WO2019022451A2 - 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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조용우
이경수
최지숙
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한양대학교 에리카산학협력단
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating osteoporosis, which comprises exosome extracted from stem cells as an active ingredient.
  • Exosome is a pseudocyst with the same membrane structure as the cell membrane, and it is known that it plays a role of transferring membrane component and protein RNA to other cells and tissues.
  • exosomes secreted from stem cells contain various growth factors and cytokines secreted by stem cells, which are known to help regenerate tissues.
  • the exosome can be safely used in the same manner as the effect of the cell culture liquid, since impurities such as cell waste, antibiotics and serum in the cell culture liquid are removed during the extraction process.
  • Bone tissue is a tissue that maintains homeostasis by sequentially taking osteoclast bone resorption and osteoblast osteogenesis.
  • Osteoporosis is a disease in which the equilibrium of the bone remodeling process is broken down by various causes such as menopause and aging, and the strength of the bone is weakened by the change of the microstructure of the bone. Osteoporosis increases the risk of fracture of the spine, femur, and radius due to lowering of bone density and prevention is very important because it progresses slowly without any obvious symptoms.
  • postmenopausal osteoporosis type 1 osteoporosis
  • senile osteoporosis type 2 osteoporosis
  • Postmenopausal osteoporosis is caused by a decrease in estrogen secretion after menopause in women, As age increases, the bone density increases rather than the bone formation.
  • osteoporosis inhibitors such as bisphosphonate, calcitonin, and parathyroid hormone, which are bone growth promoters.
  • Estrogen therapy is known to be effective in postmenopausal women.
  • bisphosphonate preparations have the potential to cause gastrointestinal disturbances and excessive bone resorption inhibition during long-term administration, and estrogen also increases arteriosclerotic diseases such as venous thrombosis and myocardial infarction and increases the incidence of breast cancer.
  • the present inventors extracted exosomes containing osteoclastogenesis inhibitory factors such as OPG (osteoprotegerin) from stem cells to solve the problems of the prior art, and applied them to the development of compositions for the prevention and treatment of osteoporosis using the same To complete the present invention.
  • OPG osteoclastogenesis inhibitory factors
  • the object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, which comprises exosome extracted from adipose tissue-derived stem cells as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating osteoporosis comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, exosome extracted from adipose-derived stem cells There is another purpose in providing a method.
  • the stem cell-derived exosome according to the present invention is effective in preventing and / or treating osteoporosis because of its excellent expression rate of a bioactive factor inhibiting osteoblast activity and osteoclast activity.
  • the adverse effect on the existing cell treatment agent can be minimized, and the cell can be stably and rapidly delivered as a cell-derived carrier. Accordingly, the present invention can be applied to a composition for preventing and treating osteoporosis.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of exosomes extracted from proliferated human adipose-derived stem cells prepared in Example 1 of the present invention, exosomes extracted from human adipose-derived stem cells differentiated into bone cells prepared in Example 2 and their applications Fig.
  • FIG. 2 is a graph showing the characteristics of exosomes extracted from proliferated human adipose-derived stem cells prepared in Example 1 of the present invention and exosomes extracted from human adipose-derived stem cells differentiated into bone cells prepared in Example 2 , which shows the structure and shape of exosome confirmed by transmission electron microscope and the size distribution of exosome confirmed by nanoparticle tracking analysis.
  • A) and B) show exosomes (ASC-EXO) extracted from human adipose-derived stem cells,
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the exosome extracted from the proliferated human adipose-derived stem cells prepared in Example 1 of the present invention, the exosome extracted from human adipose-derived stem cells differentiated into bone cells prepared in Example 2, Of OPG (osteoprotegerin) content of the cells.
  • OPG osteoprotegerin
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of the exosome extracted from the proliferated human adipose-derived stem cells prepared in Example 1 of the present invention, the exosome extracted from human adipose-derived stem cells differentiated into bone cells prepared in Example 2, (ASC-EXO, Osteo-EXO) was intravenously injected into osteoporosis-induced mouse model (ovariectomized mouse model) and 2 weeks after the end of the administration, the femur of the rat was extracted and the ⁇ CT was taken.
  • ASC-EXO Osteo-EXO
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the exosome extracted from the proliferated human adipose-derived stem cells prepared in Example 1 of the present invention, the exosome extracted from human adipose-derived stem cells differentiated into bone cells prepared in Example 2, (ASC-EXO, Osteo-EXO) was intravenously injected into an osteoporosis-induced rat model (ovariectomized mouse model). Two weeks after the end of the administration, , Bone mineral density (BMD), structure model index (SMI), tubercular thickness (Tb.Th), nodular thickness ), and trabecular number (Tb.N, number of nodules).
  • BMD Bone mineral density
  • SI structure model index
  • Tb.Th tubercular thickness
  • Tb.N trabecular number
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, which comprises, as an active ingredient, exosome extracted from adipose tissue-derived stem cells.
  • stem cell refers not only to a self-replicating ability, but also to a cell having various characteristics depending on the characteristics of multi-potency It is characterized by its ability to differentiate into cells, and is contained in fats, bone marrow, umbilical cord blood, and placenta.
  • the stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, and may be derived from any type of animal, including human and non-human mammals.
  • adipose-derived stem cell refers to a stem cell derived from an adipose tissue.
