KR101784050B1 - 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 개선용 조성물은 복제 노화 및 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에서 세포 독성 없이, 엑소솜의 농도의존적으로 SA-β-gal 활성이 억제됨에 따라, 줄기세포에서 분리된 엑소솜이 세포 노화 억제에 효과적인 것이 확인하였으며, 줄기세포에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군의 세포 증식이 향상된 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 조성물은 세포 노화 관련 질환 치료용 조성물 및 피부 노화 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

Description

엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cell senescence comprising exosome}
본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
세포 증식제한, 조직 및 개체의 노화유도, 암의 억제와 촉진, 조직재생과 복구에 중요한 역할을 하며 노화 질환에 기여하는 세포노화는 텔로미어의 단축, 암 유전자의 발현, 염색체 이상, DNA 손상, 산화 혹은 염증 관련 스트레스, 방사선, 항암제 등과 같은 여러 가지 요인에 의해 유도된다. 이러한 세포노화는 비가역적이고 필연적인 과정으로 알려져 있었지만, 최근 연구결과에 따르면, 노화의 속도와 과정은 세포분비물질과 작은 화합물 등으로 조절될 수 있다고 보고되어졌는데, 젊은 생쥐가 분비한 순환물질들이 늙은 생쥐의 근육 재생, 신경조직 재생 및 심장비대증을 개선하는 효과를 확인하였다. 따라서, 노화에 관련된 연구는 노화 자체뿐만 아니라, 심장병, 신경변성질환, 암 등과 같은 노화관련 질환을 효율적으로 치료하는 역할을 할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
배아줄기세포는 자기복제능력과 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있으므로, 세포 치료에 많은 가능성을 가지고 있다. 또한, 배아줄기세포가 분비하는 물질을 함유하고 있는 배양액의 경우, 세포증식과 조직손상 회복에 뛰어난 효과를 나타내는 것으로 알려졌는데, 사람 줄기세포 배양액이 늙은 생쥐에서 분리된 근육세포의 MAPK 신호 과정을 활성화시켜 세포 증식을 증가시켰으며, 젊은 근육 유래 줄기세포의 분비물질이 늙은 근육 줄기세포의 세포 증식 및 분화를 촉진시킨다고 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 줄기세포배양액의 세포노화에 대한 유용한 효과는 명확히 증명된 바가 없다.
엑소솜은 다양한 생체 나노입자 중 지름 30-100nm의 접시 모양으로, 세포 내외부의 자극에 의해 능동적으로 분비되는데, 혈액, 침, 뇌척수액, 모유 및 소변 등과 같은 거의 모든 체액에서 발견되므로, 채취가 용이하여 진단 표시자로 사용될 수 있다. 최근에는 이러한 엑소솜의 중요성이 대두되면서 다양한 연구들이 진행되고 있다. 특히 암세포에서 분비되는 엑소솜을 이용한 치료 및 진단을 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 최근 연구보고(Jenjaroenpun P, Kremenska Y, Nair VM, Kremenskoy M, Joseph B, Kurochkin IV. Characterization of RNA in exosomes secreted by human breast cancer cell lines using next-generation sequencing. PeerJ. 2013;1:e201. doi: 10.7717/peerj.201.)에 따르면, 사람 유방암 세포주에서 전이되는 세포인 MDA-MB 232 세포와 전이되지 않는 MCF-10A세포에서 분리된 엑소솜에 존재하는 RNA를 비교한 결과, 두 세포 모두 유방암 세포이지만, 분리된 엑소솜내 RNA가 매우 상이하였으며, 이러한 차이가 두 세포의 전이 능력이 기여하는 것으로 보고되었다.
또한, 다른 연구보고(Zhang B1, Wang M, Gong A, Zhang X, Wu X, Zhu Y, Shi H, Wu L, Zhu W, Qian H, Xu W. HucMSC-exosome mediated -Wnt4 signaling is required for cutaneous wound healing. Stem Cells. 2014)에 따르면, 사람 중간엽 줄기세포와 섬유아세포에서 분리된 엑소좀의 상처 치유 효과를 확인한 결과, 중간엽 줄기세포에서 분리된 엑소솜이 처리된 흰쥐의 경우, 상처치유가 촉진된 반면, 섬유아세포에서 분리된 엑소솜이 처리된 흰쥐에서는 상처치유 효과가 나타나지 않았다.
