養培地は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体、ナノ粒子、または組成物を調製する方法は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む組成物に、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を添加するステップ、あるいは組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進しないおよび／もしくはそれに寄与しないか、またはｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２００％以下（例えば、約１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％（これらの値のうちのいずれかの間の任意の範囲を含む）以下のいずれか）大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の担体タンパク質の濃度とするステップをさらに含む。一部の実施形態では、担体タンパク質（例えば、アルブミン）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）の濃度とする。一部の実施形態では、担体タンパク質（例えば、アルブミン）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１００％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）の濃度とする。一部の実施形態では、担体タンパク質（例えば、アルブミン）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約５０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）の濃度とする。一部の実施形態では、担体タンパク質（例えば、アルブミン）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約２５％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）の濃度とする。一部の実施形態では、担体タンパク質（例えば、アルブミン）は、組成物に添加される、または組成物を調整して、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも約１０％以下大きいサイズを有するｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子の凝集物の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する、組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）の濃度とする。一部の実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
一部の実施形態では、本発明のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む安定な組成物では、複合体またはナノ粒子の平均直径は、約１０％を超えるまでは変化せず、多分散指数は、約１０％を超えるまでは変化しない。
使用方法
疾患処置方法
本発明は、一態様では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、個体に、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、個体に、ｍＲＮＡの細胞内送達のための本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子が、疾患または状態の処置に有用な１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されている（例えば、ここで、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子は、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含むＣＰＰを含む。一部の実施形態では、医薬組成物中のｍＲＮＡの最低有効量は、ｍＲＮＡが本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子に存在しない同様の医薬組成物（例えば、遊離ｍＲＮＡを含む医薬組成物）中のｍＲＮＡの最低有効量未満である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質、例えば、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子は、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉなどの阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、第１の治療用タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ、および第２の治療用タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡを含む、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉｃｒｏＲＮＡ）を含み、複数のＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する複数の内因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ナノ粒子の複合体は、治療用ｍＲＮＡおよび治療用ＲＮＡｉを含み、治療用ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードし、治療用ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とし、ｍＲＮＡは、内因性遺伝子の治療形態である（例えば、第２の導入遺伝子は、変異体タンパク質の野生型もしくは機能形態をコードする、または第２の導入遺伝子は、タンパク質の正常発現をもたらす）。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、第１の治療用タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡおよび第２の治療用ｍＲＮＡをコードする第２のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質をコードする単一のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、処置を予定している疾患または状態は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベル異常を特徴とする疾患を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、成長因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および他の転写モジュレーター、タンパク質発現および修飾の調節因子、腫瘍抑制因子、ならびにアポトーシスおよび転移の調節因子を、これらに限定されないが、含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の１つまたは複数の追加のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、個体に、本明細書に記載の１つまたは複数の追加のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む１つまたは複数の追加の医薬組成物の有効量を投与するステップをさらに含む。
本明細書で使用される活性または発現の「モジュレ―ション（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、遺伝子もしくはｍＲＮＡの状態もしくはコピー数を制御もしくは変更すること、または産生されるタンパク質などの遺伝子産物の量を変化させることを意味する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を増加させる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、遺伝子または遺伝子産物の発現を、少なくとも約０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかに増加させる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、遺伝子または遺伝子産物の発現を、少なくとも約０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のいずれか、阻害する。
一部の実施形態では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、個体に、ｍＲＮＡの細胞内送達のための本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物の有効量を投与するステップを含み、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子が、疾患または状態の処置に有用な１つまたは複数のｍＲＮＡと、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む細胞膜透過ペプチドとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、処置を予定している疾患または状態は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベル異常を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、医薬組成物中のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子は、個体の１つまたは複数の遺伝子の発現をモジュレートするための１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子は、成長因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および他の転写モジュレーター、タンパク質発現および修飾の調節因子、腫瘍抑制因子、ならびにアポトーシスおよび転移の調節因子を、これらに限定されないが、含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の１つまたは複数の追加のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、方法は、個体に、本明細書に記載の１つまたは複数の追加のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子を含む１つまたは複数の追加の医薬組成物の有効量を投与するステップをさらに含む。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のタンパク質、例えば、１つまたは複数の治療用タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子は、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、例えば、治療用ＲＮＡｉをさらに含む。
一部の実施形態では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、医薬組成物の複数回の投与を含む方法が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物の反復投与は、医薬組成物に対する個体における有害免疫応答を誘発しない、またはｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体もしくはナノ粒子に含有される１つもしくは複数のｍＲＮＡを単独で含む同様の医薬組成物の反復投与と比較して個体における実質的に低下した免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、医薬組成物の反復投与は、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子に含有される１つまたは複数のｍＲＮＡを単独で含む同様の医薬組成物の対応する反復投与によって生成される免疫応答の約９９％以下（例えば、約９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１％以下またはそれ未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）のいずれか）の強さの免疫応答をもたらす。
一部の実施形態では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載されているｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、局所組織、器官または細胞に送達される、方法が提供される。一部の実施形態では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載されているｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）送達複合体またはナノ粒子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の有効量を個体に投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、血管または血管周囲の組織に送達される、方法が提供される。
疾患および状態
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり、医薬組成物は、成長因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および他の転写モジュレーター、タンパク質発現および修飾の調節因子、腫瘍抑制因子、ならびにアポトーシスおよび転移の調節因子を含むがこれらに限定されないタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、成長因子またはサイトカインには、これらに限定されないが、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－αおよびｗｎｔが、これらの変異型を含めて、含まれる。一部の実施形態では、細胞表面受容体には、これらに限定されないが、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、アンジオポエチン受容体、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＨＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＫＧＦＲ、ＭＳＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体（ＦＺＤ－１～１０）、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）、パッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）およびＣＸＣＲ４が、これらの変異型を含めて、含まれる。一部の実施形態では、シグナル伝達分子またはキナーゼには、これらに限定されないが、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＭＡＰＫ、ＭＫＫ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ＪＡＫ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、ＲＩＣＴＯＲ、ＭＬＳＴ８、ＰＲＡＳ４０、ＤＥＰＴＯＲ、ＭＳＩＮ１、Ｓ６キナーゼ、ＰＤＫ１、ＢＲＡＦ、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｓｈｃ、ＧＳＫ、ＩＫＫ、ＰＬＫ－１、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ１～１３）、ＣＤＫ活性化キナーゼ、ＡＬＫ／Ｍｅｔ、Ｓｙｋ、ＢＴＫ、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＲＥＴ、β－カテニン、Ｍｃｌ－１およびＰＫＮ３が、これらの変異型を含めて、含まれる。一部の実施形態では、転写因子、または他の転写モジュレーターには、これらに限定されないが、ＡＲ、ＡＴＦ１、ＣＥＢＰＡ、ＣＲＥＢ１、ＥＳＲ１、ＥＷＳＲ１、ＦＯＸＯ１、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＩＫＺＦ１、ＩＲＦ１、ＩＲＦ４、ＫＬＦ６、ＬＭＯ１、ＬＹＬ１、ＭＹＣ、ＮＲ４Ａ３、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＢＸ１、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＭＬ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ７、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＡＬ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＺＢＴＢ１６、ＡＴＦ－２、Ｃｈｏｐ、ｃ－Ｊｕｎ、ｃ－Ｍｙｃ、ＤＰＣ４、Ｅｌｋ－１、Ｅｔｓ１、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＦＡＴ４、Ｓａｐ１ａ、ＳＴＡＴ、Ｔａｌ、ｐ５３、ＣＲＥＢ、ＮＦ－κＢ、ＨＤＡＣ、ＨＩＦ－１αおよびＲＲＭ２が、これらの変異型を含めて、含まれる。一部の実施形態では、タンパク質発現または修飾の調節因子には、これらに限定されないが、ユビキチンリガーゼ、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７およびＭＥＣＬ－１が、これらの変異型を含めて、含まれる。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子には、これらに限定されないが、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＤＰＣ４、ＩＮＫ４、ＭＡＤＲ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＮＦ１、ＮＦ２、ｐ５３、ＰＴＣ、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ２、およびこれらの変異体を含むＳＷＩ／ＳＮＦクロマチンリモデリング複合体の構成成分が含まれる。一部の実施形態では、アポトーシスまたは転移の調節因子には、これらに限定されないが、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ－２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９、ｕＰＡＲが、これらの変異型を含めて、含まれる。
一部の実施形態では、固形腫瘍としては、これらに限定されないが、肉腫および癌、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉縮、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮サクロノーマシノビオーマ、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、メナンギオーマ（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫が挙げられる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子、例えば、発癌遺伝子を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ｒａｓＫである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、固形腫瘍である、がんであり、医薬組成物は、腫瘍の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、腫瘍の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡには、これらに限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロン－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、カスパーゼ－９、ｐ５３、ＭＵＣ－１、ＭＤＲ－１、ＨＬＡ－Ｂ７／ベータ２－ミクログロブリン、Ｈｅｒ２、Ｈｓｐ２７、チミジンキナーゼ、およびＭＤＡ－７が、これらの変異型を含めて、含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、単一のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、第１のタンパク質および第２のタンパク質をコードする単一のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ、例えば、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉであり、タンパク質は、疾患または状態を処置するために有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、治療用ｍＲＮＡおよび治療用ＲＮＡｉを含み、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とし、治療用ｍＲＮＡは、内因性遺伝子の治療形態に対応する（例えば、第２の導入遺伝子は、変異体タンパク質の野生型もしくは機能形態をコードする、または第２の導入遺伝子は、タンパク質の正常発現をもたらす）。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、肝がんである、がんであり、医薬組成物は、肝がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、肝がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、肝がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、肝がんは、肝細胞癌、胆管癌、肝臓の血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、または肝臓の血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）である。一部の実施形態では、肝がんの発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＣＣＮＤ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＧＲＰ７８、ＣＥＰ１６４、ＭＤＭ２およびＡＬＤＨ２が、これらの変異型を含めて、含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかによれば、がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）である。一部の実施形態では、ＨＣＣは、早期ＨＣＣ、非転移性ＨＣＣ、原発性ＨＣＣ、進行ＨＣＣ、局所進行ＨＣＣ、転移性ＨＣＣ、寛解期のＨＣＣ、または再発ＨＣＣである。一部の実施形態では、ＨＣＣは、限局性切除可能（すなわち、完全な外科的除去が可能である肝臓の一部分に限定される腫瘍）であるか、限局性切除不能（すなわち、極めて重要な血管構造が冒されているため、もしくは肝臓が障害されるため、切除不能であり得る限局性腫瘍）であるか、または切除不能である（すなわち、腫瘍が、すべての肝臓葉が冒されている、および／または拡大して他の器官（例えば、肺、リンパ節、骨）が冒されている。一部の実施形態では、ＨＣＣは、ＴＮＭ分類に従って、ステージＩ腫瘍（血管浸潤のない単一の腫瘍）、ステージＩＩ腫瘍（血管浸潤を伴う単一の腫瘍、または５ｃｍより大きいものがない複数の腫瘍）、ステージＩＩＩ腫瘍（いずれも５ｃｍより大きい複数の腫瘍、または門脈もしくは肝静脈の主枝を冒している腫瘍）、ステージＩＶ腫瘍（胆嚢以外の隣接器官への直接浸潤、または臓側腹膜穿孔を伴う、腫瘍）、Ｎ１腫瘍（領域リンパ節転移）またはＭ１腫瘍（遠隔転移）である。一部の実施形態では、ＨＣＣは、ＡＪＣＣ（米国がん合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ
ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ））ステージ分類基準に従って、ステージＴ１、Ｔ２、Ｔ３またはＴ４ ＨＣＣである。一部の実施形態では、ＨＣＣは、肝細胞癌、ＨＣＣの線維層板型バリアントおよび混合型肝細胞・胆管癌のいずれか１つである。一部の実施形態では、個体は、肝細胞癌に関連する遺伝子、遺伝子変異または多型（例えば、ＣＣＮＤ２、ＲＡＤ２３Ｂ、ＧＲＰ７８、ＣＥＰ１６４、ＭＤＭ２および／またはＡＬＤＨ２の変異または多型）を有するヒトであってもよく、または肝細胞癌に関連する遺伝子の１つもしくは複数の余分なコピーを有するヒトであってもよい。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、肺がんである、がんであり、医薬組成物は、肺がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、肺がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、肺がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、肺がんの発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＳＡＳＨ１、ＬＡＴＳ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＰＡＲＫ２、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｋｒａｓ２、Ｋｒａｇ、Ｐａｓ１、ＥＲＣＣ１、ＸＰＤ、ＩＬ８ＲＡ、ＥＧＦＲ、Ｏｔ１－ＡＤ、ＥＰＨＸ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１２、ＩＬ１β、ＲＡＳおよびＡＫＴが、これらの変異型を含めて、含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかによれば、がんは、肺がんである。一部の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。ＮＳＣＬＣの例としては、大細胞癌（例えば、大細胞神経内分泌癌、混合型大細胞神経内分泌癌、類基底細胞癌、リンパ上皮腫様癌、明細胞癌、およびラブドイド表現型を有する大細胞癌）、腺癌（例えば、腺房状、乳頭状（例えば、気管支肺胞癌、非粘液性、粘液性、粘液性と非粘液性の混合型、および不確定細胞型）、ムチンを伴う固形腺癌、混合亜型を伴う腺癌、高分化型胎児型腺癌、粘液性（膠様）腺癌、粘液性嚢胞腺癌、印環腺癌、および明細胞腺癌）、神経内分泌肺腫瘍、および扁平上皮癌（例えば、乳頭状、明細胞、小細胞、類基底のもの）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＴＮＭ分類に従って、ステージＴ腫瘍（原発性腫瘍）、ステージＮ腫瘍（領域リンパ節）、またはステージＭ腫瘍（遠隔転移）である。一部の実施形態では、肺がんは、カルチノイド（定型または非定型）、腺扁平上皮癌、円柱腫、または唾液腺の癌（例えば、腺様嚢胞癌または粘表皮癌）である。一部の実施形態では、肺がんは、多形性、肉腫様または肉腫性要素を伴う癌（例えば、紡錘および／もしくは巨細胞を伴う癌、紡錘細胞癌、巨細胞癌、癌肉腫、または肺芽腫）である。一部の実施形態では、がんは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ；燕麦細胞癌とも呼ばれる）である。小細胞肺がんは、限局期小細胞肺がんであってもよく、進展期小細胞肺がんであってもよく、または再発小細胞肺がんであってもよい。一部の実施形態では、個体は、肺がんに関連することが疑われるもしくは明らかにされた遺伝子、遺伝子変異もしくは多型（例えば、ＳＡＳＨ１、ＬＡＴＳ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＰＡＲＫ２、ＫＲＡＳ、ＰＴＥＮ、Ｋｒａｓ２、Ｋｒａｇ、Ｐａｓ１、ＥＲＣＣ１、ＸＰＤ、ＩＬ８ＲＡ、ＥＧＦＲ、Ｏｔ１－ＡＤ、ＥＰＨＸ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１２、ＩＬ１ β、ＲＡＳおよび／もしくはＡＫＴの変異もしくは多型）を有するヒトであってもよく、または肺がんに関連する遺伝子の１つもしくは複数の余分なコピーを有するヒトであってもよい。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、腎細胞癌（ＲＣＣ）である、がんであり、医薬組成物は、ＲＣＣの発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、ＲＣＣの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＲＣＣの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、ＲＣＣの発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＶＨＬ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＣＵＬ２、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ、ＭＥＴ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β１、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＲ、ＡＫＴおよびＰＴＥＮが、これらの変異型を含めて、含まれる。
一部の実施形態では、上記に記載の方法のいずれかによれば、がんは、腎細胞癌である。一部の実施形態では、腎細胞癌は、腺癌である。一部の実施形態では、腎細胞癌は、明細胞腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌（好色素性腎細胞癌とも呼ばれる）、嫌色素性腎細胞癌、集合管腎細胞癌、顆粒腎細胞癌、混合顆粒腎細胞癌（ｍｉｘｅｄ ｇｒａｎｕｌａｒ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎血管筋脂肪腫、または腎紡錘細胞癌（ｓｐｉｎｄｌｅ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。一部の実施形態では、個体は、腎細胞癌に関連する遺伝子、遺伝子変異または多型（例えば、ＶＨＬ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＣＵＬ２、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ、ＭＥＴ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β１、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＲ、ＡＫＴおよび／またはＰＴＥＮの変異または多型）を有するヒトであってもよく、または腎細胞癌に関連する遺伝子の１つもしくは複数の余分なコピーを有するヒトであってもよい。一部の実施形態では、腎細胞癌は、（１）フォンヒッペル・リンダウ（ＶＨＬ）症候群、（２）遺伝性乳頭状腎癌（ＨＰＲＣ）、（３）バート・ホッグ・デュベ症候群（ＢＨＤＳ）に関連する家族性腎オンコサイトーマ（ＦＲＯ）、または（４）遺伝性腎癌（ＨＲＣ）に、関連している。一部の実施形態では、腎細胞癌は、米国がん合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）ステージ分類グループに従って、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれかである。一部の実施形態では、腎細胞癌は、ステージＩＶ腎細胞癌である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍である、がんであり、医薬組成物は、ＣＮＳ腫瘍の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、ＣＮＳ腫瘍の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＣＮＳ腫瘍の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ＣＮＳ腫瘍に対する外科手術手技中または後（例えば、直後）に投与される。一部の実施形態では、外科手術手技は、ＣＮＳ腫瘍の切除である。一部の実施形態では、医薬組成物は、外科手術手技の結果として生じる術後腔に投与される。一部の実施形態では、ＣＮＳ腫瘍の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＮＦ１、ＮＦ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ｐＶＨＬ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ｐ５３、ＣＨＫ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＰＴＣＨ、ＳＵＦＵおよびＸＲＣＣ７が、これらの変異型を含めて、含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかによれば、がんは、ＣＮＳ腫瘍である。一部の実施形態では、ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫および混合型神経膠腫）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても公知）、星細胞腫（例えば、高悪性度星細胞腫）、小児神経膠腫もしくは神経膠芽腫（例えば、小児高悪性度神経膠腫（ＨＧＧ）およびびまん性内在性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ））、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、または脳転移である。一部の実施形態では、個体は、ＣＮＳ腫瘍に関連することが疑われるもしくは明らかにされた遺伝子、遺伝子変異または多型（例えば、ＮＦ１、ＮＦ２、ＳＭＡＲＣＢ１、ｐＶＨＬ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ｐ５３、ＣＨＫ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＰＴＣＨ、ＳＵＦＵおよびＸＲＣＣ７の変異もしくは多型）を有するヒトであってもよく、またはＣＮＳ腫瘍に関連する遺伝子の１つもしくは複数の余分なコピーを有するヒトであってもよい。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、血液疾患であり、医薬組成物は、血液疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、血液疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、血液疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、血液疾患は、ヘモグロビン異常症、例えば、鎌状赤血球症、サラセミアもしくはメトヘモグロビン血症、貧血、例えば、巨赤芽球性貧血、溶血性貧血（例えば、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、先天性赤血球形成異常性貧血、グルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、免疫介在性溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血、温式抗体自己免疫性溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、エバンス症候群、寒冷自己免疫性溶血性貧血、寒冷凝集素症、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、伝染性単核症、同種免疫性溶血性貧血、新生児溶血性疾患、もしくは発作性夜間ヘモグロビン尿症）、再生不良性貧血（例えば、ファンコニ貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、もしくは後天性赤芽球癆）、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、好中球減少症、無顆粒球症、グランツマン血小板無力症、血小板減少症、骨髄増殖性障害、例えば、真正赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｅｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ）、赤血球増加症、白血球増加症もしくは血小板増加症、または凝血異常、例えば、再発性血栓症、播種性血管内凝固、血友病（例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、もしくは血友病Ｃ）、フォン・ヴィルブランド病、プロテインＳ欠乏症、抗リン脂質抗体症候群、またはウィスコット・オルドリッチ症候群である。一部の実施形態では、血液疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＰＲＯＣ、ＡＬＡＳ２、ＡＢＣＢ７、ＳＬＣ２５Ａ３８、ＭＴＴＰ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２）、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＪ（ＢＲＩＰ１）、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＮＣＮ（ＰＡＬＢ２）、ＦＡＮＣＰ（ＳＬＸ４）、ＦＡＮＣＳ（ＢＲＣＡ１）、ＲＡＤ５１Ｃ、ＸＰＦ、ＡＮＫ１、ＳＰＴＢ、ＳＰＴＡ、ＳＬＣ４Ａ１、ＥＰＢ４２、およびＴＰＩ１が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、器官に基づいた疾患であり、医薬組成物は、器官に基づいた疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、器官に基づいた疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、器官に基づいた疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、器官に基づいた疾患は、眼、肝臓、肺、腎臓、心臓、神経系、筋肉または皮膚の疾患である。一部の実施形態では、疾患は、心血管疾患、例えば、冠動脈心疾患、高血圧症、心房細動、末梢動脈疾患、マルファン症候群、ＱＴ延長症候群、または先天性心臓欠陥である。一部の実施形態では、疾患は、消化器系疾患、例えば、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病、消化性潰瘍疾患、胃食道逆流症、または慢性膵炎である。一部の実施形態では、疾患は、泌尿器疾患、例えば、慢性前立腺炎、良性前立腺肥大症、または間質性膀胱炎である。一部の実施形態では、疾患は、筋骨格系疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、骨形成不全症、または骨パジェット病である。一部の実施形態では、疾患は、皮膚疾患、例えば、湿疹、乾癬、ざ瘡、酒さ、または皮膚炎である。一部の実施形態では、疾患は、歯または頭蓋顔面障害、例えば、歯周病または側頭下顎関節および筋肉の障害（ＴＭＪＤ）である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、眼疾患であり、医薬組成物は、眼疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、眼疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、眼疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、眼疾患は、加齢黄斑変性など、未熟児網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、虚血性増殖性網膜症、網膜色素変性、錐体ジストロフィー、増殖性硝子体網膜症、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、角膜炎、結膜炎、ぶどう膜炎、レーバー病、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、血管新生緑内障、角膜血管新生、網膜脈絡膜血管新生または遺伝性網膜疾患（ＲＰＥ６５媒介性ＩＲＤ、全脈絡膜萎縮症、ロドプシン関連常染色体優性網膜色素変性（ＲＨＯ－ａｄＲＰ）、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）またはレーバー先天黒内障など）である。一部の実施形態では、眼疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、Ｒｈｏ、ＰＤＥ６β、ＡＢＣＡ４、ＲＰＥ６５、ＬＲＡＴ、ＲＤＳ／ペリフェリン、ＭＥＲＴＫ、ＣＮＧＡ１、ＲＰＧＲ、ＩＭＰＤＨ１、ＣｈＲ２、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＤＳ／ペリフェリン、ＡＩＰＬ１、ＡＢＣＡ４、ＲＰＧＲＩＰ１、ＩＭＰＤＨ１、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＲＡＴ、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲＩＰ１、ＲＰＥ６５、ＣＥＰ２９０、ＡＢＣＡ４、ＤＦＮＢ３１、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＵＳＨ１Ｇ、ＣＬＲＮ１、ＧＮＡＴ２、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、Ｒｓ１、ＯＡ１、ＭＴ－ＮＤ４、（ＯＣＡ１）、チロシナーゼ、ｐ２１ ＷＡＦ－１／ＯＣｉｐｌ、ＲＥＰ－１、ＰＤＧＦ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦインヒビター、オプシン、ＯＰＮ１ＬＷ、アリールスルファターゼＢおよびβ－グルクロニダーゼが、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、肝臓疾患であり、医薬組成物は、肝臓疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、肝臓疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、肝臓疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、肝臓疾患は、肝炎、脂肪肝疾患（アルコール性および非アルコール性）、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞３型、遺伝性果糖不耐症、糖原病ＩＶ型、チロシン血症Ｉ型、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、シトリン欠損症（ＣＴＬＮ２、ＮＩＣＣＤ）、コレステリルエステル蓄積症、嚢胞性線維症、アルストレム症候群、先天性肝線維症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、糖原病ＩＩ型、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス、ジルベール症候群、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、血友病（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）、またはメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）である。一部の実施形態では、肝臓疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＢＣＢ４、ＡＬＤＯＢ、ＧＢＥ１、ＦＡＨ、ＡＳＬ、ＳＬＣ２５Ａ１３、ＬＩＰＡ、ＣＦＴＲ、ＡＬＭＳ１、ＨＦＥ、ＨＦＥ２、ＨＦＤＥ２Ｂ、ＨＦＥ３、ＳＬＣ１１Ａ３／ＳＬＣ４０Ａ１、セルロプラスミン、トランスフェリン、Ａ１ＡＴ、ＢＣＳ１Ｌ、Ｂ３ＧＡＴ１、Ｂ３ＧＡＴ２、Ｂ３ＧＡＴ３、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ２Ａ１、ＵＧＴ２Ａ２、ＵＧＴ２Ａ３、ＵＧＴ２Ｂ４、ＵＧＴ２Ｂ７、ＧＴ２Ｂ１０、ＵＧＴ２Ｂ１１、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＵＧＴ２Ｂ１７、ＵＧＴ２Ｂ２８、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、およびＭＵＴ（ＣｏＡムターゼ）が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、肺疾患であり、医薬組成物は、肺疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、肺がんの発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、肺疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、肺疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、嚢胞性線維症、原発性線毛機能不全、肺線維症、バート・ホッグ・デュベ症候群、結節性硬化症、カルタゲナー症候群、α１－アンチトリプシン欠損症、肺毛細血管腫症（ＰＣＨ）、または遺伝性出血性毛細血管拡張症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｈｅａｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）である。一部の実施形態では、肺疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＩＲＥＢ２、ＨＨＩＰ、ＦＡＭ１３Ａ、ＩＬ１ＲＬ１、ＴＳＬＰ、ＩＬ３３、ＩＬ２５、ＣＦＴＲ、ＤＮＡＩ１、ＤＮＡＨ５、ＴＸＮＤＣ３、ＤＮＡＨ１１、ＤＮＡＩ２、ＫＴＵ、ＲＳＰＨ４Ａ、ＲＳＰＨ９、ＬＲＲＣ５０、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＡ２、ＦＬＣＮ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、Ａ１ＡＴ、ＥＮＧ、ＡＣＶＲＬ１、およびＭＡＤＨ４が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、腎臓疾患であり、医薬組成物は、腎臓疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、腎臓疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、腎臓疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、腎臓疾患は、嚢胞性腎臓疾患（例えば、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、常染色体劣性多発性嚢胞腎疾患、ネフロン癆、もしくは髄質海綿腎）、アルポート症候群、バーター症候群、先天性ネフローゼ症候群、爪膝蓋骨症候群、原発性免疫性糸球体腎炎、逆流性腎症、または溶血性尿毒症症候群である。一部の実施形態では、腎臓疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ３、フィブロシスチン、ＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ２、ＮＰＨＰ３、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ５、ＮＰＨＰ６、ＮＰＨＰ７、ＮＰＨＰ８、ＮＰＨＰ９、ＮＰＨＰ１１、ＮＰＨＰ１１、ＮＰＨＰＬ１、ＧＤＮＦ、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＳＬＣ１２Ａ２（ＮＫＣＣ２）、ＲＯＭＫ／ＫＣＮＪ１、ＣＬＣＮＫＢ、ＢＳＮＤ、ＣＡＳＲ、ＳＬＣ１２Ａ３（ＮＣＣＴ）、およびＡＤＡＭＴＳ１３が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、筋肉疾患であり、医薬組成物は、筋肉疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、筋肉疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、筋肉疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、筋肉疾患は、ミオパチー（例えば、ミトコンドリアミオパチー）、筋ジストロフィー（例えば、デュセンヌ型、ベッカー型、エミリー・ドレイフス型、顔面肩甲上腕型、筋強直性、先天性、遠位型、肢帯型、および眼咽頭型）、脳性麻痺、進行性骨化性線維異形成症、皮膚筋炎、コンパートメント症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、横紋筋融解、多発性筋炎、線維筋痛症、筋強直、筋筋膜性疼痛症候群である。一部の実施形態では、筋肉疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＤＭＤ、ＬＡＭＡ２、コラーゲンＶＩ（ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、またはＣＯＬ６Ａ３）、ＰＯＭＴ１、ＰＯＭＴ２、ＦＫＴＮ、ＦＫＲＰ、ＬＡＲＧＥ１、ＰＯＭＧＮＴ１、ＩＳＰＤ、ＳＥＰＮ１、ＬＭＮＡ、ＤＹＳＦ、ＥＭＤ、ＤＵＸ４、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＰＡＢＰＮ１、ＣＡＶ３、ＣＡＰＮ３、ＳＧＣＡ、ＳＧＣＢ、ＳＧＣＧ、ＳＧＣＤ、ＴＴＮ、ＡＮＯ５、ＤＮＡＪＢ６、ＨＮＲＮＰＤＬ、ＭＹＯＴ、ＴＣＡＰ、ＴＮＰＯ３、ＴＲＡＰＰＣ１１、およびＴＲＩＭ３２が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、神経系疾患（例えば、中枢神経系疾患）であり、医薬組成物は、神経系疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、神経系の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、神経系の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、神経系疾患は、副腎白質ジストロフィー、アンジェルマン症候群、毛細血管拡張性運動失調症、シャルコー・マリー・トゥース症候群、コケイン症候群、本態性振戦、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、レッシュ・ナイハン症候群、メープルシロップ尿症、メンケス症候群、ナルコレプシー、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、フェニルケトン尿症、プラダー・ウィリー症候群、レフサム病、レット症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、タンジール病、テイ・サックス病、結節性硬化症、フォンヒッペル・リンダウ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ツェルベーガー症候群、注意欠陥／多動性障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、双極性障害、うつ病、てんかん、偏頭痛、多発性硬化症、脊髄症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、トゥレット症、ＣＬＮ２疾患（ＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患など）またはムコ多糖症（ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）またはムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）など）である。