  • the adipose tissue has a good condition for harvesting stem cells, When stem cells are cultured, they show stable growth and proliferation, and when they induce differentiation, they can differentiate into various cells.
  • proliferated stem cell refers to a stem cell derived from passage 0 of a stem cell using tissue culture medium (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin) Stem cells proliferated up to passage 7. From this, it is possible to extract exosomes containing stem cell genetic information, proteins, and growth factors.
  • tissue culture medium Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin
  • stem cells differentiated into bone cells refers to stem cells that are differentiating into bone cells from stem cells of bone cell origin. From this, exosomes containing genetic information, proteins, and growth factors related to bone cell differentiation can be extracted. Specifically, when a stem cell differentiates into a bone cell, the shape and characteristics of the cell change, and the exosome is extracted at this time. Therefore, it is different from extracting exosome from normal stem cells.
  • exosome refers to a pseudocyst of the membrane structure that is secreted from various kinds of cells, and binds to other cells and tissues to carry out various functions such as transferring membrane components, And the average diameter of the exosomes is approximately 30-200 nm.
  • the exosome extracted from the proliferated stem cells may have basic characteristics of stem cells and may contain important growth factors, bioactive proteins and gene information necessary for tissue regeneration.
  • the exosomes extracted from the stem cells differentiated into bone cells may have basic characteristics of stem cells, and may contain important growth factors, various bioactive proteins and gene information at the time of bone differentiation.
  • osteoclast activation inhibitory substance OPG (osteoprotegerin), which inhibits the differentiation of pre-osteoclast, and mesenchymal stem cells, which are one of the promoters of osteocyte activation, BMPs (bone morphogenic proteins) that promote cell differentiation
  • BMPs bone morphogenic proteins
  • TGF-beta transforming growth factor-beta
  • the exosome may be prepared by using the exosome extraction method known in the art, for example,
  • the " induction of differentiation of bone cells” may mean inducing stem cells to differentiate into bone cells.
  • the stem cells differentiated into bone cells may be adult stem cells capable of differentiating into bone cells.
  • the adult stem cells that can be differentiated into bone cells may be bone marrow stem cells, cord blood stem cells, or adipose derived stem cells.
  • the adipose-derived stem cells may be human or mammal-derived stem cells.
  • exosome extracted from adipose stem cells derived from adipose according to the present invention and exosome extracted by the above extraction method have an effect of preventing or treating osteoporosis.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, which comprises exosome extracted from adipose derived stem cells as an active ingredient.
  • composition for preventing or treating osteoporosis is different from the prior art in that exosome extracted from stem cells differentiating into bone cells is used as an effective agent for bone regeneration.
  • the present invention provides a method for regenerating bone tissue which is capable of effectively reproducing sustainable bone tissue by various growth factors related to the proliferation and differentiation of cells carried on extracted and purified exosome, Problems such as calcification can be solved.
  • the stem cell-derived exosomes extracted during bone cell differentiation according to the present invention effectively deliver not only the characteristics of the stem cells but also the differentiation-related activity factors to the bone cells, The same effect can be expected.
  • the stem cell-derived exosome extracted during bone cell differentiation according to the present invention is a biomembrane endoplasmic reticulum secreted from the cells.
  • it since it has a lipid structure similar to a cell membrane, it has excellent absorption rate into peripheral cells when injected into the body, and it is possible to induce effective regeneration of bone tissue by rapid delivery of efficacious substances.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis according to the present invention may comprise exosome alone or in combination with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents extracted from a pharmaceutically effective amount of fat-derived stem cells .
  • a pharmaceutically effective amount herein means an amount sufficient to prevent, ameliorate, and treat the symptoms of osteoporosis.
  • the " pharmaceutically acceptable” means physiologically acceptable compositions which, when administered to humans, do not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like.
  • the pharmaceutical composition may be of various oral or parenteral formulations.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Examples of the pharmaceutical composition according to the present invention include non-aqueous solutions, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like.
  • Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • Dosage forms of the pharmaceutical compositions according to the above embodiments may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts and may also be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in suitable aggregates.
  • the salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable so long as it is pharmaceutically acceptable and includes, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and naphthalenesulfonic acid.
  • compositions according to the above embodiments may be administered parenterally or orally, and may be administered one to several times per day, in an amount of 0.1 to 500 mg per 1 kg of body weight.
  • the dosage for a particular patient may vary depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, severity of disease, and the like.
  • compositions according to the above embodiments may be formulated into oral compositions such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, external preparations such as ointments and creams, suppositories and sterilized injection solutions And may be formulated in any form suitable for pharmaceutical preparations.
  • compositions according to the above embodiments may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans by various routes such as parenteral, oral, etc., and any manner of administration may be expected, Rectal, or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.
  • the pharmaceutical composition according to the above embodiment may further include a differentiation inducing substance such as dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate for differentiating stem cells into bone cells But is not limited thereto.
  • a differentiation inducing substance such as dexamethasone, ascorbic acid and beta-glycerophosphate for differentiating stem cells into bone cells But is not limited thereto.
  • the adipose tissue-derived stem cells (ASC-EXO) extracted from the proliferated adipose tissue-derived stem cells and the exosomes extracted from adipose tissue-derived stem cells differentiated into osteocytes
  • the average size of the stem cell-derived exosome was 50 ⁇ 200 nm.
