CN102935079A - 咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物应用技术领域，公开了一种咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯CADPE的制药用途，应用所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯（CADPE）制备的预防和/或治疗药物用于抑制破骨细胞分化、抑制破骨细胞蚀骨功能、促进成骨细胞分化、促进成骨细胞成骨功能。所述药物用于预防和/或治疗破骨细胞活性异常导致的疾病，包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s病、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏等。

Description

咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的制药用途

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，涉及一种咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的制药用途，将咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯应用于制备含有破骨细胞分化及功能抑制剂及成骨细胞分化及功能促进剂的药物中。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是由多因素引起的一种慢性系统性骨质病，其特点为单位体积内骨基质与骨量呈等比例下降，骨皮质变薄，骨小粱体积大小及数目均减少，骨髓腔增宽，骨内矿物成分失衡，从而导致骨的脆性增高，易产生腰酸背痛、骨骼疼痛、脊柱畸形，最终导致骨折的发生。骨质疏松是一种常见的女性易患疾病，该病女性人群数量多于男性，常见于绝经后妇女。伴随我国人口老龄化进程，骨质疏松症已成为危害我国人口公共健康最严重的问题之一。我国目前老龄人口约1.3亿，其中骨质疏松症患者达8400万人，占全国人口数量的6.6% ；预计到2050年，我国老龄人口数量将达到2.5亿，增加一倍，其中25%-70% 都可能患骨质疏松症。因此，开发安全有效的治疗骨质疏松疾病的药物具有重大的社会价值和市场价值。

骨的新陈代谢由破骨细胞（Osteoclast）介导的骨吸收与成骨细胞（Osteoblast）介导的骨形成之间巧妙平衡来维持，这种平衡一旦破坏，就会发生骨代谢异常。当破骨细胞的活性远超过成骨细胞的活性时，骨量减少，从而导致骨质疏松症的发生；反之，如果成骨细胞活性过高则会导致骨骼石化症（Boyle W .J. et al. Nature, 2003, 423, 337; Teitebaum S. L. et al. Science, 2000, 289, 1504）。骨的新陈代谢分为三个步骤：即骨的吸收，骨的形成和骨基质的矿化。骨质疏松症实际上就是骨的新陈代谢失衡的结果，因此，治疗骨质疏松症的药物按照其作用也可分为三类：即抑制骨吸收，促进骨形成和促骨矿化。之前的研究表明，破骨细胞在骨质疏松发生发展中具有重要作用，破骨细胞活性异常是骨质疏松发病的重要原因。而针对抑制破骨细胞吸收骨质的药物又有如下几类：第一种为雌激素及其类似物，能直接与其受体结合，刺激成骨细胞增殖和胶原合成，抑制破骨细胞诱导因子的产生；可降低破骨细胞对甲状旁腺激素的敏感性，减少骨吸收，促进降钙素合成。但是长期使用会导致乳腺癌发生几率增加，或使心脑血管疾病发生机率大大增加。第二种为选择性雌激素受体调节剂，如他莫昔芬能够选择性与骨细胞上雌激素受体结合，但是长期使用可导致子宫内膜增生和子宫内膜癌。第三种为降钙素，能够抑制破骨细胞活性，降低血液中钙离子浓度，还能促进成骨细胞形成和活性，加快钙沉积，对骨质疏松性骨痛有很好的效果，但是这类药物抑制骨吸收的作用不能长久发挥，并且单独使用会引发低血钙和继发性甲状旁腺机能亢进，因此需要将其与钙剂合用。第四种为二膦酸盐类药物，抑制破骨细胞介导的骨吸收，增加骨密度，由于其强力抑制骨吸收且半衰期很长，长期使用会影响骨强度。同时，二膦酸盐类药物被认为有潜在的肾毒性，对消化系统副作用较明显。第五种为植物雌激素，如异黄酮，香豆素和木脂素，异黄酮类化合物及其衍生物具有抑制骨吸收和促进骨形成的双重作用。但是提取物对骨骼有益的成分和最佳剂量不清楚，其作用机制也未见公开。

