KR20050055479A

KR20050055479A - 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로하는 ｍｍｐ-9 억제제

Info

Publication number: KR20050055479A
Application number: KR1020030088697A
Authority: KR
Inventors: 정태욱; 이영춘; 김철호
Original assignee: 김철호
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-06-13
Also published as: WO2005053671A1

Abstract

본 발명은 MMP-9 억제제에 관한 것으로 좀더 상세히는 카페인산(caffeic acid) 또는 카페인산 페네틸에스테르(caffeic acid phenethyl ester)를 함유하는 MMP-9 억제제에 관한 것이다.

Description

카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 ＭＭＰ-9 억제제{ＭＭＰ-9 inhibitor containing caffeic acid or caffeic acid phenethyl ester}

MMP류는 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 여러 가지 성분을 분해하는데 중요한 역할을 한다. MMP류에 의해서 매개되는 질환으로는 동맥경화증, 재협착증, MMP-매개 골감소증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 각막궤양, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤과 전이 등이 있다.

이러한 MMP류 중에서 특히 MMP-2와 MMP-9는 타입Ⅳ 콜라겐에 특이적으로 작용하여 염증, 졸중, 종양생장 및 전이와 같은 질환에서 중요한 역할은 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 뇌척수액에서 MMP-9의 수준은 다발성 경화증 및 기타 신경성 질환과 관련되어 있으며[Beeley, N.R.A. et al., supra.; Miyazaki, K. et al., Nature 362, 839~841(1993)], 또한 아밀로이드 베타단백질을 분해하여 축적시키는데도 기여한다고 알려져 있다[Backstrom JR, et al., J neurosci 16(24), 7910-9 (1996)].

뿐만 아니라, MMP-9는 간암의 침윤과 전이에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 암의 전이와 침윤은 악성암세포의 기본적인 특성이다. 암은 초기에 전이뿐만 아니라 혈관으로 침윤을 일으킨다. 암세포는 침윤과 전이 과정에서 몇 가지 중요한 단계를 거친다. 이들 과정 중에서 암조직을 둘러싸는 세포외기질과 기저막은 암의 침윤에 있어서 벽으로 간주되므로 기저막(basement membrane)을 구성하는 세포외기질의 분해가 본질적인 초기 단계이다. 여러 가지 단백질분해효소가 이 과정에 관여하며 외부환경 장벽인 세포외기질(ECM)과 기저막의 분해를 통하여 최종단계에 이른다(Woessner, J. F. Jr. FASEB J., 5: 2145-2154, 1991.). 그러나 세포에서 분비되는 것은 비활성형의 프로MMP-9으로써 이것은 우로키나제-타입 프라즈미노겐 활성자(urokinase-type plasminogen activator, uPA)에 의한 프라즈미노겐(plasminogen)의 활성형의 생성(plasmin)을 포함한 일련의 효소 활성화를 통해서 활성화된다. 활성화된 MMP-9는 암세포의 침윤능을 증진시킨다(대한민국 특허공보 제2002-71674호).

암의 침윤과 전이에 중요한 영향을 미치는 MMP-9의 발현과 관련이 있는지를 실험하기 위해 암세포에서 발현되는 MMP-9를 자이모그래피(zymography), 노던블랏(northern blot), 웨스턴블랏(western blot) 분석법을 이용하여 확인하였다. 암세포에서 MMP-9의 발현은 높게 나타나고 마트리젤(matrigel)을 이용한 침윤실험에서 플라즈민(plasmin) 의존적으로 침윤이 증가하였다. 이 결과들은 암세포의 전이가 MMP-9 전사활성을 통해서 침윤과 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 보여진다. 게다가 MMP-9 발현은 뇌암, 신경계암 및 유방암의 침윤과 전이에 중요하다(Rao et al., 1993; Rao et al., 1996 Scorilas et al., 2001). 또한, MMP-9의 프로모터영역이 AP-1과 NF-κB 결합영역을 가지고 있기 때문에(Sato, H., and Seiki, M. Oncogene, 8: 395-405, 1993) 종양세포와 그 사이토카인이나 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 같은 자극원들은 Ras/Raf/ERK, JNK 및 PI-3K/AKT 신호전달경로(Arai, K.등,Glia. 43: 254-264, 2003; Sato, H., and Seiki, M.. Oncogene, 8: 395-405, 1993; Gum, R등, Oncogene, 14: 1481-1493, 1997; Eberhardt, W., 등, J. Immunol., 165: 5788-5797, 2000; Abiru, S.등, Hepatology, 35: 1117-1124, 2002; Kim, D등, FASEB J., 15: 1953-1962, 2001; Sato, T.등, Cancer Res., 62: 1025-1029, 2002)를 통하여 AP-1과 NF-κB 등의 전사인자의 활성화를 조절함으로서 MMP-9 발현을 조절한다. NF-κB는 암화 개시에 직접 관여하는 수많은 유전자들의 발현을 조절한다(Pahl H. L., Oncogene, 18: 6853-6866, 1999; Garg A., Aggarwal B. B., Leukemia (Baltimore), 16: 1053-1068, 2002). 여기에 해당하는 것들로는 survivin, TRAF, bcl-2 등과 같은 항아폽토시스(antiapoptosis) 유전자 등이 있다. 게다가, NF-κB는 TNF-α나 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인 유전자들의 활성화에 관여하는 핵심전사인자이다. 또한 NF-κB는 MMP-9, COX-2 및 iNOS유전자의 활성화를 유도한다. 그래서, NF-κB 활성화를 억제하는 몇 가지 물질들이 암화를 억제하고 암전이를 억제하는 잠재성이 있는 것으로 평가되며 치료제로서 개발이 왕성하게 이루어지고 있다.