  • the exosome (ASC-EXO) extracted from the proliferated adipose tissue-derived stem cells and the exosome (Osteo-EXO) extracted from the adipose tissue- ) was found to be superior in the promotion of bone regeneration and the effect of enhancing bone density when injected in vivo
  • the present invention provides an injection for preventing or treating osteoporosis, which comprises, as an active ingredient, exosome extracted from adipose tissue-derived stem cells.
  • the injection may further include phosphate-buffered saline (PBS). That is, the injectable preparation can be used by supporting exosomes extracted from adipose-derived stem cells in phosphate-buffered saline.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the injection may contain a hydrogel instead of phosphate buffered saline.
  • the hydrogel may be any one or more selected from the group consisting of hyaluronic acid, gelatin, alginate, chitosan, fibrin, elastin, collagen and methylcellulose, and may be hyaluronic acid hydrogel, but is not limited thereto.
  • the injection may include, but is not limited to, 1 x 10 6 to 1 x 10 11 particles / mL or 1 x 10 6 to 1 x 10 11 particles / day / kg body weight of exosomes.
  • the injection may be injected into an injured area of a mammal such as a mouse, a mouse, a livestock, or a human, and may be administered intravenously.
  • the injectable composition according to the present invention can be easily injected into the body, which is economical in terms of operation time and cost, thereby reducing patient suffering, sequelae and economic burden.
  • the stem cells are differentiated into osteocytes, the extracted exosomes contain various extracellular matrix derivatives and various growth factors related to cell proliferation and differentiation, thereby promoting effective regeneration of damaged bone tissue and enhancing bone density. Therefore, long-term effects can be expected with a single procedure, which can overcome the problems that had to be performed periodically in order to obtain a lasting effect.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or ameliorating osteoporosis, which comprises exosome extracted from adipose tissue-derived stem cells as an active ingredient. That is, the health functional food according to the present invention may be used either simultaneously with or separately from the agent for the treatment of osteoporosis before or after the onset of osteoporosis for the prevention or improvement of osteoporosis.
  • improvement means all actions that at least reduce the degree of symptom associated with the condition being treated.
  • the health functional food composition according to the present invention can be added to health supplements such as foods, beverages for the purpose of preventing or improving osteoporosis.
  • foods to which the active ingredient can be added include dairy products including dairy products, meat, sausage, bread, biscuits, rice cakes, chocolates, snacks, confectionery, pizza, ramen noodles, other noodles, gums, ice cream, , Beverages, alcoholic beverages and vitamin complexes, dairy products, and dairy products, all of which include health functional foods in a conventional sense.
  • the active ingredient may be directly added to the food or may be used together with other food or food ingredients, and may be suitably used according to a conventional method.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (for prevention or improvement).
  • the composition of the present invention is added in an amount of not more than 15% by weight, preferably not more than 10% by weight based on the raw material, in the production of food or beverage.
  • the amount may be less than the above range.
  • composition for health beverage of the present invention has no particular limitation on the other components other than those containing the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratio and may contain various flavors or natural carbohydrates as an additional ingredient have.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • Natural flavors tau martin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used as flavors other than those described above .
  • the ratio of the above-mentioned natural carbohydrate can be appropriately determined by a person skilled in the art.
  • the health functional food of the present invention may contain flavorings such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, And salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. These components may be used independently or in combination. The ratios of these additives can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the present invention provides the use of exosomes extracted from adipose derived stem cells in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of osteoporosis.
  • exosomes extracted from the adipose-derived stem cells are as described above and can be used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis, as described above.
  • the present invention includes a step of administering to a subject a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, exosome extracted from adipose-derived stem cells Gt; osteoporosis < / RTI >
  • &quot refers to all animals including humans, which may have developed or developed osteoporosis.
  • the term "therapeutally effective amount” means the amount of active ingredient or pharmaceutical composition that elicits a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as contemplated by a researcher, veterinarian, This includes an amount that induces relief of the symptoms of the disease or disorder being treated. It will be apparent to those skilled in the art that the therapeutically effective amount and the administration frequency of the active ingredient of the present invention will vary depending on the desired effect.
  • the optimal dosage to be administered can be appropriately determined by a person skilled in the art and depends on the kind of the disease, the severity of the disease, the content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of the formulation, the weight of the patient, The range varies depending on the condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and the like.
  • the pharmaceutically effective amount of exosomes extracted from adipose derived stem cells according to the present invention may be from 1 x 10 6 to 1 x 10 11 particles / day / kg body weight, and may be 4 x 10 9 particles / day / kg body weight have.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the degree of osteoporosis symptoms, the age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the patient.
  • the composition comprising the exosome extracted from the adipose-derived stem cell of the present invention as an active ingredient may be administered orally or parenterally (for example, For example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically).
  • Example 1 Extraction of exosome (ASC-EXO) from proliferated human adipose-derived stem cells
  • human adipose-derived stem cells (passage 3-7) were cultured in a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM contating 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin) The cell culture supernatant was recovered by replacing with serum-free, non-antibiotic and phenol red-free DMEM medium for 24 hours. From this, exosomes were extracted from the proliferated human adipose-derived stem cells.