骨质疏松主要表现为骨质被破骨细胞异常过度吸收外，还有其他疾病与破骨细胞的过度活化紧密相关。如牙周炎，其主要病理变化之一是牙槽骨的吸收过度，牙槽骨吸收过度就是破骨细胞大量活化导致，因此，抑制破骨细胞活性同样能抑制牙周炎（Xu J et al. Cytokine Growth Factor Rev. 2009 20,7）。同理，类风湿性关节炎，Paget’s 病，牙齿脱落、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移都是由于免疫系统或肿瘤细胞大量活化破骨细胞，从而导致骨质被破骨细胞大量异常吸收，最终发生疾病（Gruber R. Wien Med Wochenschr. 2010 160, 438）。

临床上虽然有部分针对破骨细胞的药物，但是其使用起来均有副作用较大等问题，而同时针对破骨细胞和成骨细胞的药物就更少。因此，开发出安全有效的同时针对破骨细胞和成骨细胞的药物在临床上十分必要。我国具有优质的中草药资源，从中分离出有效抑制骨质疏松的化合物具有重要的经济和社会价值。本发明的化合物咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯（CADPE）提取自长毛香科植物和药用植物肿节风，中药肿节风具有抗菌消炎，祛风通络，活血散结的功效，常用于肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎、风湿痹痛、跌扑损伤、肿瘤。目前尚未见有肿节风在治疗骨质疏松相关疾病中的报道。

本发明创新地提出了一种咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯CADPE的制药用途，将CADPE应用于对破骨细胞分化及功能具有抑制作用、对成骨细胞分化及功能具有促进作用的药物的制备中。本发明中CADPE能够抑制破骨细胞分化、抑制破骨细胞蚀骨功能、促进成骨细胞分化、促进成骨细胞成骨功能，将CADPE及其药物组合物应用于抗骨质疏松、关节炎及肿瘤骨转移中具有良好的效果。

发明内容

本发明提出了一种式(1)所示咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯（CADPE）的制药用途，应用所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯CADPE制备的预防和/或治疗药物用于抑制破骨细胞分及蚀骨功能、促进成骨细胞分化及成骨功能。

其中，所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯CADPE在抑制破骨细胞分化及蚀骨功能之同时，促进成骨细胞分化及成骨功能。

其中，所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯抑制生理病变组织中破骨细胞分化及蚀骨功能，促进生理病变组织中成骨细胞分化及成骨功能。

其中，所述药物用于预防和/或治疗破骨细胞活性异常导致的疾病；所述疾病包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s 病、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏。

其中，所述药物用于预防和/或治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎以及癌症骨转移造成的骨破坏；其中，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。

其中，所述药物用于预防和/或治疗溶骨性骨损伤；其中，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。

其中，所述药物含有有效量的咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯CADPE以及药学可接受成分。

其中，所述药物配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

本发明中，化合物咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯CADPE可以是水合物或药学上可接受的盐，其中所述的化合物是包括但不限于用放射性、荧光基团或者生物素（Biotin）标记的。

本发明利用多种细胞模型验证，通过多种实验生物学手段，获得包括体内和体外CADPE对于破骨细胞分化抑制效果的实验证据。在针对成骨细胞的分化活性和功能进行实验中，发现CADPE还具有促进成骨细胞活性的功能。本发明首次提出CADPE在制备抑制破骨细胞分化和活性增加导致的相关疾病，以及促进成骨细胞分化和活性降低导致的相关疾病的药物中的用途。

本发明提出了CADPE在制备抑制破骨细胞分化和功能以及促进成骨细胞分化和功能的治疗和/或预防药物中的用途，提出了CADPE在抑制破骨细胞分化以及破骨细胞活性异常，促进成骨细胞分化及成骨细胞活性弱化等相关疾病的治疗和/或预防药物中的应用。本发明提出了CADPE尤其是在制备治疗和/或预防骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s 病、佝偻病、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏等破骨细胞活性异常的药物的用途。本发明中所述的疾病，包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s 病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏等都已经有明确报道为破骨细胞活性异常的相关疾病。本发明中涉及的药物，可以抑制破骨细胞分化和功能，并可以抑制病变组织破骨细胞分化，本发明中的药物可以促进成骨细胞分化和功能，并可以促进病变组织成骨细胞分化和功能。