카페인산(caffeic acid, CA)은 과일, 야채, 포도주, 식물성오일 및 커피성분 등에 자연계에 광범위하게 존재하는 페놀산(phenolic acid)계 화합물이다(Shahidi, F., and Naczk. M. Food phenolics. Sources, chemistry, effects, applications, Technomic Publishing Company, Inc, Lancaster, PA (1995).

카페인산 페네틸에스테르(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)는 주로 벌의 프로폴리스(Grunberger, D.등, Experientia. 44: 230-232, 1988)에서 추출되며 CA(Nagaoka, T.등, Bioorg Med Chem. 10: 3351-3359, 2002)를 에스테르화하여 합성된다.

CA와 CAPE는 잘 알려진 항산화 활성을 가지고 있으며(Grunberger, D.등, Experientia. 44: 230-232, 1988; Vieira, O.등, Biochem. Pharmacol. 55: 333-340,1998), 리포옥시게나제(lipoxygenases), 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase), 클루타사이온 S-트랜스페라제(glutathione S-transferase), 잔틴옥시다제(xanthine oxidase) 등의 효소들을 저해하는 활성을 가진다[Chan, W.S.등, Anticancer Res. 15: 703-707, 1995; Schefferlie, J.G., and van Bladeren, P.J. Food Chem. Toxicol. 31: 475-482, 1993; Koshihara, Y.등, Biochim. Biophys. Acta. 792: 92-97, 1984; Mirzoeva, O. K.등, FEBS Lett. 396: 266-270, 1996]. 또한, CA와 CAPE는 항종양활성[Tanaka, T.등, Carcinogenesis. 14: 1321-1325, 1993; Frenkel, K.등, Cancer Res., 53: 1255-1261, 1993], 항염증성 활성[Michaluart, P.등, Cancer Res. 59: 2347-2352, 1999; Fernandez, M. A.등, J. Pharm. Pharmacol. 50: 1183-1186, 1998], 에이즈 바이러스 HIV 복제억제능[Kashiwada, Y.등, J. Nat. Prod. 58: 392-400, 1995; Fesen, M. R.등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2399-2403, 1993]이 보고되었다. 나아가서, CA는 효과적으로 세라마이드(ceramide)-유발된 NF-κB 결합활성을 억제하며(Nardini, M.등, Free Radic Biol Med. 30: 722-733, 2001), CAPE는 전사인자 NF-κB의 활성을 특이적이고 효과적으로 억제한다(Natarajan, K.등, Proc Natl Acad Sci U S A 93: 9090-9095, 1996.). 그러나, CAPE의 항암전이 활성이 알려져 있다 하더라도(Nagaoka, T.등, Biol. Pharm. Bull. 26: 487-491, 2003), CA와 CAPE에 의한 MMP-9 효소활성의 직접적인 저해와 MMP-9 유전자발현의 직접적인 억제를 통한 암전이 및 침윤억제 활성은 보고된 바가 없다.

따라서, 본 발명은 CA와 CAPE의 MMP-9 효소활성의 직접적인 저해제로서의 용도를 밝히려는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 함유하는 MMP-9 억제제를 개발하였다.