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
  • the recovered cell culture supernatant was centrifuged at 300 xg for 10 minutes to remove the cells, and the cell residue was removed using a filter having a processing size of 0.22 ⁇ m.
  • the protein was removed by TFF (tangential flow filtration) using a filter with 300 kD molecular weight cut off (MWCO).
  • TFF tangential flow filtration
  • MWCO molecular weight cut off
  • the saline buffer was added to the recovered solution to continuously repeat the TFF procedure, and finally the exosome was obtained. Exosomes were kept frozen at -70 ° C until use.
  • Example 2 From human adipose-derived stem cells differentiated into bone cells Exosome (Osteo-EXO) extraction
  • exosomes were extracted in the process of differentiating human adipose-derived stem cells into osteocytes.
  • human adipose-derived stem cells (passage 3-7) were cultured in osteoclast differentiation medium (10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 1 ⁇ M dexamethasone, And cultured in DMEM high-density glucose (Dulbecco Modified Eagle Medium) containing 0.5 mM ascorbic acid and 0.01 M beta-glycerophosphate in a serum-free, antibiotic-free medium every 3 days, And replaced with DMEM medium without phenol red for 24 hours. After 24 hours, the culture supernatant of differentiating stem cells was recovered. After the supernatant was collected, the differentiation medium was added again to induce osteoblast differentiation of stem cells, and this process was repeated until 3 weeks.
  • osteoclast differentiation medium 10% fetal bovine serum, 1% penicillin / streptomycin, 1 ⁇ M dexamethasone
  • DMEM high-density glucose Dulbecco Modified Eagle Medium
  • the recovered cell culture supernatant was centrifuged at 300 xg for 5 minutes to remove the cells.
  • the recovered cell culture supernatant was centrifuged at 300 xg for 10 minutes to remove the cells, and cell debris was removed using a filter having a working size of 0.22 ⁇ m.
  • the recovered solution was subjected to TFF (tangential flow filtration) to remove proteins using a filter having a molecular weight cutoff of 300 kD.
  • TFF tangential flow filtration
  • the saline buffer was added to the recovered solution to continuously repeat the TFF procedure, and finally the exosome was obtained. From 1 week after the differentiation of the differentiation medium, the cell shape was changed.
  • Example 3 Extracted from proliferating adipose-derived stem cells Exosome And characterization of exosomes extracted from adipose-derived stem cells differentiated into bone cells
  • exosomes extracted from Examples 1 and 2 were analyzed for the structure and shape of exosome using a transmission electron microscope and the size distribution of exosomes determined using a nanoparticle tracking analysis Respectively. The results are shown in Fig.
  • the extracted exosomes were in the form of round nanoparticles, and the average size of these exosomes was ascertained to be ASC-EXO 176.7 nm and Osteo-EXO 181.8 nm (Fig. 2 (B), (D)).
  • OPG in exosomes was quantitatively analyzed using a human osteoprotegerin ELISA kit with 1 x 10 8 particles / mL of exosome extracted from Example 1 and Example 2 of the present invention.
  • BM-MSC-EXO extracted from bone-marrow mesenchymal stem cells was used as a comparative control.
  • the exosomes (ASC-EXO) extracted from the proliferated stem cells showed a significantly higher OPG content than the exosome (BM-MSC-EXO) extracted from bone marrow-derived stem cells (46.79 pg / 10 8 particles exosomes).
  • the OPG content of osteosarcoma (Osteo-EXO) extracted from human adipose-derived stem cells differentiated into osteocytes was 29.38 pg / 10 8 particle exosomes
  • BM-MSC-EXO extracted from bone marrow- P ⁇ 0.001 compared to the OPG content (27.44 pg / 10 8 particle exosomes) (see FIG. 3)
  • stem cell exosome ASC-EXO
  • exosome Osteo-EXO
  • ASC adipocyte stem cells
  • BV bone volume
  • BMD structure model index
  • Tb.Th tubercular thickness
  • Tb.N trabecular number
  • BV Bone volume
  • BMD bone mineral density
  • SI structure model index
  • Tb.Th tubercular thickness
  • Tb.N trabecular number
  • Tb.Th nodular thickness (Tb.Th) values were not significantly different in ASC, ASC-EXO and Osteo-EXO treated groups compared to negative control (PBS), bone volume (BV), bone volume versus tissue volume ), Bone density (BMD), and number of nodules (Tb.N) were increased at 0.01 level compared to negative control (PBS).
  • the structural model index (SMI) for analysis of cancellous bone structure was found to be decreased at the 0.05 level in the ASC and ASC-EXO groups compared to the negative control group (PBS).
  • SMI is a structural model index that shows an increase in index when there are diseases such as elderly or osteoporosis.
  • the exosome significantly reduces osteoporosis when compared to negative control group
  • TbTh the remaining bone volume (BV), bone volume (BV / cm) versus tissue volume (TbTh) TV), bone density (BMD), number of nodules (Tb.N) and cancellous bone structure index (SMI) were significantly different when treated with ASC-EXO and Osteo-EXO. )

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Abstract

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 골 재생을 촉진시키며, 골 밀도를 증진시킴으로써 골다공증 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인간을 포함한 다세포 생명체 내에 존재하는 다양한 세포에서는 ‘엑소좀’이라는 나노 크기의 소포체를 분비하는 것으로 알려졌다. 엑소좀은 세포 막과 동일한 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결함하여 막 구성요소, 단백질 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 줄기세포가 분비하는 다양한 성장인자와 사이토카인을 함유하고 있어, 조직 재생에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 또한 엑소좀은 추출하는 과정에서 세포 배양액 내 세포 노폐물, 항생제, 혈청 등 불순물이 제거되므로, 세포 배양액의 효과와 동등하면서 안전하게 사용 가능하다.
