CN114010756A - 一种卵巢再生贴片及其基于真空装置的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及到一种卵巢再生贴片及其基于真空装置的制备方法。本申请的一种基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，通过将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒低温离心，除去上清液，保留沉淀；接着使用易挥发溶剂将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒再次悬浮，并装入含有控制阀的第一密封容器中；最后将妇产科盆腔材料平铺于第二密封容器中，开启真空装置，将间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液均匀地铺在妇产科盆腔材料上，获得卵巢再生贴片，使得其能够缓慢释放间充质干细胞内有效成分，解决早发性卵巢功能不全问题，达到更好的治疗目的，恢复卵巢功能，促进卵泡发育及排卵；且可有效避免药物流失及重复给药。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及到一种卵巢再生贴片及其基于真空装置的制备方法。
背景技术
早发性卵巢功能不全(Primary Ovarian Insufficiency，POI)又称卵巢早衰(Premature Ovarian Failure，POF)，是指女性40岁以前卵巢功能丧失，临床表现为月经紊乱(闭经或月经稀发)伴有促性腺素升高和雌激素降低，其定义为，月经稀发或闭经至少4个月，两次随机(间隔>4周)促卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)>25IU/L。
POI常见的症状为围绝经期症状，包括潮热，出汗，睡眠障碍，生殖道干涩，性欲减低，易怒以及一些心理疾病，这些都与雌性激素减低密切相关，且POI女性往往患有不孕症。POI的临床管理策略包括生活方式的调整，戒烟，激素替代治疗以及青春期诱导。但这些治疗方案都是为改善患者生活及生存质量，预防因雌激素降低带来的骨质疏松及心脑血管事件发生风险，并不能够真正逆转卵巢功能，如卵巢分泌激素，卵泡发育及排卵等。且POI导致的不孕症也不能够逆转，即使在辅助生育技术的帮助下，亦无法改变妊娠结局和生育结局。
近年来，干细胞及仿生材料在再生医学领域中成为研究热点，尤其是承载干细胞及其衍生物的生物医学材料在组织或器官损伤及修复中发挥重要功能。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)在组织或器官损伤及修复中发挥重要功能，在再生医学中应用广泛，并且在治疗POI中也被报道发挥重要作用。在分子生物学研究中显示，MSCs通过改变卵巢细胞内信号通路，基因修饰及MSCs旁分泌蛋白等改善了卵巢的功能。但是，活细胞难以保存及运输，且使用活细胞直接注射到卵巢皮质功能层时流失严重，使其疗效大打折扣，且活细胞治疗可能引起自身免疫反应或干细胞肿瘤分化等风险。
因此，如何使得充质干细胞分布更加均匀，从而提高间充质干细胞治疗的效果，减少细胞流失，并降低其治疗时带来的风险，是解决间充质干细胞治疗早发性卵巢功能不全的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种卵巢再生贴片及其基于真空装置的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，包括以下方法：
S1、将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒低温离心，除去上清液，保留沉淀；
S2、使用易挥发溶剂将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒再次悬浮，并装入含有控制阀的第一密封容器中；
S3、将妇产科盆腔材料平铺于第二密封容器中，开启真空装置，将间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液均匀地铺在妇产科盆腔材料上，获得卵巢再生贴片。
进一步的，第一密封容器与所述第二密封容器通过一导向管相连通，所述导向管朝向所述第二密封容器的开口呈喇叭状。
进一步的，间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的制备包括
S101、间充质干细胞分离及培养
健康产妇分娩后断脐，胎盘自然剥离后消毒脐带，取脐带中间段约0.5～5cm，保存于4℃的无菌注射用水中；
2～6小时内，在超净台内，充分剪碎及研磨脐带，并加入胶原蛋白酶IV置于37℃温箱内，待组织完全疏松，成为匀浆时，裂解红细胞后离心；
