CN110368496A - 成纤维细胞激活蛋白抑制剂在制备药物中的用途 - Google Patents

成纤维细胞激活蛋白抑制剂在制备药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及成纤维细胞激活蛋白抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于：1)治疗骨质疏松症；和/或，2)提高骨骼强度；和/或，3)提高骨骼骨量；和/或，4)促进骨骼矿化；和/或，5)促进骨骼骨生成；和/或，6)抑制骨骼骨吸收。本发明药物作用于成纤维细胞激活蛋白，能够促进骨生成又抑制骨吸收，达到治疗的目的，具备广阔的临床应用前景。

Description

成纤维细胞激活蛋白抑制剂在制备药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种成纤维细胞激活蛋白抑制剂在制备药物中的 用途。
背景技术
骨质疏松症是由于骨质密度下降，同时骨折风险增高的一种骨科疾病。随着年龄的增 长，骨骼中矿物质的流失加速，钙质减少，造成骨质疏松。发生骨质疏松的骨骼如果受到外 界暴力作用就会发生断裂，造成骨折，严重影响人们活动能力和生活质量，由于体质等原 因，骨质疏松在黄种人和白种人尤为明显。
由于骨骼的形成和稳定是由成骨细胞的骨生成和破骨细胞的骨吸收二者平衡进行的。目 前临床上大多数治疗骨质疏松疾病的药物是通过单一抑制骨吸收的方式实现的，比如双膦酸 盐，靶向核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κBligand，RANKL)单抗， 选择性雌激素受体调节剂等。
破骨细胞能够内化吸附到矿化骨表面的双膦酸盐，从而干扰骨的重吸收过程。代表药物 有阿仑膦酸盐，利塞膦酸盐，依班膦酸盐，唑来膦酸和羟乙基膦酸盐等。双膦酸盐是一类耐 受性良好的药物，副作用较少见，但是用药周期需要3～5年，根据疾病的严重性有的需要 5～10年或更长。
RANKL单抗作为治疗骨质疏松的药物是较早提出的，代表药物地舒单抗是首个用于治 疗骨质疏松症的生物药物，地舒单抗是完全人源化的RANKL单克隆抗体，避免了嵌合性抗 体可能造成的免疫反应。该药能够竞争性结合RANKL，降低RANKL和RANK的结合，从 而起到抑制破骨细胞的激活和功能，通过抑制骨吸收来治疗骨质疏松。
选择性雌激素受体调节剂是一组雌激素受体激动剂/拮抗剂，在骨骼中具有选择性雌激 素受体激动活性。代表药物有雷洛昔芬，该药可以增加椎骨的骨密度，较少椎体骨折发生 率，对髋骨骨折无效。
这些药物已经应用于临床，但是仍然有诸多问题和副作用。例如，双膦酸盐药物可能会 引起颌骨的坏死，发烧，骨骼肌肉关节疼痛和头痛等。在服用双磷酸盐药物期间，患者要避 免拔牙等可能伤害颌骨的活动。此外，由于吸收入血的双磷酸盐被骨骼吸收的的剩余部分通 过肾脏排出体外，肾功能不全者慎用双膦酸盐药物。使用RANKL单抗药物常见副作用为便 秘、咽喉痛、红疹、头痛、关节痛、水肿、高血压等。另外，经过FDA批准的甲状旁腺激素短肽(Teriparatide，特立帕肽)能够促进骨生成，进而增加骨密度，但是会引发头痛、恶心、眩晕、关节痛等副作用。在大鼠实验中，特立帕肽会增加骨肉瘤的发生几率。中国食品药品监督管理局批准特立帕肽的使用周期为24个月。
成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)属于丝氨酸蛋白酶家族成员， 具有二肽外切酶活性和内切酶活性。能够在脯氨酸的碳端切开氨基酸之间的连接。FAP有跨 膜形式和分泌形式两种存在方式。最初研究者发现FAP在癌症基质细胞中高表达，使用免疫 疗法杀伤FAP+细胞会造成贫血等副作用。这是因为FAP在骨髓微环境中的骨髓间充质干细 胞高表达，免疫疗法会破坏骨髓微环境，导致贫血等症状的产生。