골 조직은 파골세포의 골흡수와 조골세포의 골형성 과정이 순차적으로 발생하여 항상성을 유지하는 조직이다. 골다공증은 폐경, 노화 등 여러 가지 원인에 의하여 골 재형성 과정의 평형이 무너지고, 이에 따른 뼈 미세구조의 변화로 뼈의 강도가 약화되는 질환이다. 골다공증은 골밀도의 저하로 척추, 대퇴, 요골 등의 골절 위험도가 증가하며, 뚜렷한 증상 없이 서서히 진행되기 때문에 예방이 매우 중요한 질환이다.
골다공증의 원인은 크게 폐경 후 골다공증(제 1형 골다공증)과 노인성 골다공증(제 2형 골다공증)으로 나뉘는데, 폐경 후 골다공증은 여성에서 폐경 이후 에스트로겐 분비가 줄어들면서 급격한 골 흡수가 야기되어 나타나며, 노인성 골다공증은 연령 증가에 따라 뼈의 형성보다 흡수가 늘면서 골밀도가 줄어들어 나타난다.
2016년 고령자 통계(통계청)에 2015년 기준 65세 이상 인구는 657만명으로 전체 인구의 13.2%에 이른다. 노인 인구의 증가에 따라, 노인성 질환으로 분류되는 골다공증의 환자도 급격하게 증가하고 있는 추세이다. 50세 이상 성인의 5명중 1명(22.4%)이 골다공증, 2명 중 1명(47.9%)이 골감소증이다. 70대 이상 골다공증의 유병률은 여성이 68.5%, 남성이 18.0% 이다. 빠른 속도로 초고령화 사회에 진입하고 있는 국내 현실상 골다공증 유병률은 더욱 높아질 것으로 예상 가능하다.
현재 임상에서 쓰이고 있는 골다공증 치료제로는 비스포스포네이트(bisphosphonate), 칼시토닌(calcitonin) 등 골 흡수 억제제와, 골형성 촉진제인 부갑상선호르몬(parathyroid hormone)이 사용되고 있다. 폐경기 여성에서는 에스트로겐 투여가 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나 비스포스포네이트 제제는 장기 투여 시 위장관 장애, 과도한 골 재형성 억제로 인한 부작용이 발생할 가능성이 있으며, 에스트로겐 역시 장기 투여 시 정맥 혈전증, 심근경색 등 동맥경화성 질환을 증가시키며 유방암 발생률을 증가시킨다는 보고가 있다.
줄기세포를 이용한 골다공증 치료제가 특허 출원된 바 있으나[국내 특허 공개특허공보 제2007-0101756호, 국내 등록 특허 제679642호, 국내 특허 공개특허공보 제2014-0006323호], 성체 줄기세포는 이식 시 생존율과 생착률이 저조하기 때문에 효율이 떨어지며, 미분화 줄기세포가 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재하는 문제가 있다. 또한, 줄기세포 배양액은 세포 노폐물, 항생제, 소태아혈청(FBS) 등 불순물의 잔존 가능성이 있다.
이에, 부작용이 적고 장기 투여가 가능하며, 효능이 우수한 골다공증 치료제의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 종래 기술이 갖는 문제점을 해결하기 위하여 줄기세포로부터 OPG(osteoprotegerin)와 같이 파골형성억제 인자를 함유한 엑소좀을 추출하였고, 이를 이용한 골다공증 예방 및 치료용 조성물 개발에 응용하기 위한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 주사제를 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 골다공증 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 용도를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀은 조골세포의 활성 및 파골세포의 활성을 억제하는 생체활성인자 발현율이 우수하여 골다공증을 예방 및/또는 치료하는데 효과가 있다. 또한, 기존 세포치료제에 대한 부작용은 최소화하면서 세포 유래 전달체로서 안정적이면서 신속하게 효능물질을 세포 내로 전달할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 조성물로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 이의 응용에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 분석에 대한 결과를 나타낸 도면으로, 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 이용하여 확인한 엑소좀의 구조 및 모양과 나노입자분석기(nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 확인한 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 것이다. (A)와 (B)는 증식하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO), (C)와 (D)는 분화하는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)의 구조, 모양 및 크기를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 OPG(osteoprotegerin) 함량에 대한 ELISA 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO, Osteo-EXO)을 골다공증이 유발된 쥐 모델(자궁 적출 모델, ovariectomized mice model)에 정맥 주사하고, 투여 종료 2주 후, 쥐의 대퇴골을 적출하여 μCT를 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 본 발명의 실시예 1에서 제조된 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 실시예 2에서 제조된 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO, Osteo-EXO)을 골다공증이 유발된 쥐 모델(자궁 적출 모델, ovariectomized mice model)에 정맥 주사하고, 투여 종료 2주 후, 쥐의 대퇴골을 적출하여 μCT를 촬영하여 bone volume(BV, 골 부피), percent bone volume(BV/TV, 조직 부피 대비 골 부피), bone mineral density(BMD, 골 밀도), structure model index(SMI, 구조 모델 지수), tubercular thickness(Tb.Th, 결절 두께), trabecular number(Tb.N, 결절 개수) 등 파라미터를 비교 분석한 결과는 나타낸 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "줄기세포(stem cell)"란 자기 복제 능력뿐만 아니라, 세포가 위치하는 환경의 영향을 받아 필요에 따라 적절한 신호가 주어질 경우, 다중분화능(multi-potency)의 특성에 의해 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 특성이 있으며, 지방, 골수, 제대혈 및 태반 등에 포함되어 있다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다.