再将离心管内底部细胞充分吹匀，转移至含有5～20％血清的基础培养基中，并置于恒温培养箱中，每4～12小时换液一次，待细胞密度到达80～90％时进行传代培养；
S102、间充质干细胞分泌蛋白的提取及纯化
间充质干细胞传代培养至P5，待细胞贴壁生长，吸去含有血清的培养基，使用无菌PBS溶液清洗培养瓶，并加入不含有血清的培养基，放入恒温细胞培养箱中；
24～72小时后，观察培养瓶中细胞状态，收集培养基并离心去除培养基内杂质，保留上清液，获得条件培养基；再使用3k超速离心管进行低温离心，浓缩蛋白，并监测蛋白浓度，直到蛋白浓度达到0.1～10mg/ml，快速冷冻浓缩的蛋白液；最后将冷冻的蛋白液进行冻干，制备成蛋白冻干粉，并称重；
S103、间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒制备
将步骤S102中1～100mg间充质干细胞分泌蛋白溶于0.1～10ml 0.01-1％的聚乙烯醇中，获得间充质干细胞分泌蛋白溶液；
称取高分子聚合物10-500mg，溶于1～10ml的有机溶剂，然后注入到间充质干细胞分泌蛋白溶液中，接着在冰上使用超声波震碎器混合搅拌10～100秒，得到乳状液；
再将获得的乳状液注入到0.7～2％的聚乙烯醇中，并使用高速搅拌器搅拌8～120分钟后，低温搅拌8h，离心，收集底部沉淀；
最后使用无菌蒸馏水充分洗涤，获得间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒。
进一步的，步骤S103高分子聚合物为聚乙酸-羟基乙酸共聚物；所述有机溶剂为二氯甲烷。
进一步的，间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的大小为0.1～10μm。
进一步的，步骤S2中易挥发溶剂为乙醚。
进一步的，步骤S3中卵巢再生贴片内颗粒数为106～108/cm2，蛋白浓度为0.05～5mg/cm2；每张卵巢再生贴片的大小为5-8～7-12cm。
进一步的，妇产科盆腔材料为防粘连的可降解材料。
进一步的，间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的密度为107～109/ml，蛋白浓度为0.05～5mg/ml。
一种卵巢再生贴片，使用上述的基于真空装置的卵巢再生贴片的制备方法制得。
本发明的有益效果：由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的一种基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，通过将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒低温离心，除去上清液，保留沉淀；接着使用易挥发溶剂将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒再次悬浮，并装入含有控制阀的第一密封容器中；最后将妇产科盆腔材料平铺于第二密封容器中，开启真空装置，将间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液均匀地铺在妇产科盆腔材料上，获得卵巢再生贴片，使得其能够缓慢释放间充质干细胞内有效成分，解决早发性卵巢功能不全问题，达到更好的治疗目的，恢复卵巢功能，促进卵泡发育及排卵；且可有效避免药物流失及重复给药，以及解决活细胞难以保存运输、降低引发免疫或肿瘤应答风险等问题。
附图说明
图1为本发明优选实施例中控制人脐带间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液流速的真空装置结构示意图；
图2为本发明优选实施例中卵巢再生贴片的制备方法图；
图3为本发明优选实施例中盆腔防粘连材料电镜扫描图；
图4为本发明优选实施例人脐带间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒电镜扫描图；
图5为本发明优选实施例中未经调控装置的卵巢再生贴片电镜扫描图；
图6为本发明优选实施例中经调控装置的卵巢再生贴片电镜扫描图。
附图标记：1、第一密封容器；2、第二密封容器；3、真空装置；4、流速控制开关。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
参照图1-2所示，本发明的优选实施例，一种基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，包括以下方法：
S1、将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒低温离心，除去上清液，保留沉淀；
S2、使用易挥发溶剂乙醚将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒再次悬浮，并装入含有控制阀的第一密封容器1中；