이러한 결과들은 각각의 세포에서 분비되는 엑소솜의 효능이 서로 다르며, 이는 각 세포마다 분비되는 엑소솜 내용물이 서로 다르다는 것을 의미한다.
이렇듯 엑소솜에 대한 다양한 연구들이 진행되고 있으나, 아직까지 생쥐 배아줄기세포에서 분비되는 엑소솜의 항노화 기능에 대한 연구는 보고되지 않았다.
한국공개특허 제10-2014-0066456호
본 발명은 생쥐 배아줄기세포 유래 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하여, 세포 노화를 예방 또는 개선하는 항노화용 약물 또는 화장품 조성물로 사용하고자 한다.
본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 개선용 조성물을 복제 노화 및 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 처리한 결과,줄기세포에서 분리된 엑소솜이 세포 독성 없이, 농도의존적으로 SA-β-gal 활성을 억제함에 따라, 줄기세포에서 분리된 엑소솜이 세포 노화 억제에 효과적인 것을 확인하였으며, 줄기세포 유래 엑소솜이 처리된 세포군의 세포 증식이 향상된 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소솜 조성물을 세포 노화 관련 질환 치료용 약학조성물, 세포 노화 개선용 건강식품조성물 및 피부 노화 개선용 화장료 조성물로 사용할 수 있다.
도 1은 복제 노화된 사람 섬유아세포에서 생쥐 배아줄기세포 유래 엑소솜의 세포노화 억제 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 SA-β-gal 활성 염색 사진이며, 도 1B는 SA-β-gal 활성 염색 백분율을 나타내는 그래프이며, 도 1C는 트립토판 블루로 확인한 세포 증식 결과로, 각 결과들은 독립적으로 3번 반복 수행된 실험 결과를 평균과 표준편차로 나타내었으며, C는 대조군, MEF는 생쥐 배아섬유아세포 유래 엑소솜 처리군 및 ESC는 생쥐 배아줄기세포 유래 엑소솜 처리군; **p<0.01 vs 대조군이다.
도 2는 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에서 생쥐 배아줄기세포 유래 엑소솜의 세포 노화 억제 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 SA-β-gal 활성 염색 사진이며, 도 1B는 SA-β-gal 활성 염색 백분율을 나타내는 그래프이며, 도 1C는 트립토판 블루로 확인한 세포 증식 결과로, 각 결과들은 독립적으로 3번 반복 수행된 실험 결과를 평균과 표준편차로 나타내었으며, C는 대조군이며, MEF는 생쥐 배아섬유아세포 유래 엑소솜 22.6 μg 처리군이며, ESC는 생쥐 배아줄기세포 유래 엑소솜 22.6 μg 처리군이며; **p<0.01 vs 대조군이다.
본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 줄기세포에서 분리된 엑소솜은 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소솜일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포 노화는 복제 노화 및 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 복제 노화된 사람 섬유아세포에 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소솜 또는 생쥐 배아섬유아세포에서 분리된 엑소솜을 처리한 결과, 도 1A 및 1B와 같이, 생쥐 배아섬유아세포(MEF)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군에서는 SA-β-gal 활성 염색의 변화가 나타나지 않았지만, 생쥐 배아줄기세포(ESC)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군에서는 엑소솜의 농도의존적으로 SA-β-gal 활성 염색이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 아드리아마이신에 의해 세포 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 생쥐 배아줄기세포 유래 엑소솜 또는 생쥐 배아섬유아세포에서 분리된 엑소솜을 처리한 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이 생쥐 배아줄기세포(ESC)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군의 경우, SA-β-gal 활성이 감소하였으며, 도 2C와 같이 세포증식이 활성화된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 생쥐 배아줄기 세포에서 분리된 엑소솜은 복제 노화뿐만 아니라, 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포 노화억제에도 효과적인 것이 확인되었다.
상기 세포 노화 질환은 피부 노화, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 뇌졸중, 퇴행성 관절 질환, 노인성 흑점, 골다공증, 탈모증, 다발성 경화증, 백반증, 죽상경화증, 관상동맥질환, 협심증, 간경화증, 전립선비대증, 만성신질환, 폐기종 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 줄기세포에서 분리된 엑소솜의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공할 수 있다.