一部の実施形態では、神経系疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＡＬＤ、ＰＳ１（ＡＤ３）、ＰＳ２（ＡＤ４）、ＳＯＤ１、ＵＢＥ３Ａ、ＡＴＭ、ＰＭＰ２２、ＭＰＺ、ＬＩＴＡＦ、ＥＧＲ２、ＭＦＮ２、ＫＩＦ１Ｂ、ＲＡＢ７Ａ、ＬＭＮＡ、ＴＲＰＶ４、ＢＳＣＬ２、ＧＡＲＳ、ＮＥＦＬ、ＨＳＰＢ１、ＧＤＡＰ１、ＨＳＰＢ８、ＭＴＭＲ２、ＳＢＦ２、ＳＨ３ＴＣ２、ＮＤＲＧ１、ＰＲＸ、ＦＧＤ４、ＦＩＧ４、ＤＮＭ２、ＹＡＲＳ、ＧＪＢ１、ＰＲＰＳ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｘ２６、ＥＰＭ２Ａ、ＥＴＭ１（ＦＥＴ１）、ＥＴＭ２、ＦＭＲ１、フラタキシン、ＧＢＡ、ＨＴＴ、ＨＰＲＴ１、ＢＣＫＤＨ、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ＬＲＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ＰＩＮＫ１、ＰＲＫＮ、ＳＮＣＡ、ＵＣＨＬ１、ＰＡＨ、ＰＨＹＨ、ＰＥＸ７、ＭｅＣＰ２、ＳＭＮ１、ＡＴＸＮ遺伝子（例えば、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２など）、ＡＢＣ１、ＨＥＸＡ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、ＣＬＩＰ２、ＥＬＮ、ＧＴＦ２Ｉ、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＬＩＭＫ１、ＰＸＲ１、ＴＰＰ１、ＩＤＵＡ、およびＩＤＳが、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、血液悪性腫瘍であるがんであり、医薬組成物は、血液悪性腫瘍の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、血液悪性腫瘍の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、血液悪性腫瘍の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、血液悪性腫瘍の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＧＬＩ１、ＣＴＮＮＢ１、ｅＩＦ５Ａ、変異型ＤＤＸ３Ｘ、ヘキソキナーゼＩＩ、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２、ＡＲＫ５、ＡＬＫ、ＭＵＣ１、ＨＭＧＡ２、ＩＲＦ１、ＲＰＮ１３、ＨＤＡＣ１１、Ｒａｄ５１、Ｓｐｒｙ２、ｍｉｒ－１４６ａ、ｍｉｒ－１４６ｂ、サバイビン、ＭＤＭ２、ＭＣＬ１、ＣＭＹＣ、ＸＢＰ１（スプライシングされたものおよびスプライシングされていないもの）、ＳＬＡＭＦ７、ＣＳ１、Ｅｒｂｂ４、Ｃｘｃｒ４（ワルデンストレームマクログロブリン血症）、Ｍｙｃ、Ｂｃｌ２、Ｐｒｄｘ１およびＰｒｄｘ２（バーキットリンパ腫）、Ｂｃｌ６、Ｉｄｈ１、Ｉｄｈ２、Ｓｍａｄ、Ｃｃｎｄ２、サイクリンｄ１～２、Ｂ７－ｈ１（ｐｄｌ－１）およびＰｙｋ２が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、限定されないが、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、脾性辺縁帯リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、およびバーキットリンパ腫）、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞リンパ腫（例えば、成人Ｔ細胞リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸症関連Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、および未分化大細胞リンパ腫）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無症候性および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病ならびに脊髄形成異常症を含む白血病を含む、血液悪性腫瘍である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、ウイルス感染性疾患であり、医薬組成物は、ウイルス感染性疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、ウイルス感染性疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ウイルス感染性疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、ウイルス感染性疾患は、肝炎ｍＲＮＡ、ヒト免疫不全ｍＲＮＡ（ＨＩＶ）、ピコルナｍＲＮＡ、ポリオｍＲＮＡ、エンテロｍＲＮＡ、ヒトコクサッキーｍＲＮＡ、インフルエンザｍＲＮＡ、ライノｍＲＮＡ、エコーｍＲＮＡ、風疹ｍＲＮＡ、脳炎ｍＲＮＡ、狂犬病ｍＲＮＡ、ヘルペスｍＲＮＡ、パピローマｍＲＮＡ、ポリオーマ（ｐｏｌｙｏｍａｎ）ｍＲＮＡ、ＲＳＶ、アデノｍＲＮＡ、黄熱病ｍＲＮＡ、デングｍＲＮＡ、パラインフルエンザｍＲＮＡ、出血性ｍＲＮＡ、ポックスｍＲＮＡ、水痘帯状疱疹ｍＲＮＡ、パラインフルエンザｍＲＮＡ、レオｍＲＮＡ、オルビｍＲＮＡ、ロタｍＲＮＡ、パルボｍＲＮＡ、豚コレラｍＲＮＡ、麻疹、ムンプスまたはノーウォークｍＲＮＡによる感染を特徴とする。一部の実施形態では、ウイルス感染性疾患は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＢＶ、ＫＳＨＶ、ＨＰＶ、ＭＣＶ、ＨＴＬＶ－１、ＨＩＶ－１およびＨＣＶを含むがこれらに限定されない、発癌ｍＲＮＡによる感染を特徴とする。一部の実施形態では、ウイルス感染性疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ＲＳＶヌクレオカプシド、Ｐｒｅ－ｇｅｎ／Ｐｒｅ－Ｃ、Ｐｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２／Ｓ、Ｘ、ＨＢＶ保存配列、ＨＩＶ Ｇａｇポリタンパク質（ｐ５５）、ＨＩＶ Ｐｏｌポリタンパク質、ＨＩＶ Ｇａｇ－Ｐｏｌ前駆体（ｐ１６０）、ＨＩＶマトリックスタンパク質（ＭＡ、ｐ１７）、ＨＩＶカプシドタンパク質（ＣＡ、ｐ２４）、ＨＩＶスペーサーペプチド１（ＳＰ１、ｐ２）、ＨＩＶヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ、ｐ９）、ＨＩＶスペーサーペプチド２（ＳＰ２、ｐ１）、ＨＩＶ Ｐ６タンパク質、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ、ｐ５０）、ＨＩＶ ＲＮアーゼＨ（ｐ１５）、ＨＩＶインテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３１）、ＨＩＶプロテアーゼ（ＰＲ、ｐ１０）、ＨＩＶ Ｅｎｖ（ｇｐ１６０）、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ＨＩＶトランス活性化因子（Ｔａｔ）、ＨＩＶビリオンタンパク質発現調節因子（Ｒｅｖ）、ＨＩＶレンチｍＲＮＡタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）、ＨＩＶ Ｖｉｆ、ＨＩＶ陰性因子（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）（Ｎｅｆ）、ＨＩＶｍＲＮＡタンパク質Ｕ（Ｖｐｕ）、ヒトＣＣＲ５、ｍｉＲ－１２２、ＥＢＯＶポリメラーゼＬ、ＶＰ２４、ＶＰ４０、ＧＰ／ｓＧＰ、ＶＰ３０、ＶＰ３５、ＮＰＣ１およびＴＩＭ－１をコードする遺伝子が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患または状態は、自己免疫または炎症性の疾患または状態であり、医薬組成物は、自己免疫または炎症性の疾患または状態の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、自己免疫または炎症性の疾患または状態の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、自己免疫または炎症性の疾患または状態の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、自己免疫または炎症性の疾患または状態は、ざ瘡、アレルギー、アナフィラキシー、喘息、セリアック病、憩質炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、狼瘡、耳炎、骨盤内炎症性疾患、関節リウマチ、サルコイドーシス、または血管炎である。一部の実施形態では、自己免疫または炎症性の疾患または状態の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、補体系の分子をコードする遺伝子（ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＦＢ、ＣＦＤ、ＣＦＨ、ＣＦＨＲ１、ＣＦＨＲ２、ＣＦＨＲ３、ＣＦＨＲ４、ＣＦＨＲ５、ＣＦＩ、ＣＦＰ、ＣＲ１、ＣＲ１Ｌ、ＣＲ２、Ｃ１ＱＡ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＣ、Ｃ１Ｒ、Ｃ１Ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ＡＲ１、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂ、Ｃ５、Ｃ５ＡＲ１、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ、Ｃ８Ｇ、Ｃ９、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、およびＩＴＧＢ２）が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患または状態は、リソソーム蓄積症であり、医薬組成物は、リソソーム蓄積症の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、リソソーム蓄積症の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、リソソーム蓄積症の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、リソソーム蓄積症は、スフィンゴリピドーシス（例えば、ファーバー病、クラッベ病（乳児発症型、遅発型）、ガラクトシアリドーシス、ガングリオシドーシス（例えば、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児型、若年型、成人型／慢性）、ＧＭ２ガングリオシドーシス（例えば、サンドホフ病（乳児、若年、成人発症型）、テイ・サックス））、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症（早期発症型、遅発型）、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型）、スルファチドーシス（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、マルチプルスルファターゼ欠損症））、ムコ多糖症（例えば、ＭＰＳ Ｉ型ハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉ Ｓ型シャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉ Ｈ－Ｓ型ハーラー・シャイエ症候群、ＩＩ型（ハンター症候群）、ＩＩＩ型（サンフィリポ症候群）、ＩＶ型（モルキオ）、ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群）、ＶＩＩ型（スライ症候群）、ＩＸ型（ヒアルロニダーゼ欠損症））、ムコリピドーシス（例えば、Ｉ型（シアリドーシス）、ＩＩ型（Ｉ細胞病）、ＩＩＩ型（偽性ハーラー・ポリジストロフィー／ホスホトランスフェラーゼ欠損症）、ＩＶ型（ムコリピジン（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｉｎ）１欠損症））、リピドーシス（例えば、ニーマン・ピック病（Ｃ型、Ｄ型）、神経セロイドリポフスチン症（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｃｅｒｏｉｄ Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｅｓ）、ウォルマン病）、アルファマンノシドーシス、ベータマンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、リソソーム輸送障害（例えば、シスチン症、濃化異骨症、サラ病／シアル酸蓄積症、乳児遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ））、コレステリルエステル蓄積症である。一部の実施形態では、リソソーム蓄積症の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、セラミダーゼ、アルファガラクトシダーゼ（Ａ、Ｂ）、ベータガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、サポシンＢ、スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ムコリピジン１、アスパルチルグルコサミニダーゼ、アルファ－Ｄ－マンノシダーゼ、ベータマンノシダーゼ、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ、シスチノシン、カテプシンＫ、シアリン、ＳＬＣ１７Ａ５、酸性アルファグルコシダーゼ、ＬＡＭＰ２をコードする遺伝子が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患または状態は、糖原病であり、医薬組成物は、糖原病の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、糖原病の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、糖原病の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、糖原病は、フォン・ギルーケ病、ポンペ病、コリ病もしくはフォーブス病、アンダーソン病、マッカードル病、ハース病、垂井病、ファンコニ・ビッケル症候群、または赤血球アルドラーゼ欠損症である。一部の実施形態では、糖原病の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、グリコーゲンシンターゼ、グルコース－６－ホスファターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、グリコーゲン分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコース輸送体、ＧＬＵＴ２、アルドラーゼＡおよびβ－エノラーゼをコードする遺伝子が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している状態は、異常なコレステロールレベル（例えば、異常に高いＬＤＬレベル、例えば、約１００ｍｇ／ｄＬより高いＬＤＬ、および／または異常に低いＨＤＬレベル、例えば、約４０～５０ｍｇ／ｄＬより低いＨＤＬ）によって特徴付けされ、例えば、家族性高コレステロール血症（ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）など）を含み、医薬組成物は、コレステロールの輸送および／または代謝に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、コレステロールの輸送および／または代謝に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、コレステロールの輸送および／または代謝に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、コレステロールの輸送および／または代謝に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体（ＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１（ＬＤＬＲＡＰ１）、およびＰＣＳＫ９が、これらの変異型を含めて、含まれる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ＬＤＬＲ発現を活性化するかまたは増加させるために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ＡｐｏＢ発現を活性化するかまたは増加させるために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ＬＤＬＲＡＰ１発現を活性化するかまたは増加させるために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含み、ＲＮＡｉは、ＰＣＳＫ９発現を抑止する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、遺伝性疾患などの遺伝子疾患であり、医薬組成物は、遺伝子疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、遺伝子疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、遺伝子疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、遺伝子疾患は、２２ｑ１１．２欠失症候群、軟骨無形成症、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、アンジェルマン症候群、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、乳がん、カナバン病、シャルコーマリートゥース病、がん、色覚異常、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓形成傾向、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、ハンチントン病、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、多発性嚢胞腎疾患、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、ＳＣＩＤ、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、テイサックス病、サラセミア、トリメチルアミン、およびウィルソン病を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、遺伝子疾患の発生および／または進行に関与する遺伝子には、これらに限定されないが、ＡＡＴ、ＡＤＡ、ＡＬＡＤ、ＡＬＡＳ２、ＡＰＣ、ＡＳＰＭ、ＡＴＰ７Ｂ、ＢＤＮＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＦＴＲ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＭＴ、ＣＮＢＰ、ＣＰＯＸ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＨ、ＣＲＴＡＰ、ＣＸＣＲ４、ＤＨＦＲ、ＤＭＤ、ＤＭＰＫ、Ｆ５、ＦＢＮ１、ＦＥＣＨＦＧＦＲ３、ＦＧＲ３、ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＭＯ３、ＦＭＲ１、ＧＡＲＳ、ＧＢＡ、ＨＢＢ、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＨＭＢＳ、ＨＴＴ、ＩＬ２ＲＧ、ＫＲＴ１４、ＫＲＴ５、ＬＭＮＡ、ＬＲＲＫ２、ＭＥＦＶ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＡＨ、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ３、ＰＡＲＫ７、ＰＧＬ２、ＰＨＦ８、ＰＩＮＫ１、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＰＯＸ、ＲＨＯ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＭＮＩ、ＳＮＣＡ、ＳＲＹ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＣＨＬ１、ＵＲＯＤ、ＵＲＯＳ、ＭＥＦＶ、ＡＰＰ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＬＣＫ、ＬＥＰ、ＬＩＦ、ＭＣＭ６、ＭＹＨ７、ＭＹＯＤ１、ＮＰＰＢ、ＯＳＭ、ＰＫＣ、ＰＩＰ、ＳＬＣ１８Ａ２、ＴＢＸ１、トランスサイレチン、ＭＤＳ１－ＥＶＩ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＥＴＢＰ１、β－グロビンおよびＬＰＬが、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、老化または変性疾患であり、医薬組成物は、老化または変性疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、老化または変性疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、老化または変性疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、老化または変性疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、これらに限定されないが、ケラチンＫ６Ａ、ケラチンＫ６Ｂ、ケラチン１６、ケラチン１７、ｐ５３、β－２アドレナリン作用性受容体（ＡＤＲＢ２）、ＴＲＰＶ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＨＩＦ－１およびカスパーゼ－２が、これらの変異型を含めて、含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置を予定している疾患は、線維性または炎症性疾患であり、医薬組成物は、線維性または炎症性疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含み、タンパク質は、線維性または炎症性疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子に対応する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、線維性または炎症性疾患の発生および／または進行に関与する１つまたは複数の遺伝子を標的とする１つまたは複数のＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、線維性または炎症性疾患の発生および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子には、ＳＰＡＲＣ、ＣＴＧＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、ＶＥＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＴＩＭＰ、ＨＳＰ４７、トロンボスポンジン、ＣＣＮ１、ＬＯＸＬ２、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＣＣＬ２、アデノシン受容体Ａ２Ａ、アデノシン受容体Ａ２Ｂ、アデニリルシクラーゼ、Ｓｍａｄ ３、Ｓｍａｄ ４、Ｓｍａｄ ７、ＳＯＸ９、アレスチン、ＰＤＣＤ４、ＰＡＩ－１、ＮＦ－κＢおよびＰＡＲＰ－１（これらの変異型を含めて）からなる群から選択される。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、医薬組成物は、疾患または状態に関与する１つまたは複数のｍｉＲＮＡの発現をモジュレートする１つまたは複数のｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、１つもしくは複数のｍｉＲＮＡを含むか、または１つもしくは複数のｍｉＲＮＡと組み合わせて使用されるべきである。一部の実施形態では、疾患または状態は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、多発性肝嚢胞および多発性嚢胞腎疾患、がん、心血管疾患、心不全、心肥大、神経発達疾患、脆弱Ｘ症候群、レット症候群、ダウン症候群、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、炎症性疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、および骨格筋疾患を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡには、これらに限定されないが、ｈａｓ－ｍｉｒ－１２６＊、Ｈａｓ－ｍｉＲ－１９１、ｈａｓ－ｍｉｒ－２０５、ｈａｓ－ｍｉｒ－２１、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２、ｌｅｔ－７ファミリー、ｌｅｔ－７ｃ、ｌｅｔ－７ｆ－１、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１００、ｍｉＲ－１０３、ｍｉＲ－１０３－１、ｍｉＲ－１０６ｂ－２５、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－１１２、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２、ｍｉＲ１２５ｂｌ、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－１２８ａ、ｍＩＲ－１３２、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ１３５、ｍｉＲ－１４０、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ１４３、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ１４５、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１４６、ｍｉＲ－１４６ｂ、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１５ｂ、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１７－１９ファミリー、ｍｉＲ－１７３ｐ、ｍｉＲ１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－１８１ｂ、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１８５、ｍｉＲ－１８９、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９１、ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９３ａ、ｍｉＲ－１９３ｂ、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－１９６ａ、ｍｉＲ－１９８、ｍｉＲ－１９９、ｍｉＲ－１９９ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ２００ａ、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ２００ｃ、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２０３、ｍｉＲ－２０５、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２２４、ｍｉＲ－２３、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２３ｂ、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－２６ｂ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－２９、ｍｉＲ－２９８、ｍｉＲ－２９９－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－３０ｄ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ３１、ｍｉＲ－３４、ｍｉＲ３４２、ｍｉＲ－３８１、ｍｉＲ－３８２、ｍｉＲ－３８３、ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｍｉＲ－４５、ｍｉＲ－６１、ｍｉＲ－７８、ｍｉＲ－８０２、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－９２ａ－１、ｍｉＲ－９９ａ、ｍｉＲ－ｌｅｔ７、ｍｉＲ－ｌｅｔ７ａおよびｍｉＲ－ｌｅｔ７ｇが含まれる。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、医薬組成物は、個体に、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、膀胱内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内または経口投与のいずれかによって投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、対流強化送達によって個体に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、輸液ポンプによって個体に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、浸透圧ポンプによって個体に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、カテーテル、例えば、ニードル付きカテーテルによって個体に投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、冠内の局所薬物送達カテーテルによって個体に投与される。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
細胞送達方法
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、細胞を本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されている（例えば、ここで、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含む、ＣＰＰを含む。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、細胞は、不死化細胞、例えば、細胞系からの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞、例えば、個体からの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、細胞は、末梢血由来Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、臍帯血由来Ｔ細胞、または造血幹細胞もしくは他の前駆細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞系からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、接触させるステップは、Ｔ細胞を活性化した後に行われる。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞であり、接触させるステップは、Ｔ細胞を活性化してから少なくとも１２時間（例えば、少なくとも約１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、またはそれより長い時間のうちのいずれか）後に行われる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８試薬（例えば、マイクロビーズ）を使用して活性化される。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、線維芽細胞は、初代線維芽細胞、例えば、個体の線維芽細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞は、個体の肝細胞など、初代（ｐｒｉｍａｒｙ）肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト肺前駆細胞（ＬＰＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、神経細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載の処置を予定している疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、ならびに老化および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患の処置に有用である。
したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡと、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含むＣＰＰとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質、例えば、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、単一のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、第１のタンパク質および第２のタンパク質をコードする単一のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ、例えば、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉであり、タンパク質は、疾患または状態を処置するために有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、治療用ｍＲＮＡおよび治療用ＲＮＡｉを含み、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とし、治療用ｍＲＮＡは、内因性遺伝子の治療形態に対応する（例えば、第２の導入遺伝子は、変異体タンパク質の野生型もしくは機能形態をコードする、または第２の導入遺伝子は、タンパク質の正常発現をもたらす）。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、細胞は、不死化細胞、例えば、細胞系からの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞、例えば、個体からの細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞系からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、線維芽細胞は、初代線維芽細胞、例えば、個体の線維芽細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞は、初代肝細胞、例えば、個体の肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト肺前駆細胞（ＬＰＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、神経細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載の処置を予定している疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、ならびに老化および変性疾患）の処置に有用である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載の処置を予定している疾患のいずれか（例えば、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、ならびに老化および変性疾患）に関与するタンパク質のモジュレーションに有用である。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＡＧＤＮ－１０６ペプチドである。
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡをＴ細胞に送達する方法であって、細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡと、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択されるＣＰＰとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、Ｔ細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、Ｔ細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、Ｔ細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、不死化Ｔ細胞、例えば、Ｔ細胞系からのＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば、個体のＴ細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載の処置を予定している疾患のいずれかの処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、線維芽細胞に１つまたは複数のｍＲＮＡを送達する方法であって、線維芽細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡと、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択されるＣＰＰとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、線維芽細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、線維芽細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、線維芽細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、線維芽細胞は、不死化線維芽細胞、例えば、線維芽細胞系からの線維芽細胞である。一部の実施形態では、線維芽細胞は、初代線維芽細胞、例えば、個体の線維芽細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載の処置を予定している疾患のいずれかの処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを肝細胞に送達する方法であって、肝細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡと、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択されるＣＰＰとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、肝細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、肝細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、肝細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、肝細胞は、不死化肝細胞、例えば、肝細胞系からの肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞は、初代肝細胞、例えば、個体の肝細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、疾患、例えば、本明細書に記載の処置を予定している疾患のいずれかの処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、１つまたは複数のＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患の処置に有用である。
一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体の細胞に送達する方法であって、個体に本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む組成物を投与するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡと、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択されるＣＰＰとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、組成物は、個体に、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、皮下、髄腔内、頭蓋内、脳内、脳室内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、眼科的、門脈内、経皮、皮内、経口、舌下、局所または吸入経路によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、個体に静脈内経路によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、個体に皮下経路によって投与される。一部の実施形態では、細胞は、肺、肝臓、脳、腎臓、心臓、脾臓、血液、膵臓、筋肉、骨髄および腸を含む、器官または組織に存在する。一部の実施形態では、細胞は、個体の肺、肝臓、腎臓または脾臓に存在する。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト肺前駆細胞（ＬＰＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌ）である。一部の実施形態では、個体は、疾患を有し、または疾患を発症するリスクがあり、ｍＲＮＡは、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物であり、薬学的に許容される担体をさらに含む。一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、細胞を本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップを含み、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、ｍＲＮＡ内にパッケージされた導入遺伝子と、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドのアミノ酸配列を含むＣＰＰとを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５および７６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０および７７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２および７８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９および８０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、単一のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、第１のタンパク質および第２のタンパク質をコードする単一のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ、例えば、ｓｉＲＮＡ、例えば、内因性遺伝子、例えば、疾患関連内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉであり、タンパク質は、疾患または状態を処置するために有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、治療用ｍＲＮＡおよび治療用ＲＮＡｉを含み、治療用ＲＮＡｉは、内因性遺伝子の疾患関連形態（例えば、変異体タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常発現をもたらす遺伝子）を標的とし、治療用ｍＲＮＡは、内因性遺伝子の治療形態に対応する（例えば、第２の導入遺伝子は、変異体タンパク質の野生型もしくは機能形態をコードする、または第２の導入遺伝子は、タンパク質の正常発現をもたらす）。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、細胞を複合体またはナノ粒子と接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。一部の実施形態では、細胞は、細胞系由来の細胞など、不死化細胞である。一部の実施形態では、細胞は、個体由来の細胞など、初代細胞である。一部の実施形態では、細胞は、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞など、免疫細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞系由来のＴ細胞など、不死化Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、個体のＴ細胞など、初代Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態では、線維芽細胞は、個体の線維芽細胞など、初代線維芽細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞である。一部の実施形態では、細胞は、心臓細胞である。一部の実施形態では、細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞は、個体の肝細胞など、初代肝細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト肺前駆細胞（ＬＰＣ）である。一部の実施形態では、細胞は、神経細胞である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の処置を予定している疾患（例えば、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、ならびに老化および変性疾患）のいずれかなど、疾患の処置に有用である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉは、本明細書に記載の処置を予定している疾患（例えば、がん、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、ならびに老化および変性疾患）のいずれかなど、疾患に関与するタンパク質をモジュレートするために有用である。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を対象に送達する方法であって、複合体またはナノ粒子が、局所組織、器官または細胞を標的とする、方法が提供される。一部の実施形態では、局所組織、器官または細胞は、疾患領域である。一部の実施形態では、局所組織、器官または細胞は、疾患領域ではない。一部の実施形態では、局所送達は、ターゲティング部分によって媒介される。一部の実施形態では、局所送達は、細胞膜透過ペプチドによって媒介される。一部の実施形態では、局所送達は、局所投与によって媒介される。一部の実施形態では、局所送達は、本明細書に記載の特定のデバイスによって媒介される。一部の実施形態では、局所送達は、本明細書に記載の機構の組合せによって媒介される。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子としては、限定されないが、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４、またはＶＨＬが挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍抑制遺伝子は、ＰＢ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮおよびＴＰ５３から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のｍＲＮＡは、本明細書に記載されているｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子とともに送達される。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮをコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮは、ヒトＰＴＥＮ配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ００５８２１、ＪＦ２６８６９０、Ｕ９２４３６、ＣＲ４５０３０６、ＡＫ０２４９８６、ＡＫ３１３５８１、Ｕ９６１８０、およびＵ９３０５１ならびにＮＭ＿０００３１４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、ヒトＴＰ５３配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＡＦ０５２１８０、ＮＭ＿０００５４６、ＡＹ４２９６８４、ＢＴ０１９６２２、ＡＫ２２３０２６、ＤＱ１８６６５２、ＤＱ１８６６５１、ＤＱ１８６６５０、ＤＱ１８６６４９、ＤＱ１８６６４８、ＤＱ２６３７０４、ＤＱ２８６９６４、ＤＱ１９１３１７、ＤＱ４０１７０４、ＡＦ３０７８５１、ＡＭ０７６９７２、ＡＭ０７６９７１、ＡＭ０７６９７０、ＤＱ４８５１５２、ＢＣ００３５９６、ＤＱ６４８８８７、ＤＱ６４８８８６、ＤＱ６４８８８５、ＤＱ６４８８８４、ＡＫ２２５８３８、Ｍ１４６９４、Ｍ１４６９５、ＥＦ１０１８６９、ＥＦ１０１８６８、ＥＦ１０１８６７、Ｘ０１４０５、ＡＫ３１２５６８、ＮＭ＿００１１２６１１７、ＮＭ＿００１１２６１１６、ＮＭ＿００１１２６１１５、ＮＭ＿００１１２６１１４、ＮＭ＿００１１２６１１３、ＮＭ＿００１１２６１１２、ＦＪ２０７４２０、Ｘ６００２０、Ｘ６００１９、Ｘ６００１８、Ｘ６００１７、Ｘ６００１６、Ｘ６００１５、Ｘ６００１４、Ｘ６００１３、Ｘ６００１１、Ｘ６００１２、Ｘ６００１０、Ｘ０２４６９、Ｓ６６６６６、ＡＢ０８２９２３、ＮＭ＿００１１２６１１８、ＪＮ９００４９２、ＮＭ＿００１２７６６９９、ＮＭ＿００１２７６６９８、ＮＭ＿００１２７６６９７、ＮＭ＿００１２７６７６１、ＮＭ＿００１２７６７６０、ＮＭ＿００１２７６６９６、およびＮＭ＿００１２７６６９５の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１は、ヒトＢＲＣＡ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿００７２９４、ＮＭ＿００７２９７、ＮＭ＿００７２９８、ＮＭ＿００７３０４、ＮＭ＿００７２９９、ＮＭ＿００７３００、ＢＣ０４６１４２、ＢＣ０６２４２９、ＢＣ０７２４１８、ＡＹ３５４５３９、ＡＹ７５１４９０、ＢＣ０８５６１５、ＢＣ１０６７４６、ＢＣ１０６７４５、ＢＣ１１４５１１、ＢＣ１１５０３７、Ｕ１４６８０、ＡＫ２９３７６２、Ｕ６８０４１、ＢＣ０３０９６９、ＢＣ０１２５７７、ＡＫ３１６２００、ＤＱ３６３７５１、ＤＱ３３３３８７、ＤＱ３３３３８６、Ｙ０８８６４、ＪＮ６８６４９０、ＡＢ６２１８２５、ＢＣ０３８９４７、Ｕ６４８０５、およびＡＦ００５０６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２は、ヒトＢＲＣＡ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４７５６８、ＮＭ＿００００５９、ＤＱ８９７６４８、ＢＣ０２６１６０の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１は、ヒトＴＳＣ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４７７７２、ＮＭ＿０００３６８、ＢＣ０７００３２、ＡＢ１９０９１０、ＢＣ１０８６６８、ＢＣ１２１０００、ＮＭ＿００１１６２４２７、ＮＭ＿００１１６２４２６、Ｄ８７６８３、およびＡＦ０１３１６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２は、ヒトＴＳＣ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＢＣ０４６９２９、ＢＸ６４７８１６、ＡＫ１２５０９６、ＮＭ＿０００５４８、ＡＢ２１００００、ＮＭ＿００１０７７１８３、ＢＣ１５０３００、ＢＣ０２５３６４、ＮＭ＿００１１１４３８２、ＡＫ０９４１５２、ＡＫ２９９３４３、ＡＫ２９５７２８、ＡＫ２９５６７２、ＡＫ２９４５４８、およびＸ７５６２１の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＲＢ１は、ヒトＲＢ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＭ＿０００３２１、ＡＹ４２９５６８、ＡＢ２０８７８８、Ｍ１９７０１、ＡＫ２９１２５８、Ｌ４１８７０、ＡＫ３０７７３０、ＡＫ３０７１２５、ＡＫ３００２８４、ＡＫ２９９１７９、Ｍ３３６４７、Ｍ１５４００、Ｍ２８４１９、ＢＣ０３９０６０、ＢＣ０４０５４０、およびＡＦ０４３２２４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、１つまたは複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を個体に投与するステップを含み、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）が、ＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異体形態を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異体形態を特異的に標的とするが、ＫＲＡＳの野生型形態は標的としない。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１に変異を含む。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異体形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８３）、５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３（アンチセンス）（配列番号８４）、５’－ＧＡＡＧＵＧＣＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴ－３’（センス）（配列番号８６）、５’－ＧＵＣＵＣＧＧＵＧＵＡＧＣＡＣＵＵＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８７）、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８８）および／または５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８９）のうちの１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号８３、８４、８６～８９を有する配列から選択される核酸配列を含む。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、および神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは膵がんである。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、約週に１回または５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のＲＮＡｉの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のＲＮＡｉの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