其中，间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的密度为107～109/ml，蛋白浓度为0.05～5mg/ml；
S3、将防粘连的可降解材料的妇产科盆腔材料平铺于第二密封容器2中，开启真空装置3，将间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液均匀地铺在妇产科盆腔材料上，获得卵巢再生贴片，
其中，卵巢再生贴片内颗粒数为106～108/cm2，蛋白浓度为0.05～5mg/cm2；每张卵巢再生贴片的大小为5-8～7-12cm。
作为本发明的优选实施例，其还可具有以下附加技术特征：第一密封容器1与所述第二密封容器2通过一导向管相连通，所述导向管朝向所述第二密封容器2的开口呈喇叭状，且第一密封容器1底部设置有一流速控制开关4，使得间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液能够均匀地铺在妇产科盆腔材料上。
本实施例中，间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的制备包括
S101、间充质干细胞分离及培养
健康产妇分娩后断脐，胎盘自然剥离后消毒脐带，取脐带中间段约0.5～5cm，保存于4℃的无菌注射用水中；
2～6小时内，在超净台内，充分剪碎及研磨脐带，并加入胶原蛋白酶IV置于37℃温箱内，待组织完全疏松，成为匀浆时，裂解红细胞后离心；
再将离心管内底部细胞充分吹匀，转移至含有5～20％血清的基础培养基中，并置于恒温培养箱中，每4～12小时换液一次，待细胞密度到达80～90％时进行传代培养；
S102、间充质干细胞分泌蛋白的提取及纯化
间充质干细胞传代培养至P5，待细胞贴壁生长，吸去含有血清的培养基，使用无菌PBS溶液清洗培养瓶，并加入不含有血清的培养基，放入恒温细胞培养箱中；
24～72小时后，观察培养瓶中细胞状态，收集培养基并离心去除培养基内杂质，保留上清液，获得条件培养基；再使用3k超速离心管进行低温离心，浓缩蛋白，并监测蛋白浓度，直到蛋白浓度达到0.1～10mg/ml，快速冷冻浓缩的蛋白液；最后将冷冻的蛋白液进行冻干，制备成蛋白冻干粉，并称重；
S103、间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒制备
将步骤S102中1～100mg间充质干细胞分泌蛋白溶于0.1～10ml 0.01-1％的聚乙烯醇中，获得间充质干细胞分泌蛋白溶液；
称取高分子聚乙酸-羟基乙酸共聚物10-500mg，溶于1～10ml的有机溶剂二氯甲烷，然后注入到间充质干细胞分泌蛋白溶液中，接着在冰上使用超声波震碎器混合搅拌10～100秒，得到乳状液；
再将获得的乳状液注入到0.7～2％的聚乙烯醇中，并使用高速搅拌器搅拌8～120分钟后，低温搅拌8h，离心，收集底部沉淀；
最后使用无菌蒸馏水充分洗涤，获得间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒。
本实施例中，间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的大小为0.1～10μm。
一种卵巢再生贴片，使用上述的基于真空装置的卵巢再生贴片的制备方法制得，该卵巢再生贴片内间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒均匀分布于妇产科盆腔材料上，使得其能够缓慢释放间充质干细胞内有效成分，解决早发性卵巢功能不全问题，达到更好的治疗目的，恢复卵巢功能，促进卵泡发育及排卵；且可有效避免药物流失及重复给药，以及解决活细胞难以保存运输、降低引发免疫或肿瘤应答风险等问题。
具体地操作如下：
S1、人脐带间充质干细胞培养
原代人脐带间充质干细胞，初始细胞数量为106个/ml。接种在含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的IMDM(Iscove's Modified Dulbecco'sMedia)中，细胞密度约为50％，放置于5％二氧化碳37℃恒温细胞培养箱。每12小时换液一次，待细胞密度到达80％-90％时进行传代培养。
无菌磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗培养瓶，置入胰蛋白酶消化液，细胞培养箱中消化5-8min，光学显微镜下观察，细胞悬浮后，置入等量含血清培养IMDM终止消化。将细胞液置入离心管中，离心10分钟。吸去上清液，保留底部细胞。用含血清IMDM充分悬浮后接种至T-175培养瓶中，细胞密度约50％，置入恒温箱中培养。
S2、人脐带间充质干细胞分泌蛋白的提取与纯化