如上所述，目前临床上主要用于治疗骨质疏松的药物治疗方式又比较单一，治疗药物的 需求逐年增长，所以一种能够既促进骨生成又抑制骨吸收的药物不仅具有巨大的经济前景， 对于治疗患者病痛，改善患者工作与生活都具有重大意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种成纤维细胞激活蛋白抑制剂 在制备药物中的用途，用于解决现有技术中的问题。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包括成纤维细胞激活蛋白 抑制剂的组分。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种成纤维细胞激活蛋白抑制剂在 制备药物中的用途，所述药物用于：1)治疗骨质疏松症；和/或，2)提高骨骼强度；和/ 或，3)提高骨骼骨量；和/或，4)促进骨骼矿化；和/或，5)促进骨骼骨生成；和/或，6) 抑制骨骼骨吸收。
在本发明一些实施方式中，所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂用于抑制成纤维细胞激活蛋 白的酶活。
在本发明一些实施方式中，所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂用于抑制骨髓间充质干细胞 和/或成骨细胞和/或肥大软骨细胞中的成纤维细胞激活蛋白的酶活。
在本发明一些实施方式中，所述抑制剂为特异性抑制剂。
在本发明一些实施方式中，所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂选自Ac-Gly-BoroPro。
在本发明一些实施方式中，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症。
在本发明一些实施方式中，所述骨质疏松症为卵巢功能衰退和/或雌激素水平降低所引 起的骨质疏松症。
在本发明一些实施方式中，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
在本发明一些实施方式中，成纤维细胞激活蛋白抑制剂为单一药效成分。
本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括成纤维细胞激活蛋白抑制剂。
附图说明
图1显示为成纤维细胞激活蛋白在骨骼细胞中表达情况的结果示意图。
图2显示为成纤维细胞激活蛋白抑制剂对小鼠骨量水平的影响的效果示意图。
图3显示为成纤维细胞激活蛋白抑制剂对卵巢切除小鼠骨量水平的影响的效果示意图。
图4显示为在斑马鱼中敲除fap能够促进成骨的效果示意图。
具体实施方式
本发明发明人经过大量探索研究，发现将成纤维细胞激活蛋白作为治疗患者骨质疏松及 骨质疏松相关疾病的药物靶点，抑制成纤维细胞激活蛋白的酶活，可以促进骨生成，降低骨 吸收，从而达到维持骨量，防止骨质疏松的效果，从而具有良好的产业化前景，并在此基础 上完成了本发明。
本发明中，术语“骨质疏松”通常是指人的骨矿物密度低于骨矿物质峰值约2个标准差以 上的情况。包括骨丢失、骨折、骨质疏松、转移性骨病以及其他症状。骨质疏松症是由于多 种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的 全身性骨病。骨质疏松症分为原发性和继发性二大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质 疏松症(Ⅰ型)、老年性骨质疏松症(Ⅱ型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)三种。绝 经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5～10年内；老年性骨质疏松症一般指老人70岁后发 生的骨质疏松；而特发性骨质疏松主要发生在青少年。
本发明中，术语“骨骼矿化”通常是无机矿物质沉积于骨的有机基质中，使钙和磷等形成 磷灰石，并与有机质螯合形成骨质的生化过程。其中骨基质和骨矿物质是骨矿化的两种最基 本物质，当骨骼矿化不足时，会出现骨量减少或骨质疏松的情况。
本发明中，术语“骨骼细胞”通常是形成骨组织的细胞，包括骨原细胞、成骨细胞、骨细 胞破骨细胞、骨髓基质干细胞和软骨细胞等。其中，骨细胞均匀地分布在矿化的骨基质中， 通过细胞膜的多个突触结构互相连接并与骨基质表面的细胞连接形成网状的细胞结构，骨骼 细胞对骨吸收和骨形成都起作用，是维持成熟骨新陈代谢的主要细胞。