本发明提供的CADPE既可以显著抑制原代培养的破骨前体细胞向成熟破骨细胞分化也能够显著地抑制小鼠细胞系RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。本发明通过实验研究发现，CADPE能够抑制成熟破骨细胞肌动蛋白环（actin-ring）的形成，也能够抑制破骨细胞对骨片的吸收功能。本发明发现CADPE对于成骨细胞的分化有促进作用。本发明通过动物实验本发明发现CADPE治疗抑制体内破骨细胞分化及其功能，并且促进成骨细胞分化及其功能，CADPE能够用于减轻由于卵巢切除导致的骨质疏松。

附图说明

图1A表示CADPE浓度梯度依赖性抑制破骨细胞前体细胞系RAW264.7细胞系向破骨细胞分化的TRAP染色效果图及破骨细胞数目统计图，图1B表示CADPE浓度梯度依赖性抑制原代破骨细胞分化的TRAP染色效果图和破骨细胞数目统计图。

图2表示不同浓度CADPE对破骨细胞前体细胞系RAW264.7、原代培养的破骨细胞的毒性分析试验结果示意图。

图3表示CADPE抑制破骨细胞中肌动蛋白丝环形成实验结果示意图。

图4表示CADPE抑制破骨细胞骨吸收功能实验结果示意图。

图5表示CADPE促进成骨细胞分化实验结果示意图。

图6表示CADPE治疗小鼠卵巢切除导致的骨质疏松实验结果示意图。图6A表示CADPE减缓卵巢切除导致的骨质丢失及骨质分析示意图；图6B表示CADPE抑制卵巢切除导致的破骨细胞过度活化及其分析示意图；图6C 表示CADPE促进成骨细胞活化分析示意图。

图7表示CADPE对卵巢切除小鼠血清中破骨细胞标志分子影响的示意图。

以上附图均以p<0.05显示有显著性差异。图中a表示p<0.05，b表示0.001<p<0.01，c表示p<0.001。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

实施例1：CADPE抑制破骨前体细胞分化

原理:骨髓干细胞在细胞因子M-CSF的刺激下，会向破骨前体细胞分化，同时，单核的破骨前体细胞在细胞因子（如RANKL,M-CSF）的继续刺激下，细胞间相互接触融合形成多核细胞，紧接着会继续分化、形成具有密封圈结构的成熟破骨细胞。小鼠破骨细胞前体细胞系RAW264.7也可以在RANKL细胞因子的作用下分化为多核的破骨细胞。成熟破骨细胞能够吸附在骨基质上，通过分析蛋白酶降解骨质，从而达到代谢骨质的目的。通过检测破骨细胞的形成能力能够检测药物对于破骨细胞分化和形成的抑制作用，从而可以分析药物对骨质疏松的潜在治疗效果。

本实施例CADPE抑制破骨前体细胞分化实验方法如下：

1. 从四周龄C57/BL6小鼠胫骨和股骨中分离原代BMMs细胞，并分化成成熟破骨细胞：

将骨上皮肤和肌肉去除后，将骨存于PBS中；用剪刀去除骨两端，并用装有培养基的10mL针头将骨髓中细胞冲出；将骨髓细胞收集于50mL离心管中，5min 1000rpm离心后将收集的细胞用5mL 培养基重悬；加入20mL 红细胞裂解液上下振荡几次后加入25mL培养基，5min 1200rpm离心收集细胞；重悬细胞并加入M-CSF（5ng/mL）过夜后收集悬浮细胞加入M-CSF（20ng/mL）培养至细胞贴壁长满。为形成成熟的破骨细胞，原代破骨细胞前体细胞在含有M-CSF（20ng/ml）和RANKL（30ng/ml）的

