CN111117953B - 一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法 - Google Patents

一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111117953B
CN111117953B CN202010018934.3A CN202010018934A CN111117953B CN 111117953 B CN111117953 B CN 111117953B CN 202010018934 A CN202010018934 A CN 202010018934A CN 111117953 B CN111117953 B CN 111117953B
Authority
CN
China
Prior art keywords
genioglossus muscle
genioglossus
digestion
culture
suspension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010018934.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111117953A (zh
Inventor
朱露莹
刘月华
卢燕勤
韩欣欣
於丽明
张维华
邓佳佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI STOMATOLOGICAL DISEASE CENTER
Original Assignee
SHANGHAI STOMATOLOGICAL DISEASE CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI STOMATOLOGICAL DISEASE CENTER filed Critical SHANGHAI STOMATOLOGICAL DISEASE CENTER
Priority to CN202010018934.3A priority Critical patent/CN111117953B/zh
Publication of CN111117953A publication Critical patent/CN111117953A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111117953B publication Critical patent/CN111117953B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，包括如下步骤：将年老小鼠颏舌肌置于含有I型胶原酶的培养皿中，剪碎，得到颏舌肌组织碎片和I型胶原酶的混合液置于离心管中，轻轻吹打得到颏舌肌悬液，进行第一次消化，离心去上清，吸去I型胶原酶后加入胰蛋白酶进行第二次消化，终止消化后得到的颏舌肌悬液进行离心，去上清液，得到的颏舌肌碎片用原代培养基进行重悬，轻轻吹打再混匀制成悬液，然后置于培养箱中采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养。本发明的体外培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的颏舌肌成肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，培养周期短，培养效率高，具有较大的推广意义。