本发明中，术语“成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)”通常是存在 于活化的成纤维细胞上的一种膜整合糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族，与二肽肽酶家族成员 二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)具有52％的同源性，同时具有二肽肽酶和胶原酶活性，能够在脯氨 酸的碳端切开氨基酸之间的连接。FAP在骨骼细胞中高表达。
本发明中，术语“成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)抑制剂”通常 是为任何能够降低FAP的酶活、降低FAP的稳定性、抑制FAP的表达、减少FAP的有效作 用时间或抑制FAP的转录活加工的物质。
本发明中，术语“FAP特异性抑制剂”通常是指为对成纤维细胞激活蛋白产生特异性作用 的抑制剂。
本发明中，术语“骨表面积(BS)”通常是通过移动立方体算法对骨组织进行三角测量计 算的骨组织表面积。
本发明中，术语“组织体积(TV)”通常是感兴趣区域总体积，主要根据研究者或研究重 点观察区域而定。
本发明中，术语“骨体积分数(BV/TV)”通常是表示骨组织体积与组织体积比值，是皮 质骨和松质骨骨量评价指标，对于髓腔内松质骨而言，该比值能够反应不同样本骨小梁骨量 的多少，该值增高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加，反之亦然，从而能够直接或间 接反应骨代谢状况。
本发明中，术语“骨小梁数(Tb.N)”通常是感兴趣区域中，每平方米中骨组织与非骨组 织交点数量的平均值。
本发明中，术语“骨小梁厚度(Tb.Th)”通常是感兴趣区域总体积，骨小梁平均厚度。
本发明中，术语“骨小梁分离度(Tb.Sp)”通常是感兴趣区域总体积，骨小梁之间髓腔平 均宽度。
本发明中，术语“骨小梁数(Tb.N)”、“骨小梁厚度(Tb.Th)”和“骨小梁分离度(Tb.Sp)” 是评价骨小梁空间形态结构的主要指标，在骨分解代谢大于骨合成代谢时情况下，例如发生 骨质疏松时，骨小梁数(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)数值减少，而骨小梁分离度(Tb.Sp) 数值增加。
本发明中，术语“骨表面积骨体积比(BS/BV)”通常是表示单位体积骨组织的面积大小。
本发明中，术语“骨矿物质密度(BMD)”通常是表示感兴趣区域骨组织中，骨矿物密度的大小。
本发明中，术语“矿物质沉积率(Mineral Apposition Rate,MAR)”通常是指每日在活性 成骨表面新沉积的矿化骨厚度，其计算方式是双标记带平均宽度/双标记间隔天数，所述标 记物例如是钙黄绿素。
本发明中，术语“骨生成率(Bone Formation Rate,BFR)”通常是指骨矿化率*单标长度* (骨小梁表面长度/骨小梁面积)*100。
本发明中，术语“总I型前胶原氨基端延长肽(procollagen type 1amino-terminal propeptide，P1NP)”通常是指构成骨基质的I型胶原在骨内合成过程中释放入血的N端小肽。 I型胶原来源于成纤维细胞和成骨细胞合成的I型前胶原蛋白。I型前胶原蛋白有N-(氨基) 和C-(羧基)端延长部分。这些延长部分(前胶原肽)在由前胶原蛋白转化成胶原蛋白过程 中被特殊的蛋白酶除去，并释放入血。所以P1NP通常作为一种检测骨生成的指标。
本发明中，术语“脱氧吡啶啉(Deoxypyridinoline,DPD)”通常是骨中细胞外基质成熟胶 原的不可还原的代谢产物，进入血循环，不经肝脏的降解直接排泄于尿中，用于判断骨吸收 情况。
本发明第一方面提供一种FAP抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于：1)治疗骨 质疏松症；和/或，2)提高骨骼强度；和/或，3)提高骨骼骨量；和/或，4)促进骨骼矿化；和/或，5)促进骨骼骨生成；和/或，6)抑制骨骼骨吸收。
所述的FAP抑制剂为任何能够降低FAP的酶活、降低FAP的稳定性、抑制FAP的表达、减少FAP的有效作用时间或抑制FAP的转录活加工的物质，包括但不限于FAP特异性 抑制剂。在本发明公开的一具体实施方式中，所述FAP抑制剂例如为Ac-Gly-BoroPro。