-MEM培养基中培养7天，并同时在培养基中加入终浓度为0，0.1μM，0.5μM ，1μM ，2.5μM，5 μM 的CADPE。其间培养基隔天换培养基和CADPE。7天后，行TRAP染色。代细胞固定后，根据试剂盒说明进行TRAP活性分析。TRAP阳性的多核细胞被统计为破骨细胞。

2. 将小鼠破骨细胞前体细胞系RAW264.7细胞系分化成成熟破骨细胞：

将小鼠破骨细胞前体细胞系RAW264.7细胞在含有RANKL（30ng/ml）的

-MEM培养基中培养3天，并同时在培养基中加入终浓度为0，0.1μM，0.5μM ，1μM ，2.5μM，5 μM 的CADPE。其间培养基隔天换培养基和CADPE。3天后行TRAP染色。代细胞固定后，根据试剂盒说明进行TRAP活性分析。TRAP阳性的多核细胞被统计为破骨细胞。

结果与评价：实施例本实施例结果如图1所示，图1A表示CADPE浓度梯度依赖性抑制破骨细胞前体细胞系RAW264.7细胞系向破骨细胞分化的TRAP染色效果图及破骨细胞数目统计图；图1B表示CADPE浓度梯度依赖性抑制原代破骨细胞分化的TRAP染色效果图和破骨细胞数目统计图。从图1可见，CADPE对RAW264.7细胞及原代破骨细胞的分化存在抑制作用，且这种抑制作用在0.1-5μM浓度CADPE作用下呈浓度依赖性。本实施例说明CADPE在体外实验中能够有效抑制破骨细胞分化。

本实施例中，将有效量的CADPE与药学可接受成分（例如：淀粉、糊精、糖粉、甘露醇、硫酸钙、纤维素等药学可接受辅料）配伍制备的药物用于上述实验中，获得类似的有效实验结果，表明该药物能有效抑制破骨细胞分化。

实施例2：CADPE对破骨细胞的细胞毒性试验

原理：磺酰罗丹明B染色是一种旨在通过使用蛋白结合性红色染料，即比色法定量测定细胞内总蛋白质合成率，以评价活体细胞毒性的经典的技术方法。作为蛋白质染色剂之一的磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B，SRB），又称酸性红52（Acid Red 52），是一种阴离子染料，与蛋白质静电（electrostate）结合，在540nm波长下产生吸收峰：吸光值与细胞量成线性正相关。

本实施例CADPE对破骨细胞的细胞毒性试验方法如下：

96孔板中接BMMs

，细胞贴壁过夜后，含有M-CSF（20ng/ml）的

-MEM培养配成浓度为0，0.5μM，1μM ，5μM ，10μM ，25μM 的CADPE 处理细胞3天，隔天换液，实验结束后CADPE对细胞毒性通过SRB方法分析，具体操作如下: 96孔板中细胞100uL培养基中加入冷的TCA(50%,W/V)25uL后混匀；4℃孵育60min后去除孔内溶液；流水冲洗5遍后风干；每孔加入50uL SRB，室温孵育10min；用1%醋酸洗5遍以除去未结合的染料，将培养板风干；加入100uL Tris（10mM）溶解板中染料，酶标仪515nm测定OD值。

结果与评价：本实施例试验结果见图2示。加入不同剂量的CADPE后对前体破骨细胞增殖有一定影响，半抑制浓度在25

M以上。但是在低浓度0.5-5

M没有太大影响。本发明在抑制破骨细胞分化所使用的浓度在5

M以内，因此可以排除由于细胞毒性或者影响细胞增殖导致抑制破骨细胞分化的影响。

实施例3：CADPE抑制肌动蛋白丝环形成

原理：破骨细胞在行使吸收骨质功能之时，会在其与骨质接触的表面局部区域形成密闭的酸性环境，而此环境的形成是依赖于特殊的环形结构，此结构的主要成分是肌动蛋白，因此这种结构被称为肌动蛋白环（actin-ring）。肌动蛋白环的形成是破骨细胞吸收骨质的先决条件。因此通过检测肌动蛋白环结构的形成可以评估药物对破骨细胞进行骨吸收的影响。