본 발명은 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 MMP-9 억제제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 억제제가 MMP-9 효소생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 억제제가 MMP-9 발현을 위한 전사를 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 억제제가 MMP-9 프로모터 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 억제제가 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 종양의 전이, 침윤 또는 성장과 관련한 질환에 사용되는 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르의 MMP-9 억제제로써의 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 통해 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: CA와 CAPE가 HepG2 세포의 증식에 미치는 억제효과 측정>

세포배양은 사람간암세포주 HepG2를 10% 열처리된 소태아혈청(FBS, Gibco-BRL, USA), 페니실린(100units/㎖), 스트렙토마이신(100㎍/㎖) 및 중탄산나트륨 (sodium bicarbonate, 2.2g/ℓ)이 함유된 Dulbecco의 수식배지(DMEM, Gibco-BRL, USA)에서 37℃, 5% CO₂-공기배양기에서 배양하였다.

세포증식검정은 시판중인 증식검정 킷트-II(XTT, Boehringer Mannheim, Germany)를 구입하여 측정하였다. 간단하게 설명하면 HepG2 세포를 96웰 배양플레이트에서 100㎕의 DMEM 배양배지당 10³개의 세포수까지 이르도록 24시간동안 배양한뒤 96웰 플레이트상의 배지를 버리고 여러 가지 농도의 CA 또는 CAPE가 첨가된 100㎕ 용량의 새로운 배지를 대체하였다. 플레이트를 5% CO₂로 유지하고 24시간동안 37℃에서 습도유지 배양기에서 보온배양하였다. 배양 후에 배지를 버리고 세포를 PBS 생리식염수로 세척하고 5㎖의 XTT-표식시약과 100㎕의 전자결합(electron coupling) 시약을 혼합하여 조제한 XTT시약 50㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 다시 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간동안 보온하여 ELISA 측정기(Molecular Devices, USA)로 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

CA와 CAPE가 간암세포인 HepG2의 증식에 미치는 효과를 검정하기 위하여 HepG2 세포를 여러 농도의 CA 및 CAPE를 각각 첨가하고 24시간동안 반응시킨 후 세포증식 억제활성을 XTT법으로 측정하였다. 흡광도는 490nm에서 ELISA 측정기(Molecular Devices, USA)로 측정하였다. 상기 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1의 (A)는 CA의 효과이고 (B)는 CAPE의 효과이다. 또한 상기 그래프는 CA 및 CAPE를 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하여 세포증식을 백분율로 나타내었고, 각 데이터는 3번의 독립적인 실험을 실시하여 평균치±SD로 나타내었다. 결과에서 알수 있듯이 CA, CAPE 모두 간암세포주 증식억제 활성을 확인하였다.

<실시예 2: CA와 CAPE의 MMP-9 효소활성에 미치는 효과>

CA와 CAPE의 MMP-9 효소활성인 젤라틴 분해활성에 대한 억제효과를 검정하기 위하여 PMA를 처리한 HepG2 세포배양액으로부터 얻은 조건배지를 62.5mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤(glycerol), 2% SDS 및 0.00625%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 함유된 같은 완충액에 재희석하였다. 그리고 이 용액을 0.1%(w/v) 젤라틴이 함유된 10% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 가열하지 않고 전기영동시켰다. 전기영동 후에 젤을 실온에서 2.5% Triton X-100(2X30 min)에 담가 적시고 NanoPure 증류수로 세척하였다. 그런 다음 젤을 각 전기영동 레인단위로 슬라이스 조각으로 세절하여 다양한 농도의 CA나 CAPE를 함유한[50mM Tris-HCl(pH 7.5), 200mM NaCl, 2.5mM CaCl₂] 반응용 완충액을 담은 각각의 탱크용기에 담구었다. 이렇게 준비된 CA와 CAPE를 처리한 젤을 37℃에서 24시간동안 보온하였다. 효소활성에 해당하는 흰 밴드가 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R-250을 사용한 염색에서 확인되었다(도 2).

추가적으로 PMA로 유발한 MMP-9 발현에 미치는 CA와 CAPE의 억제효과를 결정하기 위하여 HepG2 세포에 200nM PMA 존재하에서 CA나 CAPE를 처리하고 MMP-9 발현정도는 위의 자이모그래피 방법으로 평가하였다. HepG2 세포를 10% FBS/DMEM 배지에서 배양하고 PBS 생리식염수로 세척후 PMA 존재하에서 24시간동안 CA 또는 CAPE와 함께 무혈청 DMEM 배지에서 배양하였다. 그 후 이러한 조건배지를 모으고 0.1% 젤라틴이 함유된 10% 아크릴아미드 젤에 혼합시켜 전기영동을 실시하였다. 전기영동후, 젤을 2.5%(v/v) Triton X-100으로 1시간동안 세척하여 SDS를 제거하고, 반응완충액에서 24시간동안 보온하여 젤라틴기질을 분해하도록 하였다. 활성부분에 해당하는 흰색의 밴드가 쿠마시브릴리언트블루 R-250(Bio-Rad, USA)염색으로 발색되었으며 분자량은 예비염색한 SDS-PAGE 마커와 비교하여 추정하였다.