一部の実施形態では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを個体に投与するステップを含み、ｍＲＮＡが、治療用タンパク質またはその組換え形態をコードする、方法が提供される。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、アルファ１アンチトリプシン、フラタキシン、インスリン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、成長因子、ホルモン、ジストロフィン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α，α－ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼインヒビター、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼを含む）、アデノシンデアミナーゼ、およびアルブミンからなる群から選択される。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、静脈内または皮下に投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または皮下に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される場合に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ １０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約週に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回もしくは月に１回または週に１回未満、２週間毎に１回未満、３週間毎に１回未満もしくは月に１回未満の頻度で送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体はヒトである。
ターゲティング部分
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を対象に送達する方法であって、複合体またはナノ粒子が、ターゲティング部分を介して局所組織、器官または細胞を標的とする、方法が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子は、細胞膜透過ペプチドを含み、細胞膜透過ペプチドは、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、本明細書に記載のターゲティング部分は、組織または特定の細胞型に、ｍＲＮＡ送達複合体を向かわせる。一部の実施形態では、組織は、処置を必要とする組織である。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ｍＲＮＡにより処置され得る組織または細胞に、ｍＲＮＡ送達複合体を向かわせる。一部の実施形態では、表面層中の末梢細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部は、ターゲティング部分に連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合である。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによる。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法による。
細胞膜透過ペプチド
一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、細胞膜透過ペプチドを含み、細胞膜透過ペプチドは、対象における特異的な組織、器官または細胞を優先的に標的とする。
局所的投与
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を対象に送達する方法であって、複合体またはナノ粒子が、対象に、腹腔内、小胞内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒ）、皮下、髄腔内、頭蓋内、冠内、脳内、脳室内、肺内、筋肉内、気管内（例えば、非外科的気管内により、例えば、噴霧化もしくは滴注により）、眼内、眼科的、門脈内、経皮、皮内、経口、舌下、局所または吸入経路から選択される経路によって投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を対象に送達する方法であって、複合体またはナノ粒子が、個体に局所経路によって投与される、方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を対象に送達する方法であって、複合体またはナノ粒子が、個体に全身性経路（例えば、静脈内）によって投与される、方法が提供される。
一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａｌ）は、ニードル（配置可能（ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ）なニードルなど）を備えるカテーテルを介して対象に投与され、ニードルは、複合体またはナノ粒子を含有する。例えば、治療剤および他の薬剤を、血管内腔を囲む外膜層中に深く送達することができるニードルを保有するカテーテルは、米国特許第６，５４７，３０３号、同第６，８６０，８６７号ならびに米国特許出願公開第２００７／０１０６２５７号、同第２０１０１０３０５５４６号および同第２００９１０１４２３０６号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、特に、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一部の実施形態では、ニードルは、配置可能である。カテーテルは、血管における標的注射部位（疾患領域であってもそうでなくてもよい）に向かって、血管内を進むことができる。ニードルにおける開口部が所望の領域（例えば、血管周囲領域）に位置するように、カテーテル中のニードルは、血管壁を通って進み、複合体またはナノ粒子組成物を、ニードル（ｎｅｅｄｌｅｄ）の開口部を通して所望の領域に注射することができる。
例えば、一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管壁を囲む組織中に、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子の有効量を（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質、例えば、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管壁を囲む組織中に、ｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチドを含む複合体またはナノ粒子の有効量を（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ＲＮＡｉをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内在性遺伝子、例えば、疾患関連内在性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外来性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患部位に注射される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患部位に対して遠位に（例えば、疾患部位から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｃｍのうちのいずれかだけ離れて注射される。
一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、血管の外膜組織中に注射される。外膜組織は、血管を囲む組織、例えば、動脈の外弾性板を越えたまたは静脈の中膜を越えた組織である。外膜は、高濃度の脂質を有する。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、外膜の脈管の脈管（ｖａｓａ ｖａｓｏｒｕｍ）領域中に注射される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、注射後に、複合体またはナノ粒子が注射されている血管の軸に関して、注射部位から外膜を通って外周に（ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）、長軸方向に、および／または経壁的に分散することができる（本明細書では以降、「体積分布」と称される）。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、６０分間以下の期間にわたり、注射部位から、長軸方向に少なくとも約１ｃｍ（例えば、少なくとも約２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍまたはそれよりも多くのうちのいずれか）、および／または放射状に少なくとも１ｃｍ（例えば、少なくとも約２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍまたはそれよりも多くのうちのいずれか）の距離にわたって分布する。一部の実施形態では、送達部位から少なくとも２ｃｍ離れた全ての場所で測定された複合体またはナノ粒子の濃度は、例えば、６０分間の期間後に、送達部位における濃度の少なくとも１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％または５０％のうちのいずれか）である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、血管の内皮層および内膜層、中膜、ならびに筋肉層にわたって経壁的に分布する。
したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管壁の外膜組織中に、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を含む組成物の有効量を（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管の外膜組織中に、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子の有効量を（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ＲＮＡｉをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内在性遺伝子、例えば、疾患関連内在性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外来性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含むナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管壁の外膜組織中に、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を含む組成物の有効量を（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップを含み、ナノ粒子の平均サイズが、２００ｎｍ未満である、方法が提供される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患部位にまたはそれに隣接する部位に（例えば、疾患部位から約２、１または０．５ｃｍ以下だけ離れて）注射される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患部位から遠くに（例えば、疾患部位から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｃｍのうちのいずれかだけ離れて）注射される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、注射後に体積分布を達成する。
一部の実施形態に記載の血管は、動脈、例えば、冠動脈または末梢動脈である。一部の実施形態では、動脈は、腎動脈、大脳動脈、肺動脈、および脚の動脈からなる群から選択される。一部の実施形態では、血管は、膝より上の動脈または静脈である。一部の実施形態では、血管は、膝より下の動脈または静脈である。一部の実施形態では、血管は、大腿動脈である。一部の実施形態では、血管は、バルーン傷害された動脈である。
一部の実施形態では、血管は、次のうちのいずれか１つから選択される動脈である：腹部大動脈、前脛骨動脈、大動脈弓、弓状動脈、腋窩動脈、上腕動脈、頸動脈、腹腔動脈、腓骨回旋動脈、総肝動脈、総腸骨動脈、深大腿動脈、深掌動脈弓、背側指動脈、背側中足動脈、外頸動脈、外腸骨動脈、顔面動脈、大腿動脈、下腸間膜動脈、内腸骨動脈、腸（ｉｎｓｔｅｓｔｉｎａｌ）動脈、外側下膝動脈、外側上膝動脈、掌側指動脈、腓骨動脈、膝窩動脈、後脛骨動脈、深大腿動脈、肺動脈、橈骨動脈、腎動脈、脾動脈、鎖骨下動脈、浅掌動脈弓、上腸間膜動脈、上尺側側副動脈および尺骨動脈。
一部の実施形態では、血管は、静脈である。一部の実施形態では、血管は、次のうちのいずれか１つから選択される静脈である：副橈側皮静脈、腋窩静脈、尺側皮静脈、上腕静脈、橈側皮静脈、総腸骨静脈、背側指静脈、背側中足静脈、外腸骨静脈、顔面静脈、大腿静脈、大伏在静脈、肝静脈、下腸間膜静脈、下大静脈、前腕正中皮静脈、内腸骨静脈、腸静脈、頸静脈、外側大腿回旋静脈、左下肺静脈、左上肺静脈、掌側指静脈、門脈、後脛骨静脈、腎静脈、下顎後（ｒｅｔｒｏｍａｎｉｂｕｌａｒ）静脈、伏在静脈、小伏在静脈、脾静脈、鎖骨下静脈、上腸間膜静脈および上大静脈。
一部の実施形態では、血管は、冠血管脈管構造（動脈および静脈の脈管構造を含む）、大脳脈管構造、肝脈管構造、末梢脈管構造、ならびに他の器官および組織区画の脈管構造の一部である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を血管に送達する方法であって、大腿動脈に、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子の有効量を外膜周囲に（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップ（すなわち、外膜周囲組織中に注射するステップ）を含む方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管の外膜周囲組織中に、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子の有効量を（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）注射するステップを含み、複合体またはナノ粒子が、ＲＮＡｉをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内在性遺伝子、例えば、疾患関連内在性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外来性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含むナノ粒子を血管に送達する方法であって、血管壁の外膜周囲組織中に、ｍＲＮＡおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を含む組成物の有効量を注射する（例えば、ニードルを備えるカテーテルにより）ステップを含み、ナノ粒子の平均サイズが、２００ｎｍ未満である、方法が提供される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患部位にまたはそれに隣接する部位に（例えば、疾患部位から約２、１または０．５ｃｍ以下だけ離れて）注射される。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、疾患部位から遠くに（例えば、疾患部位から少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｃｍのうちのいずれかだけ離れて）注射される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、注射後に体積分布を達成する。
本明細書に記載の送達方法は、例えば、陰性リモデリング、血管線維化、再狭窄、血管における細胞増殖および細胞遊走、ならびに創傷治癒を含む、血管異常の１つまたは複数の側面の阻害において有効である。一部の実施形態では、本方法は、血管の陽性リモデリングの促進において有効である。
細胞操作方法
一部の実施形態では、操作されたＴ細胞などの操作された細胞を産生する方法であって、１つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達するための本明細書に記載の方法を含む方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、エレクトロポレーションまたは非ＣＰＰ媒介性ウイルストランスフェクションの使用を含む方法などの、操作された細胞を産生する以前の方法に対する改善である。一部の実施形態では、改善には、限定ではないが、該方法の効率を上昇させること、該方法に付随するコストを削減すること、該方法の細胞毒性を低下させること、および／または該方法の複雑さを低減させることが含まれる。
本明細書に記載の方法のいずれかを組み合わせてもよいことを理解されたい。したがって、例えば、複数のｍＲＮＡ分子を細胞に送達するために本明細書に記載の方法のいずれかを組み合わせることにより、１つまたは複数のｍＲＮＡの第１のセット、および１つまたは複数のｍＲＮＡの第２のセットを細胞に送達することができる。企図される可能な組合せは、本明細書に記載の方法のいずれかのうちの２つまたはそれより多くの組合せを含む。
併用療法
Ａ．ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の併用療法
個体における本明細書に記載の疾患または状態を処置するための併用療法であって、ａ）個体に、本明細書に記載のｍＲＮＡを送達するステップと、ｂ）個体に、本明細書に記載のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達するステップとを含む併用療法も、本明細書に提供される。例えば、個体の疾患または状態を処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん（例えば、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、神経膠芽腫）である。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質および／または発癌遺伝子タンパク質に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮ（すなわち、ＰＴＥＮ遺伝子によってコードされるタンパク質）およびｐ５３（すなわち、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質）から選択される。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの変異型形態を特異的に標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋから選択されるＫＲＡＳの異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、同じ細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、異なる細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと別々に複合体を形成している。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、改変されている（例えば、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がＰＴＥＮである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制因子タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制因子タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＣ００５８２１、ＪＦ２６８６９０、Ｕ９２４３６、ＣＲ４５０３０６、ＡＫ０２４９８６、ＡＫ３１３５８１、Ｕ９６１８０およびＵ９３０５１およびＮＭ＿０００３１４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がＰＴＥＮであり、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がｐ５３であり、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がＰＴＥＮであり、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がｐ５３であり、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんの転移を阻害する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんの転移を阻害する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がＰＴＥＮである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体のがんの転移を阻害する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体のがんの転移を阻害する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がＰＴＥＮであり、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制因子タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制因子タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、腫瘍抑制因子タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体の膵がんの転移を阻害する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質がＰＴＥＮであり、発癌遺伝子がＫＲＡＳである、方法が提供される。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＣ００５８２１、ＪＦ２６８６９０、Ｕ９２４３６、ＣＲ４５０３０６、ＡＫ０２４９８６、ＡＫ３１３５８１、Ｕ９６１８０およびＵ９３０５１およびＮＭ＿０００３１４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質ｐ５３をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＡＦ０５２１８０、ＮＭ＿０００５４６、ＡＹ４２９６８４、ＢＴ０１９６２２、ＡＫ２２３０２６、ＤＱ１８６６５２、ＤＱ１８６６５１、ＤＱ１８６６５０、ＤＱ１８６６４９、ＤＱ１８６６４８、ＤＱ２６３７０４、ＤＱ２８６９６４、ＤＱ１９１３１７、ＤＱ４０１７０４、ＡＦ３０７８５１、ＡＭ０７６９７２、ＡＭ０７６９７１、ＡＭ０７６９７０、ＤＱ４８５１５２、ＢＣ００３５９６、ＤＱ６４８８８７、ＤＱ６４８８８６、ＤＱ６４８８８５、ＤＱ６４８８８４、ＡＫ２２５８３８、Ｍ１４６９４、Ｍ１４６９５、ＥＦ１０１８６９、ＥＦ１０１８６８、ＥＦ１０１８６７、Ｘ０１４０５、ＡＫ３１２５６８、ＮＭ＿００１１２６１１７、ＮＭ＿００１１２６１１６、ＮＭ＿００１１２６１１５、ＮＭ＿００１１２６１１４、ＮＭ＿００１１２６１１３、ＮＭ＿００１１２６１１２、ＦＪ２０７４２０、Ｘ６００２０、Ｘ６００１９、Ｘ６００１８、Ｘ６００１７、Ｘ６００１６、Ｘ６００１５、Ｘ６００１４、Ｘ６００１３、Ｘ６００１１、Ｘ６００１２、Ｘ６００１０、Ｘ０２４６９、Ｓ６６６６６、ＡＢ０８２９２３、ＮＭ＿００１１２６１１８、ＪＮ９００４９２、ＮＭ＿００１２７６６９９、ＮＭ＿００１２７６６９８、ＮＭ＿００１２７６６９７、ＮＭ＿００１２７６７６１、ＮＭ＿００１２７６７６０、ＮＭ＿００１２７６６９６、およびＮＭ＿００１２７６６９５の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＮＭ＿００７２９４、ＮＭ＿００７２９７、ＮＭ＿００７２９８、ＮＭ＿００７３０４、ＮＭ＿００７２９９、ＮＭ＿００７３００、ＢＣ０４６１４２、ＢＣ０６２４２９、ＢＣ０７２４１８、ＡＹ３５４５３９、ＡＹ７５１４９０、ＢＣ０８５６１５、ＢＣ１０６７４６、ＢＣ１０６７４５、ＢＣ１１４５１１、ＢＣ１１５０３７、Ｕ１４６８０、ＡＫ２９３７６２、Ｕ６８０４１、ＢＣ０３０９６９、ＢＣ０１２５７７、ＡＫ３１６２００、ＤＱ３６３７５１、ＤＱ３３３３８７、ＤＱ３３３３８６、Ｙ０８８６４、ＪＮ６８６４９０、ＡＢ６２１８２５、ＢＣ０３８９４７、Ｕ６４８０５、およびＡＦ００５０６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＣ０４７５６８、ＮＭ＿００００５９、ＤＱ８９７６４８、ＢＣ０２６１６０の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＣ０４７７７２、ＮＭ＿０００３６８、ＢＣ０７００３２、ＡＢ１９０９１０、ＢＣ１０８６６８、ＢＣ１２１０００、ＮＭ＿００１１６２４２７、ＮＭ＿００１１６２４２６、Ｄ８７６８３、およびＡＦ０１３１６８の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＣ０４６９２９、ＢＸ６４７８１６、ＡＫ１２５０９６、ＮＭ＿０００５４８、ＡＢ２１００００、ＮＭ＿００１０７７１８３、ＢＣ１５０３００、ＢＣ０２５３６４、ＮＭ＿００１１１４３８２、ＡＫ０９４１５２、ＡＫ２９９３４３、ＡＫ２９５７２８、ＡＫ２９５６７２、ＡＫ２９４５４８、およびＸ７５６２１の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｍＲＮＡが、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおけるＮＭ＿０００３２１、ＡＹ４２９５６８、ＡＢ２０８７８８、Ｍ１９７０１、ＡＫ２９１２５８、Ｌ４１８７０、ＡＫ３０７７３０、ＡＫ３０７１２５、ＡＫ３００２８４、ＡＫ２９９１７９、Ｍ３３６４７、Ｍ１５４００、Ｍ２８４１９、ＢＣ０３９０６０、ＢＣ０４０５４０、およびＡＦ０４３２２４の受託番号を有する配列からなる群から選択される配列を含む、方法が提供される。
一部の実施形態では、個体の膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、ｓｉＲＮＡがＫＲＡＳの変異型形態を標的とする、方法が提供される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの変異型形態を特異的に標的とするが、ＫＲＡＳの野生型形態は標的としない。一部の実施形態では、変異型形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１における変異を含む。一部の実施形態では、変異型形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異型形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異型形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、変異型形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８３）、５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３（アンチセンス）（配列番号８４）、５’－ＧＡＡＧＵＧＣＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴ－３’（センス）（配列番号８６）、５’－ＧＵＣＵＣＧＧＵＧＵＡＧＣＡＣＵＵＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８７）、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８８）および／または５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８９）のうちの１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号８３、８４、８６～８９を有する配列から選択される核酸配列を含む。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）第１の細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している腫瘍抑制遺伝子をコードするｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮまたはｐ５３をコードするｍＲＮＡ）を含むｍＲＮＡ送達複合体、およびｂ）第２の細胞膜透過ペプチドと複合体を形成しているＲＮＡｉ（例えば、ＫＲＡＳの変異型形態などの発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡｉ送達複合体を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、第１および／または第２の細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１および／または第２の細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
Ｂ．２つまたはそれよりも多いｍＲＮＡの併用療法
個体のがん（例えば、膵がん）を処置するための併用療法であって、個体に、ａ）第１のｍＲＮＡ（例えば、第１の治療用タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ）およびｂ）第２のｍＲＮＡ（例えば、第２の治療用タンパク質、例えば、第２の腫瘍抑制タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡ）を送達するステップを含む併用療法も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、第１の治療用タンパク質は、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＰＴＥＮ遺伝子によってコードされるタンパク質であるＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、第２の治療用タンパク質は、第２の腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質）である。一部の実施形態では、個体は、第１または第２の腫瘍抑制タンパク質に異常を有する。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、個体に送達される際に、同じ細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、個体に送達される際に、異なる細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび第２のｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと別々に複合体を形成している。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、改変されている（例えば、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）第１の腫瘍抑制タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ、およびｂ）第２の腫瘍抑制タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、第１の腫瘍抑制タンパク質および／または第２の腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、個体は、第１および／または第２の腫瘍抑制タンパク質に異常を有する。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号１５～４０（例えば、配列番号７７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号５３～７０（例えば、配列番号７９または８０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／または第２のｍＲＮＡ（例えば、ＴＰ５３をコードするｍＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎の第１のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡ（例えば、ＴＰ５３をコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡ（例えば、ＴＰ５３をコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、静脈内または皮下に投与される。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がんを処置する方法であって、個体に、ａ）ＰＴＥＮをコードする第１のｍＲＮＡ、およびｂ）ｐ５３をコードする第２のｍＲＮＡを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号１５～４０（例えば、配列番号７７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号５３～７０（例えば、配列番号７９または８０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎の第１のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡの用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよびまたは第２のｍＲＮＡは、静脈内または皮下に投与される。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）第１の細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している第１のｍＲＮＡを含む第１のｍＲＮＡ送達複合体であって、第１のｍＲＮＡがＰＴＥＮをコードする、第１のｍＲＮＡ送達複合体およびｂ）第２の細胞膜透過ペプチド（ｓｅｃｏｎｄ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｎｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）と複合体を形成している第２のｍＲＮＡを含む第２のｍＲＮＡ送達複合体であって、第２のｍＲＮＡがｐ５３をコードする、第２のｍＲＮＡ送達複合体を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、第１および／または第２の細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１および／または第２の細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、第１および／または第２の細胞膜透過ペプチドは、配列番号１５～４０（例えば、配列番号７７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１または第２の細胞膜透過ペプチドは、配列番号５３～７０（例えば、配列番号７９または８０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎の第１のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡの用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよびまたは第２のｍＲＮＡは、静脈内または皮下に投与される。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）ＰＴＥＮをコードする第１のｍＲＮＡ、ｂ）ｐ５３をコードする第２のｍＲＮＡ、およびｃ）細胞膜透過ペプチドを含むｍＲＮＡ送達複合体を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号１５～４０（例えば、配列番号７７）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、配列番号５３～７０（例えば、配列番号７９または８０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよび／または第２のｍＲＮＡは、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎の第１のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎の第２のｍＲＮＡの用量は、約０．００３ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約３０ｍｇ／ｍ２、約０．３ｍｇ／ｍ２～約３ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、第１のｍＲＮＡおよびまたは第２のｍＲＮＡは、静脈内または皮下に投与される。
Ｃ．ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と別の薬剤との併用療法
個体のがん（例えば、膵がん）を処置するための併用療法であって、個体に、ａ）本明細書に記載のｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ｂ）第２の薬剤を送達するステップを含む併用療法も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、第２の薬剤は、本明細書に記載のナノ粒子組成物を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン）を含む。一部の実施形態では、タキサンは、パクリタキセルである。一部の実施形態では、他の薬剤は、ｎａｂ－パクリタキセルである。一部の実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。一部の実施形態では、他の薬剤は、ｎａｂ－ラパマイシンである。一部の実施形態では、本方法は、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、改変されている（例えば、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、限定ではないが、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４またはＶＨＬを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制遺伝子は、ＰＢ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮおよびＴＰ５３から選択される。一部の実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、およびｂ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異型形態を標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１における変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳおよび／またはＧ１２Ｃ ＫＲＡＳを含む。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｂ）発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ならびにｃ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、限定ではないが、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４またはＶＨＬを含む。一部の実施形態では、腫瘍抑制遺伝子は、ＰＢ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＴＥＮおよびＴＰ５３から選択される。一部の実施形態では、がんは、乳がん、肺がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異型形態を標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１における変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳおよび／またはＧ１２Ｃ ＫＲＡＳを含む。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ならびにｂ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮまたはｐ５３である。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ならびにｂ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異型形態を標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１における変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳおよび／またはＧ１２Ｃ ＫＲＡＳを含む。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｂ）発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｃ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物を送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮまたはｐ５３である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異型形態を標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１における変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳおよび／またはＧ１２Ｃ ＫＲＡＳを含む。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｂ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物、ならびにｃ）有効量のゲムシタビンを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮまたはｐ５３である。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡの用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、個体のがん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｂ）発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ｃ）タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物、ならびにｄ）有効量のゲムシタビンを送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮまたはｐ５３である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの変異型形態を標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１における変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳおよび／またはＧ１２Ｃ ＫＲＡＳを含む。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含むナノ粒子は、２００ｎｍ以下の平均直径を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）で被覆されている。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の担体タンパク質（例えば、アルブミン）のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）に対する重量比は、約９：１またはそれ未満である。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１０ｍｇ／ｍ２～約５０ｍｇ／ｍ２である。
Ｄ．ｍＲＮＡ複合体／ナノ粒子の別の薬剤との併用療法