本实施例CADPE抑制肌动蛋白丝环形成实验方法如下：

在M-CSF（20ng/ml）和RANKL(30ng/ml)刺激下使前体细胞分化为成熟的破骨细胞。此后用4%多聚甲醛固定10min后用PBS洗三遍。固定后细胞用FITC-鬼笔环肽孵育1小时后用DAPI染核10min。在荧光显微镜下拍照观察肌动蛋白环的形成。

结果与评价：本实施例结果见图3示。RANKL可以诱导破骨前体细胞分化并且形成肌动蛋白丝环。与对照组相比，实验组中加入CADPE后前体破骨细胞中肌动蛋白丝环结构的大小和数量在CADPE 5

M处理下显著减少，表明CADPE 能够抑制肌动蛋白丝环形成并显著减少了破骨细胞密封圈的形成，表明CADPE对破骨细胞的功能具有抑制作用。

实施例4：CADPE抑制破骨细胞吸收骨质

原理：破骨细胞成熟后形成密闭结构溶解吸收骨质，在骨表面留下吸收骨质后剩下的骨陷窝。骨表面的损坏程度间接反映了破骨细胞吸收骨质的能力。本实施例基于这一特征，将破骨细胞前体接种在骨片表面进行分化，在破骨细胞形成后检测分析这些分化的细胞溶解骨片的能力。

本实施例CADPE抑制破骨细胞吸收骨质实验方法如下：

将破骨前体细胞接种到置入96孔板的骨片上（3000/片/孔），加入10ng/ml M-CSF和50ng/ml的RANKL诱导细胞分化并且同时加入5

M的CADPE，设置空白对照组。待单加RANKL组细胞完全分化成熟为多核细胞，约5-7天，再过12小时，吸出骨片上的培养基且用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗培养孔两次，然后加入固定液固定。经常使用的固定液为4%的戊二醛（0.2M的甲胂酸钠溶液配成）。行甲苯胺蓝（0.5%四硼酸盐溶液配成）染色。骨质片层在甲苯胺蓝溶液中染色3-5分钟。PBS清洗去除表面多余的染料，然后用PBS再漂洗几次并风干。已染色的骨质片层可以在室温下长期保存。显微镜拍照观察结果。

结果与评价：本实施例结果见图4示。与对照组相比，单加RANKL组骨表面的破损面积显著增加，加入CADPE后能够有效抑制表面的融损程度。实验结果说明，CADPE能够抑制RANKL诱导的破骨细胞导致的骨吸收，抑制破骨细胞的蚀骨功能。

实施例5：CADPE促进成骨细胞分化

原理：小鼠间充质干细胞在50ug/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠，10-8M地塞米松诱导下能向成骨细胞分化，增加骨质。分化后新形成的破骨细胞高表达碱性磷酸酶，可以通过染色观察成骨细胞形成情况。

本实施例CADPE促进成骨细胞的分化实验方法如下：

成骨细胞分化：取4周龄C57/BL6小鼠胫骨和股骨，尽量去除附着其上的肌肉等软组织，剪去骨两端，用

-MEM培养基将骨髓冲入离心管，1000r/min离心5min后去上清。用含有10%FBS的

-MEM悬浮细胞接到培养板中培养，待细胞长满。用含有诱导剂地塞米松10-8 M，维生素C 50ug/ml，

-甘油磷酸5mM 诱导成骨细胞分化，同时用浓度为0,1μM，2.5μM，5μM的CADPE处理4天后行碱性磷酸酶（ALP）染色，拍照观察，然后加入Triton X-100 溶液 (50 mM Tris–HCl, 0.1% Triton X-100, 0.9% NaCl, pH 7.6)，反复冻融3次，然后加入200μL ALP的底物 (购自sigma N7653-100ML)37°C 0.5小时，然后加入3N NaOH 800μL，酶标仪405nm测定OD值。

结果与评价：本实施例结果如图5A显示，在50ug/ml维生素C，10mMβ-甘油磷酸钠，10-8M地塞米松诱导下骨髓间充质干细胞能够分化为成骨细胞，在能够抑制破骨细胞分化的浓度范围内，随CADPE浓度的增加，成骨细胞的分化能力增强。利用分化光度计测试ALP的活性的结果如图5B显示，随着CADPE浓度的增加，ALP的活性逐渐上升，说明CADPE对成骨细胞的分化能力具有增强作用，且这种增强作用存在浓度依赖性。