本发明提供的FAP抑制剂溶解在杜氏磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco's PhosphateBuffered Saline，DPBS)中，使用方式为腹腔注射，注射量为500μg/kg小鼠体重。
本发明第二方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括FAP抑制剂的组分，所述药 物用于：1)治疗骨质疏松症；和/或，2)提高骨骼强度；和/或，3)提高骨骼骨量；和/或，4)促进骨骼矿化；和/或，5)促进骨骼骨生成；和/或，6)抑制骨骼骨吸收。
所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。所述载体可以包括各种赋形剂和稀释 剂，这些载体本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。另一方面，在施用所 述药物组合物所需要考虑的剂量应当取决于施用频率和模式，受治疗的受试者的年龄、性别、 重量和一般状况，治疗的状况和严重性，以及给药途径而异，待治疗的任何伴随性疾病以及 对于本领域技术人员显而易见的其他因素。同时，根据受治疗者的情况和其他病理状况，包 含本发明的药物组合物可以与一种或多种其他的治疗活性化合物或物质组合施用或应用。
本发明人发现，通过抑制FAP酶活可以促进骨生成并且抑制骨吸收，达到增强野生型小 鼠骨量的作用，例如通过制备FAP抑制剂抑制FAP酶活。FAP能够识别蛋白序列中的甘氨 酸-脯氨酸(G-P)二肽，并在脯氨酸后进行酶切，FAP抑制剂Ac-Gly-BoroPro通过将乙酰化 的G-P二肽和硼酸基团共价结合，从而能够识别FAP的蛋白酶结构域并抑制其活性。
本发明还进行了确定FAP在骨骼细胞中表达情况的实验，在其中一个实施例中，通过免 疫荧光实验确定了FAP在骨骼细胞中具有高表达，从而确定FAP可以作为药物组合物的靶 点。
本发明还进行了小鼠骨量水平的检测实验，在其中一个实施例中，施用了本发明的FAP 抑制剂可以促进骨生成并且抑制骨吸收，达到增强骨量的作用。
本发明还进行了卵巢切除小鼠骨量水平的检测实验，模拟卵巢功能衰退和/或雌激素水平 降低所引起的骨质疏松症，例如绝经后骨质疏松症。在其中一个实施例中，施用了本发明的 FAP抑制剂，可以治疗由于卵巢切除所导致的骨质疏松症。
本发明还进行了敲除fap基因的斑马鱼模型的动物实验，在其中一个实施例中，通过敲 除fap，抑制FAP蛋白翻译可以促进成骨。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方 案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料 外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实 施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发 明。
实施例1
FAP抑制剂的制备
本实施例中的FAP特异性抑制剂为Ac-Gly-BoroPro(购自MedChemExpress公司，CAS 886992-99-0)，用于抑制FAP的酶活。在本发明中示例性的订购了Ac-Gly-BoroPro，应当知 晓，FAP特异性抑制剂的种类并不限定于此。此外，在其他的实施例中，所述FAP特异性抑 制剂也可以根据需要进行制备获得。需要注意的是，任何能够降低FAP的酶活、降低FAP的稳定性、抑制FAP的表达、减少FAP的有效作用时间或抑制FAP的转录活加工的物质均 应当涵盖的在本发明要求保护的范围内。
实施例2
FAP在骨骼细胞中表达情况
本实施例中例如可以通过免疫荧光实验(Immunofluorescence technique)确定FAP在骨 髓微环境中的表达情况。当然也并不限定于此，在这里仅示例性地给出一种可行的确定方法。
确定过程如下
(1)分离提取出小鼠长骨，例如野生型C57小鼠的胫骨：首先分离出野生型C57小鼠的胫骨，利用4％多聚甲醛溶液固定过夜，随后用10％乙二胺四乙酸脱钙4天，用30％蔗糖溶液脱水两天。
(2)切片：冰冻切片机对野生型C57小鼠胫骨进行切片，切片厚度为10μm。