疾患または状態を処置する方法であって、ａ）本明細書に記載のｍＲＮＡおよび細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む複合体またはナノ粒子、ならびにｂ）別の薬剤を対象に送達するステップを含む方法も提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質、例えば、腫瘍抑制タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＰＴＥＮまたはｐ５３をコードする。一部の実施形態では、ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内在性遺伝子、例えば、疾患関連内在性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外来性遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、疾患関連内在性遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、他の薬剤は、本明細書に記載のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）および担体タンパク質（例えば、アルブミン）を含むナノ粒子組成物である。一部の実施形態では、他の薬剤は、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）をさらに含む。一部の実施形態では、他の薬剤は、ｎａｂ－パクリタキセルである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、改変されている（例えば、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）である）。
疾患または状態を処置する方法であって、ａ）本明細書に記載のｍＲＮＡ（例えば、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば、ＰＴＥＮまたはｐ５３をコードするｍＲＮＡ）および細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む複合体またはナノ粒子、ｂ）本明細書に記載のＲＮＡｉおよびＣＰＰを含む複合体またはナノ粒子を対象に送達するステップを含む方法も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ（例えば、発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患関連内在性遺伝子または外来性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ複合体またはナノ粒子と同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ複合体またはナノ粒子と併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ複合体またはナノ粒子は、ＲＮＡｉ複合体またはナノ粒子と逐次に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ複合体またはナノ粒子は、対象に複数回送達される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ複合体またはナノ粒子は、対象に複数回送達される。
一部の実施形態では、疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載のａ）ｍＲＮＡ、ｂ）ＲＮＡｉ、およびｃ）細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む複合体またはナノ粒子を対象に送達するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患関連内在性または外来性遺伝子を標的とする。
Ｅ．２つまたはそれよりも多いＲＮＡｉの併用療法
疾患または状態を処置する方法であって、２つまたはそれよりも多いＲＮＡｉ（例えば、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡ）を対象に送達するステップを含む方法も提供される。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、本明細書に記載の細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）と複合体を形成していた。一部の実施形態では、ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１つまたは複数の発癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの変異型形態を特異的に標的とし、ＫＲＡＳの変異型形態は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋから選択されるＫＲＡＳの異常を有する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡのカクテルを含む。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳの第１の変異型形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異型形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含む。例示的な２つまたはそれよりも多いｓｉＲＮＡは、これらに限定されないが、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＣおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ｃ）ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋの両方を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびにｄ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤおよびＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とするｓｉＲＮＡを含む。好ましい一実施形態では、第１のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とし、第２のｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする。一部の実施形態では、疾患または状態は、がんである。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。
一部の実施形態では、がん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、対象に、ａ）第１の遺伝子を標的とする第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）、ｂ）第２の遺伝子を標的とする第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）、およびｃ）細胞膜透過ペプチドを含むＲＮＡｉ送達複合体を送達するステップを含み、第１のＲＮＡｉおよび／または第２のＲＮＡｉが、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している、方法が提供される。一部の実施形態では、対象は、第１の遺伝子および／または第２の遺伝子における異常を含む。一部の実施形態では、第１の遺伝子および／または第２の遺伝子は、発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。
一部の実施形態では、がん（例えば、膵がん）を処置する方法であって、対象に、ａ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを標的とする第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）、ｂ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを標的とする第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）、およびｃ）細胞膜透過ペプチドを含むＲＮＡｉ送達複合体を送達するステップを含み、第１のＲＮＡｉおよび／または第２のＲＮＡｉが、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している、方法が提供される。一部の実施形態では、対象は、ＫＲＡＳにおける１つまたは複数の異常を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドまたはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ送達複合体は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを標的とする第３のＲＮＡｉ（例えば、第３のｓｉＲＮＡ）をさらに含む。
併用療法の投薬および投与方法
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ／ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、同時に投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ／ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、逐次に投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ／ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、併せて投与される。
ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤の投薬頻度は、投与担当の医師の判断に基づき、処置の経過にわたって調整することができる。別々に投与する場合、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤は、異なる投薬頻度または間隔で投与することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤の持続徐放製剤を使用することができる。徐放を達成するための様々な製剤およびデバイスが、当技術分野で公知である。本明細書に記載の投与構造の組合せを使用することもできる。
ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ送達複合体またはＲＮＡｉ送達複合体は、全身性または局所投与のために製剤化される。一部の実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡまたはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ送達複合体またはＲＮＡｉ送達複合体は、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内または経口投与のために製剤化される。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置のためのｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の投薬量は、投与毎に約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよび／またはｐ５３ ｍＲＮＡ）の例示的な投薬量は、個体における投与毎に約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．０４ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）の例示的な投薬量は、個体における投与毎に約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０４ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、ヒトまたは哺乳動物対象の処置のためのｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の投薬量は、投与毎に約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４０００ｍｇ／ｍ２の範囲内である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよび／またはｐ５３ ｍＲＮＡ）の例示的な投薬量は、個体における投与毎に約０．０１ｍｇ／ｍ２～約２０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．２ｍｇ／ｍ２～約２ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２～約１．５ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ）の例示的な投薬量は、個体における投与毎に約０．２ｍｇ／ｍ２～約２０ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２、例えば、約１ｍｇ／ｍ２～約２０ｍｇ／ｍ２、例えば、約１．５ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉの例示的な投薬頻度は、これらに限定されないが、中断なしで毎週；４週間のうちの３週間、毎週；３週間毎に１回；２週間毎に１回；３週間のうちの２週間、毎週を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、約２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、６週間毎に１回または８週間毎に１回投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、少なくとも１週間に約１回、２回、３回、４回、５回、６回または７回（すなわち、毎日）のうちのいずれかで投与される。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約６ヶ月間、３ヶ月間、１ヶ月間、２０日間、１５日間、１２日間、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間または１日間のうちのいずれか未満である。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間または１２ヶ月間のうちのいずれかより長い。一部の実施形態では、投薬スケジュールに中断はない。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１週間以下である。一部の実施形態では、個体へのｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の投与スケジュールは、処置全体を構成する単回投与から毎日投与に及ぶ。ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の投与は、長期間、例えば、約１ヶ月間から最長約７年間にわたって延長することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２または８４ヶ月間のうちのいずれかの期間にわたって投与される。
ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、タキサンおよび／または化学療法剤に要求される用量は、各薬剤が単独で投与される場合に通常要求される用量よりも低くてよい（ただし、必ずしもそうでなくてもよい）。よって、一部の実施形態では、治療量未満の量のｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤が投与される。「治療量未満の量」または「治療量未満のレベル」は、治療量より少ない、すなわち、ナノ粒子組成物中の薬物および／または他の薬剤が単独で投与される場合に通常使用される量未満の量を指す。低下は、所与の投与において投与される量および／または所与の期間（低下した頻度）にわたって投与される量に関して反映され得る。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、タキサン、および／または化学療法剤の両方の用量は、単独で投与される場合のそれぞれの対応する正常用量と比較して低下される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤は、治療量未満の、すなわち、低下したレベルで投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ナノ粒子組成物および／または化学療法剤の用量は、実質的に、確立された最大毒性用量（ＭＴＤ）より少ない。例えば、ナノ粒子組成物および／または他の薬剤の用量は、ＭＴＤの約５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満である。
本明細書に記載の投与構造の組合せを使用することができる。本明細書に記載の併用療法方法は、単独で、または化学療法、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、化学免疫療法、肝動脈に基づく治療法、寒冷療法、超音波療法、肝臓移植、局所的切除療法、高周波アブレーション療法、光線力学的療法などの別の治療法と併せて行うことができる。その上、がん（例えば、膵がん）発症リスクがより大きい患者は、疾患発症を阻害および／または遅延させるための処置を受けることができる。
ナノ粒子組成物
個体（例えば、ヒト）に投与されるナノ粒子組成物の用量は、特定の組成物、投与機序、および処置されている膵がんの型により変動し得る。一部の実施形態では、組成物の量
は、客観的応答（例えば、部分奏効、完全奏効または安定疾患）をもたらすのに有効である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の量は、個体における完全奏効をもたらすのに十分である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の量は、個体における部分奏効をもたらすのに十分である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物の量は、個体における安定疾患（すなわち、膵がん）をもたらすのに十分である。一部の実施形態では、投与されるナノ粒子組成物の量（例えば、単独で投与される場合の）は、ナノ粒子組成物で処置した個体の集団の間で、約２５％、３０％、３２％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、６０％、６５％または７０％のうちのいずれかを超える奏効率をもたらすのに十分である。本明細書に記載の方法の処置に対する個体の応答は、例えば、ＲＥＣＩＳＴレベルに基づき決定することができる。
一部の実施形態では、組成物の量は、個体の無進行生存期間の延長に十分である。一部の実施形態では、組成物の量は、個体の全生存期間の延長に十分である。一部の実施形態では、組成物の量（例えば、単独で（ａｌｏｎｇ）投与される場合の）は、ナノ粒子組成物で処置した個体の集団の間で、約２５％、３０％、３２％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、６０％、６５％または７０％のうちのいずれかを超える臨床利益をもたらすのに十分である。
一部の実施形態では、組成物、第１の治療法、第２の治療法または併用療法の量は、処置に先立つ同じ対象における対応する腫瘍サイズ、膵がん細胞数もしくは腫瘍成長速度と比較して、または処置を受けていない他の対象における対応する活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のうちのいずれかだけ、腫瘍のサイズを減少させる、がん細胞数を減少させる、または腫瘍の成長速度を減少させるのに十分な量である。精製された酵素によるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞に基づくアッセイ、動物モデルまたはヒト検査など、標準方法を使用して、この効果の大きさを測定することができる。
一部の実施形態では、組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の量は、個体に組成物が投与される場合、毒性学的効果（すなわち、毒性の臨床上許容されるレベルを上回る効果）を誘導するレベルを下回る、または潜在的副作用が制御されるもしくは耐容性を示すことができるレベルである。
一部の実施形態では、組成物の量は、同じ投薬レジームに従った組成物の最大耐用量（ＭＴＤ）に近い。一部の実施形態では、組成物の量は、ＭＴＤの約８０％、９０％、９５％または９８％のうちのいずれかより多い。
ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の例示的な有効量は、これに限定されないが、投与毎に約１ｍｇ／ｍ２～１５０ｍｇ／ｍ２のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）を含む。
ナノ粒子組成物の投与のための例示的な投薬頻度は、これらに限定されないが、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、中断なしで毎週、４週間のうちの３週間、３週間毎に１回、２週間毎に１回、または３週間のうちの２週間を含む。一部の実施形態では、組成物は、約２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、６週間毎に１回、または８週間毎に１回投与される。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１週間に約１回（Ｉｘ）、２回、３回、４回、５回、６回または７回（すなわち、毎日）のうちのいずれかで投与される。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約６ヶ月間、３ヶ月間、１ヶ月間、２８日間、２０日間、１５日間、１４日間、１３日間、１２日間、１１日間、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間または１日間のうちのいずれか未満である。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、８ヶ月間または１２ヶ月間のうちのいずれかより長い。一部の実施形態では、投薬スケジュールに中断はない。一部の実施形態では、各投与間の間隔は、約１週間以下である。
一部の実施形態では、投薬頻度は、２日毎に１回を、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回および１１回である。一部の実施形態では、投薬頻度は、２日毎に１回を５回である。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、少なくとも１０日間の期間にわたって投与され、各投与間の間隔は、約２日間以下であり、各投与におけるタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。
一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、２８日間サイクルの１、８および１５日目に投与され、各投与におけるタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、タキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）は、２８日間サイクルの１、８および１５日目に３０分間にわたって静脈内に投与され、各投与におけるタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の用量は、約１ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、タキサンは、パクリタキセルである。
組成物の投与は、長期間、例えば、約１ヶ月間から最大約７年間にわたって延長することができる。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、３６、４８、６０、７２または８４ヶ月間のうちのいずれかの期間にわたって投与される。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）またはｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）の投薬量は、週間スケジュールで与えた場合、５～１５０ｍｇ／ｍ２の範囲内（８０～１５０ｍｇ／ｍ２、例えば、１００～１２０ｍｇ／ｍ２など）とすることができる。
ナノ粒子組成物（例えば、パクリタキセル／アルブミンナノ粒子組成物）の投与のための他の例示的な投薬スケジュールは、これらに限定されないが、１００ｍｇ／ｍ２、中断なしで毎週；７５ｍｇ／ｍ２、４週間のうちの３週間、毎週；１００ｍｇ／ｍ２、４週間のうちの３週間、毎週；１２５ｍｇ／ｍ２、４週間のうちの３週間、毎週；１２５ｍｇ／ｍ２、３週間のうちの２週間、毎週；１３０ｍｇ／ｍ２、中断なしで毎週；および２０～１５０ｍｇ／ｍ２、１週間に２回を含む。組成物の投薬頻度は、投与担当の医師の判断に基づき、処置の経過にわたって調整することができる。
一部の実施形態では、個体は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０処置サイクルのうちのいずれかにおいて処置される。
本明細書に記載の組成物は、約２４時間よりも短い注入時間にわたる個体への組成物の注入を可能にする。例えば、一部の実施形態では、組成物は、約２４時間、１２時間、８時間、５時間、３時間、２時間、１時間、３０分間、２０分間または１０分間のうちのいずれか未満の注入期間にわたって投与される。一部の実施形態では、組成物は、約３０分間の注入期間にわたって投与される。
ナノ粒子組成物中のタキサン（一部の実施形態では、パクリタキセル）の他の例示的な用量は、これらに限定されないが、約５０ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２および１５０ｍｇ／ｍ２のいずれかを含む。例えば、ナノ粒子組成物中のパクリタキセルの投薬量は、週間スケジュールで与えた場合、約５０～１５０ｍｇ／ｍ２の範囲内とすることができる。
ナノ粒子組成物は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経粘膜および経皮を含む様々な経路により個体（例えば、ヒト）に投与することができる。一部の実施形態では、組成物の持続徐放製剤を使用することができる。一部の実施形態では、組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、組成物は、動脈内に投与される。一部の実施形態では、組成物は、腹腔内に投与される。
化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）
本明細書に記載の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内または経皮を含む非経口などの、様々な経路により個体（例えば、ヒト）に投与することができる。一部の実施形態では、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、静脈内に投与される。
化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の投薬頻度は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはナノ粒子組成物の投薬頻度と同じであっても異なっていてもよい。例示的な頻度は、上に提示されている。さらに別の例として、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、１日に３回、１日に２回、毎日１回、１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、毎週１回投与することができる。一部の実施形態では、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、毎日２回または毎日３回投与される。化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の例示的な量は、これらに限定されないが、次の範囲：約０．５～約５ｍｇ、約５～約１０ｍｇ、約１０～約１５ｍｇ、約１５～約２０ｍｇ、約２０～約２５ｍｇ、約２０～約５０ｍｇ、約２５～約５０ｍｇ、約５０～約７５ｍｇ、約５０～約１００ｍｇ、約７５～約１００ｍｇ、約１００～約１２５ｍｇ、約１２５～約１５０ｍｇ、約１５０～約１７５ｍｇ、約１７５～約２００ｍｇ、約２００～約２２５ｍｇ、約２２５～約２５０ｍｇ、約２５０～約３００ｍｇ、約３００～約３５０ｍｇ、約３５０～約４００ｍｇ、約４００～約４５０ｍｇ、または約４５０～約５００ｍｇのうちのいずれかを含む。例えば、化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）の用量で投与することができる。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約４５ｍｇ／ｍ２～約３５０ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約８０ｍｇ／ｍ２～約３５０ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約８０ｍｇ／ｍ２～約３００ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約１５０ｍｇ／ｍ２～約３５０ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約８０ｍｇ／ｍ２～約１５０ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）の有効量は、約１００ｍｇ／ｍ２である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約１７０ｍｇ／ｍ２～約２００ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサンの有効量は、約２００ｍｇ／ｍ２～約３５０ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ～約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇを含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）の有効量は、約２６０ｍｇ／ｍ２である。上述の方法のいずれかの一部の実施形態では、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約２０～３０ｍｇ／ｋｇ、約３０～４０ｍｇ／ｋｇ、約４０～５０ｍｇ／ｋｇ、約５０～６０ｍｇ／ｋｇ、約６０～７０ｍｇ／ｋｇ、約７０～８０ｍｇ／ｋｇ、約８０～１００ｍｇ／ｋｇまたは約１００～１２０ｍｇ／ｋｇである。
一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）の有効量は、約３０～約３００ｍｇ／ｍ２の間であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１００～約５０００ｍｇ／ｍ２の間である。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中のタキサン（例えば、パクリタキセル）の有効量は、約３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００ｍｇ／ｍ２のうちのいずれかであり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０または５０００ｍｇ／ｍ２のうちのいずれかである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約３０～約３００ｍｇ／ｍ２であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１００～約５０００ｍｇ／ｍ２であり、ナノ粒子組成物および他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は両者共に、膵がんに関して以前に処置された個体に毎週投与される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約３０～約３００ｍｇ／ｍ２であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１００～約５０００ｍｇ／ｍ２であり、ナノ粒子組成物および他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は両者共に、膵がんに関して以前に処置された個体に１週１回未満の頻度で投与される。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約３０～約３００ｍｇ／ｍ２であり、他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）の有効量は、約１００～約５０００ｍｇ／ｍ２であり、ナノ粒子組成物および他の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）は両者共に、個体に２８日間サイクルの１、８および１５日目に３０分間にわたって静脈内に投与される。
バイオマーカーの存在に基づく処置方法
本発明は、一態様では、個体の疾患または状態を処置する方法であって、１つまたは複数の異常の状態に基づき、個体に、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応する遺伝子および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に存在する。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応するタンパク質および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に対応するタンパク質に存在する。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、個体に、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップを含み、個体が、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子における異常を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子の異常を査定するステップと、ｂ）個体に、ｉ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｂ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子の異常を査定するステップと、ｂ）個体に、ｉ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｉｉ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップとを含み、個体が、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子に異常を有することに基づく処置のために選択される、方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子に異常を有する個体に基づく処置のための個体を選択する（例えば、同定または推奨する）ステップと、ｂ）個体に、ｉ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｉｉ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、個体のがんを処置する方法であって、ａ）腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子の異常を査定するステップと、ｂ）腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子に異常を有する個体に基づく処置のための個体を選択する（例えば、同定または推奨する）ステップと、ｃ）個体に、ｉ）腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、およびｉｉ）発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを送達するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される。一部の実施形態では、がんは、膵がんである。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ＰＴＥＮである。一部の実施形態では、発癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、個体は、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および発癌遺伝子に異常を有する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、同時に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、併せて送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、静脈内に送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡは、個体に送達される際に、細胞膜透過ペプチドと複合体を形成している。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０３ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０４ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０５ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０６ペプチドと交換可能に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書でＡＤＧＮ－１０９ペプチドと交換可能に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞膜透過ペプチドは、ＡＤＧＮ１０６ペプチドおよびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）および／またはｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）は、約１週間に１回または約５日毎に１回送達される。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮをコードするｍＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体における投与毎のｓｉＲＮＡ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ）の用量は、約０．０３ｍｇ／ｍ２～約４００ｍｇ／ｍ２（例えば、約０．４ｍｇ／ｍ２～約４０ｍｇ／ｍ２、約０．８ｍｇ／ｍ２～約４ｍｇ／ｍ２）である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
一部の実施形態では、がんなどの疾患または状態を有する個体が、異常を有する個体に基づく処置に応答する可能性があるか、またはこれに適するかに関する査定を援助する方法であって、処置が、個体に、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達するステップを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応する遺伝子および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に存在する。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応するタンパク質および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に対応するタンパク質に存在する。一部の実施形態では、異常の存在は、個体が、処置に対し応答性である可能性があることを示し、異常の非存在は、個体が、処置に応答する可能性が低いことを示す。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＰＴＥＮまたはｐ５３）をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とする。
一部の実施形態では、処置に応答する可能性がある疾患または状態（例えば、がん）を有する個体を同定する方法であって、ａ）個体が異常を有することに基づいて個体を同定するステップと、ｂ）個体に、ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を送達するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応する遺伝子および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に存在する。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応するタンパク質および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に対応するタンパク質に存在する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＰＴＥＮまたはｐ５３）をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とする。
ｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を受けている疾患または状態（例えば、がん）を有する個体の治療処置を調整する方法であって、異常を査定するステップと、異常の状態に基づき治療処置を調整するステップとを含む方法も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応する遺伝子および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に存在する。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応するタンパク質および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に対応するタンパク質に存在する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＰＴＥＮまたはｐ５３）をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とする。
個体集団の疾患または障害における使用のためのｍＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む治療をマーケティングする方法であって、異常を有する試料を有するかかる集団の個体によって特徴付けられた個体集団を処置するための治療法の使用について、ターゲットオーディエンスに通知するステップを含む方法も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応する遺伝子および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に存在する。一部の実施形態では、異常は、ｍＲＮＡに対応するタンパク質および／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子に対応するタンパク質に存在する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ＰＴＥＮまたはｐ５３）をコードする。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、発癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とする。
「異常」は、ｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによって標的とされる遺伝子（例えば、発癌遺伝子）に対応するタンパク質の異常な発現および／または活性をもたらし得る、ｍＲＮＡに対応する遺伝子および／またはｓｉＲＮＡによって標的とされる遺伝子の遺伝的異常、異常な発現レベルおよび／または異常な活性レベルを指す。一部の実施形態では、異常を有するタンパク質は、参照活性レベルまたは参照活性範囲の中央値を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％もしくはそれよりも多く上回るまたは下回る値のうちのいずれかなど、参照活性レベルまたは範囲を上回るまたは下回るレベルまで増加または減少した、タンパク質またはタンパク質が関与するシグナル伝達経路の発現／活性を有する。一部の実施形態では、参照活性レベルは、標準化検査において臨床的に受け入れられる正常活性レベル、あるいは異常がない健康個体（または個体から単離された組織もしくは細胞）における活性レベルである。
異常の「状態」は、遺伝子における異常または異常なレベル（タンパク質のリン酸化レベルを含む、発現もしくは活性レベル）の存在または非存在を指すことができる。一部の実施形態では、対照と比較して遺伝子における遺伝的異常（例えば、変異またはコピー数変異）の存在は、（ａ）個体が、処置に応答する可能性がより高い、または（ｂ）個体が、処置に選択されることを示す。一部の実施形態では、対照と比較してｍＲＮＡに対応する遺伝子またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子における遺伝的異常の非存在は、（ａ）個体が、処置に応答する可能性が低い、または（ｂ）個体が、処置に選択されないことを示す。一部の実施形態では、送達されるまたは送達されるべきｍＲＮＡに対応する遺伝子またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子の異常なレベル（例えば、タンパク質のリン酸化レベルを含む、発現レベルもしくは活性レベル）は、個体が処置に応答する見込み（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）に相関する。例えば、送達されるまたは送達されるべきｍＲＮＡに対応する遺伝子またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子のレベル（例えば、タンパク質のリン酸化レベルを含む、発現レベルもしくは活性レベル）のより大きい偏差は、個体が、処置に応答する可能性がより高いことを示す。一部の実施形態では、送達されるまたは送達されるべきｍＲＮＡに対応する遺伝子またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子のレベル（複数可）（例えば、タンパク質のリン酸化レベルを含む、発現レベルもしくは活性レベル）に基づく予測モデルは、（ａ）個体が処置に応答する見込み、および（ｂ）処置に個体を選択するかどうかの予測に使用される。例えば、レベル毎の係数を含む予測モデルは、臨床試験データを使用した回帰解析などの統計解析によって得ることができる。
送達されるもしくは送達されるべきｍＲＮＡに対応するもしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルおよび／もしくは活性レベル、ならびに／または送達されるもしくは送達されるべきｍＲＮＡに対応する遺伝子もしくはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子の存在もしくは非存在は、次のうちのいずれかの決定に有用となり得る：（ａ）処置（複数可）を初期に受けることに対して個体がほぼ確実にまたはおそらく適切、（ｂ）処置（複数可）を初期に受けることに対して個体がほぼ確実にまたはおそらく不適切、（ｃ）処置に対して応答性であること、（ｄ）処置（複数可）を受け続けることに対して個体がほぼ確実にまたはおそらく適切、Ｉ 処置（複数可）を受け続けることに対して個体がほぼ確実にまたはおそらく不適切、（ｆ）投薬量を調整すること、（ｇ）臨床利益の見込みを予測すること。
本明細書で使用される場合、「に基づく」は、本明細書に記載の個体の特徴を査定、決定または測定すること（および好ましくは、処置を受けるのに適した個体を選択すること）を含む。異常の状態が、本明細書に記載の処置方法を選択、査定、測定または決定するための「基礎として使用される」場合、送達されるまたは送達されるべきｍＲＮＡに対応する遺伝子またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子における異常は、処置の前および／またはその間に決定され、得られた状態（異常の存在、非存在、発現レベルおよび／または活性レベルを含む）は、臨床医によって、次のうちのいずれかの査定に使用される：（ａ）処置（複数可）を初期に受けることに対して個体がほぼ確実にもしくはおそらく適切、（ｂ）処置（複数可）を初期に受けることに対して個体がほぼ確実にもしくはおそらく不適切、（ｃ）処置に対して応答性であること、（ｄ）処置（複数可）を受け続けることに対して個体がほぼ確実にもしくはおそらく適切、Ｉ 処置（複数可）を受け続けることに対して個体がほぼ確実にもしくはおそらく不適切、（ｆ）投薬量を調整すること、または（ｇ）臨床利益の見込みを予測すること。
個体の異常は、個体由来の試料を解析することにより査定または決定することができる。査定は、新鮮組織試料またはアーカイブ組織試料に基づくことができる。適した試料は、これらに限定されないが、がん組織、がん組織に隣接した正常組織、がん組織から遠位の正常組織、または末梢血リンパ球を含む。一部の実施形態では、試料は、がん細胞の細針吸引または腹腔鏡検査により得られるがん細胞など、がん細胞を含有する生検である。一部の実施形態では、生検細胞は、解析に先立ち、遠心分離してペレットにされ、固定され、パラフィンに包埋される。一部の実施形態では、生検細胞は、解析に先立ち、瞬間（ｆｌａｓｈ）凍結される。一部の実施形態では、試料は、血漿試料である。
一部の実施形態では、試料は、循環転移性がん細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を選別することによって得られる。一部のさらなる実施形態では、ＣＴＣは、原発性腫瘍から脱離しており、体液中を循環する。一部のさらなる実施形態では、ＣＴＣは、原発性腫瘍から脱離しており、血流中を循環する。一部の実施形態では、ＣＴＣは、転移の指標である。
異常は、処置の開始前に、処置中のいずれかの時点で、および／または処置の終わりに査定することができる。
Ｉ．異常
候補の異常は、種々の方法により、例えば、文献検索によって、または遺伝子発現プロファイリング実験（例えば、ＲＮＡ配列決定もしくはマイクロアレイ実験）、定量的プロテオミクス実験および遺伝子配列決定実験を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の実験方法によって、同定することができる。例えば、対照試料と比較してがんを有する個体から採取された試料において行われた、遺伝子発現プロファイリング実験および定量的プロテオミクス実験は、異常なレベルで存在する遺伝子ならびに遺伝子産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質およびリン酸化タンパク質）のリストを提供することができる。一部の事例では、対照試料と比較してがんを有する個体から採取された試料において行われた、遺伝子配列決定（例えば、エクソーム配列決定）実験は、遺伝的異常のリストを提供することができる。統計的関連研究（例えば、ゲノムワイド関連研究）を、がんを有する個体の集団から採取された実験データにおいて行って、実験において同定された異常（例えば、異常なレベルまたは遺伝的異常）をがんに関連付けることができる。一部の実施形態では、標的化された配列決定実験（例えば、ＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査）が行われて、がんを有する個体の遺伝的異常のリストを提供する。
ＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査を使用して、試料（例えば、腫瘍生検または血液試料）の様々な供給源由来のＤＮＡにおける体細胞変異、コピー数変異および構造再配列を含む遺伝的異常の検出のために、がん関連遺伝子のエクソンＤＮＡ配列およびイントロン領域を調査し、これにより、遺伝的異常の候補リストを提供することができる。一部の実施形態では、遺伝子異常は、ＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査（ＣＬＩＡ認定）から選択される遺伝子における遺伝的異常または異常なレベル（例えば、発現レベルもしくは活性レベル）である。例えば、Ｗａｇｌｅ Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２．１ （２０１２）： ８２－９３を参照されたい。
ＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査の例示的なバージョンは、３００種のがん遺伝子、および３５種の遺伝子にわたる１１３種のイントロンを含む。例示的なＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査に含まれる３００種の遺伝子を次に示す：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＬＯＸ１２Ｂ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＭ、ＡＴＲＸ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＡＸＬ、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ６、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＵＢ１Ｂ、ＣＡＤＭ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ２７４、ＣＤ５８、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ２、ＣＩＩＴＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＴＣ１、ＣＲＴＣ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＴＮＮＢ１、ＣＵＸ１、ＣＹＬＤ、ＤＤＢ２、ＤＤＲ２、ＤＥＰＤＣ５、ＤＩＣＥＲ１、ＤＩＳ３、ＤＭＤ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＰ３００、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ７、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＳＲ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＦＡＭ４６Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＨ、ＦＫＢＰ９、ＦＬＣＮ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＵＳ、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＮＢ２Ｌ１、ＧＰＣ３、ＧＳＴＭ５、Ｈ３Ｆ３Ａ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＫＺＦ１、ＩＫＺＦ３、ＩＮＳＩＧ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＣＮＩＰ１、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＭ６Ｂ、ＫＤＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＩＮＣ００８９４、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＭＯ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰＫ１、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ（ＫＭＴ２Ａ）、ＭＬＬ２（ＫＴＭ２Ｄ）、ＭＰＬ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１（ＭＹＣＬ）、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＮＢＮ、ＮＥＧＲ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＫＢＩＡ、ＮＦＫＢＩＺ、ＮＫＸ２－１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＰＲＬ２、ＮＰＲＬ３、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＸ５、ＰＢＲＭ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＲＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＩ、ＰＲＫＣＺ、ＰＲＫＤＣ、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＲＰＦ８、ＰＳＭＤ１３、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＫ２、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＱＫＩ、ＲＡＤ２１、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＬ２、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＦＷＤ２、ＲＨＥＢ、ＲＨＰＮ２、ＲＯＳ１、ＲＰＬ２６、ＲＵＮＸ１、ＳＢＤＳ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＡＦ２、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ２、ＳＦ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＣ３、ＳＭＯ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＱＳＴＭ１、ＳＲＣ、ＳＲＳＦ２、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ６、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＴＥＴ２、ＴＬＲ４、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、Ｕ２ＡＦ１、ＶＨＬ、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＺＮＦ２１７、ＺＮＦ７０８、ＺＲＳＲ２。例示的なＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査において調査されるイントロン領域は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＲＡＦ、ＣＩＩＴＡ、ＥＧＦＲ、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＷＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＵＳ、ＩＧＨ、ＩＧＬ、ＪＡＫ２、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＰＭ１、ＮＴＲＫ１、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＰＡＲＧ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＳ１８、ＴＲＡ、ＴＲＢ、ＴＲＧ、ＴＭＰＲＳＳ２の特異的イントロンにタイル表示されている。上に収載の遺伝子およびイントロン領域を含むがこれらに限定されない、ＯＮＣＯＰＡＮＥＬ（商標）検査のいずれかの実施形態またはバージョンに含まれる遺伝子のうちのいずれかの異常（例えば、遺伝的異常および異常なレベル）が、上述のがん遺伝子をコードするｍＲＮＡおよび／または上述のがん遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡによる処置に対して個体を選択するための基礎として機能することが、本願によって企図される。
ＩＩ．遺伝的異常
個体に送達されるまたは送達されるべきｍＲＮＡに対応するおよび／またはＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって標的とされる遺伝子（複数可）の遺伝的異常は、遺伝子（複数可）のコード、非コード、調節性、エンハンサー、サイレンサー、プロモーター、イントロン、エクソンおよび非翻訳領域を含むがこれらに限定されない、遺伝子に関連する核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくはタンパク質配列（すなわち、変異）またはエピジェネティックフィーチャに対する変化を含むことができる。
遺伝的異常は、生殖系列変異（染色体再配列を含む）または体細胞変異（染色体再配列を含む）であってもよい。一部の実施形態では、遺伝的異常は、個体の正常組織およびがん組織を含む全組織に存在する。一部の実施形態では、遺伝的異常は、個体のがん組織のみに存在する。一部の実施形態では、遺伝的異常は、がん組織の部分のみに存在する。
一部の実施形態では、異常は、欠失、フレームシフト、挿入、インデル、ミスセンス変異、ナンセンス変異、点変異、一塩基変異（ＳＮＶ）、サイレント変異、スプライス部位変異、スプライスバリアントおよび転座を含むがこれらに限定されない、遺伝子の変異を含む。一部の実施形態では、変異は、シグナル伝達経路の負の調節因子の機能喪失型変異であっても、遺伝子が関与するシグナル伝達経路の正の調節因子の機能獲得型変異であってもよい。
一部の実施形態では、遺伝的異常は、遺伝子のコピー数変異を含む。例えば、正常であれば、ゲノム当たりＮコピーの遺伝子が存在する。一部の実施形態では、遺伝子のコピー数は、遺伝的異常によって増幅され、ゲノムにおける遺伝子の少なくとも約２、３、４、５、６、７、８またはそれよりも多くのコピーのうちのいずれかをもたらす。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、ゲノムにおける数コピーの遺伝子の喪失をもたらす。一部の実施形態では、遺伝子のコピー数変異は、遺伝子の欠失である。一部の実施形態では、遺伝子のコピー数変異は、染色体またはその断片の欠失、重複、反転および転座を含む、ゲノムの構造再配列によって引き起こされる。
一部の実施形態では、遺伝的異常は、ＤＮＡメチル化、ヒドロキシメチル化、異常なヒストン結合、クロマチンリモデリングなどを含むがこれらに限定されない、遺伝子に関連する異常なエピジェネティックフィーチャを含む。一部の実施形態では、遺伝子のプロモーターは、例えば、対照レベル（例えば、標準化検査における臨床的に受け入れられる正常レベル）と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも多くのうちのいずれかだけ、個体において過剰メチル化されている。
一部の実施形態では、上述の遺伝子のうちのいずれか１種に遺伝的異常（例えば、変異またはコピー数変異）が存在する。
遺伝性がんおよび孤発性がんを含む様々なヒトがんにおいて、遺伝子における遺伝的異常が同定されている。例えば、ＴＳＣ１／２における生殖系列不活性化変異は、結節性硬化症を引き起こし、この状態を有する患者は、皮膚および脳過誤腫、腎血管筋脂肪腫、ならびに腎細胞癌（ＲＣＣ）を含む病変を呈する（Ｋｒｙｍｓｋａｙａ ＶＰ ｅｔ ａｌ． ２０１１ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ２５（６）： １９２２－１９３３）。ＰＴＥＮ過誤腫腫瘍症候群（ＰＨＴＳ）は、不活性化生殖系列ＰＴＥＮ変異に連鎖され、乳がん、子宮内膜がん、濾胞性甲状腺がん、過誤腫およびＲＣＣを含む臨床所見スペクトルに関連する（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００３ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ３５（３ Ｓｕｐｐｌ）： １５１Ｓ－１５３Ｓ）。加えて、孤発性腎臓がんも、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路におけるいくつかの遺伝子（例えば、ＡＫＴ１、ＭＴＯＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＨＥＢ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２）に体細胞変異を有することが示されている（Ｐｏｗｅｒ ＬＡ， １９９０ Ａｍ． Ｊ． Ｈｏｓｐ． Ｐｈａｒｍ． ４７５．５： １０３３－１０４９；Ｂａｄｅｓｃｈ ＤＢ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｃｈｅｓｔ １３７（２）： ３７６－３８７ｌ；Ｋｉｍ ＪＣ ＆ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ ＧＤ， ２００１， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｕｒｏｌｏｇｙ， １６５（３）： ７４５－７５６；ＭｃＫｉｅｒｎａｎ
Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２０１０， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １８３（Ｓｕｐｐｌ ４））。一部の遺伝子における例示的な遺伝的異常については後述し、本願が、本明細書に記載の例示的な遺伝的異常に限定されないことが理解される。
一部の実施形態では、異常は、ＰＴＥＮにおける遺伝的異常を含む。一部の実施形態では、遺伝的異常は、ゲノムにおけるＰＴＥＮの欠失を含む。一部の実施形態では、遺伝的異常は、ＰＴＥＮにおける機能喪失型変異を含む。一部の実施形態では、機能喪失型変異は、ミスセンス変異、ナンセンス変異またはフレームシフト変異を含む。一部の実施形態では、変異は、Ｋ１２５Ｅ、Ｋ１２５Ｘ、Ｅ１５０Ｑ、Ｄ１５３Ｙ、Ｄ１５３Ｎ、Ｋ６２Ｒ、Ｙ６５Ｃ、Ｖ２１７ＡおよびＮ３２３Ｋからなる群から選択されるＰＴＥＮにおける位置に含まれる。一部の実施形態では、遺伝的異常は、ＰＴＥＮ遺伝子座にヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）を含む。
一部の実施形態では、異常は、ＴＰ５３における遺伝的異常を含む。一部の実施形態では、遺伝的異常は、ＴＰ５３における機能喪失型変異を含む。一部の実施形態では、機能喪失型変異は、Ａ３９ｆｓ＊５など、ＴＰ５３におけるフレームシフト変異である。
一部の実施形態では、異常は、ＡＫＴにおける遺伝的異常を含む。一部の実施形態では、遺伝的異常は、ＡＫＴにおける機能喪失型変異を含む。一部の実施形態では、機能喪失型変異は、ＡＫＴにおけるフレームシフト変異である。
一部の実施形態では、異常は、ＫＲＡＳにおける遺伝的異常を含む。一部の実施形態では、遺伝的異常は、ＫＲＡＳにおける機能喪失型変異を含む。一部の実施形態では、機能喪失型変異は、ＫＲＡＳにおけるフレームシフト変異である。
遺伝子の遺伝的異常は、個体由来の試料および／または参照試料など、試料に基づき査定することができる。一部の実施形態では、試料は、組織試料、または組織試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、細胞試料（例えば、ＣＴＣ試料）、または細胞試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍生検である。一部の実施形態では、試料は、腫瘍試料、または腫瘍試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、生検試料、または生検試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料、またはＦＦＰＥ試料から抽出された核酸である。一部の実施形態では、試料は、血液試料である。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、血液試料から単離される。一部の実施形態では、生体試料は、血漿試料、または血漿試料から抽出された核酸である。
遺伝子の遺伝的異常は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって決定することができる。例えば、Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ２０１３， １３２（７）： １７１１－１７１７；Ｗａｇｌｅ Ｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ２０１４， ４：５４６－５５３；およびＣａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１３， ４９９： ４３－４９を参照されたい。例示的な方法としては、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ配列決定、亜硫酸水素塩配列決定、またはサンガー配列決定もしくは次世代配列決定プラットフォームを使用した他のＤＮＡ配列決定に基づく方法、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、およびＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。個体から単離された試料由来の１つまたは複数の遺伝子のエピジェネティックフィーチャ（例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストン結合またはクロマチン修飾）は、対照試料由来の１つまたは複数の遺伝子のエピジェネティックフィーチャと比較することができる。試料から抽出された核酸分子は、ＴＰ５３、ＫＲＡＳ、ＡＫＴおよびＰＴＥＮの野生型配列など、参照配列と比べた遺伝的異常の存在に関して配列決定または解析することができる。
一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、無細胞ＤＮＡ配列決定方法を使用して査定される。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、次世代配列決定を使用して査定される。一部の実施形態では、血液試料から単離された遺伝子の遺伝的異常は、次世代配列決定を使用して査定される。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、エクソーム配列決定を使用して査定される。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析を使用して査定される。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、本明細書に記載の処置方法の開始前に査定される。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、本明細書に記載の処置方法の開始後に査定される。一部の実施形態では、遺伝子の遺伝的異常は、本明細書に記載の処置方法の開始前および後に査定される。遺伝子の異常なレベルは、異常な発現レベルまたは異常な活性レベルを指すことができる。
ＩＩＩ．異常なレベル
遺伝子の異常な発現レベルは、対照レベルと比較した、遺伝子によってコードされる分子のレベルの増加または減少を含む。遺伝子によってコードされる分子は、ＲＮＡ転写物（複数可）（例えば、ｍＲＮＡ）、タンパク質アイソフォーム（複数可）、タンパク質アイソフォーム（複数可）のリン酸化および／もしくは脱リン酸化状況、タンパク質アイソフォーム（複数可）のユビキチン化および／もしくは脱ユビキチン化状況、タンパク質アイソフォーム（複数可）の膜局在化（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化など）状況、タンパク質アイソフォーム（複数可）の他の翻訳後修飾状況、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。
遺伝子の異常な活性レベルは、下流標的遺伝子のエピジェネティック調節、転写調節、翻訳調節、翻訳後調節またはこれらのいずれかの組合せを含む、遺伝子のいずれかの下流標的遺伝子によってコードされる分子の増強または抑制を含む。その上、遺伝子の活性は、タンパク質合成、細胞成長、増殖、シグナル伝達、ミトコンドリア代謝、ミトコンドリア新生、ストレス応答、細胞周期停止、オートファジー、微小管組織化および脂質代謝を含むがこれらに限定されない、異常に応答した下流の細胞および／または生理学的効果を含む。
一部の実施形態では、異常（例えば、異常な発現レベル）は、異常なタンパク質リン酸化レベルを含む。一部の実施形態では、異常なリン酸化レベルは、ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳ、ＡＫＴおよびＴＰ５３からなる群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質に存在する。遺伝子の例示的なリン酸化種は、関連するバイオマーカーとして機能することができる。一部の実施形態では、個体におけるタンパク質がリン酸化されている場合、個体は、処置のために選択される。一部の実施形態では、個体におけるタンパク質がリン酸化されていない場合、個体は、処置のために選択される。一部の実施形態では、タンパク質のリン酸化状態は、免疫組織化学的検査によって決定される。
個体の遺伝子のレベル（例えば、発現レベルおよび／または活性レベル）は、試料（例えば、個体由来の試料または参照試料）に基づき決定することができる。一部の実施形態では、試料は、組織、器官、細胞または腫瘍に由来する。一部の実施形態では、試料は、生体試料である。一部の実施形態では、生体試料は、生体液試料または生体組織試料である。さらなる実施形態では、生体液試料は、体液である。一部の実施形態では、試料は、がん組織、前記がん組織に隣接する正常組織、前記がん組織から遠位の正常組織、血液試料または他の生体試料である。一部の実施形態では、試料は、固定された試料である。固定された試料は、これらに限定されないが、ホルマリン固定された試料、パラフィン包埋された試料、または凍結された試料を含む。一部の実施形態では、試料は、がん細胞を含有する生検である。さらなる実施形態では、生検は、がん細胞の細針吸引である。さらなる実施形態では、生検は、腹腔鏡検査により得られるがん細胞である。一部の実施形態では、生検細胞は、遠心分離してペレットにされ、固定され、パラフィンに包埋される。一部の実施形態では、生検細胞は、瞬間凍結される。一部の実施形態では、生検細胞は、遺伝子によってコードされる分子を認識する抗体と混合される。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、下流標的遺伝子のエピジェネティック調節、転写調節、翻訳調節、翻訳後調節またはこれらのいずれかの組合せを含む、遺伝子のいずれかの下流標的遺伝子によってコードされる分子の増強または抑制を含む。その上、遺伝子の活性は、タンパク質合成、細胞成長、増殖、シグナル伝達、ミトコンドリア代謝、ミトコンドリア新生、ストレス応答、細胞周期停止、オートファジー、微小管組織化および脂質代謝を含むがこれらに限定されない、異常に応答した下流の細胞および／または生理学的効果を含む。
一部の実施形態では、試料は、循環転移性がん細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、血液から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を選別することによって得られる。さらなる実施形態では、ＣＴＣは、原発性腫瘍から脱離しており、体液中を循環する。またさらなる実施形態では、ＣＴＣは、原発性腫瘍から脱離しており、血流中を循環する。さらなる実施形態では、ＣＴＣは、転移の指標である。
一部の実施形態では、遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルが決定されて、遺伝子の異常な発現レベルを査定する。一部の実施形態では、遺伝子の下流標的遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルが決定されて、遺伝子の異常な活性レベルを査定する。一部の実施形態では、タンパク質レベルは、個々のタンパク質またはそのタンパク質分解性断片の１つまたは複数のエピトープに特異的な１つまたは複数の抗体を使用して決定される。本発明の実施における使用に適した検出方法論は、これらに限定されないが、免疫組織化学的検査、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、質量分析およびイムノ－ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、試料における遺伝子および／またはその下流標的遺伝子（複数可）によってコードされるタンパク質（複数可）のレベルは、同じ試料におけるハウスキーピングタンパク質（例えば、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼまたはＧＡＰＤＨ）のレベルによって正規化される（例えば、除算される）。
一部の実施形態では、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのレベルが決定されて、遺伝子の異常な発現レベルを査定する。一部の実施形態では、遺伝子の下流標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのレベルが決定されて、遺伝子の異常な活性レベルを査定する。一部の実施形態では、逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ（定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイを含む）が使用されて、ｍＲＮＡレベルを決定する。一部の実施形態では、遺伝子チップまたは次世代配列決定方法（例えば、ＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列決定もしくはエクソーム配列決定）が使用されて、遺伝子および／またはその下流標的遺伝子によってコードされるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルを決定する。一部の実施形態では、試料における遺伝子および／またはその下流標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、同じ試料におけるハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡレベルによって正規化される（例えば、除算される）。
一部の実施形態では、個体の遺伝子のレベルは、対照試料における遺伝子のレベルと比較される。一部の実施形態では、個体の遺伝子のレベルは、複数対照試料における遺伝子のレベルと比較される。一部の実施形態では、複数対照試料が使用されて、がんを有する個体の遺伝子のレベルの分類に使用される統計量を生成する。
遺伝子のレベルの分類またはランク付け（すなわち、高または低）は、対照レベルの統計分布と比べて決定することができる。一部の実施形態では、分類またはランク付けは、個体から得られる正常組織（例えば、末梢血単核細胞）または正常上皮細胞試料（例えば、口腔スワブ（ｂｕｃｃａｌ ｓｗａｐ）または皮膚パンチ）など、対照試料と比べられる。一部の実施形態では、遺伝子のレベルは、対照レベルの統計分布と比べて分類またはランク付けされる。一部の実施形態では、遺伝子のレベルは、個体から得られる対照試料由来のレベルと比べて分類またはランク付けされる。
対照試料は、非対照試料と同じ供給源および方法を使用して得ることができる。一部の実施形態では、対照試料は、異なる個体（例えば、がんがない個体、がんに対応する疾患の良性型もしくは進行性がより低い型を有する個体、ならびに／または同様の民族性、年齢および性別を共有する個体）から得られる。一部の実施形態では、試料が腫瘍組織試料である場合、対照試料は、同じ個体由来の非がん性試料であってもよい。一部の実施形態では、複数対照試料（例えば、異なる個体に由来する）が使用されて、特定の組織、器官または細胞集団における遺伝子のレベルの範囲を決定する。
一部の実施形態では、対照試料は、適切な対照であると決定された、培養された組織または細胞である。一部の実施形態では、対照は、異常がない細胞である。一部の実施形態では、標準化検査において臨床的に受け入れられる正常レベルが、遺伝子の異常なレベルを決定するための対照レベルとして使用される。一部の実施形態では、個体の遺伝子またはその下流標的遺伝子のレベルは、免疫組織化学的検査に基づくスコアリング方式などのスコアリング方式に従って、高、中程度または低として分類される。
一部の実施形態では、遺伝子のレベルは、個体の遺伝子のレベルを測定し、対照または参照（例えば、所与の患者集団の中央値レベル、もしくは第２の個体のレベル）と比較することにより決定される。例えば、単一個体に関する遺伝子のレベルが患者集団の中央値レベルを上回ると決定される場合、当該個体は、遺伝子の高発現レベルを有すると決定される。あるいは、単一個体に関する遺伝子のレベルが患者集団の中央値レベルを下回ると決定される場合、当該個体は、遺伝子の低発現レベルを有すると決定される。一部の実施形態では、個体は、処置に対して応答性である第２の個体および／または患者集団と比較される。一部の実施形態では、個体は、処置に対して応答性でない第２の個体および／または患者集団と比較される。一部の実施形態では、レベルは、遺伝子および／またはその下流標的遺伝子によってコードされる核酸のレベルを測定することにより決定される。例えば、単一個体に関する遺伝子によってコードされる分子（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）のレベルが、患者集団の中央値レベルを上回ると決定される場合、当該個体は、遺伝子によってコードされる分子（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）が高レベルであると決定される。あるいは、単一個体に関する遺伝子によってコードされる分子（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）のレベルが、患者集団の中央値レベルを下回ると決定される場合、当該個体は、遺伝子によってコードされる分子（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）が低レベルであると決定される。
一部の実施形態では、遺伝子の対照レベルは、遺伝子のレベルの統計分布を得ることにより決定される。一部の実施形態では、遺伝子のレベルは、対照レベルまたは対照レベルの統計分布と比べて分類またはランク付けされる。
一部の実施形態では、バイオインフォマティクス方法が、遺伝子の活性レベルの尺度として、遺伝子の下流標的遺伝子のレベルを含む遺伝子のレベルの決定および分類に使用される。多数のバイオインフォマティクスアプローチが開発されており、遺伝子発現プロファイリングデータを使用して遺伝子セット発現プロファイルを査定している。方法は、これらに限定されないが、Ｓｅｇａｌ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３４：６６－１７６ （２００３）；Ｓｅｇａｌ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３６：１０９０－１０９８ （２００４）；Ｂａｒｒｙ， Ｗ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２１：１９４３－１９４９ （２００５）；Ｔｉａｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
１０２：１３５４４－１３５４９ （２００５）；Ｎｏｖａｋ Ｂ Ａ ａｎｄ Ｊａｉｎ Ａ Ｎ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２２：２３３－４１ （２００６）；Ｍａｇｌｉｅｔｔａ Ｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２０６３－７２ （２００７）；Ｂｕｓｓｅｍａｋｅｒ Ｈ Ｊ， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８ Ｓｕｐｐｌ ６：Ｓ６ （２００７）に記載の方法を含む。
一部の実施形態では、対照レベルは、所定の閾値レベルである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡレベルが決定され、低レベルは、臨床的に正常とみなされるレベルまたは対照から得られるレベルの、約１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、０．００１倍またはそれ未満のうちのいずれかに満たないｍＲＮＡレベルである。一部の実施形態では、高レベルは、臨床的に正常とみなされるレベルまたは対照から得られるレベルの、約１．１、１．２、１．３、１．５、１．７、２、２．２、２．５、２．７、３、５、７、１０、２０、５０、７０、１００、２００、５００、１０００倍または１０００倍超を超えるｍＲＮＡレベルである。
一部の実施形態では、タンパク質発現レベルは、例えば、ウエスタンブロットまたは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。例えば、低または高レベルに関する判定基準は、遺伝子によってコードされるタンパク質を特異的に認識する抗体によってブロットされ、ハウスキーピングタンパク質（例えば、ＧＡＰＤＨ）を特異的に認識する抗体によってブロットされたハウスキーピングタンパク質（例えば、ＧＡＰＤＨ）に対応するタンパク質ゲルにおけるバンドによって正規化された（例えば、除算された）、遺伝子によってコードされるタンパク質に対応する同じ試料の同じタンパク質ゲルにおけるバンドの総強度に基づいて設けることができる。一部の実施形態では、タンパク質レベルが、臨床的に正常とみなされるレベルまたは対照から得られるレベルの、約１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、０．００１倍またはそれ未満のうちのいずれかに満たない場合、タンパク質レベルは低である。一部の実施形態では、タンパク質レベルが、臨床的に正常とみなされるレベルまたは対照から得られるレベルの、約１．１、１．２、１．３、１．５、１．７、２、２．２、２．５、２．７、３、５、７、１０、２０、５０もしくは１００倍または１００倍超のうちのいずれかを超える場合、タンパク質レベルは高である。
一部の実施形態では、タンパク質発現レベルは、例えば、免疫組織化学的検査によって決定される。例えば、低または高レベルに関する判定基準は、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質を特異的に認識する抗体を使用することによる、陽性染色細胞の数および／または染色の強度に基づいて設けることができる。一部の実施形態では、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％未満の細胞が陽性染色を有する場合、レベルは低である。一部の実施形態では、染色が陽性対照染色よりも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％低い強さである場合、レベルは低である。一部の実施形態では、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％超の細胞が陽性染色を有する場合、レベルは高である。一部の実施形態では、染色が陽性対照染色と同じ程度の強さである場合、レベルは高である。一部の実施形態では、染色が陽性対照染色の８０％、８５％または９０％の強さである場合、レベルは高である。
一部の実施形態では、スコアリングは、米国特許出願公開第２０１３／０００５６７８号に記載の「Ｈ－スコア」に基づく。Ｈ－スコアは、０～３００の範囲を得る、次式によって得られる：３×強い染色細胞のパーセンテージ＋２×中等度染色細胞のパーセンテージ＋弱い染色細胞のパーセンテージ。
一部の実施形態では、強い染色、中等度染色および弱い染色は、較正された染色レベルであり、範囲は確立され、染色強度は、範囲内にビニングされる。一部の実施形態では、強い染色は、強度範囲の７５パーセンタイルを上回る染色であり、中等度染色は、強度範囲の２５～７５パーセンタイルの染色であり、低い染色は、強度範囲の２５パーセンタイルを下回る染色である。一部の態様では、特定の染色技法に熟達し造詣が深い当業者であれば、ビンサイズ（ｂｉｎ ｓｉｚｅ）を調整し、染色カテゴリーを明確にする。
一部の実施形態では、標識高染色（ｌａｂｅｌ ｈｉｇｈ ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、染色された細胞の５０％超が強い反応性を示した箇所に割り当てられ、標識無染色は、染色された細胞の５０％未満において染色が観察されなかった箇所に割り当てられ、標識低染色は、他の全事例に割り当てられる。
一部の実施形態では、試料、患者などにおける遺伝的異常または遺伝子のレベルの査定および／またはスコアリングは、１名または複数の経験がある臨床医、すなわち、遺伝子発現および遺伝子産物染色パターンの経験がある臨床医によって行われる。例えば、一部の実施形態では、臨床医（複数可）は、査定およびスコアリングされている試料、患者などの臨床特徴および転帰に関して盲検化される。
一部の実施形態では、タンパク質リン酸化のレベルが決定される。タンパク質のリン酸化状態は、種々の試料供給源から査定することができる。一部の実施形態では、試料は、腫瘍生検である。タンパク質のリン酸化状態は、種々の方法により査定することができる。一部の実施形態では、リン酸化状態は、免疫組織化学的検査を使用して査定される。タンパク質のリン酸化状態は、部位特異的であってもよい。タンパク質のリン酸化状態は、対照試料と比較することができる。一部の実施形態では、リン酸化状態は、本明細書に記載の処置方法の開始前に査定される。一部の実施形態では、リン酸化状態は、本明細書に記載の処置方法の開始後に査定される。一部の実施形態では、リン酸化状態は、本明細書に記載の処置方法の開始前および後に査定される。
キット
本明細書に記載の方法に有用なキット、試薬および製造品も、本明細書に提供される。一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のｍＲＮＡを含有するバイアルとは別々に、ＣＰＰ、アセンブリ分子および／または他の細胞膜透過ペプチドを含有するバイアルを含有する。患者処置の時点で、例えば、患者試料の遺伝子発現分析またはプロテオーム解析もしくは組織学的分析に基づいて、どのような特定の病変を処置すべきかが、先ず決定される。これらの結果が得られたら、ＣＰＰならびに必要に応じた集合分子および／または細胞膜透過ペプチドを、それに応じて、適切な１つまたは複数のｍＲＮＡと組み合わせて、有効な処置のために患者に投与することができる複合体またはナノ粒子をもたらす。したがって、一部の実施形態では、１）ＣＰＰと、必要に応じて２）１つまたは複数のｍＲＮＡとを含む、キットが提供される。一部の実施形態では、キットは、集合分子および／または他の細胞膜透過ペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、キットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のキットは、ａ）ｍＲＮＡ（例えば、腫瘍抑制タンパク質、例えば、ＰＴＥＮおよび／またはｐ５３をコードするｍＲＮＡ）、ならびにｂ）ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、例えば、発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、例えば、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、キットは、個体の異常を査定するための作用物質（ａｇｅｎｔ）をさらに含む。一部の実施形態では、異常は、遺伝子の変異を含む。一部の実施形態では、遺伝子は、ＰＴＥＮおよび／またはＫＲＡＳである。
本明細書に記載のキットは、対象方法を実施するためにキットの成分を使用するための指示（例えば、本明細書に記載の医薬組成物を作製するためのおよび／または医薬組成物の使用のための指示）をさらに含むことができる。対象方法を実施するための指示は、一般に、好適な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどのような基材に印刷されていてもよい。したがって、指示は、キット内に添付文書として存在していてもよく、キットの容器またはキットの成分のラベルの中に（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに付随する）あってもよい。一部の実施形態では、指示は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子保存データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示はキット内に存在せず、リモートソースから、例えばインターネット経由で、指示を得る手段が提供される。この実施形態の一例は、指示を見ることができるおよび／または指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るためのこの手段は、好適な基材に記録される。
キットの様々な成分は、別個の容器内に存在することもあり、それらの容器が単一のハウジング、例えば箱、の中に含まれていることもある。
例示的実施形態
実施形態１． 細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、ｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２． 細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ａ）ｍＲＮＡを含む第１の溶液をＣＰＰを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップであって、第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、もしくはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整される、ステップと；ｂ）第３の溶液をインキュベートして、ｍＲＮＡ送達複合体の形成を可能とするステップとを含むプロセスによって調製される、ｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３． 第１の溶液が、滅菌水中にｍＲＮＡを含む、および／または第２の溶液が、滅菌水中にＣＰＰを含む、実施形態２に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態４． 第３の溶液が、ステップｂ）のインキュベートするステップの後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整される、実施形態２または３に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態５． 細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ｍＲＮＡが、治療用タンパク質をコードする、ｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態６． 治療用タンパク質によって、欠損しているかもしくは異常であるタンパク質が置き換えられるか、既存の経路が増強されるか、新規機能もしくは活性がもたらされるか、または分子もしくは生物が干渉される、実施形態５に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態７． 細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡの細胞内送達のためのｍＲＮＡ送達複合体であって、ＲＮＡｉをさらに含む、ｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態８． ＲＮＡｉが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである、実施形態７に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態９． ｍＲＮＡが、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードし、ＲＮＡｉが、ＲＮＡを標的とし、ＲＮＡの発現が、疾患または状態に関連する、実施形態７または８に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１０． 細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである、実施形態１～９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１１． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１２． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号７５または７６のアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１３． 細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである、実施形態１～９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１４． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号１５～４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１５． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号７７のアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１６． 細胞膜透過ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである、実施形態１～９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１７． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号４１～５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１８． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号７８のアミノ酸配列を含む、実施形態１６に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態１９． 細胞膜透過ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである、実施形態１～９のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２０． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号５３～７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２１． 細胞膜透過ペプチドが、配列番号７９または８０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２２． 細胞膜透過ペプチドが、ｍＲＮＡに共有結合によって連結している、実施形態１～２１のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２３． 細胞膜透過ペプチドが、細胞膜透過ペプチドのＮ末端に共有結合によって連結している１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分が、アセチル、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核内局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体またはその断片、多糖類およびターゲティング分子からなる群から選択される、実施形態１～２２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２４． 細胞膜透過ペプチドが、そのＮ末端に共有結合によって連結しているアセチル基を含む、実施形態２３に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２５． 細胞膜透過ペプチドが、細胞膜透過ペプチドのＣ末端に共有結合によって連結している１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分が、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝状Ｃ１～Ｃ６アルキル、一級または二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核内局在化シグナル、核外輸送シグナル、抗体またはその断片、多糖類およびターゲティング分子からなる群から選択される、実施形態１～２４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２６． 細胞膜透過ペプチドが、そのＣ末端に共有結合によって連結しているシステアミド基を含む、実施形態２５に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２７． ｍＲＮＡ送達複合体における細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部が、連結によりターゲティング部分に連結している、実施形態１～２６のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２８． 連結が、共有結合である、実施形態２７に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態２９． ｍＲＮＡが、治療用タンパク質をコードする、実施形態１～２８のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３０． ｍＲＮＡが、腫瘍抑制タンパク質をコードする、実施形態２９に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３１． ＲＮＡｉをさらに含む、実施形態１～３０のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３２． ＲＮＡｉが、下方調節のために発癌遺伝子を標的とする、実施形態３１に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３３． 細胞膜透過ペプチドのｍＲＮＡに対するモル比が、約１：１～約１００：１の間である、実施形態１～３２のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３４． ｍＲＮＡ送達複合体の平均直径が、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍの間である、実施形態１～３３のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体。