CA와 CAPE의 MMP-9 활성에 미치는 효과를 검정하기 위하여 젤라틴 자이모그래피방법을 CA와 CAPE의 농도를 증가시켜가면서 PMA로 유발시킨 간암세포 HepG2를 조건배지에 키워 실시하였다. 도 2에서 알 수 있듯이 덴시토메트리(densitometry)를 사용하여 젤라틴 자이모그라피(gelatin zymography)에서 얻은 밴드의 강도가 CA와 CAPE의 첨가에 따라 감소하는 것을 확인하였다.

특히, CA의 IC₅₀(효소활성을 50% 줄이는데 필요한 CA 농도)은 8.2㎍/㎖이었으며, CAPE의 IC₅₀은 2.1㎍/㎖로서 CAPE가 약 4배정도 강한 활성을 보였다. 상기 결과는 각각 3번의 독립실험을 실시하여 평균치±SD로 나타내었다.

<실시예 3: CA와 CAPE의 간암세포에서 MMP-9 유전자 발현에 미치는 효과>

CA와 CAPE의 MMP-9 발현에 미치는 효과를 검정하기 위하여 간암세포 HepG2를 200nM PMA 존재하에 여러 농도의 CA와 CAPE로 처리하였다. 조건배지를 처리후 24시간 뒤에 모아 젤라틴 자이모그라피를 실시하였다. 200nM PMA 존재하에서 여러 농도의 CA와 CAPE를 처리한 HepG2 세포추출액을 조제하고 MMP-9 발현양을 단백질로서 웨스턴블랏(western blot)법으로 검정하였다. 이때 내부 대조군으로는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다.

세포를 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.02% NaN₃, 100㎍/㎖ PMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin) 및 1% Triton X-100이 함유된 동일한 완충액으로 파쇄하였다. 세포추출액내 단백질 정량은 Bio-Rad 단백질 정량킷트(Bio-Rad, USA)를 사용하였다. NF-κB 활성화 정도를 측정하기 위하여 세포핵 추출물을 EMSA 방법대로 분리하였다. 총 세포추출물과 세포핵추출물 20㎍ 시료를 SDS-PAGE 전기영동하여 Hoefer electrotransfer(Amersharm Biosciences, UK)를 사용하여 전기적 방법으로 니트로셀룰로스 막에 이동시켰다. MMP-9, p65 및 GAPDH 단백질 검출은 MMP-9(Serotec, UK), p65(SantaCruz Biotechnology, USA) 및 GAPDH 항체(Chemicon, USA)들을 각각 구입하여 실시하였다. 호스레디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)-결합(binding) 항마우스 항체를 사용하여 항원-항체반응을 하고 ECL 화학발광 킷트(chemiluminescence kit, Amersham, USA)로 검출하였다.

상기 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 도 3의 웨스턴블랏 결과에서 알 수 있듯이 단백질 양의 강도가 CA와 CAPE 첨가에 따라 감소하는 것을 알 수 있었다. 특히, CA는 100㎍/㎖ 농도에서 대부분의 MMP-9 효소생성을 억제하였으며 CAPE의 경우는 5.0㎍/㎖ 농도에서 대부분의 효소생성이 소멸되었다. 이러한 결과는 효소자이모그라피와 면역학적 웨스턴블랏 분석에서 동일하였다. 이들 데이터는 3번의 독립적인 실험을 실시하여 평균치±SD로 나타내었다.