(3)免疫荧光实验：利用含有10％马血清，0.1％Triton-X100的磷酸缓冲盐溶液(PBS) 封闭1小时，之后4℃孵育FAP的一抗过夜，一抗浓度为1:200。第二天用PBS洗三遍，每次10分钟。然后室温孵育二抗，二抗浓度为1:1000。PBS洗三遍每次10分钟，100μl浓度 为1μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色1分钟。
(4)荧光显微镜观察FAP在小鼠骨髓中的表达情况：使用60μl ThermoFisher抗荧光淬 灭封片剂进行封片，随后利用荧光显微镜观察FAP在小鼠骨髓中的表达情况。
如图1所示，FAP在长骨的骨髓间充质干细胞，成骨细胞和肥大软骨细胞中高表达。
实施例3
FAP抑制剂对小鼠骨量水平的影响
将实施例1中获得FAP抑制剂在野生型C57小鼠中进行连续腹腔注射，分析小鼠的骨量 情况，包括骨生成和骨吸收。
取FAP抑制剂Ac-Gly-BoroPro溶解在DPBS中，溶解浓度为100μg/ml，向野生型C57小鼠中每天进行腹腔注射，连续给药28天，注射量为100μl每次，并在观察期间内，配制5mg/ml钙黄绿素溶液，例如处死小鼠前的第九天和第二天向小鼠中分别腹腔注射100μl钙黄 绿素溶液，以对骨生成进行标记，作为实验组(FAPi)。同时，取注射安慰剂DPBS的野生型C57小鼠作为对照组(Vehicle)。通过microCT设备扫描实验组和对照组的小鼠骨组织测试小 鼠的骨量情况，股骨和脊椎骨的扫描精确度分别为10μm和7μm，最高测试管电压为55kV，电流为0.145mA。股骨的骨小梁扫描范围是远心端的干骺端，所圈选的感兴趣区域为生长板下方，骨骺帽机构完全消失开始，向近心端圈选100张。圈选圈选区域不与内皮质骨表面重叠。股骨的皮质骨扫描范围是骨干中间部位100张，圈选区域沿着外侧皮质骨范围进行。脊椎骨的扫描范围是脊椎骨的第三段，从近心端脊椎骨中骨小梁轮廓清晰开始，向远心端圈选 200张感兴趣区域。随后对感兴趣区域进行拟合，使用微型CT中自带骨小梁形态测量学方法 分析股骨和脊椎骨骨小梁部位，使用骨中段形态学测量方法分析股骨中段皮质骨。
骨生成实验
取实验组和对照组小鼠的股骨，利用70％酒精进行固定和脱水其microCT设备的扫描图 像如图2A所示。并分析小鼠股骨的骨参数，包括骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)、 骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨表面积骨体积比(BS/BV)、骨矿物质 密度(BMD)等。如图2B-2G所示，相较于对照组，注射了FAP抑制剂的野生型C57小鼠 的骨量提高。
皮质骨分析中还分析皮质骨总面积(Tt.Ar)、皮质骨面积(Ct.Ar)、皮质骨比例、皮质骨 厚度(Ct.Th)、极惯性矩(pMOI)和皮质骨骨密度(BMD)。如图2N-2T所示，相较于对照组，皮质骨总面积(Tt.Ar)的增大表示感兴趣区域总体积的增加；皮质骨面积(Ct.Ar)的显著性增长反映了皮质骨体积的增长；皮质骨的厚度也呈现显著性增长，极惯性矩(polarmoment of inertia，pMOI)的增大反映了皮质骨截面抗扭转能力的增加。即，注射了FAP特异性抑制 剂后，能够显著性增加皮质骨的骨量和抗扭转的能力。
取实验组和对照组小鼠的胫骨，经冰冻切片机切至一半后，用硅脂将半骨固定在载玻片 上，使用激光扫描共聚焦显微镜拍摄荧光照片，拍摄位置为胫骨近心端骨小梁，拍照图像如 图2H所示。分析矿物质沉积率(Mineral Apposition Rate,MAR)、矿化面积占骨表面积比例 (MS/BS)，以及骨生成率(Bone Formation Rate,BFR)等，如图2I-2K所示，相对比于对照 组，注射了FAP抑制剂的野生型C57小鼠的矿物质沉积率和骨生成率显著提高。
另一方面，为了检测骨量的增加对增强小鼠股骨的抗骨折能力的大小，例如通过三点折 断实验检测实验组和对照组小鼠的股骨的机械应力能力，使用的仪器为美国BOSE公司的 3220型电子动静态万能材料试验机。将样本平稳放置在弯曲实验夹具上，跨距8mm，预载 0.5N固定标本，防止测试过程中标本滑移。以3mm/min的速度向股骨中段施加轴向载荷，标 本破坏后测试终止。仪器能够计算得出包括测试最大受力载荷(Peak Load)和折断点受力载 荷(Fracture Load)的结果，如图2U-2V所示，相对比于对照组，注射了FAP抑制剂的野生 型C57小鼠股骨的机械性能显著增强，相应的小鼠股骨抗骨折能力显著增强。