Description

一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种老年C57BL/6小鼠颏舌肌来源的干细胞原代分离培养方法。
背景技术
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSA)是一种睡眠时易发生低通气的病理性疾病，随着年龄的增加，OSA的发病率不断增加。颏舌肌是上气道扩张肌中牵拉舌体向前运动的主要肌肉，称为“上气道安全肌”，对于气道开放和大小起决定性的作用，是研究OSA发病机制和寻求治疗途径的关键，其功能异常往往与OSA发病密切相关。成肌细胞对于肌肉生长和损伤具有重要作用，当肌纤维受到损伤或刺激时，成肌细胞开始增殖、分化并融合形成新的纤维，修复受损的肌组织。
年老颏舌肌来源的成肌细胞培养模型可以排除在体实验多种干扰因素的影响，在特定环境下研究特定因素对颏舌肌成肌细胞的作用。现有技术中已有一些颏舌肌成肌细胞的培养方法，但这些方法存在两个弊端：其一，颏舌肌通常来源年轻小鼠颏舌肌组织，无法模拟老年状态；其二，现阶段大家常采用的小鼠颏舌肌成肌细胞直接进行原代分离，所以分离出来的细胞纯度相对较低，同时活力也相对较差。利用体外培养的年老颏舌肌来源的成肌细胞建立多种病理生理模型，有利于从细胞和分子生物学水平研究老年OSA疾病的发明机制和预防手段，因此需要找到一种高效、稳定，分离出的细胞活性高、产量大、存活率高的年老小鼠颏舌肌成肌细胞的培养方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种高效、稳定，分离出的细胞活性高、产量大、存活率高的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，包括如下步骤：
(1)剪取年老的小鼠颏舌肌，置于无菌PBS缓冲液中进行清洗，去除颏舌肌中的脂肪组织及血液，随后放置于含有I型胶原酶的培养皿中，剪碎所述的颏舌肌组织，得到颏舌肌组织碎片和I型胶原酶的混合液；
(2)收集所述步骤(1)得到的混合液置于离心管中，轻轻吹打混合均匀得到颏舌肌悬液，进行第一次消化，第一次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，离心去上清，吸去I型胶原酶后加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，终止消化；先后使用I型胶原酶和胰酶对组织进行消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化得更均匀透彻；
(3)将所述步骤(2)终止消化后得到的颏舌肌悬液进行离心，去上清液，得到的颏舌肌碎片用原代培养基进行重悬，轻轻吹打再混匀制成悬液，然后置于培养箱中采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养，即得到所述的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞。
上述的体外培养方法，优选的，所述小鼠颏舌肌为12-16个月龄的老年C57BL/6小鼠颏舌肌；所述小鼠颏舌肌由以下方法得到：用眼科剪剪开小鼠颏下皮肤，暴露二腹肌，用弯镊分离二腹肌，用眼科剪剔除二腹肌后，暴露颏舌肌，用弯镍分离出颏舌肌后，用眼科剪将其近远心端离断，即得到所述小鼠颏舌肌。
优选的，所述步骤(1)中，所述PBS缓冲液中含体积浓度为1％的PS，且使用前先于4℃条件下预冷；将所述颏舌肌组织剪碎成0.5-1cm3大小的颏舌肌组织碎片。
优选的，所述步骤(1)中，所述I型胶原酶的质量分数为0.05％-0.1％；所述I型胶原酶为型胶原酶，分离自溶组织梭状芽胞杆菌并包装为冻干的非无菌粉末。
优选的，所述步骤(2)中，所述第一次消化的温度为37℃，消化时间为30-40min，每隔10min用吸管吹打使组织分散，离心转速为1000r/min，离心时间为10min。
优选的，所述步骤(2)中，所述第二次消化的温度为37℃，消化时间为30-40min，每隔10min用吸管吹打使组织分散，所述胰蛋白酶的质量分数为0.05％-0.25％，采用体积浓度为20％的FBS终止消化。
优选的，所述步骤(3)中，离心的转速为1000rmp，离心时间为10min。
优选的，所述步骤(3)中，所述原代培养基为含体积浓度为20％的FBS、体积浓度为1％的PS和体积浓度为0.6％的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基。
优选的，所述步骤(3)中，所述步骤(3)中，采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养的具体操作包括如下步骤：将所述悬液均匀转移至6孔板中，摇匀后置于37℃、5％CO2的培养箱中贴壁培养0.5h后，吸取上清液转移至6孔板的另一孔中继续贴壁培养，每隔0.5h转移一次，共转移3-4次，以去除先沉淀下来的成纤维细胞，3天后换传代培养基，以后每隔2天半换一次传代培养基，直到小鼠颏舌肌的成肌细胞增殖达到融合。这种采用半换液的方式，换液的同时保留细胞分泌的因子，能更好地保持细胞干性及分化潜能。
更优选的，所述传代培养基为含体积浓度为10％的FBS、体积浓度为1％的PS和体积浓度为0.6％的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基。
本发明在消化阶段先采用I型胶原酶进行第一次消化，将组织消化成组织匀浆，再使用胰蛋白酶进行第二次消化，有利于细胞从组织胶原中脱离出来，形成细胞匀浆，可以获得更多更纯的成肌细胞。同时，本发明在原代培养基和传代培养基中加入GlutaMAX，GlutaMAX能释放L-谷氨酰胺，它是细胞生长的必须氨基酸，可供细胞利用，有利于细胞生长。此外，在培养过程中，本发明采用差速贴壁培养法和半换液的方式，在给原代细胞提供能量的同时，保留住部分培养基中细胞释放的因子，以克服老年颏舌肌成肌细胞相比于年轻小鼠骨骼肌更难适应培养环境的问题，更有利于老年颏舌肌成肌细胞生长。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的体外培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的颏舌肌成肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，培养周期短，培养效率高，具有较大的推广意义。
2、本发明的体外培养方法，采用半换液的方式，换液的同时保留细胞分泌的因子，能更好地保持细胞干性及分化潜能。
3、本发明的体外培养方法，采用差速贴壁法去除成纤维细胞，不但直接有效，降低了细胞、细菌污染的同时，大大提高了目的细胞的纯度，分离细胞时即可接近90％。
4、本发明的体外培养方法，先后使用I型胶原酶和胰酶对组织进行消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是原代年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞(放大10倍)；
图2是原代年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞(放大20倍)；
图3是本发明得到的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞标记MyoD免疫荧光染色效果图；
