KR101784054B1

KR101784054B1 - mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101784054B1
Application number: KR1020150014149A
Authority: KR
Inventors: 김재룡; 배윤위
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2017-10-10
Also published as: KR20160093312A

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다. 본 발명에 따르면, 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 mmu-miR-291a-3p를 복제노화된 사람 섬유아세포 및 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 형질주입한 경우, 노화세포의 세포노화 활성이 감소하고 세포 수가 증가하였다. 반면, mmu-miR-291a-3p의 상보적 miRNA인 mmu-miR-291a-5p를 형질주입한 노화세포에서는 세포노화 활성이 증가하였으며, 세포 증식에는 변화가 나타나지 않았다. 따라서, 본 발명의 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 조성물은 세포노화 질환 치료용 약학조성물, 세포노화 질환 개선용 건강식품조성물 및 피부노화 개선용 화장료조성물로 사용될 수 있다.

Description

mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cell senescence diseases comprising mmu-miR-291a-3p}

본 발명은 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 Mus musculus-miR-291a-3p(mmu-miR-291a-3p)를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

세포노화는 세포 증식제한, 조직과 개체의 노화 유도, 암의 억제와 촉진, 조직재생과 복구에 중요한 역할을 하며 노화관련 질환에도 원인이 된다. 이러한 세포노화는 텔로미어의 단축, 암 유전자의 발현, 염색체 이상, DNA 손상, 산화 혹은 염증관련 스트레스, 방사선, 항암제 등과 같은 여러 가지 요인에 의해 유도된다.

세포노화는 비가역적이고 필연적인 과정으로 알려져 있었지만, 최근 연구결과에 따르면 노화의 속도와 과정은 세포분비물질과 작은 화합물 등으로 조절될 수 있는 데, 젊은 생쥐의 혈액에 존재하는 순환물질들이 늙은 생쥐의 근육재생 (Conboy et al . 2005)이나, 신경조직재생(Villeda et al . 2011), 그리고 심장비대증(Loffredo et al . 2013)을 개선하는 효과가 있음이 밝혀졌다. 그러므로 노화에 관한 연구는 노화 자체뿐 아니라 심장병, 신경변성질환, 암 등과 같은 노화관련 질환을 효율적으로 치료하는데도 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다(Lopez-Otin et al . 2013).

배아줄기세포는 자기복제능력과 여러 세포들로 분화할 수 있는 전분화능을 가지고 있으므로 세포치료제로서 많은 가능성을 가지고 있다. 또한, 배아줄기세포가 분비하는 물질들이 세포증식과 조직손상에 좋은 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 사람 줄기세포 배양액이 늙은 생쥐에서 분리한 근육세포의 증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Conboy et al . 2011). 또한, 사람 줄기세포로부터 분화된 간세포 분비 물질이 CCl₄에 의한 간손상을 억제하며(Woo et al . 2012) 젊은 생쥐에서 분리한 근육 줄기세포의 분비물질이 늙은 생쥐에서 분리한 근육 줄기세포의 증식과 분화를 촉진시키는 것(Lavasani et al . 2012)으로 알려져 있다. 그러나 줄기세포 분비물질이나 배양액이 세포노화를 직접적으로 억제하는지에 대한 결과는 아직 보고되지 않고 있다.

마이크로 RNA(miRNA)는 염기서열이 22개 이내의 RNA로서 상보적인 표적 mRNA와 결합하여, mRNA의 분해를 촉진하거나, mRNA의 번역(translation)을 억제하여 유전자 발현을 조절한다. miRNA 발현 조절에 문제가 생길 경우 대사성 질환이나 면역관련 질환, 암 등이 가속화될 수 있다(Kosaka et al . 2013).

세포로부터 성장인자, 싸이토카인, 케모카인, 단백질 분해효소 등과 같은 다양한 단백질들뿐만 아니라, 엑소솜을 통하여 다양한 miRNA들이 분비되고 있으며, 분비된 단백질과 miRNA들이 주위 세포에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

엑소솜은 혈액, 침, 뇌척수액, 모유, 소변 등과 같이 거의 모든 체액에서 발견된다. 이러한 엑소솜에 존재하는 miRNA들은 다양한 질환의 진단 표시자로 유용하며, 전이성 암세포에서 분비되는 miRNA에 대한 저해제를 처리하면, 암의 성장과 전이가 억제되며, 정상 전립선 상피세포에서 분비된 miRNA가 전립선 암세포의 성장을 억제하는 것으로 알려짐에 따라, 세포에서 분비되는 miRNA가 암의 진단과 치료에 활용될 수 있는지 연구되어 지고 있다.