<실시예 4: CA와 CAPE에 의한 PMA로 유발시킨 MMP-9 발현을 위한 전사억제와 프로모터(promoter) 활성의 억제>

프로모터 활성 검정은 MMP-9 유전자의 5'-프로모터영역의 710bp 크기의 사람 MMP-9 유전자(Accession No. D10051)를 프라이머 5'-ACATTTGCCCGAGCTCCTGAAG -3'(forward/SacI)와 5'-AGGGGCTGCCAGAAGCTTATGGT-3'(reverse/Hind III)를 사용하여 클론하였다. 벡터는 pGL2-Basic vector를 사용하며 이 벡터는 루시페라제 (luciferase) 유전자의 폴리아데닐레이션 시그널 업스트림(polyadenylation signal upstream) 영역을 가지고 있으며 여기에 MMP-9 프로모터를 삽입하여 SacI/HindIII 사이트의 pGL2-Basic vector(WT-MMP9pro)에 함께 클론하였다. PCR산물(MMP-9 promoter부분)은 전기영동으로 크기를 확인한 후 염기배열을 확인하였다. 또한, WT-MMP-9 프로모터에서 AP-1-1, AP-1-2 및 NF-κB 돌연변이체(Mut-AP-1-1, Mut-AP-1-2 와 Mut-NF-κB)를 quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, USA)를 사용하여 구축하였다. 세포들을 10⁵ 세포/웰 밀도로 6-웰 플레이트에 도말 후 LipofecAMINE method(Invitrogen, USA)을 사용하여 1㎍ MMP-9 프로모터-루시페라제 리포터(promoter-luciferase reporter) 구축물과 1㎍ 베타갈락토시다제 리포터 플라즈미드(β-galactosidase reporter plasmid)를 공동 형질도입하였다. 세포는 10% FBS 배지에 키우고 24시간동안 약제선별하였다. 루시페라제 활성과 베타갈락토시다제 활성은 루시페라제와 베타갈락토시다제 측정킷트(Promega, USA)를 사용하였으며 세포추출물에서 루시페라제 활성은 베타갈락토시다제 활성으로 보정하고 3번 실시후 각각의 독립된 실험의 평균치를 사용하였다.

HepG2 세포를 MMP-9 유전자의 5'-프로모터 영역 중 710bp 단편을 구축한 WT-MMP-9 프로모터(도 4A)로 일시적으로 형질도입을 실시하고, 200nM PMA를 첨가한 것과 첨가하지 않은 군으로 나누고, 24시간동안 CA(100㎍/㎖) 또는 CAPE(5㎍/㎖)를 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 측정하였다. 루시페라제 활성은 각 세포 추출물에 대해 독립적으로 실시하였다. 데이터는 3번의 독립적인 실험을 각각 실시하여 평균치±SD로 나타내었다(도 4B).

CA와 CAPE가 PMA로 유발시킨 MMP-9 발현에 미치는 효과를 검정하기 위해 각각의 세포로부터 분리한 총 RNA에서 MMP-9 mRNA 양을 RT-PCR로 측정하였다. 이때, 베타액틴(Beta-actin)을 내부 대조군으로 사용하였다. 역전사효소유전자증폭(RT-PCR) MMP-9 유전자발현의 검출은 RT-PCR과 노던블랏(Northern blot) 분석법으로 실시하였다. RT-PCR에서는 RNAzol B시약(Tel-test, USA)을 킷트 방법대로 사용하여 HepG2로부터 총 RNA를 분리하였다. RT-PCR에는 먼저 1㎍의 총 RNA를 기질로 하여 AMV RNA PCR 키트(Takara, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하고 cDNA는 다음 각 2개의 프라이머 즉, MMP-9(537 bp): 5'-CGGAGCACGGAGACGGGTAT-3'(sense)와 5'-TGAAGGGGAAGACGCACAGC-3'(antisense); 베타액틴(247bp): 5'-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT -3'(sense)과 5'-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3'(antisense)를 사용하여 증폭하였다. PCR 생성물은 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동으로 분석하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다.

상기와 같이 루시퍼라제를 지시활성으로 측정한 결과에서 전사활성을 50% 감소시키는데 CA의 농도는 약 100㎍/㎖이었으며, CAPE의 경우는 4.0㎍/㎖로서 CAPE가 약 25배 정도 강한활성을 보였다. 또한, 이들 결과는 RT-PCR 결과와도 일치하였다(도 4C).

<실시예 5: CA와 CAPE의 NF-κB 결합부위가 MMP-9 유전자의 프로모터 활성에 미치는 억제효과>

루시페라제 활성을 검정하기 위해 구축한 MMP-9 프로모터의 구조는 710bp MMP-9 프로모터영역에 한 개의 NF-κB 결합부위와 2개의 AP-1 결합부위를 가지고 있다. 따라서 이들에 대한 2bp 돌연변이를 유도하여 WT-MMP-9의 NF-κB나 AP-1 결합부위에 도입하였다. HepG2 세포를 WT나 Mut-MMP-9 프로모터들로 일시적 형질도입하여 200nM PMA 첨가와 무첨가 조건에서 24시간동안 처리하여 루시페라제 활성을 측정하였다(도 5A).