상기 건강식품은 상기 트리테르펜 글루코사이드 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 화합물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포에서 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공될 수 있으며, 상기 화장료조성물은 유효성분인 줄기세포 유래 엑소솜 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 1> 세포 및 시약
사람 섬유아세포를 Lonza(Walkersvill, MD, 미국)에서 구입하였으며, Dubeccos-Modified Eagle's medium (DMEM), 소태아혈청, 항생제 용액(페니실린-스트렙토마이신)은 WelGene(Daegu, Korea)에서 구입하였다. 생쥐 배아줄기세포는 캐나다 토론토 대학 Andras Nagy lab에서 분양받은 G4 세포를 사용하였으며, 아드리아마이신은 일동제약주식회사 제품을 사용하였다. 엑소솜 분리는 System Biosciences (SBI) 에서 ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution 을 구매하여 사용하였다.
< 실험예 2> 세포배양
1. 사람 섬유아세포 배양
사람 섬유아세포를 직경 100 mm 배양접시에 1x105개 세포로 분주한 후, 10% 소태아혈청과 1% 항생제(페니실린 10,000 unit/ml 및 스트렙토마이신 10,000 mg/ml)가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여 37oC, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시 바닥에 80-90% 정도 세포가 자라면, 트립신-EDTA 용액(2.5%)을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 세포를 계대할 때마다 세포 수를 측정하여 세포가 몇 회 분열하였는지 조사하였다. 세포의 분열 횟수 (population doubling, PD)는 하기식으로 확인하였다.
PD= log2F/log2I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)
실험에 사용한 세포들은 사람 섬유아세포의 경우 분열횟수가 PD>75인 것을 사용하였다.
2. 줄기세포 배양
생쥐 배아줄기세포는 미토마이신 C(mitomycin C)가 처리된 생쥐 배아섬유아세포 위에 15% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민(glutamine), 100 μM 비필수 아미노산(nonessential amino acids), 100 μM 베타-멜캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 100 units/ml 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor), 50 units/ml 페니실린(penicillin), 50 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM 배양액으로 구성된 줄기세포배양액을 넣어 배양하였다.
생쥐 배아섬유아세포는 발생 13.5 일째인 배아에서 분리하였으며, 분리된 세포를 10% 소태아혈청과 1% 항생제(50 units/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배양액에서 배양하였다. 생쥐 배아섬유아세포와 생쥐 배아줄기세포는 매일 새로운 배지로 바꿔주었다.
< 실험예 3> 엑소솜 ( exsome ) 분리
생쥐 배아섬유아세포 위에서 자라고 있는 배아줄기세포를 0.1% 젤라틴(gelatin)으로 코팅된 배양접시로 옮겨 줄기세포 배양액으로 80-90% 정도 자랄 때까지 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 배아줄기세포를 수거하여 OPTI-MEM으로 10분씩 세 번 세척해주고, OPTI-MEM 상태로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 회수하고 5000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 0.22 μm 필터를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거하였다. 생쥐 배아섬유아세포의 배양액도 동일한 방법으로 준비하였다.
엑소솜 분리는 System Biosciences(SBI)에서 ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution 을 사용하였고, 제공되는 실험방법에 따라 생쥐 배아섬유아세포 배양액과 생쥐 배아줄기세포 배양액에서 엑소솜을 분리하였다.
< 실시예 1> 복제노화에 대한 엑소솜 효과 확인
복제 노화에 대한 엑소솜의 세포노화 억제 효과 정도를 세포노화 표지자로 잘 알려진 SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase) 활성 염색으로 확인하였다(Dimri et al . 1995).
계대 배양을 통해 복제 노화된 사람 섬유아세포(PD>75)를 12 well 배양용기에 well 당 8×103 세포로 분주하여 하루 동안 배양한 후, 생쥐 배아섬유아세포 또는 생쥐 배아줄기세포 배양액에서 분리된 엑소솜을 각각 5.7, 11.3 및 22.6 μg으로 3일 동안 처리하였다.
상기 생쥐 배아섬유아세포 배양액 또는 생쥐 배아줄기세포 배양액에서 분리된 엑소솜이 처리된 사람 섬유아세포를 인산완충액으로 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 고정한 후, SA-β-gal 염색 용액 (40 mM citric acid/phosphate [pH 5.8], 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, X-gal 1 mg/ml)을 24 well에서는 각 well 당 250 ml, 12 well에서는 각 well 당 500 ml씩 넣고, 은박지로 싸서 37℃에서 16시간에서 18시간 동안 반응시켰다.