이렇듯 세포에서 분비되는 다양한 miRNA들에 대한 역할이 보고되었지만, 생쥐 배아줄기세포에서 분비되는 miRNA에 대한 세포노화 저해 효능은 아직 보고되지 않고 있다.

한국공개특허 제10-2014-0018448호

본 발명은 생쥐 배아줄기세포 유래 Mus musculus-miR-291a-3p(mmu-miR-291a-3p)를 유효성분으로 함유하는 조성물을 세포노화 질환 치료용 약학조성물, 세포노화 질환 개선용 건강식품조성물 및 피부노화 개선용 화장료조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따르면, 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 mmu-miR-291a-3p를 복제노화된 사람 섬유아세포 및 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 형질주입한 경우, 노화세포의 세포노화 활성이 감소하고 세포 수가 증가하였다. 반면, mmu-miR-291a-3p의 상보적 miRNA인 mmu-miR-291a-5p를 형질주입한 노화세포에서는 세포노화 활성이 증가하였으며, 세포증식에는 변화가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 mmu-miR-291a-3p가 세포노화 저해에 효과적인 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 조성물은 세포노화 질환 치료용 약학조성물, 세포노화 질환 개선용 건강식품조성물 및 피부노화 개선용 화장료조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 복제노화가 유도된 사람 섬유아세포에서 생쥐 배아줄기세포 유래 mmu-miR-291a-3p의 세포노화 저해 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 생쥐 배아섬유아세포 배양액(MCM)과 생쥐 배아줄기세포 배양액(CM)에서 발현된 mmu-miR-291a-3p 수준을 확인한 결과이며, 도 1B는 mmu-miR-291a-3p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 노화활성을 확인한 SA-β-gal 염색 결과이며, 도 1C는 mmu-miR-291a-3p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 세포 증식을 확인한 결과이며, 도 1D는 mmu-miR-291a-3p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 세포주기 분석 결과이며, 도 1E는 mmu-miR-291a-3p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 웨스턴 블롯 분석결과이다(*p<0.05, **p<0.01).
도 2는 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에서 생쥐 배아줄기세포 유래 mmu-miR-291a-3p의 세포노화 저해 효과를 확인한 결과로, 도 2A는 mmu-miR-291a-3p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 노화활성을 확인한 SA-β-gal 염색 결과이며, 도 2B는 mmu-miR-291a-3p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 세포증식을 확인한 결과이다(*p<0.05, **p<0.01).
도 3은 복제노화가 유도된 사람 섬유아세포에서 생쥐 배아줄기세포 유래 mmu-miR-291a-5p의 세포노화 저해 효과를 확인한 결과로, 도 3A는 mmu-miR-291a-5p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 노화활성을 확인한 SA-β-gal 염색 결과이며, 도 3B는 mmu-miR-291a-5p의 negative control miRNA(neg), mimic miRNA(mi)와 inhibitor miRNA(inh)를 형질 주입한 노화세포의 세포 증식을 확인한 결과이다(*p<0.05, **p<0.01).

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다. 보다 상세하게는 상기 mmu-miR-291a-3p는 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 miRNA일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1A와 같이 mmu-miR-291a-3p는 생쥐 배아섬유아세포보다 생쥐 배아줄기세포에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 miRNA-291a-3p를 복제노화된 사람 섬유아세포에 형질주입하고 SA-β-gal 염색을 통하여 세포노화 활성을 확인한 결과, 도 1B와 같이 mmu-miR-291a-3p를 형질주입한 세포군에서 세포노화 활성이 대조군보다 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 형질 주입된 세포군의 세포증식을 확인한 결과, 도 1C와 같이 mmu-miR-291a-3p를 형질주입한 세포군에서 세포 수가 증가하였으며, 도 1D와 같이 S와 G2/M기의 세포 집단이 증가하였으며, G0/G1기 세포는 감소한 것을 확인하였다. 또한, 아드리아마이신에 의해 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 mmu-miR-291a-3p를 형질주입하고 세포노화 활성 및 세포증식을 확인한 결과, 도 2와 같이 SA-β-gal 활성이 감소하고 세포 수가 증가된 것을 확인할 수 있었다.