HepG2 세포를 Mut-NF-κB, Mut-AP-1-1, Mut-AP-1-2 플라즈미드(plasmid)로 일시적으로 형질도입하여 200nM PMA 첨가군과 무첨가군으로 나누어 24시간동안 처리하여 루시페라제(luciferase) 활성을 측정하여, 도 5B에 나타내었다. 각 데이터는 3번의 독립적인 실험을 각각 실시하여 평균치±SD로 나타내었다.

그 결과, CA와 CAPE는 NF-κB 결합부위를 통하여 MMP-9 유전자발현을 유도하는 프로모터 활성을 강력하게 억제하여 PMA 첨가군의 프로모터 활성을 완전히 억제시켜 그 활성이 검출되지 않았다.

<실시예 6: CA와 CAPE의 PMA로 유발한 NF-κB 활성화에 미치는 억제효과>

전기영동상에서 이동도 변화검정(Electrophoretic mobility shift assay; EMSA)을 위하여 세포핵추출물을 다음과 같이 조제하여 세포를 냉각하고, 생리식염수-인산완충액으로 세척 후 0.4㎖의 10mM HEPES, pH 7.9, 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 0.1mM EGTA, 1mM DTT, 0.5mM PMSF, 2.0㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 2.0㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin) 함유 용해완충액으로 부유시킨다. 얼음 위에 15분간 방치 후, 25㎕의 10% Nonidet P-40를 첨가하여 10초동안 강하게 흔든 후 내용물을 4℃에서 2분간 13,000rpm으로 원심분리하였다. 세포핵추출물을 50㎕의 20mM HEPES, pH 7.9, 0.4M NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 2.0㎍/㎖ 류펩틴 및 2.0㎍/㎖ 아프로티닌이 함유된 핵추출완충액에 희석시킨다. 15분간 방치후 부드럽게 섞고, 핵추출물을 4℃에서 5분간 13,000rpm으로 원심분리 후 상등액을 즉시 사용하고 나머지는 -70℃에 보존하였고, 단백질 정량은 Bio-Rad 단백질정량킷트(Bio-Rad, USA)로 실시하고, EMSA는 젤이동측정 킷트(Promega, USA)로 실시하였다. 2중사슬 올리고뉴클레오타이드는 보존영역으로서 AP-1-1(5'-TGACCCCTGAGTCAGCACTT-3'), AP-1-2(5'-AGGAAGCTGAGTCAAAGAAG-3')와 NF-κB(5'-CCAGTGGAATTCCCCAG-3')를 [γ-³²P] 아데노신 트리포스페이트(adenosine triphosphate, 3000Ci/mmol; Amersham Pharmacia Biotech, UK)를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(polynucleotide kinase)로 표식하여 EMSA에 사용하였다. 경쟁적 결합반응은 방사성동위원소로 표식하지 않은 야생형(wild-type)의 AP-1-1, AP-1-2, NF-κB 또는 변이형 올리고머(AP-1-1; 5'-TGACCCCTGAGTTGGCACTT-3', AP-1-2; 5'-AGGAAGCTGAGTTGAAGAAG-3', NF-κB; 5'-CCAGTGGAATTGGCCAGCCT-3') 등을 사용하여 측정하였다. 핵추출물(2㎍)을 젤이동 결합완충액(4% glycerol, 1mM MgCl₂, 0.5mM EDTA, 0.5mM dithiothreitol, 50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5))과 0.05㎍/㎖ 폴리데옥시이노신-데옥시사이토신(poly (deoxyinosine-deoxycytosine)과 10분간 보온반응시킨 후 방사성동위원소로 표식한 프로브(probe)와 20분간 실온에서 보온시켰으며 그후 시료는 변성 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 젤에서 0.5×TBE완충액으로 250V, 20분간 전기영동 후 현상하였다.