본 발명에서 용어 "지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)"란 지방조직에서 유래하는 줄기세포로, 지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, 지방 유래 줄기세포는 배양 시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 다양한 세포로의 분화가 가능하다.
본 발명에서 사용된 용어, "증식된 줄기세포"란, 조직에서 추출한 passage 0의 줄기세포를 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)를 이용하여 passage 7까지 증식된 줄기세포를 의미한다. 이로부터 줄기세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "골세포로 분화되고 있는 줄기세포"란, 골세포 기원의 줄기세포로부터 골세포로 분화하는 중에 있는 줄기세포를 의미한다. 이로부터 골세포 분화와 관련된 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다. 구체적으로, 줄기세포가 골세포로 분화할 때 세포의 모양 및 특성이 변하는데, 이때 엑소좀을 추출하는 것이다. 따라서 일반 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 것과 다르다고 볼 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 엑소좀의 평균 직경은 대략 30-200 nm이다.
상기 증식된 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 줄기세포의 기본적인 특성을 가질 수 있고, 조직 재생에 필요한 중요한 성장인자, 생체활성 단백질 및 유전자 정보 등을 함유할 수 있다.
상기 골세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 줄기세포의 기본적인 특성을 가질 수 있고, 골 분화 시 중요한 성장인자, 여러 생체활성 단백질 및 유전자 정보 등을 함유할 수 있다. 구체적으로는 파골세포 활성 억제 물질로, 파골전구세포(pre-osteoclast)의 분화를 억제하는 OPG(osteoprotegerin), 골세포 활성 촉진인자 중 하나로 주변의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)를 끌어들여 골세포 분화를 촉진하는 역할을 하는 BMPs(bone morphogenic proteins) 골세포 활성 촉진인자 중 하나로 골조상세포(osteoprogenitor cells)의 이동(migration) 및 조골세포로의 분화를 촉진하며, 혈관생성을 도와 골 조직이 잘 재생될 수 있도록 돕는 TGF-β(transforming growth factor-β) 등 골다공증 예방 및 치료와 관련된 인자를 포함할 수 있다
상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법으로 이용하여 제조할 수 있고, 예를 들어
1) 줄기세포를 증식하는 단계;
2) 상기 증식된 줄기세포를 골 세포로 분화시키는 단계; 및
3) 골 세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출 및 정제하는 단계;를 포함하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 "골세포 분화 유도"란 줄기세포(stem cell)가 골세포로 분화(differentiation)되도록 유도하는 것을 의미할 수 있다.
상기 골 세포로 분화되는 줄기세포는 골세포로 분화 가능한 성체 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 골세포로 분화 가능한 성체 유래 줄기세포는 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 지방 유래 줄기세포는 인간 또는 포유동물 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, 상기 추출방법으로 추출된 엑소좀이 골다공증 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명에 따른 "골다공증 예방 또는 치료용 조성물"은 효과적인 골 재생을 위한 효능 물질로서 골세포로 분화하는 줄기세포에서 추출한 엑소좀을 사용한다는 점에서 종래 기술들과 차별성이 있다. 추출, 정제된 엑소좀에 담지된 세포의 증식 및 분화 관련 다양한 성장인자들에 의해 효과적으로 지속 가능한 골 조직의 재생이 이루어지며, 기존의 성체줄기세포의 체외 세포배양의 문제점 또는 세포 사멸로 인한 조직의 석회화 등의 문제들을 해결할 수 있다.
본 발명에 따른 골세포로 분화하는 기간 동안 추출된 줄기세포 유래 엑소좀은 줄기세포의 특성뿐 아니라 골세포로의 분화 관련 활성인자들만을 효과적으로 전달하여, 부작용은 최소화하면서 기존 줄기세포를 이용한 치료와 같은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에 따른 골세포로 분화하는 기간 동안 추출된 줄기세포 유래 엑소좀은 세포에서 분비되는 생체막 소포체이다. 또한 세포막과 유사한 지질 구조를 가지고 있기 때문에 체내에 주입되었을 때 주변 세포로의 흡수율이 뛰어나 효능 물질의 빠른 전달로 골 조직의 효과적 재생 유도가 가능하다.
본 발명에 따른 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 골다공증의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다.
또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물 성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화 수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으나, 바람직하게는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 줄기세포를 골세포로 분화시키기 위하여 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산(ascorbic acid) 및 베타 글리세로인산(β-glycerophosphate) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Adipose tissue-derived stem cell; ASC-EXO) 및 골 세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Osteogenic differentiating stem cell-derived exosome; Osteo-EXO)의 크기를 확인한 결과, 각각의 평균 크기가 약 50 ~ 200 nm 임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명에 따른 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(ASC-EXO) 및 골 세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Osteo-EXO)을 포함하는 조성물은 생체 내 주입 시 골 재생 촉진 및 골 밀도 증진 효과가 우수한 것을 확인하였다
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 주사제를 제공한다.