반면, 도 3과 같이 mmu-miR-291a-3p의 상보적 miRNA인 mmu-miR-291a-5p를 형질주입한 노화세포에서는 세포노화 활성이 증가하였으며, 세포 증식에는 변화가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 mmu-miR-291a-3p가 세포노화 저해에 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 조성물은 세포노화 질환 치료용 조성물로 제공될 수 있다.

상기 세포노화 질환은 피부 노화, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환, 뇌졸중, 퇴행성 관절 질환, 노인성 흑점, 골다공증, 탈모증, 다발성 경화증, 백반증, 죽상경화증, 관상동맥질환, 협심증, 간경화증, 전립선비대증, 만성신질환, 폐기종 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 mmu-miR-291a-3p의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 세포노화 질환 예방 또는 개선용 건강식품조성물을 제공할 수 있다.

상기 건강식품은 상기 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 조성물의 유효용량은 상기 치료제의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공할 수 있다.

상기 화장료조성물은 유효성분인 mmu-miR-291a-3p외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 재료

사람 섬유아세포는 Lonza(Walkersvill, MD, 미국)에서 구입하였으며, DMEM(Dubeccos-Modified Eagle's medium) 배지, 소태아혈청(FBS), 항생제 용액 (Penicillin-Streptomycin)은 WelGene(Daegu, 대한민국)에서 구입하였다.

생쥐 배아줄기세포는 캐나다 토론토 대학 Andras Nagy lab에서 분양받은 G4 cell 을 사용하였다. 아드리아마이신은 일동제약주식회사 제품을 사용하였으며, miRNA는 제놀루션 주식회사(Seoul, 대한민국)에서 Mus musculus-miR-291a-3p(mmu-miR-291a-3p)의 negative control(서열번호 2), mimic(서열번호 1), inhibitor(서열번호 3)를 주문하여 사용하였다.

< 실험예 2> 세포노화 유도

1. 세포배양에 따른 복제노화 유도

사람 섬유아세포를 10% 소태아혈청과 1% 항생제(penicillin 10,000 unit/ml, stretomycin 10,000 mg/ml)가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여 직경 100 mm 배양접시에 세포를 1x10⁵개로 분주한 후, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

배양접시의 바닥에 80-90% 정도 세포가 자라면, 트립신-EDTA 용액 (2.5%)을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 세포를 계대할 때마다 세포 수를 측정하여 세포가 몇 회 분열하였는지 조사하였다. 세포의 분열 횟수 (population doubling, PD)는 하기식으로 조사하였다.

PD= log₂F/log₂I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)

실험에 사용한 세포들은 분열횟수가 사람 섬유아세포의 경우 PD>75 것을 사용하였다.

2. 아드리아마이신 처리에 의한 세포노화 유도

직경 100 mm 배양접시에 사람 섬유아세포를 1.5x10⁵개 분주하였다. 3일간 37℃ 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척하고 500 nM 아드리아마이신을 4시간 처리한 후, 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 3회 세척하고 사람 섬유아세포는 10% 소태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 배양하였다.

배양 4일 후, SA-β-gal(senescence-associated β-galactosidase) 활성 염색으로 세포노화가 유도된 것을 확인하였다.

< 실험예 3> 줄기세포 배양

생쥐 배아줄기세포는 미토마이신(mitomycin) C 가 처리된 생쥐 배아섬유아세포 위에서 줄기세포배양액[15% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민(glutamine), 100 μM 비필수 아미노산(nonessential amino acids), 100 μM 베타-멀캅토에탄올(beta-mercaptoethanol), 100 units/ml 백혈병억제인자(leukemia inhibitory factor), 50 units/ml 페니실린(penicillin), 50 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM 배양액]으로 배양하였다.