CA와 CAPE의 PMA로 유발한 NF-κB 활성화에 미치는 억제효과를 측정하기 위하여, HepG2 세포에 200nM PMA 존재하에서 CA(100㎍/㎖)이나 CAPE(5㎍/㎖l)를 처리하였다. 그후 세포핵추출물을 조제하여 EMSA법으로 NF-κB의 활성화도를 측정하였다. [γ-³²p] ATP-표식된 NF-κB, AP-1-1 그리고 AP-1-2 이중사슬 올리고뉴클레오타이드와 보온반응시킨 각각의 세포들로부터 분리한 세포핵추출물을 사용하였다. 경쟁반응은 표식하지 않은 야생형 또는 변형형의 올리고뉴클레오타이드(mutant type oligonucleotide)를 사용하여 실시하였으며, 각각의 시료는 4% 비변성 폴리아크릴아미드 젤(nondenaturing polyacrylamide gel, 0.5X TBE buffer)을 사용하여 250V에서 20분간 전기영동하였다. 젤은 오토라디오그래피(autoradiography)로 현상하였다(도 6A).

핵추출물을 각 세포로부터 분리하여 p65에 대한 항체를 사용하여 웨스턴블랏법으로 측정하였다. 내부 대조군으로는 GAPDH를 사용하였다. 그 결과, CA와 CAPE는 특이적으로 MMP-9유전자의 전사조절영역 프로모터상에 존재하는 NF-κB와 AP-1 결합부위에 결합하는 이들 2가지 전사인자의 결합을 강력하게 억제함으로서 결과적으로 MMP-9 유전자발현을 억제하는 것이 확인되었다(도 6B).

<실시예 7: CA와 CAPE의 간암세포 HepG2의 마트리젤(Matrigel)에서의 암전이 및 침윤억제효과>

CA와 CAPE가 간암세포 HepG2의 전이 및 침윤억제에 대한 효과검정은 다음과 같이 실시하였다. 즉, 24웰 침윤챔버에 맞게 마트리젤을 코팅한 필터(8㎛, Becton Dickinson, USA)로 실시하였다. 침윤활성에는 간세포를 사용하여 배양후 플레이트에서 세포를 탈부착시킨 후 세포들을 조건배지(5X10⁴ cells/200㎕)에 다시 재희석시켜 약물(PMA, CA, CAPE) 첨가군과 무첨가군별로 침윤챔버의 윗부분에 부었다. 조건배지(500㎕)는 침윤챔버의 아랫부분에 부었다. 마트리젤 침윤챔버(Matrigel invasion chambers)를 37℃, 24시간동안 5% CO₂에서 배양후 필터를 삽입하고 웰에서 제거한 후 필터의 윗부분에 있는 세포를 면봉으로 제거했다. 필터를 고정하고, 세우고, 염색을 실시했다(Becton Dickinson). 마트리젤 안으로 침윤한 세포들은 필터의 아래부분에 위치하게 된다. 보통 3-5개 챔버들을 각 조건에 맞는 실험에 사용하였으며 결과 수치들은 3개 필터로부터 총 세포수를 평균하여 계산하였다.

약물처리는 간암세포 HepG2를 조건배지에서 재희석하여(5X10⁴ cells/200㎕ 농도), PMA존재하에서 CA 또는 CAPE로 보충한 마트리젤 침윤챔버 윗분분에 첨가하였다. 보온반응 24시간 후에 필터의 아래부분으로 침윤해들어간 세포의 총수를 계산하였다. 계산에서 얻은 수치는 3개 필터의 총세포수를 평균하여 계산하였다. 데이터는 3번의 독립적인 실험을 각각 실시하여 평균치±SD로 나타내었다. 그 결과, CA와 CAPE는 간암세포 HepG2의 마트리젤에서의 암전이 및 침윤활성을 억제함으로서 암침윤과 전이억제활성이 있음을 확인하였다(도 7).

<실시예 8: CA와 CAPE의 암세포이식생쥐 모델 누드마우스에서 HepG2 암세포이식주의 증식억제효과>

암세포이식생쥐 모델에서 CA와 CAPE의 항종양활성측정을 위하여 HepG2 간암세포를 트립신 처리한 조직배양액으로부터 수확한 뒤, 세포를 무혈청 배지로 세척하고 1X10⁷cells/㎖ 농도로 희석하였다. 위의 세포희석액 10⁶개 세포수를 함유한 0.1㎖를 8주령의 누드마우스(nude mice)의 오른쪽 가슴에 피하주사하였다. 실험동물을(각 실험군당 n = 5) 종양세포이식과 동시에 매주 3회씩 100mg/kg CA와 100mg/kg CAPE를 구강식이하였고, 피하주사로 50㎍/kg CA 또는 50㎍/kg CAPE를 처리하였다. 대조군 마우스에게는 정상 생리식염수만을 제공하였다 (0.9%). CA와 CAPE를 피하주사 또는 구강식이후 10일째에, 종양의 크기를 칼리퍼(caliper)로 측정하였다. 대조군과 실험군에서 종양크기의 차이는 Students t-test방법으로 분석하였다. 아래 표 1은 피하주사처리 결과이고, 표 2는 구강식이처리 결과이다.