骨生成和骨吸收
取实验组和对照组小鼠的血清和尿液，按照试剂盒说明书的实验过程，经酶联免疫吸附(ELISA)实验，分析小鼠骨生成和骨吸收情况。我们使用IDS公司大鼠/小鼠P1NPELISA 试剂盒检测小鼠血清中成骨相关的总I型前胶原氨基端延长肽(P1NP)的含量。我们使用 Quidel公司的DPD ELISA试剂盒检测小鼠尿液中骨吸收相关的脱氧吡啶啉(Deoxypyridinoline,DPD)，并利用Quidel公司的肌酸酐(creatinine)试剂盒检测尿液中肌 酸酐含量。利用肌酸酐含量对脱氧吡啶啉进行标准化。最终用DPD/creatinine的比值反映小 鼠骨吸收情况，结果如图2L-2M所示，相较于对照组，注射了FAP抑制剂的野生型C57小鼠P1NP指数升高，DPD指数降低，即骨生成升高和骨吸收降低。
因此，通过本发明的FAP抑制剂抑制FAP酶活可以促进骨生成并且抑制骨吸收，达到 增强野生型小鼠骨量的作用。
实施例4
FAP抑制剂对卵巢切除小鼠骨量水平的影响
将实施例1中获得FAP抑制剂在卵巢切除的野生型C57小鼠中进行连续腹腔注射，分析 小鼠的骨量情况，是否能预防骨质疏松症状的发生，用于模拟卵巢缺失或卵巢功能衰退的妇 女，例如绝经后的妇女。
实验分为三组，分别为假手术组注射安慰剂DPBS(Mock+Vehicle)，卵巢切除组注射安 慰剂DPBS(OVX+Vehicle)和卵巢切除组注射FAP抑制剂(OVX+FAPi)。使用15mg/ml戊巴比妥对野生型C57小鼠进行麻醉，用手术剪在小鼠背部下侧剪开皮肤，使用手术镊夹出卵巢，并切除，缝合伤口。对于假手术组，将卵巢夹出后再放回小鼠体内，模拟手术过程。在 手术后的第二天开始注射FAP抑制剂或者对应的安慰剂DPBS，FAP抑制剂Ac-Gly-BoroPro 浓度为100μg/ml，腹腔注射药量为100μl，连续给药35天，并在观察期间内，例如处死小 鼠前的第九天和第二天向小鼠中分别腹腔注射100μl浓度为5mg/ml钙黄绿素，以对骨生成 进行标记，通过microCT设备扫描三组小鼠的股骨和脊椎骨检测小鼠的骨量情况，扫描参数 和分析方法例如可以与实施例3中相同。
骨生成实验
取实验组和对照组小鼠的股骨和脊椎骨，其microCT设备的扫描图像如图3A所示。并 分别分析小鼠股骨和脊椎骨的骨参数，包括组织体积(TV)、骨体积(BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁连接密度(Conn.D)、骨小梁数(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁 分离度(Tb.Sp)、骨矿物质密度(BMD)等。所述小鼠股骨的骨参数如图3B-3I所示，相较 于假性对照组，即卵巢切除小鼠相较于卵巢未切除小鼠，其股骨松质骨骨量、骨小梁连接密 度(Conn.D)、骨小梁数目(Tb.N)显著性下降，骨小梁分离度(Tb.Sp)有显著性上升，这 是由于缺乏雌性激素导致的。相较于安慰剂对照组，即卵巢切除小鼠注射FAP特异性抑制剂 相较于注射安慰剂，在注射了FAP特异性抑制剂后，其股骨松质骨的骨量、骨小梁的连接密 度、骨小梁的数目都有显著性升高，骨小梁分离度有显著性下降。实验结果说明了野生型小 鼠卵巢切除后，骨量相较于正常发育小鼠明显下降，而注射了FAP特异性抑制剂后，能够缓 解和治疗骨质疏松的症状。所示小鼠脊椎骨的骨参数如图3J-3R所示，通过microCT扫描观 察到了在腰椎中，注射了FAP特异性抑制剂后能够缓解由于雌性激素缺失导致的骨小梁体积的减少，对其他指标的没有明显的缓解和治疗效果。
取实验组和对照组小鼠的胫骨，经冰冻切片机切至半骨，利用硅脂包埋半骨，利用激光 扫描共聚焦显微镜进行拍照，其拍照图像如图3S所示。分析矿物质沉积率(MineralApposition Rate,MAR)、矿化面积占骨表面积比例(MS/BS)，以及骨生成率(BoneFormation Rate,BFR) 等，如图3T-3V所示，相较于安慰剂对照组，即卵巢切除小鼠注射FAP特异性抑制剂相较于 注射安慰剂，在注射了FAP特异性抑制剂后，卵巢切除小鼠胫骨的MAR和BFR都有显著性 回升。
因此，通过本发明的FAP抑制剂抑制FAP酶活可以治疗由于卵巢切除，例如卵巢缺失或 卵巢功能衰退的妇女，更进一步地，例如绝经后的妇女，所导致的骨质疏松症。