実施形態３５． 実施形態１～３４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体を含むコアを含むナノ粒子。
実施形態３６． コアが、１つまたは複数の追加の、実施形態１～３４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体をさらに含む、実施形態３５に記載のナノ粒子。
実施形態３７． コアが、ＲＮＡｉをさらに含む、実施形態３５または３６に記載のナノ粒子。
実施形態３８． ＲＮＡｉが、下方調節のために発癌遺伝子を標的とする、実施形態３７に記載のナノ粒子。
実施形態３９． ＲＮＡｉが、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＲＮＡｉを含む複合体中にある、実施形態３７または３８に記載のナノ粒子。
実施形態４０． 細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、実施形態３９に記載のナノ粒子。
実施形態４１． ナノ粒子中の細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部が、連結によりターゲティング部分に連結している、実施形態３５～４０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
実施形態４２． コアが、末梢細胞膜透過ペプチドを含むシェルにより被覆されている、実施形態３５～４１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
実施形態４３． 末梢細胞膜透過ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、実施形態４２に記載のナノ粒子。
実施形態４４． 末梢細胞膜透過ペプチドが、配列番号１～８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４３に記載のナノ粒子。
実施形態４５． シェル内の末梢細胞膜透過ペプチドの少なくとも一部が、連結によりターゲティング部分に連結している、実施形態４２～４４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
実施形態４６． 連結が、共有結合である、実施形態４１または４５に記載のナノ粒子。
実施形態４７． ナノ粒子の平均直径が、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍの間である、実施形態３５～４６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
実施形態４８． 実施形態１～３４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体または実施形態３５～４７のいずれか一項に記載のナノ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
実施形態４９． ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態４８に記載の医薬組成物。
実施形態５０． 阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をさらに含む、実施形態４８または４９に記載の医薬組成物。
実施形態５１． ＲＮＡｉが、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子中にある、実施形態５０に記載の医薬組成物。
実施形態５２． ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態４８に記載の医薬組成物。
実施形態５３． 実施形態１～３４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体を調製する方法であって、細胞膜透過ペプチドを１つまたは複数のｍＲＮＡと組み合わせるステップを含み、それによってｍＲＮＡ送達複合体を形成する方法。
実施形態５４． 細胞膜透過ペプチドとｍＲＮＡが、それぞれ、約１：１～約１００：１のモル比で組み合わされる、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５． 組み合わせるステップが、ｍＲＮＡを含む第１の溶液をＣＰＰを含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップであって、第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、もしくはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むかまたは含むように調整され、第３の溶液が、ｍＲＮＡ送達複合体の形成を可能とするようにインキュベートされる、ステップを含む、実施形態５３または５４に記載の方法。
実施形態５６． 第１の溶液が、滅菌水中にｍＲＮＡを含む、および／または第２の溶液が、滅菌水中にＣＰＰを含む、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７． 第３の溶液が、インキュベートした後に、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整され、ｍＲＮＡ送達複合体を形成する、実施形態５５または５６に記載の方法。
実施形態５８． １つまたは複数のｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、細胞を実施形態１～３４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体または実施形態３５～４７のいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップを含み、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、方法。
実施形態５９． 細胞をｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｖｏで行われる、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０． 細胞をｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップが、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６１． 細胞をｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子と接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６２． 細胞が、幹細胞、造血前駆細胞、顆粒球、マスト細胞、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、心臓細胞、肝細胞、肺前駆細胞、または神経細胞である、実施形態５８～６１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６３． 細胞がＴ細胞である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４． ｍＲＮＡが、それが発現される個体における免疫応答をモジュレートすることができるタンパク質をコードする、実施形態６２または６３に記載の方法。
実施形態６５． ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態５８～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６６． ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をさらに含む、実施形態５８～６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６７． ＲＮＡｉを細胞に送達するステップをさらに含む、実施形態５８～６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６８．ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡを含む、実施形態５８～６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態６９． 個体の疾患を処置する方法であって、個体に実施形態４８～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を投与するステップを含む方法。
実施形態７０． 医薬組成物が、静脈内、腫瘍内、動脈内、局所、眼内、眼科的、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、膀胱内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内、または経口投与を介して投与される、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１． 医薬組成物が、注射によって、血管壁または血管壁を囲む組織中に投与される、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７２． 注射が、ニードルを有するカテーテルを介するものである、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３． 疾患が、がん、糖尿病、自己免疫疾患、血液疾患、心疾患、血管疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼疾患、肝臓疾患、肺疾患、筋肉疾患、タンパク質欠損疾患、リソソーム蓄積症、神経学的疾患、腎臓疾患、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベル異常によって特徴付けられる疾患からなる群から選択される、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７４． 疾患が、タンパク質欠損疾患である、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７５． 医薬組成物が、疾患に寄与する欠損タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６． 疾患が、異常なタンパク質よって特徴付けられる、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７７． 医薬組成物が、疾患に寄与する非機能的タンパク質の機能的バリアントをコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８． 疾患が、がんである、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７９． がんが、固形腫瘍であり、医薬組成物が、固形腫瘍を処置するために有用な腫瘍抑制タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８０． がんが、肝臓、肺、腎臓、結腸直腸、または膵臓のがんである、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１． がんが、血液悪性腫瘍であり、医薬組成物が、血液悪性腫瘍を処置するために有用な腫瘍抑制タンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８２． 医薬組成物が、がんの発症および／または進行に関与する発癌遺伝子を標的とするＲＮＡｉをさらに含む、実施形態７８～８１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８３． ＲＮＡｉが、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子中にある、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４． 疾患が、ウイルス感染症であり、医薬組成物が、ウイルス感染性疾患の発症および／または進行に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態８５． 疾患が、遺伝性疾患であり、医薬組成物が、遺伝性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態８６． 疾患が、老化または変性疾患であり、医薬組成物が、老化または変性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含む、ｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態８７． 疾患が、線維性または炎症性疾患であり、医薬組成物が、線維性または炎症性疾患の発症および／または進行に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ送達複合体またはナノ粒子を含む、実施形態７３に記載の方法。
実施形態８８． 個体がヒトである、実施形態６９～８７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態８９． 実施形態１～３４のいずれか一項に記載のｍＲＮＡ送達複合体および／または実施形態３５～４７のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む組成物を含むキット。
実施形態９０． 個体のがんを処置する方法であって、個体に腫瘍抑制タンパク質をコードするｍＲＮＡの有効量を投与するステップを含み、腫瘍抑制タンパク質が、ＰＴＥＮ、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４、またはＶＨＬから選択される腫瘍抑制遺伝子に対応する、方法。
実施形態９１． 個体に発癌遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの有効量を投与するステップをさらに含む、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２． 発癌遺伝子が、ＫＲＡＳを含む、実施形態９１に記載の方法。
実施形態９３． ｓｉＲＮＡが、ＫＲＡＳの変異体形態を標的とし、ＫＲＡＳの変異体形態が、ＫＲＡＳのコドン１２または６１上に変異を含む、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４． ＫＲＡＳの変異体形態が、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを含む、実施形態９３に記載の方法。
実施形態９５． ｓｉＲＮＡが、ＫＲＡＳの第１の変異体形態を標的とする第１のｓｉＲＮＡ、およびＫＲＡＳの第２の変異体形態を標的とする第２のｓｉＲＮＡを含み、ＫＲＡＳの第１の変異体形態が、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳを含み、ＫＲＡＳの第２の変異体形態が、Ｇ１２Ｃ ＫＲＡＳを含む、実施形態９３または９４に記載の方法。
実施形態９６． ｓｉＲＮＡが、配列番号８３、８４、８６～８９を有する配列から選択される核酸配列を含む、実施形態９１～９５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９７． 腫瘍抑制因子の遺伝子が、ＰＴＥＮおよびＴＰ５３から選択される、実施形態９０～９６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態９８． 腫瘍抑制因子の遺伝子が、ＰＴＥＮである、実施形態９７に記載の方法。
実施形態９９． がんが、膵がん、卵巣がん、前立腺がんおよび神経膠芽腫から選択される、実施形態９０～９８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１００． 個体が、腫瘍抑制遺伝子コード（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ
ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ）に異常を含む、実施形態９０～９９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０１． 個体が、発癌遺伝子に異常を含む、実施形態９１～１００のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０２． 個体が、腫瘍抑制タンパク質をコードする遺伝子および／または発癌遺伝子に異常を有することに基づいて、処置のために選択される、実施形態１００または１０１に記載の方法。
実施形態１０３． ｓｉＲＮＡが、発癌遺伝子の変異体形態を標的とし、変異体形態が、発癌遺伝子に異常を含む、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０４． 個体の疾患または状態を処置する方法であって、治療用タンパク質またはその組換え形態をコードするｍＲＮＡの有効量を投与するステップを含み、治療用タンパク質が、アルファ１アンチトリプシン、フラタキシン、インスリン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、成長因子、ホルモン、ジストロフィン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、β－グルコ－セレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α，α－ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼインヒビター、ラクターゼ、膵酵素（リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼを含む）、アデノシンデアミナーゼ、およびアルブミンからなる群から選択される、方法。
実施形態１０５． 疾患または状態が、治療用タンパク質の欠損によって特徴付けられる、タンパク質欠損疾患または状態である、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６． 治療用タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子である、実施形態１０４または１０５に記載の方法。
実施形態１０７． ｍＲＮＡが、静脈内または皮下に投与される、実施形態９０～１０６のいずれか一項に記載の方法。
本発明の範囲および精神内でいくつもの実施形態が可能であることを当業者は認識する。以下の非限定的な実施例を参照することにより本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例を挙げてさらに説明するものであるが、当然ながら、いかなる形でもその範囲を限定するものと解してはならない。
材料および方法
細胞膜透過ペプチド：
次のペプチドを使用した：
ＰＥＰ－１：ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７１）
ＰＥＰ－２：ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７２）
ＶＥＰＥＰ－３ａ：βＡＫＷＦＥＲＷＦＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号７５）
ＶＥＰＥＰ－３ｂ：βＡＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号７６）
ＶＥＰＥＰ－６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）
ＶＥＰＥＰ－９：βＡＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号７８）
ＡＤＧＮ－１００ａ：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）
ＡＤＧＮ－１００ｂ：βＡＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号８０）
ペプチドのストック溶液を蒸留水または５％のＤＭＳＯ中２ｍｇ／ｍＬで調製し、水浴ソニケーターで１０分間超音波処理した後、使用直前に希釈した。
細胞系
安定なＥＧＦＰ発現細胞系（ＧＦＰ－Ｕ２ＯＳ、ＥＧＦＰ－ＪＵＲＫＡＴ Ｔ、ＥＧＦＰ－ＨＥＫ）ならびにＵ２ＯＳ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－９６（商標））、初代ヒト線維芽細胞、Ｈｅｐ Ｇ２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６５（商標））、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））、ヒト骨髄性白血病Ｋ５６２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４３（商標））、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２（商標））、ヒトＥＳＣ（Ｈ９）、およびマウスＥＳＣ（ＥＳＦ １５８）を含むいくつかの細胞系を使用した。細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］から入手した。
（実施例１）
ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡナノ粒子および複合体調製、サイズ分布、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ使用
材料
リポフェクタミン３０００、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７転写およびＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット、ＧｅｎｅＡｒｔゲノム切断検出キットミックスは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（フランス）から得た。ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキットは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂから得た。ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７転写キット、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット、ＧｅｎｅＡｒｔゲノム切断検出キットおよびＰｌａｔｉｎｕｍ ＧｒｅｅｎホットスタートＰＣＲミックスは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（フランス）から得た。全オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）から得た。
ルシフェラーゼｍＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して得た。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型として直鎖状ベクター（Ｌｕｃ２ ｐＧＬ４－１０）（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して合成し、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。合成されたｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール：クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿によって精製し、次いで、ＵＶ光の吸光度によって定量した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける紫外光の吸光度を測定することにより決定した。１μｇのＤＮＡ鋳型を使用して、１８μｇのキャップ化ｍＲＮＡ（ｃａｐｐｅｄ ｍＲＮＡ）を得て、－２０℃で貯蔵した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから、ポリアデニル化およびキャップ化形態としてＣＡＳ９ ｍＲＮＡを得た。
次のペプチド配列を使用した。全ペプチドは、溶解性およびｉｎ ｖｉｖｏ適用を容易にするために、酢酸塩形態としてＧＥＮＥＰＥＰ Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ（フランス）から得た。
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）
ＨｅｐＧ２細胞は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ２４３（商標））から入手した。
方法
ペプチドストック調製
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドは、プラスチック管内に粉末で貯蔵した。ペプチド粉末は、室温で安定しているが、－２０℃または－８０℃で貯蔵するべきである。ペプチド粉末は、ペプチド水和を防止するために、管を開栓する前に室温で３０分間平衡化させた。ペプチド粉末は先ず、純粋ＤＭＳＯ（細胞培養グレード、ＳＩＧＭＡ
ｒｅｆ Ｄ２６５０－５Ｘ５ＭＬ）を添加することにより、管内で直接的に可溶化して、２０μｌ／ｍｇのペプチド濃度を得た。次に、要求されるペプチド濃度に従って、適切な体積のＧＩＢＣＯ滅菌水（細胞培養グレード）でＤＭＳＯ溶液を希釈した。現在のところ、５５０μＭのペプチド濃度を使用した。ＤＭＳＯ溶液に水体積（ｗａｔｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）を滴下して添加した。ペプチド溶液をボルテックス２分間低速により穏やかに混合した、そしてペプチドストック溶液を水浴中で１０分間超音波処理する（デジタル超音波洗浄槽ＢＲＡＮＳＯＮ）。
ペプチドストック溶液は、－８０℃で１ヶ月間または冷蔵条件（２～８℃）で１週間貯蔵することができる。ペプチドストック溶液を１００μｌ試料に等分し、－８０℃で貯蔵した。１回きりの凍結融解が推奨される。標準対照として、使用されたペプチドに応じたイプシロン値を使用した２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度に基づき、ペプチド濃度を検証した：ＡＤＧＮ－１００［ε２８０：２７５００］およびＡＤＧＮ１０６：［ε２８０：２８４００］。
複合体形成のための最終ペプチド溶液の調製
ペプチドストック溶液は、滅菌水中に３．７倍希釈して、１５０μＭの濃度に達する最終ペプチド溶液を得て、水浴中で１０分間超音波処理した（デジタル超音波洗浄槽ＢＲＡＮＳＯＮ）。本発明者らは、２７０μｌのＧＩＢＣＯ滅菌水により１００μｌのペプチドストック溶液を希釈して、３７０μｌ体積の最終ペプチド溶液を得ることを示唆した。最終ペプチド溶液は、４℃で貯蔵し、調製１０時間以内に使用した。体積は、トランスフェクションの数に応じて調整することができる。
ｍＲＮＡとの複合体形成
１ウェル（６ウェルプレート）に対応する３５ｍｍディッシュにおいて培養された、２～５ １０６個の細胞または約７０～８０％のコンフルエンシーの細胞のトランスフェクションに関して、次のプロトコールが報告されている。プロトコールは、異なる数の細胞、より大きい体積の調製、および異なるプレートフォーマットについて調整することができる。
ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ粒子は、２０：１モル比のＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡで調製した。３種の量のｍＲＮＡ（０．１μｇ、０．５μｇおよび２．０μｇ）が、プロトコールに記載されている。
先ず、ｍＲＮＡ（０．１、０．５または２．０μｇ）を２０μｌの滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中に室温で希釈した。２μｌ最終ペプチド溶液を０．１μｇのｍＲＮＡに対して添加して、または１０μｌ最終ペプチド溶液を０．５μｇのｍＲＮＡに対して添加して、または４０μｌ最終ペプチド溶液を２μｇのｍＲＮＡに対して添加して、それぞれ２２μｌ、３０μｌまたは６０μｌの総体積を得た。滅菌水で体積を１００μｌに調整した。ペプチド／ｍＲＮＡ溶液は、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、複合体形成のために室温で３０分間インキュベートした。
トランスフェクションの直前に、５％スクロースまたは５％グルコースを含有する滅菌水のいずれかを添加することにより、複合体の体積を２００μｌに調整した。ＰＢＳおよび高塩濃度が、粒子凝集をもたらすことが発見された。したがって、これらを回避することが推奨される。細胞系または細胞型の感度に応じて、５０％ＤＭＥＭまたはＯＰＴＩＭＥＭを使用することができることも見出された。体積調整後に、複合体溶液は、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、細胞トランスフェクションまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用した。
トランスフェクションプロトコール
（ｉ）接着細胞系のためのプロトコール：
次のプロトコールは、２４ウェルプレートフォーマットのためのものである。体積は、より大きい体積および異なるプレートフォーマットに最適化することができる。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、２ｍＭグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。トランスフェクション前日に１５０，０００個の細胞を播種した２４ウェルプレートを、５０～６０％コンフルエンスとなるまで成長させ、トランスフェクション時に約７０％コンフルエンスとなるよう設定した。
トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。次に、細胞に、０．２ｍｌの複合体溶液を重層し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．４ｍｌの新鮮ＯＰＴｉＭＥＭまたはＤＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体の重層を除去することなく、１０％の最終ＦＣＳ濃度に達するために、１５％ＦＣＳを含有する完全ＯＰＴｉＭＥＭ（高グルコース）またはＤＭＥＭを２ｍｌ添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、トランスフェクション７２時間後にアッセイした。
（ｉｉ）懸濁液中の細胞系およびＴ細胞のためのプロトコール：
細胞は、トランスフェクション時に約７０％コンフルエンスになるように、１０％血清を有する高グルコースＤＭＥＭ培地において培養した。トランスフェクション前に、細胞を遠心分離によって収集し、次いでＤＭＥＭで２回洗浄した。次に、細胞は、０．２ｍｌの複合体溶液に再懸濁し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートする。次に、０．４ｍＬの新鮮ＯＰＴｉＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体の重層を除去することなく、１０％の最終ＦＣＳ濃度に達するために、１２％ＦＣＳを含有する完全ＯＰＴｉＭＥＭ（高グルコース）を２ｍＬ添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、トランスフェクション７２時間後にアッセイした。
（実施例１ａ）
ペプチド／ｍＲＮＡ複合体のナノ粒子サイズにおける希釈剤の効果
ＰＢＳ中で調製された粒子によるトランスフェクション（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ
ｖｉｖｏ）が、予想よりも低かったことが予想外に発見された。ペプチド／ｍＲＮＡ複合体は、中性（ゼータ電位＋１０ｍｖ～－１０Ｍｖ）であるため、塩またはバッファが粒子に有意に影響を与えることは予想されなかった。
したがって、ｍＲＮＡと安定したナノ粒子を形成するＡＤＧＮ１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドの能力を、異なる緩衝液条件において解析した。次の、滅菌水、５％グルコース、５％スクロース、２０％ＰＢＳ（２０％および５０％）、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（４０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ）、ＤＭＥＭまたはＯＰＴＩＭＥＭ（２０％および５０％）を含む緩衝液条件を評価した。
ルシフェラーゼｍＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して得て、プラスミドＤＮＡ鋳型（Ｌｕｃ２ ｐＧＬ４－１０）（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用して合成し、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ粒子は、２０：１モル比のＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡで調製する。
Ｌｕｃ ｍＲＮＡを、異なる緩衝液条件においてＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６と２０：１モル比で混合した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中のＬｕｃ ｍＲＮＡ（０．５または１．０μｇ）を、ＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合し、試料毎の体積は、滅菌水で１００μｌに調整した。複合体は、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。測定の直前に、異なる緩衝液を添加することにより、体積を２００μｌに調整し、複合体は、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートした。粒子サイズおよびゼータ電位は、ＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）において測定した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズおよび多分散性は、測定につき３分間２５℃で決定し、ゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）により測定した。
３回の別々の実験の平均に関して、データを図１～図４および表１に示す。
表１．
図１Ａ～図１Ｆおよび図２Ａ～図２Ｂに示す通り、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドの両方が、水、グルコース（５％）、スクロース（５％）および５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４においてｍＲＮＡと安定したナノ粒子を形成することができ、平均直径は、９８～１３０ｎｍの範囲であり、多分散指数（ＰＩ）は０．２５～０．２７であった。２種のペプチドの間に主要な差は観察されなかった。粒子電荷は、ゼータ電位によって得られ、平均値は、それぞれＡＤＧＮ－１００では－６．２ｍＶ～－７．２ｍＶ、ＡＤＧＮ－１０６では＋５．３ｍＶ～＋８．８ｍＶの範囲であった。
ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体の粒子サイズは、ＤＭＥＭまたはＯＰＴＩＭＥＭ（２０％および５０％）などの標準細胞培養培地において評価した。図２Ａ～図２Ｂに示す通り、ＤＭＥＭの存在は、粒子のサイズを僅かに増加させる。培地条件においてゼータ電位によって得られた粒子電荷は、スクロースまたは水において得られた粒子電荷と同様であり、平均値は、それぞれＡＤＧＮ－１００では－１２ｍＶ、ＡＤＧＮ－１０６では＋１１ｍＶである。
対照的に、両方のＡＤＧＮペプチドに関して、ＰＢＳ中のリン酸塩であれＮａＣｌであれ、高濃度の塩の存在は、より大きい粒子サイズをもたらした。図３Ａ～図３Ｂに示す通り、４０ｍＭから１６０ｍＭへのＮａＣｌ濃度の増加は、粒子サイズを５倍から７倍増加させ、平均直径は、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体に関してそれぞれ最大６９１ｎｍおよび５４２ｎｍである。５０％ＰＢＳの存在は、粒子サイズを、ＡＤＧＮ－１０６およびＡＤＧＮ－１００に関してそれぞれ１１および１６倍増加させる。結果は、水、スクロース５％およびグルコース５％が、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体に関して最小粒子をもたらすことを予想外に実証した。対照的に、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の両方に関して、塩またはリン酸塩の存在は、観察されたトランスフェクション効力低下を説明することができ、潜在的に、粒子の毒性のリスクも増加し得る、はるかにより大きい粒子の形成を予想外にもたらした。
血清（ＦＣＳ）は、多数の送達剤の効率を低下させることが報告されている細胞培養培地の必須構成成分である。多数の感受性細胞型の場合、血清は、トランスフェクションの間に存在して、またはトランスフェクションの直後に添加されて、細胞死を限定する。したがって、粒子サイズおよび電荷における血清の存在の影響を調査した。ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ粒子の平均サイズおよび電荷は、２０％および５０％ＦＣＳの存在下で評価した。次に、水、スクロース５％またはグルコース５％中のＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ粒子を、異なる血清条件（２０％および５０％）で３０分間インキュベートした。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズおよび多分散性は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）による測定につき３分間２５℃で決定した。３回の別々の実験の平均に関して、データを図４Ａ～図４Ｂおよび表２に示す。
表２
図４Ａ～図４Ｂに報告されている通り、遊離血清（ｆｒｅｅ ｓｅｒｕｍ）は、５±１ｎｍおよび４５±１０ｎｍにおける２個の別個のピークによって特徴付けられる。スクロース（５％）またはグルコース（５％）溶液中のＡＤＧＮ：ｍＲＮＡナノ粒子を血清（５０％または２０％最終濃度）と混合した場合、２００ｎｍあたりのサイズを有する第３のピークを得た。水中のＡＤＧＮ：ｍＲＮＡナノ粒子を血清（５０％または２０％最終濃度）と混合した場合、４５０ｎｍあたりのサイズを有する第３のピークを得た。これらの結果は、粒子のサイズが、血清タンパク質または他の血清構成成分との相互作用によって増加し、ナノ粒子が、粒子表面における血清タンパク質の動的吸着による「タンパク質コロナ」に囲まれることを示唆する。ナノ粒子の周りの血清タンパク質の会合は、スクロースまたはグルコース溶液において限定される。会合は、血清添加後にＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ粒子では、＋７．３±２ｍＶの正のゼータ電位から、負のゼータ電位、－１０±３ｍＶの間のスイッチを、スクロース溶液におけるＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ複合体では、－７．０±０．５ｍＶから－１５．２±０．５ｍＶへの増加を示す、表面電荷測定値の改変によってさらに確認される。
結果は、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６が、水中、グルコースまたはスクロース溶液中に貯蔵された場合、ｍＲＮＡと安定したナノ粒子を形成することを実証した。グルコースまたはスクロース中に貯蔵されたナノ粒子は、血清条件において安定し、ナノ粒子の周りの血清タンパク質の会合は限定される。対照的に、高塩濃度またはＰＢＳは、粒子サイズ増加を誘導した。
（実施例１ｂ）
ＡＤＧＮ－ペプチドは、ＨｅｐＧ２細胞におけるｍＲＮＡ送達を促進する
ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡを、ＨＥＰＧ２細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞送達に関して評価した。
滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中のＬｕｃ ｍＲＮＡ（０．５または１．０μｇ）をＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合した。試料毎の体積を、滅菌水で１００μｌに調整し、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合した。試料を室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、異なる緩衝液を添加することにより、体積を２００μｌに調整した。次の、滅菌水、５％グルコース、５％スクロース、２０％ＰＢＳ、５０％ＰＢＳ、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（４０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ）、ＤＭＥＭ（５０％）を含む緩衝液条件を評価した。トランスフェクションの直前に、試料をボルテックス１分間低速により穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートした。
ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェルプレートにおいて培養した。トランスフェクション前日に１００，０００個のＨｅｐＧ２細胞を播種し、５０～６０％コンフルエンスとなるように成長させた。トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、ＤＭＥＭを穏やかに除去した。次に、細胞に、０．２ｍｌの複合体溶液を重層し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。血清および抗生物質を含まない０．４ｍＬの新鮮ＤＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の重層を除去することなく、１５％ＦＣＳを含有する２ｍＬの完全ＤＭＥＭを添加した。細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、ルシフェラーゼ発現に関してトランスフェクション３０時間後にアッセイした。無処置細胞と比べたＲＬＵ（ルミネセンス）のパーセンテージに関して、結果を図５に示す。
高レベルのルシフェラーゼ発現が、スクロース（５％）およびグルコース（５％）中の両方のＡＤＧＮペプチドに関して観察された。ルシフェラーゼ発現効率は、ＤＭＥＭ中で２０％、粒子が水中にある場合は３０～４０％低下した。ＮａＣｌ ４０ｍＭまたは８０ｍＭの存在下での粒子のインキュベーションは、効率を５０％低下させた。最後に、１６０ｍＭ ＮａＣｌまたはＰＢＳの存在は、トランスフェクション効率を劇的に８０～９０％低下させた。結果は、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６が、ＨｅｐＧ２細胞におけるｍＲＮＡの効率的な送達を促進することを実証した。結果は、スクロースおよびグルコース中のＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ粒子が、高トランスフェクション効率をもたらしたことも示した。対照的に、塩またはリン酸塩の存在は、粒子のサイズを増加させ、不十分なトランスフェクションをもたらし、おそらく、非エンドソーム経路による細胞への進入を防止した。
（実施例１ｃ）
ＡＤＧＮ－ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ送達を促進する
安定したＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡを、静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に関して評価した。
滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中のＬｕｃ ｍＲＮＡ（１０μｇ）を、ＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合し、試料毎の体積を、滅菌水で１００μｌに調整した。試料を、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。注射の直前に、異なる緩衝液（スクロース５％、グルコース５％、ＮａＣｌ ８０ｍＭまたはＰＢＳ２０％最終濃度）を添加することにより、体積を２００μｌに調整した。試料を、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、マウスへと直ちに注射した。群１および２由来のマウスに、それぞれ１０μｇのＬｕｃ
ｍＲＮＡを含有する１００μｌ ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ複合体またはＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ溶液のＩＶ注射を与えた（１群当たり３匹の動物）。対照として、群３由来のマウス（１群当たり２匹の動物）に、１００μｌ生食塩水溶液のＩＶ注射を与えた。
ｍＲＮＡ Ｌｕｃ発現をバイオルミネセンスによってモニターした。３および６日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。
肝臓におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。次に、結果を、０日目と比べた値として表現し、図６Ａおよび図６Ｂに示した。
図６Ａ～図６Ｂおよび図７に示す通り、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６媒介性ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達およびｍＲＮＡ発現の両方が、３日目から開始して、肝臓において観察され、最適値は６日目であった。両方のペプチドに関して、肝臓におけるより高いルシフェラーゼ発現は、グルコースおよびスクロース中の粒子で得られた。対照的に、図６Ａおよび図６Ｂに示す通り、無視できるルシフェラーゼ発現が、ＰＢＳ中の粒子で得られ、５～１０％のみの発現が、ＮａＣｌ ８０ｍＭ中の粒子で得られた。
結果は、グルコースおよびスクロースが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達の両方にとって最良の希釈剤であることを確認する。塩によって誘導される大きい凝集物は、細胞に進入することも、ｉｎ ｖｉｖｏ送達を促進することもできない。
（実施例２）
腫瘍細胞におけるペプチド媒介性ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子ｍＲＮＡ送達
第１０染色体から欠失したホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）は、ホスファターゼ依存性および非依存性役割の両方を有する、周知の腫瘍抑制因子である。ＰＴＥＮは、がんにおける最も高頻度で破壊される腫瘍抑制因子の１つである。その脂質ホスファターゼ活性により、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－ＡＫＴ－哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）経路を抑制することにより、ＰＴＥＮは、生存、増殖、エネルギー代謝および細胞構築を含む過多の細胞過程を支配する。結果的に、転写調節、非コードＲＮＡによる転写後調節、翻訳後修飾およびタンパク質－タンパク質相互作用を含む、ＰＴＥＮ発現および機能を調節する機構は、がんにおいて全て変更される。染色体１０ｑ２３に位置するＰＴＥＮ遺伝子における病変は、ヒト腫瘍サブタイプの大部分において有意な比率で起こり、この遺伝子座は、ヒトにおける喪失に関して最高の優先度を有すると考えられる。ＰＴＥＮの不活性化は、腫瘍形成および腫瘍発達における肝要な事象であり、Ｐ５３遺伝子に次ぐがんにおける変異の最高頻度を有する。現在、ＰＴＥＮ遺伝子の腫瘍抑制機構は、ＦＡＫ経路、ＭＡＰＫ経路およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を含むいくつかの候補経路が関与する可能性がある。
がんサブタイプにわたる高頻度のＰＴＥＮ欠乏を考慮すると、ＰＴＥＮ機能喪失型を活用する治療アプローチは、有効な処置戦略を提供することができる。がん細胞における野生型ＰＴＥＮのレベルを回復させるための新たな戦略を提案するために、本発明者らは、ＰＴＥＮ遺伝子における変異またはＰＴＥＮの発現喪失のいずれかに関連するＰＴＥＮ機能の喪失を全て示すいくつかの腫瘍細胞において、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６）の効力を評価した。
材料
ＰＴＥＮ ｍＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して得た。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型として直鎖状ベクターＰＧＬ－ＰＴＥＮを使用して合成し（Ａｄｄｇｅｎｅ １３０３９）、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。合成されたｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール：クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿によって精製し、次いで、ＵＶ光の吸光度によって定量した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける紫外光の吸光度を測定することにより決定した。１μｇのＤＮＡ鋳型を使用して、１８μｇのキャップ化ｍＲＮＡを得て、－２０℃で貯蔵した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから、ポリアデニル化およびキャップ化形態としてＣＡＳ９ ｍＲＮＡを得た。
次のＡＤＧＮペプチド配列を使用した：
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）
膵がん細胞ＰＡＮＣ－１、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５、前立腺がん細胞ＰＣ３、卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３およびヒト線維芽細胞ＨＳ６９は、ＡＴＣＣから得た。
方法
次のプロトコールを、２４ウェルプレートにおいて培養された、２～５ １０６個の細胞または約７０～８０％のコンフルエンシーの細胞のトランスフェクションに使用した。ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ粒子は、２０：１モル比のＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡで調製した；２種の用量のｍＲＮＡ（０．５μｇおよび１．０μｇ）を使用した。ＰＴＥＮ