생쥐 배아섬유아세포를 발생 13.5 일째인 배아에서 분리하였고, 10% 소태아혈청과 1% 항생제(50 units/ml 페니실린 and 50 mg/ml 스트렙토마이신)가 포함된 DMEM 배양액에서 배양하였다. 생쥐 배아섬유아세포와 생쥐 배아줄기세포는 매일 새로운 배지로 바꿔주었다.

< 실험예 4> 세포배양액 준비

생쥐 배아섬유아세포 위에서 자라고 있는 배아줄기세포를 0.1% 젤라틴(gelatin)으로 코팅된 배양접시로 옮겨 줄기세포배양액에서 80-90% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배아줄기세포는 OPTI-MEM(Life Technologies, NY, 미국)으로 10분씩 세 번 세척해주고, OPTI-MEM 상태로 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 회수한 후 5000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 0.22 μm 필터를 이용하여 세포 찌꺼기들을 제거하였다. 생쥐 배아섬유아세포의 배양액도 동일한 방법으로 준비하였다.

< 실험예 5> 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응( Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ; qRT - PCR )

생쥐 배아섬유아세포와 생쥐 배아줄기세포의 배양액을 준비하고, miRNeasy Mini Kit (QIAZEN)을 이용하여 miRNA를 포함하고 있는 전체 RNA를 분리하였다. RNA를 정량한 후, Taqman microRNA reverse transcription kit를 이용하여 역전사반응을 수행하였으며, Taqman miRNA assay kit와 Taqman universal mastermix kit를 사용하여 PCR (Applied Biosystems Inc., CA, 미국)을 수행하였다.

< 실험예 6> 통계 분석

모든 실험은 한번에 3개씩 각각 3회 이상 반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였다. 통계적 유의성은 Student t-test로 분석하였으며, p값이 0.05 이하 (p<0.05)일 때 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

< 실시예 1> 세포노화 저해 효과 확인

1. miRNA 형질주입( Transfection )

복제노화된 세포와 아드리아마이신으로 유도한 노화세포를 12 well에 각각 8x10³개로 분주한 후, 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 1일 배양하였다. 세포를 OPTI-MEM으로 세척한 후, 생쥐 배아줄기세포에서 분리된 mmu-miR-291a-3p 및 mmu-miR-291a-5p에 대한 각각의 negative control miRNA, mimic miRNA와 inhibitor miRNA를 35 nM로 RNAi Max (Invitrogen, NY, 미국)을 이용하여 형질도입(transfection)하였다. 4시간 후 DMEM 배양액으로 교체하고, 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 세포 성장은 Trypan blue 염색 후, 세포수를 측정하였으며, 세포노화는 senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) 활성 염색법으로 조사하였다.

2. SA -β- gal ( Senescence - associated β- galactosidase ) 활성 염색

세포노화에 대한 miRNA의 효과는 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다 (Dimri et al . 1995). 노화된 세포를 12 well에 8x10³개로 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 1일간 배양하였다. 상기 방법으로 3일 동안 각각의 miRNA의 negative control, mimic, inhibitor로 형질주입된 세포를 인산완충액으로 세척하였다. 그 후, 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 고정하고, SA-β-gal 염색 용액(40 mM citric acid/phosphate [pH 5.8], 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, X-gal 1 mg/ml)을 24 well에 각 well 당 250 ml, 12 well에는 각 well 당 500 ml를 넣어 주었다. 은박지로 싸서 37℃에서 16시간에서 18시간 동안 반응시켰다. 그 후, 인산완충용액 (PBS)로 2번 세척하고 1% 에오진 용액으로 1분간 염색한 후, 인산완충용액으로 2회 세척하고 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50~100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율로 표시하였다.

3. 세포주기 분석

상기 방법으로 형질주입된 각 세포를 인산완충액 (0.5 mM CaCl₂, 2% FBS)으로 세척하였다. 트립신-EDTA 용액(2.5%)을 처리하여 세포를 분리한 후 3000 rpm, 4℃ 에서 2분간 원심분리한 후 인산완충액 (0.5 mM CaCl₂, 2% FBS) 100㎕를 넣어주었다. 세포를 진탕하면서, 차가운 알코올 200 ml를 한 방울씩 떨어뜨리고 4℃에서 1시간 이상 고정한 후, 인산완충액 (0.5mM CaCl₂, 2% FBS)으로 두 번 세척하고, 1.12% sodium citrate 완충액(pH 8.5, 50 mg/ml RNase)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다.