상기 주사제는 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)를 더 포함할 수 있다. 즉, 상기 주사제는 인산완충식염수에 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지하여 사용할 수 있다.
상기 주사제는 인산완충식염수 대신 하이드로젤을 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤은 히알루론산, 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 피브린, 엘라스틴, 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 히알루론산 하이드로젤일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 주사제는 엑소좀이 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/mL 또는 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/day/체중 kg로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 주사제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물의 골 등의 손상 부위에 주사하여 투여할 수 있으며, 정맥 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 주사제 조성물로서 체내 주입이 용이하기 때문에 수술 시간과 비용 면에서 경제적이고, 이에 따라 환자의 고통, 후유증과 경제적 부담을 줄여준다. 또한 줄기세포가 골세포로 분화될 때 추출된 엑소좀에는 세포외기질 유도체, 세포의 증식 및 분화와 관련된 여러 성장인자들이 포함되어 있어 손상된 골 조직의 효과적인 재생 촉진 및 골밀도 증진이 가능하다. 따라서 한 번의 시술로 장기적인 효과를 기대할 수 있어 지속적인 효과를 얻기 위해 주기적으로 시술을 해야 했던 기존의 문제점을 극복할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 즉, 본 발명에 따른 건강기능식품은 골다공증 예방 또는 개선을 위하여 골다공증의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 골다공증의 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 골다공증의 예방 또는 개선을 목적으로 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강기능식품에서 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강음료용 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 골다공증 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 용도를 제공한다.
상기 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 대하여는 전술한 바와 같고, 이를 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유효성분으로 포함하여 사용할 수 있음 또한 상기에서 설명한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료 방법을 포함한다.
상기 대상체는 골다공증이 발병하였거나 발병할 수 있는, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효성분에 대한 치료상 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 약학적으로 유효한 양은 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/day/체중 kg일 수 있으며, 4 x 109 particles/day/체중 kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 골다공증 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다.
구체적으로, 정맥주사요법, 흡입투여방식, 국소투여방식 등을 통해 대상체에 투여할 수 있으며, 흡입 및 국소 투여 방식으로 직접적으로 골에 엑소좀을 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 정맥주사 시 혈관을 따라 순환하던 엑소좀이 자연적으로 골에 축적되기 때문에 복잡한 치료 과정 없이 상기와 같은 간단한 방법으로 효율적으로 골다공증을 치료할 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1: 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀(ASC-EXO) 추출
증식된 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위하여, 인간 지방 유래 줄기세포(passage 3-7)를 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM contating 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양한 후 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하여 얻은 세포 배양 상층액을 회수하였다. 이로부터, 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하였다.
구체적으로, 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.22 μm 가공 크기를 갖는 filter를 이용하여 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 300 kD molecular weight cut off(MWCO)를 갖는 filter를 이용하여 TFF(tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액에 saline buffer를 추가하여 TFF 과정을 연속 반복한 후 최종적으로 엑소좀을 수득하였다. 엑소좀은 사용 전까지 -70 ℃에서 냉동 보관하였다.
실시예 2: 골 세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 엑소좀 (Osteo-EXO) 추출
본 발명의 일 실시예에서, 엑소좀은 인간 지방 유래 줄기세포를 골세포로 분화하는 과정에서 추출하였다.
구체적으로, 인간 지방 유래 줄기세포(passage 3-7)를 골세포 분화 배지(10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 0.5 mM 아스코르빈산(ascorbic acid), 0.01 M 베타-글리세로인산(β-glycerophosphate)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco Modified Eagle Medium))에서 배양하면서 3일에 한번씩 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 분화하고 있는 줄기세포의 배양 상층액을 회수하였다. 상층액을 회수한 이후 다시 분화 배지를 첨가하여 줄기세포의 골세포 분화를 유도하였으며, 이러한 과정을 3주까지 반복하였다.
회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 5분간 원심분리하여 세포를 제거하였다. 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.22 μm 가공 크기를 갖는 filter를 이용하여 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 300 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 filter를 이용하여 TFF (tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액에 saline buffer를 추가하여 TFF 과정을 연속 반복한 후 최종적으로 엑소좀을 수득하였다. 분화 배지 교체 1주 후부터 세포 모양의 변화가 생기며, 분화 배지 교체 2주 후부터는 골세포로 분화 시 관찰되는 칼슘 침전물이 형성되는 것을 확인하였다. 따라서 세포 모양의 변화가 확실하게 나타나는 분화 유도 후 1주 후부터 4주까지의 기간 동안 회수한 상층액으로부터 엑소좀을 추출하였다.
실시예 3: 증식된 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 골세포로 분화되고 있는 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 확인
상기 실시예 1 및 실시예 2로부터 추출한 엑소좀을 투과전자현미경(transmission electron microscope)을 이용하여 확인한 엑소좀의 구조 및 모양과 나노입자분석기(nanoparticle tracking analysis)를 이용하여 확인한 엑소좀의 크기 분포를 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2의 (A)와 (B)는 증식된 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO), (C)와 (D)는 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)의 구조, 모양(TEM) 및 크기(NTA)를 나타낸다.