CA와 CAPE는 암세포이식생쥐 누드마우스에서 HepG2 암세포를 크게 억제하여, 피하주사 처리한 CA의 암세포증식억제율은 61.0%이며, CAPE는 56.7%로 반이상을 억제하였다. CA에서 53.6%, CAPE는 47.1% 억제하였다.

피하주사	종양 성장 억제
피하주사	종양의 부피(㎣)(%)	몸무게
식염수(0.9%)	3300±11.2(100)	27.5±2.6
CA	1287±16.4*(61.0)	25.6±4.2
CAPE	1430±7.8*(56.7)	27.2±3.5

구강식이	종양 성장 억제(%)
구강식이	종양의 부피(㎣)	몸무게
식염수(0.9%, NaCl)	3306±15.6	27.7±3.5
CA	1533±24.6*(53.6)	26.7±3.3
CAPE	1750±44.3*(47.1)	27.3±2.1

따라서, 본 발명은 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하여 MMP-9을 직접 억제할 수 있는 억제제를 제공할 수 있다. 이것은 MMP-9의 활성에 따른 각종 종양이나 류마티스 관절염 등의 질병의 치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 CA와 CAPE의 간암세포 HepG2의 세포증식 억제효과를 XTT 어세이로 측정한 그래프이다. (A)는 CA(caffeic acid), (B)는 CAPE(caffeic acid phenethyl ester)

도 2는 자이모그라피를 이용하여 CA와 CAPE의 MMP-9 효소저해 활성을 측정한 그래프이다. (A)는 CA(caffeic acid), (B)는 CAPE(caffeic acid phenethyl ester)

도 3은 CA와 CAPE의 간암세포에서 MMP-2 생성억제 효과를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏한 결과이다.

도 4는 PMA로 유발된 MMP-9 유전자 발현에 대하여 CA와 CAPE에 의한 전사억제와 프로모터활성의 억제 활성을 나타낸 것이다. (A)는 MMP-9 프로모터 영역의 시스-조절인자에 대한 입체지도, (B)는 MMP-9 유전자의 전사억제 활성을 자이모그라피로 측정한 결과, (C) 역전사효소유전자증폭(RT-PCR)과 노던블랏으로 측정한 결과이다.

도 5는 CA와 CAPE의 NF-κB 결합부위가 MMP-9 유전자의 프로모터 활성에 미치는 억제효과를 나타낸 그래프이다. (A) 루시페라즈 활성을 검정하기 위한 MMP-9 프로모터 구조와 루시페라제 활성, (B) 각종 돌연변이 프로모터영역들, Mut-NF-κB, Mut-AP-1-1, Mut-AP-1-2의 루시페라제 활성.

도 6은 CA와 CAPE의 PMA로 유발한 NF-κB 활성화에 미치는 억제효과검정을 위한 전기영동상에서 이동도 변화를 나타낸 사진이다. (A) NF-κB, AP-1-1, AP-1-2 특이적 엠사반응, (B) p65 항체의 웨스턴 블랏 측정, 대조군으로 GAPDH를 사용

도 7은 CA와 CAPE의 간암세포 HepG2의 암전이 및 침윤억제를 측정한 그래프이다.

<110> KIM, Cheorl Ho <120> MMP-9 inhibitor containing caffeic acid or caffeic acid phenethyl ester <130> wjtj-shk-MMP-9 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acatttgccc gagctcctga ag 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aggggctgcc agaagcttat ggt 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cggagcacgg agacgggtat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tgaaggggaa gacgcacagc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 caagagatgg ccacggctgc t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tccttctgca tcctgtcggc a 21

Claims

카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 MMP-9 억제제.
제1항에 있어서, 상기 억제제는 MMP-9 효소생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 MMP-9 억제제.
제1항에 있어서, 상기 억제제는 MMP-9 발현을 위한 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 MMP-9 억제제.
제1항에 있어서, 상기 억제제는 MMP-9 프로모터 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 MMP-9 억제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 치주염, 치은염 또는 종양의 전이, 침윤, 성장에 관한 질환에 사용되는 것을 특징으로 하는 카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르를 유효성분으로 하는 MMP-9 억제제.
카페인산 또는 카페인산 페네틸에스테르의 MMP-9 억제제로써의 용도.