实施例5
在斑马鱼中敲除fap并分析斑马鱼脊椎骨的矿化情况
FAP蛋白在斑马鱼和小鼠中是保守的。通过设计反义吗啉环寡核苷酸(Anti-sensemorpholino oligonucleotides，MO)以敲除fap，fap MO序列为5’TTATGGGCTGTAATAAGGTGTGCGT 3’。然后在斑马鱼胚胎一细胞期注射fap MO阻止fap mRNA翻译，并在第7天使用200μl 0.5％茜素红溶液对斑马鱼进行染色，染色时间为3小 时，随后使用胚胎培养基洗两遍。使用Nikon SMZ1500显微镜进行拍照，之后对斑马鱼脊椎 骨进行计数与统计分析。结果如图4A-4C所示，fap MO能够显著提高斑马鱼第7天脊椎骨 的矿化。同时，在斑马鱼胚胎一细胞期注射fap mRNA检测其对骨骼矿化的作用，如图4D-F 所示，fap的过表达会显著降低斑马鱼第7天脊柱骨的矿化。此外，为进一步验证MO阻断 fap蛋白翻译提高骨骼矿化的效果，设计了fap的单个向导RNA(Single guide RNA，sgRNA)， 例如fapsgRNA 1:GCTGTAATAAGGTGTGCG和fap sgRNA 2:GCGTGGCGCTGGTCGGGG (购买自Ambion公司市售的MEGAshortscript试剂盒获得sgRNA)，并通过利用Crispr/Cas9 技术在DNA水平敲除fap，观察其对成骨的作用。对于以上显微注射实验，经1nl体积注射 进胚胎的一细胞向二细胞发育阶段，并且同样使用茜素红溶液对斑马鱼发育第7天进行染色 和统计分析，如图4G-4L所示，sgRNA同样能够增加斑马鱼脊椎骨的矿化。
因此，实验结果表明，FAP在斑马鱼中同样起到了抑制骨骼矿化的作用，同时也证明了 FAP在进化过程中具有保守的功能。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而 具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技 术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡 所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等 效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.成纤维细胞激活蛋白抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于：
1)治疗骨质疏松症；和/或，
2)提高骨骼强度；和/或，
3)提高骨骼骨量；和/或，
4)促进骨骼矿化；和/或，
5)促进骨骼骨生成；和/或，
6)抑制骨骼骨吸收。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂用于抑制成纤维细胞激活蛋白的酶活。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂用于抑制骨髓间充质干细胞和/或成骨细胞和/或肥大软骨细胞中的成纤维细胞激活蛋白的酶活。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制剂为特异性抑制剂。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述成纤维细胞激活蛋白抑制剂选自Ac-Gly-BoroPro。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述骨质疏松症为卵巢功能衰退和/或雌激素水平降低所引起的骨质疏松症。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述骨质疏松症为绝经后骨质疏松症。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，成纤维细胞激活蛋白抑制剂为单一药效成分。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括成纤维细胞激活蛋白抑制剂。
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