ｍＲＮＡ（０．５または１．０μｇ）を２０μｌの滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中に室温で希釈した。１０μｌ最終ペプチド溶液を０．５μｇのｍＲＮＡに対して添加した、または２０μｌ最終ペプチド溶液を１μｇのｍＲＮＡに対して添加して、それぞれ３０μｌまたは４０μｌの総体積を得た。ペプチド／ｍＲＮＡ溶液の体積を滅菌水で１００μｌに調整した。ペプチド／ｍＲＮＡ溶液は、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、５％スクロースを含有する滅菌水を添加することにより、体積を２００μｌにした。次に、溶液は、低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次に、溶液を、細胞トランスフェクションまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用した。
２４ウェルプレートフォーマットのために次のプロトコールが報告され、体積は、より大きい体積および異なるプレートフォーマットに最適化することができる。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、２ｍＭグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。トランスフェクション前日に１５０，０００個の細胞を播種した２４ウェルプレートを、５０～６０％コンフルエンスとなるまで成長させ、トランスフェクション時に約７０％コンフルエンスとなるよう設定した。
トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄する。次に、細胞に、０．２ｍｌの複合体溶液を重層し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．４ｍＬの新鮮ＤＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体の重層を除去することなく、１０％の最終ＦＣＳ濃度に達するために、１５％ＦＣＳを含有する完全ＯＰＴｉＭＥＭ（高グルコース）またはＤＭＥＭを２ｍＬ添加した。
細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、トランスフェクション７２時間後にアッセイした。ＰＴＥＮモノクローナル抗体（Ａ１７ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用したウエスタンブロットによって、ＰＴＥＮ発現のレベルを解析した。ＭＴＴアッセイを使用した増殖アッセイ、およびフローサイトメトリーアッセイを使用したアポトーシス／細胞周期進行によって、ＰＴＥＮ発現の影響をモニターした。細胞アポトーシス率（パーセンテージとして表現）および細胞周期ステージは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＡＰＯ ＢｒＤｕキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。
結果
全細胞型について、ＰＴＥＮ抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用したウエスタンブロットによって、ＰＴＥＮのレベルを評価した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ４．１ソフトウェアを使用して、タンパク質バンドを解析し、相対的タンパク質発現レベルを、β－アクチンに対して正規化した（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．）。
図８Ａに示す通り、ＰＴＥＮ発現のレベルは、細胞型に依存した。非常に低いＰＴＥＮ発現が、神経膠腫Ｕ２５（１０％）およびＰＣ３細胞（１６％）において観察された。ＰＡＮＣ－１およびＳＫＯＶ３卵巣癌細胞において、ＰＴＥＮのレベルは、非形質転換細胞（ＨＳ－６８）におけるレベルの５５％および６３％に相当した。ＰＴＥＮ発現レベルの差は、以前に報告された研究と一致した；その研究は、ＰＴＥＮ活性の喪失が、ＰＴＥＮ遺伝子における変異に主に関連したことを示している（Ｍｉｎ Ｓｕｐ Ｓｏｎｇ ｅｔ
ａｌ， ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、Ｄｉｌｌｏｎ ＆ Ｔｙｌｅｒ， Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ． ２０１４ １５（１）： ６５－７９）。
ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体を、異なるがん細胞型におけるＰＴＥＮ ｍＲＮＡの細胞送達に関して評価した。細胞に、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６のいずれかと複合体形成した０．５および１μｇ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、４８時間後にウエスタンブロットによってＰＴＥＮ発現のレベルを解析した。図８Ｂに示す通り、全ての事例において、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６は、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡの効率的送達を促進し、ＰＴＥＮタンパク質発現をもたらす。Ｕ２５およびＰＣ３において、ＰＴＥＮタンパク質のレベルは、対照細胞型と比較して十分に回復する。
次に、６日間の期間にわたって細胞増殖をモニタリングすることにより、がん細胞調節におけるＰＴＥＮ発現の影響を評価した。図９および図１０に示す通り、全細胞型において、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡの発現は、細胞増殖の阻害に直接的に相関した。がん細胞の成長曲線の低下は、６日目に著しい。結果は、野生型ＰＴＥＮ発現が、細胞の生存率を強く減少させる、またはその増殖を減速させることを示す。
フローサイトメトリーデータ（図１１）は、細胞アポトーシスの比率が、対照細胞と比較して、野生型ＰＴＥＮを発現する細胞において有意に増強されたことを実証した。アポトーシスレベルは、Ｕ２５およびＰＡＮＣ－１細胞において５倍、ＳＫＯＶ－３およびＰＣ３細胞において２．５倍増加した。
ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）染色キットを使用したサイトメトリーによって、細胞周期ステージを測定した。同様に、対照細胞と比較して、野生型ＰＴＥＮトランスフェクト細胞において、増加した割合のＧ０～Ｇ１期細胞が存在した。Ｇ０～Ｇ１における細胞の数は、４３～４７％から７２～７４％へと増加した（図１２）。対照的に、野生型ＰＴＥＮの存在下におけるＨＳ６８に関して、細胞周期進行の変化は観察されなかった。
結果は、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６が、がん細胞におけるＰＴＥＮ ｍＲＮＡの送達のための強力な薬剤であることを実証する。ＡＤＧＮペプチド媒介性ｍＲＮＡ送達は、外来性野生型ＰＴＥＮの大きい発現をもたらし、腫瘍細胞の成長を大幅に阻害し、細胞アポトーシスを促進し、Ｇ１期における細胞周期停止を引き起こすことにより、ＰＴＥＮ機能をレスキューする。
（実施例３）
ペプチド媒介性ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子ｍＲＮＡ送達ｉｎ ｖｉｖｏ膵臓腫瘍異種移植モデル
本発明者らは、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＥＮ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６）の効力を評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。２つの対照群（Ｇ１＆Ｇ２、１群当たり２匹の動物）および４つの処置群（Ｇ３～Ｇ６）（１群当たり３匹の動物）を含む、６群のマウスを使用した。異なる群を次に示す：
Ｇ１－：対照無処置マウス（対照）（２匹の動物／群）
Ｇ２：裸のｍＲＮＡ １０ｕｇ（裸の）（２匹の動物／群）
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１００／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：ＡＤＧＮ－１００／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ５：ＡＤＧＮ－１０６／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ６：ＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
動物（Ｇ２～Ｇ６）に、７日毎に裸のｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体を注射した。マウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体１００μｌのＩＶ尾静脈注射を与えた。腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を、光子／秒（光子／ｓ）として表現した。０、７、１４、２０、２６および３３日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。３３日目に、動物を屠殺し、腫瘍を収集した。
図１３および図１４Ａ～図１４Ｃに示す通り、対照群および裸のｍＲＮＡ群において、腫瘍サイズは、３３日間の期間にわたって５．５～６倍増加した。対照的に、ＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６を使用した５μｇのＰＴＥＮ ｍＲＮＡのＩＶ投与は、腫瘍成長を２．５および２．８倍に限定した。ＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６と複合体形成した１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡの投与は、腫瘍成長を有意に阻害し、サイズ増加は、ほんの１．５倍であった。結果は、ＡＤＧＮペプチドが、効率的な野生型ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ送達を媒介し、ＰＴＥＮ機能を回復させ、膵臓腫瘍成長を阻害することを実証した。
本発明者らは次に、ｍＲＮＡ送達によるＰＴＥＮ機能の回復が、どの程度まで、転移進行を阻害することができるかを評価した。６週齢の雌ヌードマウスに、膵臓に同所性に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。実験が始まる前に、腫瘍および転移発生のために６週間の期間を置いた。６週間後に、動物に、０日目および３日目に、対照食塩水またはＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ複合体を注射した。マウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ（群Ｇ２）複合体１００μｌのＩＶ注射を与え、対照マウス（Ｇ１）に、食塩水緩衝溶液を注射した。０日目および７日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
図１５Ａ～図１５Ｃに示す通り、ＡＤＧＮ－１０６媒介性野生型ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ送達は、転移発生を有意に制限した。解析は、対照群における総ルミネセンスが、７日間で２倍増加し、いくつかの転移が発生したことを実証した。対照群とは対照的に、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡペプチドを注射されたマウスは、０日目と比較して総ルミネセンスを１２～４０％減少させ、転移確立を遮断する。
（実施例４）
膵臓腫瘍動物モデルにおけるＰＴＥＮ（腫瘍抑制因子）ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ（発癌遺伝子）ｓｉＲＮＡのペプチド媒介性共送達
ＡＤＧＮ－１０６を、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ共投与に関して評価した。正常ＫＲＡＳタンパク質は、正常組織シグナル伝達における必須の機能を果たし、ＫＲＡＳ遺伝子の変異は、多くのがんの発生における必須のステップである。本明細書において、本発明者らは、ｍＲＮＡと一緒にＫＲＡＳ発癌遺伝子のｓｉＲＮＡ標的化を組み合わせて、ＰＴＥＮ腫瘍抑制因子機能を回復させ、ＫＲＡＳ発癌遺伝子の発現を遮断した。これにより、抗がん標的化アプローチのための新たな展望が提供される。
本発明者らは先ず、培養されたがん細胞系におけるＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ送達の影響を検証した。本発明者らは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を特異的に標的とするために、ｓｉＲＮＡ ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８３）および５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８４）を選択した。ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡは先ず、培養されたがん細胞において評価した。ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭおよび４０ｎＭ）は、２０／１ペプチドモル比でＡＤＧＮ－１０６に会合させた。膵がん細胞ＰＡＮＣ－１、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５、前立腺がん細胞ＰＣ３、卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３およびヒト線維芽細胞ＨＳ６８に、ＡＤＧＮ－１０６：ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクトし、次いで、４８時間および５日後に、ＫＲＡＳ発現および増殖のレベルの両方を測定した。
図１６Ａに示す通り、マウスモノクローナル抗ＫＲＡＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）および対照用のマウスモノクローナル抗アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用したウエスタンブロット解析は、いずれのがん細胞型であっても、４０ｍＭ ｓｉＲＮＡ濃度を使用して、ＫＲＡＳのレベルが８０％を超えて低下したことを明らかにした。図１６Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏルミネセント細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、トランスフェクション５日後に測定された細胞生存率を示す。結果は、ＡＤＧＮ－１０６媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡが、がん細胞増殖の有意な減少に直接的に相関する、ＫＲＡＳ変異型の著しいノックダウンを誘導したことを実証した。対照的に、非形質転換ＨＳ６８線維芽細胞の細胞において、増殖の変化は得られなかった。
６週齢の雌ヌードマウスに、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を注射した。動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。動物を７日毎に処置した。マウスに、次の群に記載の通り、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ複合体１００μｌのＩＶ注射を与えた：
Ｇ１：対照無処置マウス（対照）
Ｇ２：ＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ４：ＡＤＧＮ－１０６／１０μｇ ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳ用量０．５ｍｇ／ｋｇ；ＡＤＧＮ－１０６／５μｇ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ用量０．２５ｍｇ／ｋｇ
腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を、光子／秒（光子／ｓ）として表現した。０、７、１４、２０および２６日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。２６日目に、動物を屠殺し、腫瘍を収集した。
図１７Ａおよび図１７Ｂに示す通り、対照群において、腫瘍サイズは、２６日間の期間にわたって４．６倍増加した。ＡＤＧＮ－１０６を使用した１０μｇのＰＴＥＮ ｍＲＮＡのＩＶ投与は、腫瘍成長を５７％低下させた（２．０倍）。ＡＤＧＮ－１０６と複合体形成した１０μｇ ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの投与は、腫瘍成長を３５％阻害した（３．０倍増加）。ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（１０μｇ）とｍＲＮＡ ＰＴＥＮ（５μｇ）との組合せは、腫瘍成長を６８％阻害した（１．５倍増加）。結果は、ＡＤＧＮ－１０６が、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの両方のｉｎ ｖｉｖｏ送達を媒介し、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵腫瘍進行の阻害におけるｍＲＮＡ ＰＴＥＮおよびｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳの間の相乗作用を実証したことを示す。これらのデータは、腫瘍抑制因子および発癌遺伝子併用療法が、がん処置において有用となり得ることを示す。
（実施例５）
Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＡＤＧＮ媒介性第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡ送達評価
材料：
第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して得て、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型として直鎖状ベクターＰＧＬ－第ＶＩＩＩ因子を使用して合成し（Ａｄｄｇｅｎｅ １３０３９）、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。合成されたｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール：クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿によって精製し、次いで、ＵＶ光の吸光度によって定量した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける紫外光の吸光度を測定することにより決定した。１μｇのＤＮＡ鋳型を使用して、１８μｇのキャップ化ｍＲＮＡを得て、－２０℃で貯蔵した。
第ＶＩＩＩ因子ｓｉＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから得て、これは、マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子位置２９１２を標的とする、ｓｉＲＮＡ（センス）ＧＡＴＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＴＴ－３’（配列番号８５）である。
次のＡＤＧＮペプチド配列を使用した：
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）および
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）。
結果
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、抗血友病因子（ＡＨＦ）としても公知の、必須の血液凝固タンパク質である。ヒトにおいて、第ＶＩＩＩ因子は、Ｆ８遺伝子によってコードされる。この遺伝子の欠損は、劣性Ｘ連鎖型凝固障害である血友病Ａをもたらす。第ＶＩＩＩ因子は、肝臓類洞細胞、および肝臓外の体全体の内皮細胞において産生される。血友病Ａは、ＦＶＩＩＩの欠乏または非存在に起因する珍しいＸ連鎖型劣性出血障害である。ウイルスベクターの使用を含む、血友病患者における第ＶＩＩＩ因子レベルを回復させるために、いくつかのアプローチが提案されている。本明細書において、本発明者らは、第ＶＩＩＩ因子レベルを回復させるために、肝臓において第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮ－１００の効力を調査した。本発明者らは先ず、ＦＶＩＩＩを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩＩ）を使用して、Ｂａｌｂ Ｃマウスにおける内在性の、肝細胞で発現される血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を標的とすることにより、低い第ＶＩＩＩ因子レベルを有するマウスを確立した。
肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の一過性ノックアウトを得るために、０日目に、群Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４由来のマウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ－１００／ｓｉＦＶＩＩＩ複合体１００μｌのＩＶ注射を与えた（ｓｉＦＶＩＩＩ用量１．０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ）。群Ｎ１由来の対照マウスに、裸のｓｉＲＮＡ ｓｉＦＶＩＩＩ １０μｇを含有する１００μｌのＩＶ注射を与え、群Ｃ１由来の無処置対照マウスに、１００μｌの食塩水緩衝液を与えた。１０日後に、動物に、ＡＤＧＮ－１００／ｓｉＦＶＩＩＩを注射し、次の通りのさらなる処置による４つの異なる群（１群当たり３匹の動物）に分けた：
Ｇ１：処置なし
Ｇ２：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（１０μｇ）単回注射
Ｇ３：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６（１０μｇ）単回注射
Ｇ４：裸のｍＲＮＡ（１０μｇ）単回注射
０日目から５０日目の異なる時点で、第ＶＩＩＩ因子ＥＬＩＳＡキットを使用して、血液試料における第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。５０日目に、動物にｓｉＲＮＡ複合体を再注射し、６０日目に、動物に群Ｇ１～Ｇ４に記載のｍＲＮＡ複合体を再注射した。次に、９０日目まで、第ＶＩＩＩ因子Ｅｌｉｓａキットを使用して、血液試料における第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。動物の体重を３～５日毎に測定した。
図１８に示す通り、ＡＤＧＮ－１００媒介性ｓｉＲＮＡ送達は、血漿における第ＶＩＩＩ因子タンパク質レベルの主要な下方調節を誘導した。ｓｉＲＮＡ効果は、２日目から観察され、１０日目に７２％ノックダウンに達した。ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６媒介性ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ送達は、急速な肝臓発現、および血漿における第ＶＩＩＩ因子レベルの回復をもたらした。ｍＲＮＡ投与の１０～１２日後に、ＦＶＩＩＩの全回復を得た。対照的に、処置なし（群Ｇ１）または裸のＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡのＩＶ投与（群Ｇ４）による対照は、５０日で６５％および７２％のみのＦＶＩＩＩ回復を有した。
ＡＤＧＮ－ｓｉＦＶＩＩＩによる５０日における再処置は、最初の処置と同様のＦＶＩＩＩノックダウンをもたらした。ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡによる６０日における再処置は、初期処置と非常に類似したＦＶＩＩＩレベル回復パターンを示した。本発明者らは、処置を同じ効率で反復することができることを実証した。
ＡＤＧＮ関連毒性も動物の体重における変更（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｗｅｉｇｈｔ）も検出されなかった。さらに、肝臓組織学的解析（図１９）は、２回の連続的処置後９０日目に炎症も慢性変化も示さなかった。したがって、これらの結果は、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドを、ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ投与のため、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける多数の遺伝的障害の補正のための強力な無毒性方法として使用することができることを実証する。
（実施例６）
ＰＡＮＣ－１腫瘍モデルにおけるペプチド媒介性ＣＲＩＳＰＲ複合体送達
材料：
リポフェクタミン２０００、ＲＮＡｉＭＡＸ、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７転写キット、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット、ＧｅｎｅＡｒｔゲノム切断検出キットおよびＰｌａｔｉｎｕｍ ＧｒｅｅｎホットスタートＰＣＲミックスは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（フランス）から得た。全オリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（ベルギー）から得た。
ルシフェラーゼｇＲＮＡは、Ｈａｒｔ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ． （２０１５）． Ｃｅｌｌ， １６３（６）， １５１５－１５２６に従ってｓｇＲＮＡ発現プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃７４１９０、プラスミドｐＬＣＫＯ＿ルシフェラーゼ＿ｓｇＲＮＡ）を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得た。ルシフェラーゼ標的部位：ＡＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＡＣＣＧＣＧＣＣ（配列番号８２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写され得るＰＣＲ産物の鋳型としてのＴ７プロモーターアダプター配列を含有するジェネリックｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用して、ｓｇＲＮＡの生成を行った。製造業者の指示に従ってＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７高収率転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、フランス）を使用して、Ｔ７プロモーター結合部位と、それに続く２０ｂｐ ｓｇＲＮＡ標的配列を含有する直鎖状ＤＮＡ断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｇＲＮＡをエタノールで沈殿させ、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してさらに精製した。ｓｇＲＮＡのストック溶液を水に可溶化し、ＵＶ吸光度によって定量し、－８０℃で貯蔵した。
ＣＡＳ９ ｍＲＮＡは、ポリアデニル化およびキャップ化形態としてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから得た。
次のペプチド配列を使用した：
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）および
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）。
細胞系は、Ｌｕｃ２を発現するＰＡＮＣ－１膵がん細胞、およびＬｕｃ２を発現する卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３を含んだ。
ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ粒子は、２０：１モル比のＡＤＧＮ－ペプチド／核酸で調製した。予め混合したＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（５μｇ／１５μｇ）を、２０：１モル比（ペプチド 対 複合体）でＡＤＧＮ－１００と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＩＶ投与に先立ち、スクロース５％溶液または生理食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ最終濃度）中に複合体を希釈した。
結果
本発明者らは、ルシフェラーゼを発現する２種のがん細胞型における、ルシフェラーゼを標的とするＣＲＩＳＰＲ複合体（ｍＲＮＡ ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ）を送達するためのＡＤＧＮ－１００ペプチドの効力を評価した。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、２ｍＭグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。トランスフェクション前日に１５０，０００個の細胞を播種した２４ウェルプレートを、５０～６０％コンフルエンスとなるまで成長させ、トランスフェクション時に約７０％コンフルエントとなるよう設定した。
トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。次に、細胞に、０．２ｍｌのＡＤＧＮ－１００／ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ（０．２μｇ／２μｇまたは０．５μｇ／５μｇ）を重層し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．４ｍＬの新鮮ＤＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体の重層を除去することなく、１０％の最終ＦＣＳ濃度に達するために、１５％ＦＣＳを含有する２ｍＬの完全ＤＭＥＭを添加した。
細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、ルシフェラーゼ発現に関してトランスフェクション４８時間後にアッセイした。無処置細胞と比べたＲＬＵ（ルミネセンス）のパーセンテージとして、結果を図２０に報告する。対照は、ビヒクルで処置された細胞、裸のＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．５μｇ／５μｇ）で処置された細胞、およびＲＮＡｉＭＡＸ／ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．５μｇ／５μｇ）複合体で処置された細胞を含んだ。図２０に示す通り、両方の細胞系において、ＡＤＧＮ－１００は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の送達を媒介し、ＡＤＧＮ－１００：ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ ０．２μｇ／２μｇおよびＡＤＧＮ－１００：ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ ０．５μｇ／５μｇに対してそれぞれ８０％および９２％の、ルシフェラーゼ発現／ＫＤの主要な低下を誘導した。対照的に、裸のＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（０．５μｇ／５μｇ）によるルシフェラーゼレベルの変化は観察されなかった。脂質に基づく送達方法であるＲＮＡｉＭＡＸを使用して、約４０％のＫＤを得た。データは、ＡＤＧＮ－１００が、がん細胞における活性ＣＲＩＳＰＲ複合体の送達を促進することを示唆する。
本発明者らは次に、膵臓腫瘍マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでルシフェラーゼを標的とするＣＲＩＳＰＲ複合体（ｍＲＮＡ ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ Ｌｕｃ）を送達するためのＡＤＧＮ－１００ペプチドの効力を評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。
２群のマウス（１群当たり２匹の動物）を使用した：食塩水溶液をＩＶ尾静脈注射した対照群、およびＡＤＧＮ－１００／５μｇ ＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／１５μｇ Ｌｕｃ ｇＲＮＡを注射したＡＤＧＮ／ＣＲＩＳＰＲ群。０日目、７日目、１４日目（Ｄ１４）および２０日目（Ｄ２０）に動物に注射した。腫瘍サイズおよび腫瘍におけるＬｕｃ発現の下方調節をバイオルミネセンスイメージングによって評価した。０、７、１４、２０および２８日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。３３日目に、動物を屠殺し、腫瘍を収集した。
図２１Ａおよび図２１Ｂに示す通り、両方の群において、腫瘍サイズは、３３日間の期間にわたって５．５倍増加したため、ルシフェラーゼを標的とするＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ複合体のＩＶ投与は、腫瘍成長に効果がなかった（図２１Ａ）。対照的に、ＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ複合体のＩＶ投与は、腫瘍におけるルシフェラーゼ発現のレベルを劇的に低下させた（図２１Ｂ）。結果は、ＡＤＧＮペプチドが、腫瘍における効率的なｍＲＮＡ ＣＡＳ９／ｇＲＮＡ送達を媒介し、複合体の３回の投与後に無視できるレベルのルシフェラーゼをもたらしたことを実証する。
（実施例７）
冠内局所薬物送達
心筋梗塞後の梗塞の治癒は問題になる場合があり、心筋機能の回復は不完全なことが多い。梗塞の治癒を刺激するために、ＶＥＧＦの局所投与は、損傷部位に新たな血管の形成を増加させることができる。ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡを梗塞領域に直接的に投与することは有益となり得る。局所送達の能力を検査するために、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）をコードするｍＲＮＡをＡＤＧＮペプチドと複合体を形成させて、ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を形成した。多孔性バルーンカテーテル（ＳｃｉｍｅｄもしくはＡｔｒｉｕｍ）または微量注入（ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｉｏｎ）カテーテル（例えば、Ｂｕｌｌｆｒｏｇ、Ｍｅｒｃａｔｏｒ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）など、局所薬物送達に適したカテーテルを使用して、ペプチド／ｂ－ｇａｌ ｍＲＮＡ複合体（ｍＲＮＡ用量１０μｇ～１００μｇ）を、ニュージーランドホワイトラビット（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅ ｒａｂｂｉｔ）またはミニブタの冠動脈壁と接触させたまたはその中に注射した。注入実験の４８時間後に、心臓および適切な動脈セグメントを除去し、ＣＬＳＭのためにホルマリン溶液（４％ｖｏｌ／ｖｏｌ）においてもしくは透過型電子顕微鏡検査のためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．１Ｍ、ｐＨ７中のグルタルアルデヒド（２．７％ｖｏｌ／ｖｏｌ）において固定した、またはβ－ｇａｌ染色の可視化のために適切に調製した。染色の存在は、ｍＲＮＡが有効にトランスフェクトされ、タンパク質へと翻訳されたことの指標であった。
所望のｍＲＮＡの同様の局所投与は、現在利用できる適切な注入デバイスを使用して、身体の他の場所で達成することができる。
（実施例８）
がん治療法における同時ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＴＥＮレスキューおよびＫＲＡＳサイレンシング
方法：ＡＤＧＮ技術は、非共有結合的静電および疎水性相互作用により、核酸の大きな集団と安定した中性ナノ粒子を形成する短い両親媒性ペプチドに基づく。自己集合したＡＤＧＮ／核酸ナノ粒子は、血清および血漿条件において経時的に安定なままである。野生型ＰＴＥＮ ｍＲＮＡまたはＫＲＡＳＧ１２Ｄを標的とするｓｉＲＮＡとのＡＤＧＮペプチド複合体を、膵臓（ＰＡＮＣ１）、卵巣（ＳＫＯＶ３）、前立腺（ＰＣ３）および神経膠芽腫（Ｕ２５）細胞系において評価した。ＰＴＥＮ、ＫＲＡＳおよびＡＫＴリン酸化は、ウエスタンブロットによって評価した。細胞増殖、細胞周期およびアポトーシス活性化は、フローサイトメトリーおよびタネル（Ｔｕｎｅｌ）アッセイによって決定した。ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）および／またはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）と複合体形成したＩＶ投与されたＡＤＧＮ－ペプチドのｉｎ－ｖｉｖｏ有効性を、ＰＡＮＣ１－ＬＵＣマウス異種移植片において検査した。具体的には、６週齢のヌードマウスに、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）を注射し、腫瘍発達させた。次に、表１中の次の群に記載の通りに、４週間にわたって７日毎にマウスを処置した。Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカイン２０ｐｌｅｘを使用して、血液試料におけるＡＤＧＮ－核酸複合体に対するサイトカイン応答を測定した。
表３． 処置群
結果：野生型ＰＴＥＮ ｍＲＮＡのＡＤＧＮ媒介性送達は、検査した細胞系におけるＰＴＥＮ機能をレスキューした。野生型ＰＴＥＮ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ＰＴＥＮを回復させ、これは、細胞増殖の約９０％低下、細胞アポトーシスの３～８倍活性化、ＡＫＴリン酸化の低下、およびＧ１での細胞周期停止をもたらした。図２２Ａ～図２２Ｂ、図２３および図２４を参照されたい。ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡのＡＤＧＮ媒介性送達は、細胞系におけるＫＲＡＳ発現の６０～７０％ノックダウンを誘導し、生存率を有意に５０～７０％低下させた。図２５Ａおよび図２５Ｂを参照されたい。ＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡは、その裸の形態および食塩水対照と比較して、有意な抗腫瘍効果を示した。野生型ＰＴＥＮ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ナノ粒子は、８０％（ｐ＜０．０００１ ＡＮＯＶＡ）の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）をもたらした。図２６Ａおよび図２６Ｂを参照されたい。ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳを含有するＡＤＧＮ－ナノ粒子は、４５～５０％（ｐ＜０．０００１ ＡＮＯＶＡ）のＴＧＩをもたらした。ｍＲＮＡ ＰＴＥＮ含有ＡＤＧＮナノ粒子およびｓｉＲＮＡｓ ＫＲＡＳ含有ＡＤＧＮナノ粒子の組み合わせは、ＰＡＮＣ１異種移植片において９０％（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）のＴＧＩをもたらし、また、遠隔転移（ｄｉｓｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｔｅｓ）の発生を遅らせた。図２６Ａおよび図２６Ｂを参照されたい、また、データは示していない。全処置は耐容性を示し、いずれの群においても有意な体重減少は見られなかった。図２６Ｃを参照されたい。ＡＤＧＮ－核酸複合体の投与後に、非特異的サイトカイン応答は観察されなかった。
結論：ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ｍＲＮＡ ＰＴＥＮおよび／またはｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳ送達を効率的に促進する。ｍＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡと複合体を形成したＡＤＧＮ－ペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、変異したＰＴＥＮおよびＫＲＡＳの標的化において有効であった。さらに、ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳノックダウンとｍＲＮＡ ＰＴＥＮレスキューとの組合せは、腫瘍成長を有意に阻害する。これは、腫瘍抑制因子および発癌遺伝子の両方を同時に標的化するための新たな戦略を示唆する。
（実施例９）
腫瘍細胞におけるペプチド媒介性ｐ５３腫瘍抑制因子ｍＲＮＡ送達
材料
Ｐ５３ ｍＲＮＡ：Ｐ５３ ｍＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して得た。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型として直鎖状ベクターを使用して合成し（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２４８５９）、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。合成されたｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール：クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿によって精製し、次いで、ＵＶ光の吸光度によって定量した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける紫外光の吸光度を測定することにより決定した。１μｇのＤＮＡ鋳型を使用して、１８μｇのキャップ化ｍＲＮＡを得て、－２０℃で貯蔵した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから、ポリアデニル化およびキャップ化形態としてＣＡＳ９ ｍＲＮＡを得た。
ＡＤＧＮペプチド：次のペプチド配列を使用した。
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）
細胞系：膵がん細胞ＰＡＮＣ－１、前立腺がん細胞ＰＣ３、卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３およびヒト線維芽細胞ＨＳ６８は、ＡＴＣＣから得た。
方法
ｍＲＮＡとの複合体形成。２４ウェルプレートにおいて培養された２～５ １０６個の細胞または約７０～８０％のコンフルエンシーの細胞のトランスフェクションのために、次のプロトコールを使用した。ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ粒子は、２種の用量のｍＲＮＡ（０．５μｇおよび１．０μｇ）を使用して、２０：１モル比のＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡで調製した。Ｐ５３ ｍＲＮＡ（０．５または１．０μｇ）を２０μｌの滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中に室温で希釈した。１０μｌ最終ペプチド溶液を０．５μｇのｍＲＮＡに対して添加した、または２０μｌ最終ペプチド溶液を１μｇのｍＲＮＡに対して添加して、それぞれ３０μｌまたは４０μｌの総体積を得た。滅菌水で体積を１００μｌに調整し、溶液（ｓｏｌｕｔｕｒｅ）を低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、５％スクロースを含有する滅菌水を添加することにより、体積を２００μｌにし、溶液をボルテックス１分間低速により穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、細胞トランスフェクションまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与に進んだ。
トランスフェクションプロトコール。２４ウェルプレートフォーマットのためのプロトコールが報告されている。体積は、より大きい体積および異なるプレートフォーマットに最適化することができる。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、２ｍＭグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。トランスフェクション前日に１５０，０００個の細胞を播種した２４ウェルプレートを、５０～６０％コンフルエンスとなるまで成長させ、トランスフェクション時に約７０％コンフルエンスとなるよう設定した。
トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。次に、細胞に、０．２ｍｌの複合体溶液を重層し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．４ｍＬの新鮮ＤＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体の重層を除去することなく、１０％の最終ＦＣＳ濃度に達するために、１５％ＦＣＳを含有する完全ＯＰＴｉＭＥＭ（高グルコース）またはＤＭＥＭを２ｍＬ添加した。
細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、トランスフェクション７２時間後にアッセイした。Ｐ５３発現のレベルは、Ｐ５３ ＷＴモノクローナル抗体（ｐ５３抗体＃９２８２ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙまたはＤＯ ＳＣ１２６ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用したウエスタンブロットによって解析し、Ｐ５３ ＷＴ発現の影響は、ＭＴＴアッセイを使用した増殖アッセイおよびフローサイトメトリーアッセイを使用したアポトーシス／細胞周期進行によってモニターする。細胞アポトーシス率（パーセンテージとして表現）および細胞周期ステージは、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＡＰＯ ＢｒＤｕキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。
結果
全細胞型について、Ｐ５３のレベルは、ｐ５３抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用したウエスタンブロットによって評価した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ４．１ソフトウェアを使用して、タンパク質バンドを解析し、相対的タンパク質発現レベルを、β－アクチンに対して正規化した（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．）。
図２７Ａに報告されている通り、野生型Ｐ５３発現のレベルは、細胞型に依存した。非常に低いＰ５３野生型発現が、ＰＡＮＣ１（２１％）およびＰＣ３細胞（２０％）において観察される。ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞において、野生型Ｐ５３のレベルは、非形質転換細胞（ＨＳ－６８）におけるレベルの５１％に相当する。Ｐ５３野生型発現レベルの差は、以前に報告された研究と一致した；その研究は、Ｐ５３野生型活性の喪失が、Ｐ５３遺伝子における変異に主に関連することを示している。
ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体を、異なるがん細胞型におけるＰ５３ＷＴ ｍＲＮＡの細胞送達に関して評価した。細胞に、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６のいずれかと複合体形成した０．５および１μｇ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、４８時間後にＰ５３発現のレベルをウエスタンブロットによって解析した。図２７Ｂに報告されている通り、全ての事例において、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６は、Ｐ５３ ＷＴ ｍＲＮＡの効率的な送達を促進し、Ｐ５３タンパク質発現をもたらす。
次に、６日間の期間にわたって細胞増殖をモニタリングすることにより、がん細胞調節におけるＰ５３発現の影響を評価した。図２８に報告されている通り、全細胞型において、Ｐ５３野生型ｍＲＮＡの発現は、細胞増殖の阻害と直接的に相関した。ＰＡＮＣ１；ＰＣ３およびＳＫＯＶ３細胞に関して、７１％、６３％および５０％の細胞増殖阻害を得た。がん細胞の成長曲線の低下は、６日目に著しく、野生型Ｐ５３発現が、細胞の生存率を強く減少させる、またはその増殖を減速させることを示す。
フローサイトメトリーデータは、図２９に示す通り、細胞アポトーシスの比率が、対照細胞と比較して、野生型Ｐ５３を発現する細胞において有意に増強されたことを実証した。アポトーシスレベルは、ＰＡＮＣ－１細胞において５倍、ＳＫＯＶ－３およびＰＣ３細胞において２．８倍増加する。
結果は、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６が、がん細胞におけるＰ５３ ｍＲＮＡの送達のための強力な薬剤であることを実証した。ＡＤＧＮペプチド媒介性ｍＲＮＡ送達は、外来性野生型Ｐ５３の大きい発現をもたらし、腫瘍細胞の成長を大幅に阻害し、細胞アポトーシスおよび細胞死を促進することにより、Ｐ５３機能をレスキューする。
（実施例１０）
ペプチド媒介性ｐ５３腫瘍抑制因子ｍＲＮＡ送達ｉｎ ｖｉｖｏ膵臓腫瘍異種移植モデル
Ｐ５３ ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮペプチド（ＡＤＧＮ－１００）の効力を、膵臓腫瘍マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。２つの対照群Ｇ１＆Ｇ２（１群当たり３匹の動物）および１つの処置群（Ｇ３）（１群当たり４匹の動物）を含む、３群のマウスを使用した。異なる群を次に示す：
Ｇ１：対照無処置マウス（対照）（３匹の動物／群）
Ｇ２：裸のｍＲＮＡ １０ｕｇ（裸の）（３匹の動物／群）
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１００／１０μｇ Ｐ５３ ｍＲＮＡ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
５日毎に動物に注射した。マウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体１００μｌのＩＶ尾静脈注射を与えた。腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を、光子／秒（光子／ｓ）として表現した。０、７、１４および２１日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。