传代培养细胞，直至收集细胞密度80％的T-175培养瓶20瓶时停止传代。无菌PBS清洗培养瓶，置入无血清IMDM，培养箱中放置30分钟，弃去培养基，再次PBS清洗后置入无血清IMDM，反复3-6次，以确保培养瓶中的血清充分洗净。最后置入15-20ml无血清IMDM，放入培养箱中，利用“细胞饥饿分泌”原理，使培养基重获得充足的间充质干细胞分泌蛋白。72小时后，收集培养基并离心去除细胞碎片等杂质成分，获得条件培养基。使用3K超滤离心管在4℃环境下超滤离心条件培养基，达到浓缩目的，浓缩条件培养基10倍，测定蛋白浓度，当蛋白浓度大于1mg/ml时停止浓缩，获得人脐带间充质干细胞分泌蛋白。计算人脐带间充质干细胞分泌蛋白液的总质量并记录，之后将所有蛋白液冷冻后冻干成蛋白粉，-80℃条件下保存。
S3、人脐带间充质干细胞缓释颗粒的制备
人脐带间充质干细胞缓释颗粒是以人脐带间充质干细胞分泌蛋白为作用核心，使用高分子聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物为外包膜制备成的具有缓慢释放特点的人工合成细胞。使用0.1-0.2％聚乙烯醇充分溶解约10-20mg冻干人脐带间充质干细胞分泌蛋白粉，置于冰上待用。将50-100mg的聚乙酸-羟基乙酸共聚物在通风橱内溶于1-5ml二氯甲烷中。将之前配制好的人脐带间充质干细胞分泌蛋白溶液注入至聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液中，形成水-乳双相液，将双相液置入0.7-1.0％PVA溶液中。使用超声搅拌棒搅拌10-20s，将乳粒打散形成水-乳-水三相悬浮混合液。再使用高速搅拌器搅拌约8-10min将乳粒进一步细化至2-10微米颗粒。将悬浮液置于冰上，在通风橱内，使用磁力搅拌棒搅拌过夜，使二氯甲烷充分挥发。次日离心悬浮液，收集底部沉淀，去除上清，再使用无菌蒸馏水反复悬浮、离心、洗涤3-4次，得到人脐带间充质干细胞缓释颗粒。
S4、卵巢再生贴片的制备
使用妇产科临床上已广泛使用的可降解盆腔防粘连材料作为人脐带间充质干细胞缓释颗粒载体。该材料遇水变形、降解，但遇到有机溶剂则不改变基本形态及特点。乙醚是最为广泛使用的有机溶剂，具有快速挥发，消灭有害病原生物的特点，故使用乙醚作为颗粒的悬浮液，既能够维持可降解盆腔防粘连材料原有的特性，又可以不破坏人脐带间充质干细胞缓释颗粒的基本形态，并且能够快速挥发，达到人脐带间充质干细胞缓释颗粒与可降解盆腔防粘连材料相结合的目的。将制备好，已用乙醚悬浮的人脐带间充质干细胞缓释颗粒均匀的喷洒盆腔防粘连材料上，置于真空抽吸装置内，保持真空状态，使酒精迅速挥发。从而使人脐带间充质干细胞缓释颗粒在可降解盆腔防粘连材料上均匀且牢固的分布。反复喷洒、真空抽吸10次，制备成为卵巢再生贴片(如图2所示)。
S5、卵巢再生贴片的特点
形态学特点
使用扫描电镜观察原始状态的可降解盆腔防粘连材料如图3所见，可降解盆腔防粘连材料呈现多束纤维编织成的网状结构，每束纤维宽约100μm，由宽约10μm的20-30条纤维组成，中间为孔状，均匀致密。当可降解盆腔防粘连材料遇水到水分子，纤维束能够迅速解开，呈现松散及粘稠状态，从而达到覆盖创面及血管，预防组织间的粘连及止血的目的。图4呈现人脐带间充质干细胞缓释颗粒扫描电镜下形态，呈颗粒球形，直径约2-10μm。人脐带间充质干细胞缓释颗粒外表为乳状，非亲水性，在亲水溶剂中悬浮。人脐带间充质干细胞缓释颗粒内为亲水蛋白，可溶于水。该颗粒乳状外表有细小微孔，水分子可以通过进入内部，当人脐带间充质干细胞缓释颗粒内水分子达到足够量是，人脐带间充质干细胞缓释颗粒破乳，释放内部蛋白，从而达到缓释目的。图5是将人脐带间充质干细胞缓释颗粒悬浮液直接与可降解盆腔材料相结合得到的材料电镜图。图6展现使用图1的流速可控的真空抽吸装置制备的卵巢再生贴片电镜下形态。人脐带间充质干细胞缓释颗粒颗粒细小，以超高密度状态分布在可降解盆腔防粘连材料上，以物理形态连接，连接紧密，当卵巢再生贴片贴附于卵巢表面时，人脐带间充质干细胞缓释颗粒能够在卵巢表面附着，并且由可降解盆腔防粘连材料包裹，不易流失。当可降解盆腔防粘连材料在体内降解时，人脐带间充质干细胞缓释颗粒同时也缓慢释放其内有效的MSC分泌蛋白，修复卵巢表面功能层，达到逆转卵巢功能目的。
通过该方法设计及制备的卵巢再生贴片卵巢再生贴片同时具备了间充质干细胞修复、缓慢释放有效因子及局部包裹贴合的特点，保证了其有效作用的同时，兼顾了临床的实用性及安全性。
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (10)
1.一种基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：包括以下方法：
S1、将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒低温离心，除去上清液，保留沉淀；