투과전자현미경 결과(도 2의 (A), (C))와 같이 추출된 엑소좀은 둥근 나노입자 모양이며, 이들 엑소좀의 평균 크기는 ASC-EXO 176.7 nm, Osteo-EXO 181.8 nm인 것으로 확인하였다(도 2의 (B), (D)).
실시예 4: OPG(Osteoprotegerin) 발현 확인
본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에서 추출한 엑소좀 1 x 108particles/mL을 human osteoprotegerin ELISA Kit를 이용하여 엑소좀 내 OPG 발현을 정량 분석하였다. 이때, 비교 대조군으로서 골수 유래 줄기세포(bone-marrow mesenchymal stem cells)로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-EXO)을 사용하였다.
그 결과, 증식된 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(ASC-EXO)은 골수 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-EXO)에 비교하여 월등히 높은 OPG 함량을 보였다(46.79 pg/108 particle exosomes). 골세포로 분화되고 있는 인간 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)의 OPG 함량은 29.38 pg/108 particle exosomes 으로, 골수유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(BM-MSC-EXO)의 OPG 함량(27.44 pg/108 particle exosomes)과 비교하여 0.001 유의수준에서 차이가 있는 것을 확인하였다(P < 0.001)[도 3 참조]
실시예 5: 골 재생 촉진 및 골 밀도 증진 확인
엑소좀을 이용하여 골 재생 및 골 밀도 증진을 확인하기 위하여 증식하고 있는 줄기세포 엑소좀(ASC-EXO) 및 골세포로 분화되어 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Osteo-EXO)을 골다공증이 유발된 쥐(난소적출모델)에 1x108 particles/mL의 파티클 농도로 2주 동안 6번 정맥 투여하였다. 음성 대조군으로는 PBS를 2주동안 6번 정맥 투여하였다. 양성 대조군으로는 지방유래 줄기세포(ASC)를 5x105개씩 2번 정맥 투여하였으며, 개복수술만 진행한 sham 그룹도 함께 분석하였다.
투여 종료 2주 후, 쥐의 대퇴골을 적출하여 μCT를 촬영하여 bone volume(BV, 골 부피), percent bone volume(BV/TV, 조직 부피 대비 골 부피), bone mineral density(BMD, 골 밀도), structure model index(SMI, 구조 모델 지수), tubercular thickness(Tb.Th, 결절 두께), trabecular number(Tb.N, 결절 개수) 등 파라미터를 비교 분석하였다.
μCT를 촬영 결과는 도 4에 나타내었다. 또한, bone volume(BV, 골 부피), percent bone volume(BV/TV, 조직 부피 대비 골 부피), bone mineral density(BMD, 골 밀도), structure model index(SMI, 구조 모델 지수), tubercular thickness(Tb.Th, 결절 두께), trabecular number(Tb.N, 결절 개수) 등 파라미터를 비교 분석한 결과는 도 5와 같다.
비록 결절 두께(Tb.Th) 수치는 음성대조군(PBS)에 비하여 ASC, ASC-EXO, Osteo-EXO 투여군에서 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 골 부피(BV), 조직 부피 대비 골 부피(BV/TV), 골 밀도(BMD), 결절 개수(Tb.N)는 음성대조군(PBS)와 비교했을 때 0.01 유의수준에서 증가한 것을 확인하였다. 또한, 해면골 구조를 분석하는 구조 모델 지수(SMI)의 경우 음성대조군(PBS)에 비하여 ASC, ASC-EXO 투여군에서 0.05 유의수준에서 감소한 것을 확인하였다.
(SMI는 구조모델지수로서 고령 혹은 골다공증과 같은 질병이 있을 때 지수가 증가하는 양상을 보인다. 엑소좀 투여 시 음성대조군과 비교하였을 때 유의적으로 감소하는 결과를 통해 엑소좀이 골다공증을 완화시킨다고 확인하였다. Tb.Th 수치는 결절부위의 골 두께를 의미하는 것으로 골다공증 모델에서는 두께가 감소하는 경향을 보인다. 본 기술에서 TbTh에는 차이가 없었지만 나머지 골 부피(BV), 조직 부피 대비 골 부피(BV/TV), 골 밀도(BMD), 결절 개수(Tb.N), 해면골 구조지수(SMI)에서는 ASC-EXO과 Osteo-EXO을 처리했을 때 유의한 차이를 보이는 바, 골다공증에 효능이 있다고 판단된다.)

Claims (14)

  1. 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 골세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 지방조직 유래 줄기세포는 인간 또는 포유동물 유래 줄기세포인, 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 주사제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 주사제는 엑소좀이 1 x 106 내지 1 x 1011 particles/mL 농도로 포함되는 것인 골다공증 예방 또는 치료용 주사제.
  7. 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 골세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 골다공증 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 용도.
  11. 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell)로부터 추출된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 증식된 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 엑소좀은 골세포로 분화되고 있는 지방조직 유래 줄기세포로부터 추출된 것인, 골다공증 예방 또는 치료 방법.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 지방조직 유래 줄기세포는 인간 또는 포유동물 유래 줄기세포인, 골다공증 예방 또는 치료 방법.
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