本实施例中，将有效量的CADPE与药学可接受成分（例如：淀粉、糊精、糖粉、甘露醇、硫酸钙、纤维素等药学可接受辅料）制备的药物用于上述实验中，获得类似的有效实验结果。实验结果表明药物能够有效促进成骨细胞分化。

 实施例6：CADPE治疗小鼠卵巢切除导致的骨质疏松

   原理：去卵巢骨质疏松的动物模型是为了模拟女性由于绝经导致雌激素水平下降而出现骨髓矿物质含量不断下降产生的原发性骨质疏松。该动物模型首先于1969年由Saville用大鼠建立，经过此后多次研究验证，目前该模型已成为公认的标准化绝经后骨质疏松病理模型。也是美国FDA批准的用于筛选骨质疏松药物的动物模型（Sun et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105,4289）。这是由于哺乳动物体内雌激素水平的维持能够抑制破骨细胞的分化和活性，而卵巢切除后的小鼠雌激素水平剧烈下降，模拟了绝经后妇女的卵巢功能的丧失。免疫组化实验显示其中破骨细胞的分化和活性显著增强从而诱发骨质疏松。长期骨质疏松会使骨中矿物质成分和骨基质等比例地减少，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折风险升高。

本实施例CADPE治疗小鼠卵巢切除导致的骨质疏松实验方法如下：

选C57BL/6小鼠，8周龄雌鼠共30只，切除其中20只雌鼠的卵巢，剩下10只小鼠卵巢双侧切除一小块脂肪但不伤及卵巢作为对照假手术组。手术5天后将卵巢切除的20只小鼠随机分组，10只小鼠为一组，一个月时3组小鼠各取一部分老鼠取胫骨进行切片行TRAP染色，分析破骨细胞活性。三个月时心脏取血处死老鼠，然后进行树脂包埋腰椎骨，常规切片，进行骨质染色和骨质计量学分析。6周龄C57/BL6小鼠卵巢切除7天后，小鼠被分为3组，每组6只：假手术组，卵巢切除组，和CADPE 治疗组。假手术组和卵巢切除组皮下注射同剂量DMSO，CADPE治疗组腹腔注射CADPE 10mg/kg，分别隔天皮下注射给药三个月，每周称体重一次，并按体重变化调整给药量。卵巢切除小鼠隔天用CADPE(10mg/ml)或者DMSO注射处理。3个月后，麻醉处死小鼠进行分析。其间记录小鼠体重。腰椎部分被收集用于组织形态学分析。分离颅骨并在10%甲醛中固定，并用10%EDTA 脱钙两星期后进行破骨细胞活性分析。三个月时处死老鼠，然后将腰椎骨进行树脂包埋，常规切片，进行骨质染色和骨质计量学分析。

结果与评价：本实施例实验结果见图6A，6B所示，实验结束小鼠处死后，将假手术组（sham），卵巢切除组（OVX）以及CADPE处理的加药组的小鼠（OVX+CADPE）腰椎骨固定、包埋、切片、染色，进行骨质计量学分析。从图6A可见，与假手术对照组比较，卵巢切除小鼠出现显著骨质疏松，其表现包括骨体积（BV/TV）和骨小梁数量 (Tb.N)显著下降，而骨小梁空隙(Tb.Sp)显著加大。但CADPE处理的小鼠的骨质计量学分析发现，与卵巢切除组（OVX）相比，用药组骨体积（BV/TV）和骨小梁数量 (Tb.N)明显上升，而骨小梁空隙(Tb.Sp)明显下降，说明CADPE能有效治疗骨质疏松。