그 후, 인산완충용액(PBS)로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액으로 1분간 염색하였다. 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50~100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율로 표시하였다.
그 결과 도 1A 및 1B와 같이, 생쥐 배아섬유아세포(MEF)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군에서는 SA-β-gal 활성 염색의 변화가 나타나지 않았지만, 생쥐 배아줄기세포(ESC)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군에서는 엑소솜의 농도의존적으로 SA-β-gal 활성 염색이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과중 세포 노화억제 효과가 뛰어난 22.6 μg 생쥐 배아줄기세포(ESC) 에서 분리된 엑소솜 처리군과, 비교군인 22.6 μg 생쥐 배아섬유아세포(MEF)에서 분리된 엑소솜 처리군의 트립토판 블루 세포증식 확인 결과, 도 1C와 같이 생쥐 배아섬유아세포(MEF)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군에서는 세포 수의 변화가 나타나지 않았지만, 생쥐 배아줄기세포(ESC)에서 분리된 엑소솜이 처리된 세포군에서는 세포 수가 통계적으로 유의하게 증가하였다.
상기 결과로부터, 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소솜이 사람 섬유아세포의 세포노화를 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
< 실시예 2> 아드리아마이신에 의해 유도된 세포노화에 대한 엑소솜 효과 확인
아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 생쥐 배아섬유아세포와 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소솜들이 세포 노화에 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.
직경 100 mm 배양접시에 사람 섬유아세포를 1.5x105개로 분주하여, 3일간 37℃ 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하였다. 배양된 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 500 nM 아드리아마이신을 4시간 처리하였다. 그 후, 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 세포를 3회 세척한 후, 10% 소태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 배양하였다.
4일 후, 아드리아마이신이 처리된 사람 섬유아세포들을 트립신-EDTA로 배양접시에서 분리한 후, 10% 소태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액이 담겨있는 12 well 세포배양용기에 각 well 당 8,000개/ml가 되도록 1 ml씩 분주하고, 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다.
그 후, 각 well에서 DMEM 을 500 μl씩 덜어내고, 생쥐 배아섬유아세포 배양액 또는 생쥐 배아줄기세포 배양액에서 분리된 각각의 엑소솜이 22.6 μg 포함된 OPTI-MEM 배지 500μl을 각 well에 넣고, 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal)활성 염색하여 아드리마이신에 의해 유도된 세포노화에 대한 엑소좀 효과를 확인하였으며, 트립토판 블루(Trypan blue) 세포증식 테스트로 세포의 성장 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 2A 및 도 2B와 같이 생쥐 배아줄기세포(ESC) 유래 엑소솜이 처리된 세포군의 경우, SA-β-gal 활성이 감소하였으며, 도 2C와 같이 세포증식이 활성화된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소솜은 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화 억제에 효과적인 것이 확인되었으며, 상기 결과들로부터 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 엑소솜은 복제노화뿐만 아니라, 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화억제에도 효과적인 것이 확인되었다.
한편, 본 발명에 따른 줄기세포 유래의 엑소솜은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기에서는 본 발명에 따른 줄기세포 유래의 엑소솜을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제제예 1> 약학조성물의 처방예
<제제예 1-1> 주사제의 제조
엑소솜 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
<제제예 2-1> 정제의 제조
엑소솜 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 3-1> 캡슐제의 제조
엑소솜 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제제예 4-1> 연고제의 제조
엑소솜 100 mg, PEG-4000 250mg, PEG-400 650mg, 백색바셀린 10mg, 파라옥시안식향산메칠 1.44mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.
< 제제예 2> 화장료 조성물의 제제예
<제제예 2-1> 영양 로션의 제조
프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 엑소솜을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
<제제예 2-2> 영양 크림의 제조
카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부
및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노 스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 엑소솜을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
< 제제예 3> 건강식품의 제조
엑소솜 0.5 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 생쥐 배아줄기세포로부터 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하며, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 생쥐 배아줄기세포로부터 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하며, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 개선용 건강식품.
  5. 생쥐 배아줄기세포로부터 분리된 엑소솜을 유효성분으로 함유하며, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료조성물.
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