50 mg/ml propidium iodide가 포함된 1.12% sodium citrate 완충액(pH 8.5) 250 ml를 넣은 후, 실온에서 20분 반응시켰다. BD FACS CantoⅡ 유세포 분류기 (BD Biosciences, CA, 미국)를 사용하여 세포주기를 분석하였다.

4. 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석

세포를 인산완충액으로 1회 세척한 후, 세포 용해 용액(25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM Nacl, 1% Tryton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM sodium vanadate, 5 mM NaF, protease inhibitor or 1 mM PMSF) 50 ml를 넣었다. 세포 긁게를 이용하여 용액과 세포를 모은 후, 미세원침관으로 옮겼다. 얼음에서 30분간 반응시키면서 매 10분마다 용액을 진탕하였다. 12,000×g에서 10분간 원심분리하고 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 용액 속의 단백질 양은 소혈청 알부민을 표준단백질로 사용하여 BCA(bicinchoninic acid; Pierce Biotechnology Inc., IL, 미국)방법으로 정량하였다.

상기 정량된 단백질(30 μg)을 10% SDS-폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 이동시킨 후, 5% 탈지유가 포함된 TTBS(Tween-20-Tris buffered saline)에서 1시간 동안 반응시켰다. 니트로셀룰로스 막을 p53, p21또는 pRb에 대한 일차항체가 포함된 5% 탈지유-TTBS 용액에서 밤새도록 반응시켰다. TTBS 용액으로 3회 세척한 후, horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체와 1시간 30분 동안 반응시켰다. TTBS로 막을 5분씩 5회 세척한 후, enhanced chemiluminescence 용액을 이용하여 p53, p21와 pRb의 양을 측정하였다. 각 항체와 반응한 특정 단백질의 양은 LAS-3000 영상장치(Fujifilm Corp., CT, 미국)을 사용하여 측정하였다. 각 실험에 동일한 양의 단백질이 사용되었음은 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease (GAPDH) 항체를 사용하여 확인하였다.

5. mmu - miR -291a-3p의 세포노화 저해 효과 확인

생쥐 배아줄기세포 배양액과 생쥐 배아섬유아세포 배양액에서 mmu-miR-291a-3p의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 결과, 도 1A와 같이 배아섬유아세포 배양액보다 배아줄기세포 배양액에서 mmu-miR-291a-3p의 발현량이 100배 정도 많은 것을 확인할 수 있었다.

mmu-miR-291a-3p가 사람 섬유아세포에서 세포노화를 저해하는 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위해, 상기 생쥐 배아줄기세포 배양액에서 분리된 mmu-miR-291a-3p에 대한 negative control miRNA, mimic miRNA 및 inhibitor miRNA을 계대배양을 통해 복제 노화가 유도된 사람 섬유아세포에 형질주입한 후 세포노화 표현형의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 1B와 같이 mmu-miR-291a-3p negative control miRNA와 inhibitor miRNA를 처리한 실험군보다 mimic miRNA를 처리한 실험군의 SA-β-gal 활성 염색이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

또한 세포성장을 확인한 결과, 도 1C와 같이 mmu-miR-291a-3p mimic miRNA를 처리한 실험군의 세포 수가 mmu-miR-291a-3p negative control miRNA와 inhibitor miRNA를 처리한 실험군보다 증가 된 것을 확인할 수 있었다.

세포주기 분석결과, 도 1D와 같이 mimic miRNA를 처리한 실험군에서 S와 G2/M기의 세포 집단이 증가하였으며, G0/G1기 세포는 감소한 것을 확인하였다.

또한, 노화관련 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, 도 1E와 같이 mimic miRNA를 처리한 세포에서 세포노화 과정에서 증가하는 p53 및 p21의 발현이 감소한 반면, 세포노화 과정에서 발현이 감소하는 pRb의 발현은 증가하였다.