为进一步确认是否CADPE治疗骨质疏松是通过抑制破骨细胞活性或是促进成骨细胞活性造成的，对该三组小鼠的骨片进行破骨细胞和成骨细胞染色。从图6B可见，卵巢切除小鼠的破骨细胞活性显著增强，通过骨质计量学分析，发现其破骨细胞面积 (OcS/BS), 破骨细胞数量 (N.Oc/BS), 和噬骨面积 (ES/BS)都显著提高，而采用CADPE进行治疗后，这些指标均表现出下降趋势。因此，本实施例实验结果表明CADPE能够治疗小鼠由卵巢切除导致的破骨细胞的异常活化引起的骨质疏松症。

本实施例还通过检测血清中破骨细胞的标志物I 型胶原C 端肽（CTX-1）和小鼠抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRAP5b）检验CADPE是否能在动物体内同时抑制破骨细胞活性。CTX-1是破骨细胞骨吸收骨质过程中生成的产物；TRAP5b为破骨细胞中特异性直接分泌的蛋白，两者都可以从血清中检测到，并从而判断出破骨细胞活性和吸收的状态（Huang S et al., Bone. 2010, 46, 1138）。如图7所示，卵巢切除后小鼠血清中的CTX-1和TRAP5b指标显著上升，说明卵巢切除后强烈活化体内破骨细胞，破骨细胞的活性趋于异常，而用CADPE处理的卵巢切除小鼠则又回到了正常小鼠破骨细胞的活性水平。与前面切片的结果一致，这一结果也反映CADPE能在体内抑制破骨细胞的活性。

本实施例中还分析了这三组小鼠体内成骨细胞的成骨活性。如图6C显示，CADPE处理组的成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶（ALP）活性明显高于不加CADPE的处理组，表明CADPE在小鼠体内同样能够促进成骨细胞的成骨活性。本实施例上述结果显示，CADPE治疗能够抑制卵巢切除导致的破骨细胞的活性增强，并且同时能有效促进成骨细胞的活性以及骨质积累，从而保护了骨质流失，因此CADPE能够通过促进成骨细胞的活性治疗卵巢切除导致的骨质疏松。

本实施例中，将有效量的CADPE与药学可接受成分（例如：淀粉、糊精、糖粉、甘露醇、硫酸钙、纤维素等药学可接受辅料）制备的药物用于上述小鼠实验中，获得类似的实验结果。实验表明药物能够在小鼠体内抑制破骨细胞的活性并且同时促进成骨细胞活性，有效抑制小鼠卵巢切除导致的骨质疏松。

本实施例中药物配制为可注射流体。药物还可配制为气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。本实施例的药物是单独使用的。也可以与其他治疗骨质疏松的药物联合使用，均能实现对骨质疏松症的治疗。

本发明中CADPE既能够作为破骨细胞分化和功能抑制剂，同时也是成骨细胞分化和功能的促进剂。CADPE能够在制备预防、延缓或治疗由破骨细胞介导的骨质疏松症，牙周炎，风湿性关节炎等相关疾病药物中广泛应用。

Claims (8)

1.一种式(1)所示咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯的制药用途，其特征在于，应用所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯制备的预防和/或治疗药物用于抑制破骨细胞分化及蚀骨功能、促进成骨细胞分化及成骨功能；

式(1) 。

2.根据权利要求1所述的制药用途，其特征在于，所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯在抑制破骨细胞分化及蚀骨功能之同时促进成骨细胞分化及成骨功能。

3.根据权利要求1所述的制药用途，其特征在于，所述咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯抑制生理病变组织中破骨细胞分化及蚀骨功能，促进生理病变组织中成骨细胞分化及成骨功能。

4.根据权利要求 1  所述的制药用途，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗破骨细胞活性异常导致的疾病；所述疾病包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s 病、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏。

5.根据权利要求4所述的制药用途，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎以及癌症骨转移造成的骨破坏；其中，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。

6.根据权利要求 1  所述的制药用途，其特征在于，所述药物用于预防和/或治疗溶骨性骨损伤；其中，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。

7.根据权利要求1所述的制药用途，其特征在于，所述药物含有有效量的咖啡酸3,4-二羟基苯乙酯以及药学可接受成分。

8.根据权利要求1所述的制药用途，其特征在于，将所述药物配制成可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

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