S2、使用易挥发溶剂将间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒再次悬浮，并装入含有控制阀的第一密封容器中；
S3、将妇产科盆腔材料平铺于第二密封容器中，开启真空装置，将间充质干细胞分泌蛋白颗粒悬浮液均匀地铺在妇产科盆腔材料上，获得卵巢再生贴片。
2.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述第一密封容器与所述第二密封容器通过一导向管相连通，所述导向管朝向所述第二密封容器的开口呈喇叭状。
3.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的制备包括
S101、间充质干细胞分离及培养
健康产妇分娩后断脐，胎盘自然剥离后消毒脐带，取脐带中间段约0.5～5cm，保存于4℃的无菌注射用水中；
2～6小时内，在超净台内，充分剪碎及研磨脐带，并加入胶原蛋白酶IV置于37℃温箱内，待组织完全疏松，成为匀浆时，裂解红细胞后离心；
再将离心管内底部细胞充分吹匀，转移至含有5～20％血清的基础培养基中，并置于恒温培养箱中，每4～12小时换液一次，待细胞密度到达80～90％时进行传代培养；
S102、间充质干细胞分泌蛋白的提取及纯化
间充质干细胞传代培养至P5，待细胞贴壁生长，吸去含有血清的培养基，使用无菌PBS溶液清洗培养瓶，并加入不含有血清的培养基，放入恒温细胞培养箱中；
24～72小时后，观察培养瓶中细胞状态，收集培养基并离心去除培养基内杂质，保留上清液，获得条件培养基；再使用3k超速离心管进行低温离心，浓缩蛋白，并监测蛋白浓度，直到蛋白浓度达到0.1～10mg/ml，快速冷冻浓缩的蛋白液；最后将冷冻的蛋白液进行冻干，制备成蛋白冻干粉，并称重；
S103、间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒制备
将步骤S102中1～100mg间充质干细胞分泌蛋白溶于0.1～10ml 0.01-1％的聚乙烯醇中，获得间充质干细胞分泌蛋白溶液；
称取高分子聚合物10-500mg，溶于1～10ml的有机溶剂，然后注入到间充质干细胞分泌蛋白溶液中，接着在冰上使用超声波震碎器混合搅拌10～100秒，得到乳状液；
再将获得的乳状液注入到0.7～2％的聚乙烯醇中，并使用高速搅拌器搅拌8～120分钟后，低温搅拌8h，离心，收集底部沉淀；
最后使用无菌蒸馏水充分洗涤，获得间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒。
4.根据权利要求3所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述步骤S103高分子聚合物为聚乙酸-羟基乙酸共聚物；所述有机溶剂为二氯甲烷。
5.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的大小为0.1～10μm。
6.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述步骤S2中易挥发溶剂为乙醚。
7.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述步骤S3中卵巢再生贴片内颗粒数为106～108/cm2，蛋白浓度为0.05～5mg/cm2；每张卵巢再生贴片的大小为5-8～7-12cm。
8.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述妇产科盆腔材料为防粘连的可降解材料。
9.根据权利要求1所述的基于真空装置的卵巢再生贴片制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞分泌蛋白缓释颗粒的密度为107～109/ml，蛋白浓度为0.05～5mg/ml。
10.一种卵巢再生贴片，其特征在于：使用权利要求1-9任一所述的基于真空装置的卵巢再生贴片的制备方法制得。
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| CN113244272A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-08-13 | 陕西中鸿科瑞再生医学研究院有限公司 | 用于改善卵巢早衰的组合物及其制备方法和应用 |
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- 2021-10-25 CN CN202111239447.0A patent/CN114010756A/zh active Pending
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