상기 결과들로부터 생쥐 배아줄기세포에서 분비되는 mmu-miR-291a-3p가 복제노화가 유도된 사람 섬유아세포의 세포노화를 억제하는 것이 확인되었다.

mmu-miR-291a-3p가 복제노화뿐만 아니라, 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화도 억제 효과를 나타낼 수 있는지 확인하였다.

아드리아마이신 처리로 노화된 사람 섬유아세포에 상기 생쥐 배아줄기세포 배양액에서 분리된 mmu-miR-291a-3p에 대한 negative control miRNA, mimic miRNA 및 inhibitor miRNA을 형질주입하고 SA-β-gal 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 Negative control miRNA와 inhibitor miRNA 처리 실험군보다 mimic miRNA를 처리한 실험군의 SA-β-gal 활성이 감소하였으며, 세포 성장은 증가하였다.

상기 결과로부터 생쥐 줄기세포에서 분비되는 mmu-miR-291a-3p는 복제 노화뿐만 아니라, 아드리아마이신에 의해 유도된 세포노화 억제에도 효과적인 것이 확인되었다.

6. mmu - miR -291a-5p의 세포노화 저해 효과 확인

miRNA는 두 가닥으로 존재하며, 각 가닥에 서로 다른 표적 mRNA와 결합한다.

따라서, mmu-miR-291a-3p의 상보적 가닥인 mmu-miR-291a-5p에 대한 세포노화 저해 효능을 확인하였다.

mmu-miR-291a-5p에 대한 negative control miRNA(서열번호 4), mimic miRNA(서열번호 5) 및 inhibitor miRNA(서열번호 6)을 노화세포에 형질주입하고 세포 수 및 SA-β-gal 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 3과 같이 mmu-miR-291a-5p mimic miRNA를 처리한 실험군의 경우, SA-β-gal 활성이 증가하였으며, 세포 성장에는 변화가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터, mmu-miR-291a-5p는 세포노화 저해 효능이 없는 것이 확인되었으며, 세포노화 저해 효과는 mmu-miR-291a-3p의 특이적인 효과인 것을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명에 따른 줄기세포 유래의 mmu-miR-291a-3p는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기에서는 본 발명에 따른 줄기세포 유래의 엑소솜을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 약학조성물의 처방예

<제제예 1-1> 주사제의 제조

mmu-miR-291a-3p 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

<제제예 2-1> 정제의 제조

mmu-miR-291a-3p 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3-1> 캡슐제의 제조

mmu-miR-291a-3p 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4-1> 연고제의 제조

mmu-miR-291a-3p 100 mg, PEG-4000 250mg, PEG-400 650mg, 백색바셀린 10mg, 파라옥시안식향산메칠 1.44mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.

< 제제예 2> 화장료 조성물의 제제예

<제제예 2-1> 영양 로션의 제조

프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 mmu-miR-291a-3p를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<제제예 2-2> 영양 크림의 제조

카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부

및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노 스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 mmu-miR-291a-3p를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

< 제제예 3> 건강식품의 제조

mmu-miR-291a-3p 0.5 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cell senescence diseases comprising mmu-miR-291a-3p <130> ADP-2015-0628 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-291a-3p <400> 1 aaagugcuuc cacuuugugu gc 22 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-291a-3p nagative control <400> 2 ccucgugccg uuccaucagg uag 23 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-291a-3p inhibitor <400> 3 gcacacaaag uggaagcacu uu 22 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> mmu-miR-291a-5p negative control <400> 4 ccucgugccg uuccaucagg uag 23 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-291a-5p <400> 5 caucaaagug gaggcccucu cu 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> mmu-miR-291a-5p inhibitor <400> 6 agagagggcc tccactttga tg 22

Claims

생쥐 배아줄기세포로부터 분리되며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하며, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 치료용 약학조성물.
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생쥐 배아줄기세포로부터 분리되며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하며, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 개선용 건강식품조성물.
생쥐 배아줄기세포로부터 분리되며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 표시되는 mmu-miR-291a-3p를 유효성분으로 함유하며, 아드리아마이신에 의해 유도되는 섬유아세포 노화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부노화 예방 또는 개선용 화장료조성물.