図３０に報告されている通り、対照群および裸のｍＲＮＡ群において、腫瘍サイズは、２１日間の期間にわたって３．４～３．６倍増加した。ＡＤＧＮ－１００を使用した１０μｇのＰ５３ ｍＲＮＡのＩＶ投与は、腫瘍成長を有意に阻害し、サイズはわずか２．３倍増加した。結果は、ＡＤＧＮペプチドが、効率的な野生型Ｐ５３ ｍＲＮＡ送達を媒介し、Ｐ５３機能を回復させ、膵臓腫瘍成長を阻害したことを実証した。
（実施例１１）
腫瘍細胞におけるｐ５３またはＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのペプチド媒介性共送達
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６を、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡまたはＰ５３ ｍＲＮＡ、およびいくつかのＫＲＡＳ変異を標的とするｓｉＲＮＡのカクテルの共送達に関して評価した。正常ＫＲＡＳタンパク質は、正常組織シグナル伝達における必須の機能を果たし、ＫＲＡＳ遺伝子の変異は、多くのがんの発生における必須のステップである。本明細書において、本発明者らは、ｍＲＮＡと一緒にＫＲＡＳ発癌遺伝子のｓｉＲＮＡ標的化を組み合わせて、ＰＴＥＮまたは／およびＰ５３腫瘍抑制因子機能を回復させた。これにより、抗がん標的化アプローチのための新たな展望が提供され得る。
培養されたがん細胞系における、コドン１２または６１における特異的ミスセンス変異に関係なくＫＲＡＳ発現を強力に阻害する、異なるＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの送達の影響を先ず検証した。次のＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを選択した：
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を特異的に標的とするための、ｓｉＲＮＡ ５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８３）および５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８４）
ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋ変異を特異的に標的とするための、ｓｉＲＮＡ ５’－ＧＡＡＧＵＧＣＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴ－３’’（センス）（配列番号８６）および５’－ＧＵＣＵＣＧＧＵＧＵＡＧＣＡＣＵＵＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８７）
ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異を特異的に標的とするための、ｓｉＲＮＡ ５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）（配列番号８８）および５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）（配列番号８９）。
ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡを先ず培養されたがん細胞において評価した。単一ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭおよび４０ｎＭ）またはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの組合せ（各５ｎＭまたは２０ｎＭ）を、２０／１ペプチドモル比でＡＤＧＮ－１０６に会合させた。
膵がん細胞ＰＡＮＣ－１、前立腺がん細胞ＰＣ３、卵巣がん細胞ＳＫＯＶ３およびヒト線維芽細胞ＨＳ６８に、ＡＤＧＮ－１０６：ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクトし、次いで、その後の６日間の期間にわたって細胞増殖を測定した。
図３１Ａおよび図３１Ｂならびに表４は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏルミネセント細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してトランスフェクション７日後に測定された細胞増殖を報告した。結果は、ＡＤＧＮ－１０６媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡが、がん細胞増殖の有意な減少と直接的に相関する、ＫＲＡＳ変異型の著しい（ｍａｒｋｅｔ）ＫＤを誘導したことを実証した。Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｃ変異型を標的とするｓｉＲＮＡの組合せは、検査した全がん細胞型の増殖阻害を増加させた。Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｃ ｓｉＲＮＡの組合せは、低濃度であっても著しい増強作用を示す。対照的に、Ｑ６１Ｋ ＫＲＡＳ変異を標的とするｓｉＲＮＡを添加することにより、増強作用は得られなかった。非形質転換ＨＳ６８線維芽細胞の細胞において、増殖の変化は得られなかった。
表４． トランスフェクション７日後に測定された細胞増殖の阻害（％単位）
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６を、ＰＴＥＮ ｍＲＮＡまたはＰ５３ ｍＲＮＡ、およびいくつかのＫＲＡＳ変異を標的とするｓｉＲＮＡのカクテルの共送達に関して評価した。ＰＴＥＮおよびＰ５３ ｍＲＮＡをＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡと組み合わせ、ＰＡＮＣ１およびＳＫＯＶ－３がん細胞において評価した。ＡＤＧＮ－１００を、０．２５μｇ（５．７ｎＭ）および０．５μｇ（１１．５ｎＭ）においてそれぞれｍＲＮＡ ＰＴＥＮおよびＰ５３送達に使用した。ＡＤＧＮ １０６を、それぞれ５ｎＭでＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（Ｇ１２Ｄ／Ｇ１２Ｃ）送達に使用した。細胞増殖データを図３２および表５に報告する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏルミネセント細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、トランスフェクション後８日間の期間にわたって細胞増殖を測定した。図３２および表５に報告されている通り、ｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳと共にｍＲＮＡを組み合わせることには重要な相乗作用がある。ＰＴＥＮまたはＰ５３ ｍＲＮＡとＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ／Ｇ１２Ｃとの組合せは、がん細胞増殖の阻害を有意に増加させた。ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡまたはＰ５３ ｍＲＮＡ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡにより重要な増強作用が得られた。Ｐ５３ ｍＲＮＡとＰＴＥＮ ｍＲＮＡとの組合せは、細胞増殖における中等度の影響をもたらし、全３種のＰＴＥＮ ｍＲＮＡ／Ｐ５３ ｍＲＮＡ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの組合せによって有意な増強作用は得られなかった。これらのデータは、腫瘍抑制因子および発癌遺伝子併用療法が、がん処置において有用となり得ることを示す。
表５．トランスフェクション７日後に測定された細胞増殖阻害の阻害（％単位）
（実施例１２）
ｉｎ ｖｉｖｏ膵臓腫瘍異種移植モデルでのペプチド媒介性ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ送達
コドン１２における変異を標的とするＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの共投与の影響を評価した。６週齢の雌ヌードマウスに、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を注射した。動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。動物を７日毎に処置した。マウスに、次の群に記載の通りに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ複合体１００μｌのＩＶ注射を与えた：
Ｇ１：対照無処置マウス（対照）
Ｇ２：５μｇ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ／５μｇ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
Ｇ３：ＡＤＧＮ－１０６／５μｇ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ／５μｇ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ用量０．５ｍｇ／ｋｇ
腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を、光子／秒（光子／ｓ）として表現した。０、７、１４および２１日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。
図３３に報告されている通り、対照群および裸のｓｉＲＮＡ群において、腫瘍サイズは、２１日間の期間にわたって３．６および３．４倍増加した。ＡＤＧＮ－１０６を使用した５μｇ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ／５μｇ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのＩＶ投与は、腫瘍成長を７７％（１．５倍）低下させた。結果は、ＡＤＧＮ－１０６が、ＫＲＡＳ
Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄ ｓｉＲＮＡの両方のｉｎ ｖｉｖｏ送達を媒介し、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵腫瘍進行の阻害におけるｓｉＲＮＡ ＫＲＡＳの間の相乗作用を実証したことを示す。
（実施例１３）
ｉｎ ｖｉｖｏ ＡＤＧＮ媒介性第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡ送達評価
第ＶＩＩＩ因子レベルを回復させるために、肝臓において第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡを送達するためのＡＤＧＮ－１００／ＡＤＧＮ１０６の効力を、ＩＶまたは皮下（ＳＱ）投与のいずれかの後に評価した。ＦＶＩＩＩを標的とするＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＳＰＲ ＦＶＩＩＩ）を使用して、Ｂａｌｂ Ｃマウスにおける内在性の、肝細胞で発現される血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を標的化することにより、低い第ＶＩＩＩ因子レベルを有するマウスを先ず確立した。
第ＶＩＩＩ因子（マウス）遺伝子内の５’構成的エクソンＩに二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことにより遺伝子発現を破壊するように、第ＶＩＩＩ因子ｇＲＮＡを設計した。ゲノムスケールＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ｖ２ライブラリーに由来するｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって、第ＶＩＩＩ因子ｇＲＮＡを得た。第ＶＩＩＩ因子標的部位：ＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴ（配列番号９０）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写され得るＰＣＲ産物の鋳型としてのＴ７プロモーターアダプター配列を含有するジェネリックｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用して、ｓｇＲＮＡの生成を行った。製造業者の指示に従ってＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７高収率転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、フランス）を使用して、Ｔ７プロモーター結合部位と、それに続く２０ｂｐ ｓｇＲＮＡ標的配列を含有する直鎖状ＤＮＡ断片をｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｇＲＮＡをエタノールで沈殿させ、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ転写クリーンアップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してさらに精製した。ｓｇＲＮＡのストック溶液を水に可溶化し、ＵＶ吸光度によって定量し、－８０℃で貯蔵した。
ＣＡＳ９ ｍＲＮＡは、ポリアデニル化およびキャップ化形態としてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから得た。本実験において２７匹のマウスを使用した。群Ｇ１（３匹のマウス）由来の対照マウスに、無処置対照群として１００μｌの食塩水緩衝液のＩＶ注射を与えた。肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の永続的ノックアウトを得るために、０日目に、群Ｇ２～Ｇ８（各３匹のマウス）由来の残っている２４匹のマウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ ｍＲＮＡ／Ｆ ＶＩＩＩ ｇＲＮＡ複合体１００μｌのＩＶ注射を与えた（ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｆ ＶＩＩＩ用量０．５ｍｇ／ｋｇ）。１０日後に、ＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ Ｆ ＶＩＩＩを注射された動物を、次の通りに８つの異なる群（１群当たり３匹の動物）に分けた：
Ｇ２：処置なし
Ｇ３：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（２０μｇ単回ＳＱ注射）
Ｇ４：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（４０μｇ単回ＳＱ注射）
Ｇ５：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（５０μｇ単回ＳＱ注射）
Ｇ６：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６（２０μｇ単回ＳＱ注射）
Ｇ７：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６（４０μｇ単回ＳＱ注射）
Ｇ８：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１０６（５０μｇ単回ＳＱ注射）
Ｇ９：ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００（１０μｇ単一ＩＶ注射）
０日目～４５日目の異なる時点で第ＶＩＩＩ因子Ｅｌｉｓａキットを使用して、血液試料における第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。動物の体重を３～５日毎に測定した。
図３４に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００媒介性ＣＲＩＳＰＲ Ｆ ＶＩＩＩ複合体送達は、血漿における第ＶＩＩＩ因子タンパク質レベルの主要な下方調節を誘導した。ＣＲＩＳＰＲ効果は、２日目から観察され、１０日目に７５％ノックダウンに達する。ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６媒介性ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ送達は、血漿における第ＶＩＩＩ因子レベルのｍＲＮＡ用量依存性の急速な肝臓発現および回復をもたらす。ＦＶＩＩＩの回復は、ｍＲＮＡ ＩＶおよびＳＱ投与のそれぞれ１０日および１５日後に得られる。表６に報告されている通り、ＦＶＩＩＩ回復のレベルは、投与機序および注射されるｍＲＮＡの用量に依存する。ｍＲＮＡレベルは１０日間において維持され、次いで、第ＶＩＩＩ因子ｉｎ ｖｉｖｏターンオーバーと一致して急速に減少した。対照的に、対照において、５０日目にＦＶＩＩＩ回復は測定されなかった。
表６． ｍＲＮＡ投与１５日後（実験３０日目）のＦＶＩＩＩ回復のレベル
ＡＤＧＮ関連毒性も動物の体重における変更も検出されなかった。したがって、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６は、ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ ＩＶおよびＳＱ投与のための強力な無毒性方法であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける多数の遺伝的障害の補正に使用することができる。
次に、第ＶＩＩＩ因子発現レベルを６０％よりも高く維持するために、複数回のＳＱ投与による処置において使用することができる異なる用量のｍＲＮＡを評価した。肝臓における第ＶＩＩＩ因子発現の永続的ノックアウトを得るために、０日目に、Ｂａｌｂ Ｃマウス群Ｇ２～Ｇ８の新たなセット（下の表７に従って）に、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ ｍＲＮＡ／Ｆ ＶＩＩＩ ｇＲＮＡ複合体１００μｌのＩＶ注射を与えた（ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ Ｆ ＶＩＩＩ用量０．５ｍｇ／ｋｇ）。対照として、群Ｇ１由来のマウスに、無処置群として１００μｌの食塩水緩衝液のＩＶ注射を与えた。１０日後に、ＡＤＧＮ－１００／ＣＲＩＳＰＲ Ｆ ＶＩＩＩを注射された動物に、初期ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００用量をＳＱ注射（４０μｇ単回ＳＱ注射）し、２週間目に、動物を５つの異なる群（１群当たり４匹の動物）に分け、ＳＱ注射によって、異なる用量のｍＲＮＡ複合体（下表に従って）で処置した。Ｅｌｉｓａ発色性第ＶＩＩＩ因子活性アッセイを使用して、第ＶＩＩＩ因子レベルをモニターした。動物の体重を１週間に１回測定した。３ヶ月間の期間にわたって処置を行った。
表７．
図３５に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００媒介性ＣＲＩＳＰＲ Ｆ ＶＩＩＩ複合体送達は、血漿における第ＶＩＩＩ因子タンパク質レベルの主要な下方調節を誘導して、１０日目に７５～７８％ノックダウンに達した。ＡＤＧＮ－１００媒介性４０μｇ ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡ ＳＱ送達は、第ＶＩＩＩ因子の急速な肝臓発現および血漿における最大６０％の第ＶＩＩＩ因子レベルの回復をもたらす。ＦＶＩＩＩの回復は、ｍＲＮＡ投与の１０日後に得られる。初期ｍＲＮＡ用量注射の２週間後の２０μｇ、３０μｇおよび４０μｇのｍＲＮＡのＳＱ注射は、第ＶＩＩＩ因子発現レベルを６０％に維持した。対照的に、１０μｇ ｍＲＮＡをＳＱ注射したマウスは、第ＶＩＩＩ因子発現の減少を示す。
（実施例１４）
膵腫瘍および卵巣腫瘍におけるｐ５３またはＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのペプチド媒介性共送達
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６を、膵臓および卵巣腫瘍マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＥＮ ｍＲＮＡまたはＰ５３ ｍＲＮＡ、およびいくつかのＫＲＡＳ変異を標的とするｓｉＲＮＡのカクテルの共送達に関して評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）または卵巣がん細胞（ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。
動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。
表８に示す通り、１５群のマウス（１群当たり４匹の動物）を使用した。
表８．
５日毎に動物に注射した。マウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体１００μｌのＩＶ尾静脈注射を与えた。腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を、光子／秒（光子／ｓ）として表現した。０、７、１４および２１日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。
Ａ．膵腫瘍におけるｐ５３またはＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのペプチド媒介性共送達
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６を、膵臓および卵巣腫瘍マウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＥＮ ｍＲＮＡまたはＰ５３ ｍＲＮＡ、およびいくつかのＫＲＡＳ変異を標的とするｓｉＲＮＡのカクテルの共送達に関して評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。
動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。
６群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ２）、ＡＤＧＮ－１００／Ｐ５３ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ３）、ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）／ＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ＳｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ４）、ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ／Ｐ５３ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ５）およびＡＤＧＮ－１００／Ｐ５３ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）／ＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ６）を注射されたマウスと識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、４、７、１１、１５、２０、２５、３０、３７日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
図４２に報告されている通り、対照群において、腫瘍サイズは、２５日間の期間にわたって５．５倍増加した。ＡＤＧＮ－１００を使用したＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）またはＰ５３ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ投与は、それぞれ３．５および４．２倍に腫瘍成長を制限した。１０μｇのＰＴＥＮ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ）を標的とするｓｉＲＮＡのカクテル／ＡＤＧＮ－１０６（各５μｇ）のＩＶ投与による共送達は、２５日間の期間にわたって２．９倍に、３８日間の期間にわたって３．８倍に腫瘍成長を制限し、これは、４７％腫瘍成長阻害に相当する。１０μｇのＰ５３ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ）を標的とするｓｉＲＮＡのカクテル／ＡＤＧＮ－１０６（各５μｇ）のＩＶ投与による共送達は、２５日間の期間にわたって３．４倍に、３８日間の期間にわたって４．４倍に腫瘍成長を制限し、これは、３８％腫瘍成長阻害に相当する。ＡＤＧＮ－１００を使用した１０μｇのＰＴＥＮ ｍＲＮＡ／Ｐ５３ ｍＲＮＡのＩＶ投与による共送達は、２５日間の期間にわたって２．４倍に、３８日間の期間にわたって３．０倍に腫瘍成長を制限し、これは、５９％腫瘍成長阻害に相当する。
結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでの膵腫瘍進行の阻害における、ＰＴＥＮとＰ５３機能回復との間の、ならびにＰ５３機能回復とＫＲＡＳ変異阻害との間の相乗作用を実証した。これらのデータは、腫瘍抑制因子および発癌遺伝子併用療法が、がん処置において有用となり得ることを示す。
（実施例１５）
アブラキサン（ｎａｂ－パクリタキセル）および／またはゲムシタビンと組み合わせた、膵腫瘍におけるＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよび／またはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのペプチド媒介性共送達
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６を、膵臓マウスモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびいくつかのＫＲＡＳ変異（Ｇ１２Ｄ／Ｇ１２Ｃ）を標的とするｓｉＲＮＡのカクテルの共送達に関して評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。
動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。
表９に示す通り、複数の群のマウス（ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）（１群当たり４匹の動物）を使用した。
表９．
５日毎に動物に注射した。マウスに、食塩水緩衝液（９０ｍＭ ＮａＣｌ）中のＡＤＧＮ／ｍＲＮＡまたはＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体１００μｌのＩＶ尾静脈注射を与えた。腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。ルシフェラーゼ陽性腫瘍細胞シグナルの半定量的データは、製造業者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。結果を、光子／秒（光子／ｓ）として表現した。０、７、１４および２１日目に、バイオルミネセンスイメージングを行った。次に、結果を、０日目と比べた値として表現した。
Ａ．アブラキサン（ｎａｂ－パクリタキセル）と組み合わせた、膵腫瘍におけるＰＴＥＮ
ｍＲＮＡおよび／またはＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡのペプチド媒介性共送達
ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６を、膵臓マウスモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびいくつかのＫＲＡＳ変異（Ｇ１２Ｄ／Ｇ１２Ｃ）を標的とするｓｉＲＮＡのカクテルの共送達に関して評価した。６週齢の雌ヌードマウスの膵臓に、ヒト膵癌細胞系（Ｐａｎｃ１－Ｌｕｃ）（２００μｌ ＰＢＳ中に２０×１０６個の細胞）を植え込んだ。
動物は、２２℃の一定温度で１２時間／１２時間の明／暗周期による専用の部屋において、２～４匹の動物のケージ内で（推奨される面積表面／動物に従って）、病原体を含まない条件下で維持し、自由に摂食および飲水させた。実験が始まる前に、腫瘍発達のために３週間の期間を置いた。
０、７、１４、２１、２８および３４日目に、１週間に１回動物に注射した。マウスに、１００μｌ ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（１０μｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）またはＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ＳｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ＆Ｇ１２Ｄ（５ｕｇ／５μｇ）複合体および／またはアブラキサン（５０μｇパクリタキセル、２．５ｍｇ／ｋｇ）のＩＶ注射を与えた。６群のマウスを、対照無処置マウス（Ｇ１）、ＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）／ＡＤＧＮ／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ２）、アブラキサン（２．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ３）、アブラキサン（２．５ｍｇ／ｋｇ）ＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ４）、アブラキサン（２．５ｍｇ／ｋｇ）ＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ＳｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ＆Ｇ１２Ｄ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ５）またはアブラキサン（２．５ｍｇ／ｋｇ）／ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）／ＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ＳｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ＆Ｇ１２Ｄ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｇ６）を注射されたマウスに識別した。動物に、７日毎にＩＶ尾静脈注射した。０、４、７、１１、１５、２０、２５、３０、３７日目に、腫瘍サイズをバイオルミネセンスイメージングによって評価した。
結果が図４３に報告されており、対照群において、腫瘍サイズは、２５日間の期間にわたって５．４増加した。１０μｇのＰＴＥＮ ｍＲＮＡ／ＡＤＧＮ－１００およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ）を標的とするｓｉＲＮＡのカクテル／ＡＤＧＮ－１０６（各５μｇ）のＩＶ投与による共送達は、２５日間の期間にわたって２．９倍に、３８日間の期間にわたって４．２倍に腫瘍成長を制限し、これは、４７％腫瘍成長阻害に相当する。アブラキサン（５０μｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ）の投与は、２５日間の期間にわたって３．９倍に、３８日間の期間にわたって５．２倍に腫瘍成長を低下させ、２９％腫瘍成長阻害に相当する。
ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡと共にまたはＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ＳｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ＆Ｇ１２Ｄと共にアブラキサンを組み合わせることは、腫瘍成長を有意にそれぞれ７５％および７０％阻害する。腫瘍サイズは、両方の事例で３８日間の期間にわたってわずか１．８倍増加した。最も際立つことに、アブラキサン、ＡＤＧＮ－１００／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ Ｇ１２Ｃ＆Ｇ１２Ｄの組合せで処置したマウスは、０日目と比較して縮小した腫瘍を有した。
（実施例１６）
ヒト骨肉腫細胞におけるＡＤＧＮ媒介性ｐ５３腫瘍抑制因子ｍＲＮＡ送達
全骨原性肉腫（ＯＳ）のうちの大きいパーセントが、ｐ５３を不活性にするｐ５３変化を有する。ｐ５３活性の喪失は、これらの腫瘍において発癌性ドライバーとなる場合がある。青年期および若年成人のこの高悪性度骨腫瘍における改善された治療法の必要は、治療法および成績が過去２０年間にわたって変化していないという事実によって証明される。ｐ５３ ｍＲＮＡを有するＡＤＧＮペプチドを使用して、本発明者らは、ＯＳにおいてｐ５３を再発現させることができる。十分に遺伝学的に特徴付けされたヒトＯＳ細胞系、例えば、Ｇ２９２、ＨＯＳ、ＳａＯＳｓおよびＭＧ６３は全て、ｐ５３変化を有する。これら細胞系のそれぞれは、また、マウス異種移植片として成長させる。
本発明者らは、リアルタイムイメージングを使用して、これらＯＳ細胞系のぞれぞれのｉｎ ｖｉｔｒｏ成長における、野生型ｐ５３の再発現の効果を検査する。各細胞系は、４反復（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）で検査され、本発明者らは、ｗｔ ｐ５３を発現する細胞および対照感染細胞を比較して、４時間毎にリアルタイムイメージングをアッセイすることにより成長曲線を得る。次に、本発明者らは、ＡＤＧＮ－ペプチドｐ５３ ｍＲＮＡ複合体で処置したマウス異種移植モデルにおいてこれらの研究に従事する。
（実施例１７）
ヒト骨肉腫細胞におけるＡＤＧＮ媒介性ｐ５３腫瘍抑制因子ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰ ｍＲＮＡ送達
ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体は、ヒト骨肉腫細胞Ｇ－２９２におけるＰ５３ ＷＴ ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰ ｍＲＮＡの細胞送達に関して評価した。
Ａ．ｐ５３腫瘍抑制因子ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰ ｍＲＮＡの送達
材料
ｍＲＮＡ。トランスフェクションの陽性対照としてｅＧＦＰ ｍＲＮＡを使用した。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）は、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から得た。Ｐ５３ ｍＲＮＡは、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用して得た。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型として直鎖状ベクターを使用して合成し（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２４８５９）、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。合成されたｍＲＮＡは、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール：クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿によって精製し、次いで、ＵＶ光の吸光度によって定量した。ｍＲＮＡ翻訳またはヌクレアーゼ安定性を増強するために特異的な改変は加えなかった。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける紫外光の吸光度を測定することにより決定した。１μｇのＤＮＡ鋳型を使用して、１８μｇのキャップ化ｍＲＮＡを得て、－２０℃で貯蔵した。
ＡＤＧＮペプチド：次のペプチド配列を使用した。
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ（配列番号７７）
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号７９）
細胞系：ヒト骨肉腫細胞Ｇ－２９２、クローンＡ１４１Ｂ１は、ＡＴＣＣから得た。
方法。ｍＲＮＡとの複合体形成。２４ウェルプレートにおいて培養された２～５ １０６個の細胞または約７０～８０％のコンフルエンシーの細胞のトランスフェクションのために、次のプロトコールを使用した。ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ粒子は、３種の用量のｍＲＮＡ（０．２５μｇ、０．５μｇおよび１μｇ）を使用して、２０：１モル比のＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ（ＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６）で調製した。Ｐ５３ ｍＲＮＡまたはｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（０．２５、０．５および１μｇ）を２０μｌの滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中に室温で希釈した。５μｌ、１０μｌおよび２０μｌ最終ペプチド溶液を、０．２５μｇ、０．５μｇおよび１μｇのｍＲＮＡに対して添加して、それぞれ２０μｌまたは３０μｌの総体積を得た。体積を滅菌水で５０μｌに調整し、ボルテックス１分間低速により穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、５％スクロースを含有する滅菌水を添加することにより、体積を１００μｌにし、溶液をボルテックス１分間低速により穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、細胞トランスフェクションに進んだ。
トランスフェクションプロトコール。２４ウェルプレートフォーマットのためのプロトコールが報告されている。細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下、２ｍＭグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。トランスフェクション前日に１５０，０００個の細胞を播種した２４ウェルプレートを、５０～６０％コンフルエンスとなるまで成長させ、トランスフェクション時に約７０％コンフルエンスとなるよう設定した。トランスフェクション前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。次に、細胞に、０．１ｍｌの複合体溶液を重層し、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。０．２ｍＬの新鮮ＤＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。次に、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体の重層を除去することなく、１０％の最終ＦＣＳ濃度に達するために、１５％ＦＣＳを含有する１ｍＬの完全ＤＭＥＭを添加した。
細胞を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻し、トランスフェクション２、４、５および７日後にアッセイした。発現およびＰ５３ ＷＴ発現の影響をウエスタンブロット、およびＭＴＴアッセイを使用した増殖アッセイによってモニターし、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリーアッセイによって定量する。
結果
ｅＧＦＰ発現のレベルをフローサイトメトリーによって評価した。図３６に報告されている通り、全ての事例において、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６は、ｅＧＦＰ
ｍＲＮＡの効率的な送達を促進し、用量依存性様式でのｅＧＦＰ発現をもたらす。送達のためにＡＤＧＮ１００またはＡＤＧＮ１０６のいずれかを使用して、全ｍＲＮＡ濃度でｅＧＦＰ ｍＲＮＡ発現が観察された。ｅＧＦＰ発現は、０．２５μｇ～０．５μｇの間のｍＲＮＡ濃度で２倍に増加し、０．５～１μｇの間のｍＲＮＡでわずか２５％増加した。全事例において、ｅＧＦＰの発現は、２日目に開始し、最大タンパク質発現は５日目であったが、これは７日目に安定したままである。
図３７に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６粒子の両方と０．５および１．０μｇのｍＲＮＡを使用して、Ｐ５３ ＷＴの発現は有意に増加した。Ｐ５３のレベルは、０．５および１．０μｇ ｍＲＮＡによりそれぞれ５倍および７～８倍増加した。０．２５μｇ ｍＲＮＡを使用して、Ｐ５３レベルのごく僅かな変化が観察された（バックグラウンドの１．２倍）。
図３８に報告されている通り、Ｐ５３ ＷＴ ｍＲＮＡの発現は、細胞増殖の阻害と直接的に相関した。ＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００と複合体形成した１．０μｇ
ｍＲＮＡを使用して、それぞれ５９％および５６％の細胞増殖阻害を得た。ＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００と複合体形成した０．５μｇ ｍＲＮＡを使用して、それぞれ３１％および３８％の細胞増殖阻害を得た。対照的に、ＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００と複合体形成した０．２５μｇ ｍＲＮＡを使用して、それぞれ８％および１１％のほんの軽微な細胞増殖阻害を得た。Ｇ２９２細胞の成長曲線の低下は、７日目に著しく、野生型Ｐ５３発現が、細胞の生存率を減少させる、またはその増殖を減速させることを示す。ＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００と複合体形成したｅＧＦＰ ｍＲＮＡを対照として使用し（０．５ｕｇ）、処置なし対照と同様に細胞増殖の阻害を示さなかった。
結果は、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６が、ヒト骨肉腫細胞Ｇ－２９２におけるＰ５３ ｍＲＮＡの送達のための強力な薬剤であることを実証した。ＡＤＧＮペプチド媒介性ｍＲＮＡ送達は、腫瘍細胞の成長を阻害することにより、Ｐ５３機能のレスキューをもたらす。
Ｂ．５ｍｏＵ改変ｅＧＦＰ ｍＲＮＡの送達
ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体を、ヒト骨肉腫細胞Ｇ－２９２における５ｍｏＵ改変ｅＧＦＰ ｍＲＮＡの細胞送達に関して評価した。本発明者らは、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の細胞発現のレベルおよび安定性におけるｍＲＮＡの５ｍｏＵ改変の影響を評価した。２４ウェルプレートにおいてＧ２９２細胞を成長させた。０．５μｇおよび１μｇの、無改変のおよび５ｍｏＵ改変ｅＧＦＰ ｍＲＮＡを、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６に会合させ、細胞処置に先立つ（ｐｒｉｏｒ
ｃｅｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）１０％または２５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）のいずれかを含有する完全培地の存在下における３時間インキュベーション後に、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の安定性を評価した。６日目にｅＧＦＰ発現のレベルをフローサイトメトリーによって評価した。
図４１に報告されている通り、全ての事例において、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６は、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡおよびｅＧＦＰ ｍＲＮＡ ５ｍｏＵの効率的な送達を促進し、ｅＧＦＰ発現をもたらした。ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の両方に関して、５ｍｏＵ改変を含むｍＲＮＡを使用した場合、ｅＧＦＰ発現は、２５％増加した。１０％血清とのインキュベーション後に、ｅＧＦＰ発現レベルにおける改変は観察されなかった。対照的に、２５％血清の存在は、どのｍＲＮＡを使用しても、ｅＧＦＰ発現を５０～６０％減少させた。
（実施例１８）
局所送達によるＡＤＧＮ媒介性ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｌｕｃ送達
安定したＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡを、噴霧化／非外科的気管内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に関して評価した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中の５ｍｏＵ改変Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（６０μｇ）をＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合し、体積を滅菌水で５００μｌに調整した。試料を低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。注射の直前に、５％の最終スクロース濃度に達するように、体積をスクロース２０％で６００μｌに調整した。試料を低速で１分間のボルテックスにより穏やかに混合し、マウスに投与した。
群１由来のマウスに、それぞれ１０μｇのＬｕｃ ｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ溶液を噴霧化／非外科的気管内投与により与えた（１群当たり６匹の動物）。対照として、群２（１群当たり２匹の動物）由来のマウスに、１００μｌ食塩水溶液の噴霧化／非外科的気管内投与を与えた。ｍＲＮＡ Ｌｕｃ発現をバイオルミネセンスによってモニターした。投与の６時間および２４時間後に、バイオルミネセンスイメージングを行った。非侵襲的バイオルミネセンスイメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のため、マウスに１５０μｇ／ｇルシフェリンのｉ．ｐ．注射を与えた。２４時間目に動物を屠殺し、器官を収集した。異なる器官におけるｍＲＮＡ発現をバイオルミネセンスによってモニターした。器官をルシフェリン（３００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、次いで、ｅｘ ｖｉｖｏバイオルミネセンスにより解析した。
図３９に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１０６は、噴霧化によりｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ送達を媒介した。高ルシフェラーゼ発現は、６時間後の肺において主に観察されたが、これは２４時間ではそのままである。対照的に、対照マウス群において、ルシフェラーゼシグナルは観察されなかった。図４０に示す通り、異なる器官の解析は、ルシフェラーゼ発現が、２４時間後に肺に主に存在することを実証した。
結果は、ＡＤＧＮ－１０６が、噴霧化／非外科的気管内投与による、肺におけるｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ標的化送達のための強力な技術であることを実証した。
（実施例１９）
機能的ｍＲＮＡのナノ粒子媒介性ｉｎ ｖｉｖｏ送達：がん治療法に対する意義
ＲＮＡは、生命のあらゆる生化学的機能を含み、あらゆる細胞過程において中心的な役割を担う、普遍的な分子である。そのため、ｍＲＮＡ治療は、数え切れないほどの適用を有し、いくつかの利点を提供する。がん治療法におけるｍＲＮＡ治療の刺激的な開発は、変異されたまたは失われたタンパク質の機能的バージョンをレスキューすることである。
しかし、細胞への機能的にインタクトなｍＲＮＡの効率的な送達は、依然として、ｍＲＮＡ治療分野における肝要な課題である。ｍＲＮＡ分子は、細胞／組織障壁を通過することができず、ヌクレアーゼによる急速な分解に対して感受性であり、自然免疫経路を活性化する。本明細書において、本発明者らは、哺乳動物細胞系およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて機能的ｍＲＮＡを強力に保護および送達することができる、新たな送達プラットフォームを報告する。
ＡＤＧＮ技術は、非共有結合的静電および疎水性相互作用により、核酸複合体と安定した中性ナノ粒子を形成する短い両親媒性ペプチドに基づく。自己集合したペプチド／ｍＲＮＡナノ粒子は、血清および血漿条件において経時的に安定したままである。本発明者らは、初代Ｔ細胞を含む複数の細胞系および動物モデルにおいて、ｍＲＮＡと複合体形成、送達および放出するためのＡＤＧＮ－ナノ粒子の有効性を実証する。全身性静脈内注射によって適用されると、ＡＤＧＮは、いかなる非特異的炎症性応答を誘発することもなく、標的化組織におけるｍＲＮＡの送達を促進する。
本発明者らは、がんにおける治療潜在力を有し得る、腫瘍抑制因子レスキューに関してＡＤＧＮ技術を調査した。腫瘍抑制因子ＰＴＥＮおよびＰ５３は、腫瘍形成において必須の役割を果たす。Ｐ５３およびＰＴＥＮ変異ならびにその結果生じる機能喪失は、種々の腫瘍にわたって共通し、腫瘍細胞増殖に影響する。本発明者らは、ｗｔ Ｐ５３ ｍＲＮＡまたはｗｔ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡのＡＤＧＮ媒介性送達が、膵臓（ＰＡＮＣ１）、卵巣（ＳＫＯＶ３）、前立腺（ＰＣ３）、神経膠芽腫（Ｕ２５）および骨肉腫（Ｇ２９２）を含むいくつかのがん細胞系において、腫瘍抑制因子機能をレスキューしたことを示した。ＰＴＥＮの回復は、細胞増殖の低下、細胞アポトーシスの活性化、ＡＫＴリン酸化の低下、およびＧ１での細胞周期停止をもたらした。ＩＶ投与されたＡＤＧＮ／ＰＴＥＮ ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ／Ｐ５３ ｍＲＮＡのｉｎ－ｖｉｖｏ有効性を、ＰＡＮＣ１マウス異種移植片において検査した。ｗｔ ｐ５３ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびｗｔ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を含有するＡＤＧＮ－ナノ粒子は、それぞれ５０％および８０％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）をもたらした。ＡＤＧＮ－ＰＴＥＮ ｍＲＮＡナノ粒子およびＡＤＧＮ－ｐ５３ ｍＲＮＡナノ粒子の組合せは、ＰＡＮＣ１異種移植片において９０％のＴＧＩをもたらし、また、遠隔転移の発生を遅らせた。ＡＤＧＮ－核酸複合体の投与後に、非特異的サイトカイン応答は観察されなかった。
ｍＲＮＡと複合体形成したＡＤＧＮ－ナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＰＴＥＮおよびＰ５３のレスキューにおいて有効であった。ｍＲＮＡ療法の強い潜在力を考慮すると、本研究は、がん処置における治療標的としての腫瘍抑制因子を検証するためのＡＤＧＮ媒介性ｍＲＮＡ送達の効力を明らかにする。
配列表

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  1. 本願明細書に記載の発明。
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