图4是本发明得到的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的分化效果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
在本发明的实施例中，PBS为磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)；FBS为胎牛血清(fetal bovine serum)；PS为青霉素链霉素双抗溶液(penicillin-streptomycinsolution)；DMEM为含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium)。
实施例1：
一种本发明的C57BL/6小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，具体包括如下步骤：
(1)试验器具的准备：将眼科剪、弯镊、100mm培养皿、15mL离心管、移液枪和枪头用高温消毒灭菌备用；
(2)小鼠颏舌肌的提取：用步骤(1)准备好的眼科剪剪开12个月大的C57BL/6小鼠颏下皮肤，暴露二腹肌，用步骤S1准备好的弯镊，分离二腹肌，用眼科剪刀剔除二腹肌后，暴露颏舌肌，弯镍分离出颏舌肌后，用眼科剪将其近远心端离断，得到小鼠颏舌肌，小鼠颏舌肌为表面无附着膜和脂肪组织的肌肉；
(3)小鼠颏舌肌的消化及悬液制备：在培养皿中配制含1％体积PS的PBS缓冲液，且使用前先于4℃条件下预冷，将步骤(2)剪取的小鼠颏舌肌在无菌的PBS培养皿中清洗去除颏舌肌中的脂肪组织及血液后，放置于含有质量分数为0.1％的I型胶原酶的培养皿中，采用步骤(1)准备好的眼科剪，剪碎的颏舌肌组织，使得颏舌肌组织呈1cm3大小的组织碎片；收集小鼠颏舌肌组织碎片于步骤(1)准备好的15mL离心管中，轻轻吹打混合均匀得颏舌肌悬液；将悬液置于37℃下进行第一次消化，每10min用吸管吹打使组织分散，共消化30min，然后离心1000r/min×10min，去上清；吸去I型胶原酶，加入质量分数为0.05％的胰蛋白酶，在37℃下进行第二次消化，每10min用吸管充分吹打，共消化30min，最后用20％体积的FBS终止消化；
(4)颏舌肌悬液的培养：将步骤(3)终止消化后得到的颏舌肌悬液于1000rmp转速下室温离心10min，离心结束后小心去上清液，然后再用原代培养基重悬颏舌肌碎片，轻轻吹打再混匀制成悬液，采用差速贴壁培养法和半换液的方式，将悬液均匀转移至6孔板中，轻轻摇匀，标记时间后置于37℃、5％CO2的培养箱中贴壁培养0.5h后，吸取上清液转移至6孔板的另一孔中继续贴壁培养，每隔0.5h转移一次，共转移3-4次，以去除先沉淀下来的成纤维细胞，3天后换传代培养基，以后每隔2天半换一次传代培养基，直到小鼠颏舌肌的成肌细胞增殖达到融合，即得到本实施例的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞；
原代培养基为：含体积浓度为20％的FBS、体积浓度为1％的PS和体积浓度为0.6％的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基；
传代培养基为：含体积浓度为10％的FBS、体积浓度为1％的PS和体积浓度为0.6％的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基。
原代年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞分别放大10倍、20倍后，如图1和图2所示。
由图3可知，本发明得到的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞标记MyoD免疫荧光染色达80％以上；由图4可知，本发明得到的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞成肌分化良好。
说明本实施例的体外培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的颏舌肌成肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，培养周期短，培养效率高。
实施例2：
一种本发明的C57BL/6小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，具体包括如下步骤：
(1)试验器具的准备：将眼科剪、弯镊、100mm培养皿、15mL离心管、移液枪和枪头用高温消毒灭菌备用；
(2)小鼠颏舌肌的提取：用步骤(1)准备好的眼科剪剪开16个月大的C57BL/6小鼠颏下皮肤，暴露二腹肌，用步骤S1准备好的弯镊，分离二腹肌，用眼科剪刀剔除二腹肌后，暴露颏舌肌，弯镍分离出颏舌肌后，用眼科剪将其近远心端离断，得到小鼠颏舌肌，小鼠颏舌肌为表面无附着膜和脂肪组织的肌肉；
(3)小鼠颏舌肌的消化及悬液制备：在培养皿中配制含1％体积PS的PBS缓冲液，且使用前先于4℃条件下预冷，将步骤(2)剪取的小鼠颏舌肌在无菌的PBS培养皿中清洗去除颏舌肌中的脂肪组织及血液后，放置于含有质量分数为0.1％的I型胶原酶的培养皿中，采用步骤(1)准备好的眼科剪，剪碎的颏舌肌组织，使得颏舌肌组织呈0.5cm3大小的组织碎片；收集小鼠颏舌肌组织碎片于步骤(1)准备好的15mL离心管中，轻轻吹打混合均匀得颏舌肌悬液；将悬液置于37℃下进行第一次消化，每10min用吸管吹打使组织分散，共消化40min，然后离心1000r/min×10min，去上清；吸去I型胶原酶，加入质量分数为0.05％的胰蛋白酶，在37℃下进行第二次消化，每10min用吸管充分吹打，共消化40min，最后用20％体积的FBS终止消化；
(4)颏舌肌悬液的培养：将步骤(3)终止消化后得到的颏舌肌悬液于1000rmp转速下室温离心10min，离心结束后小心去上清液，然后再用原代培养基重悬颏舌肌碎片，轻轻吹打再混匀制成悬液，采用差速贴壁培养法和半换液的方式，将悬液均匀转移至6孔板中，轻轻摇匀，标记时间后置于37℃、5％CO2的培养箱中贴壁培养0.5h后，吸取上清液转移至6孔板的另一孔中继续贴壁培养，每隔0.5h转移一次，共转移3-4次，以去除先沉淀下来的成纤维细胞，3天后换传代培养基，以后每隔2天半换一次传代培养基，直到小鼠颏舌肌的成肌细胞增殖达到融合，即得到本实施例的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞；
原代培养基为：含体积浓度为20％的FBS、体积浓度为1％的PS和体积浓度为0.6％的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基；
传代培养基为：含体积浓度为10％的FBS、体积浓度为1％的PS和体积浓度为0.6％的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基。
本实施例的体外与培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的颏舌肌成肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，培养周期短，培养效率高。

Claims (6)

1.一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）剪取年老的小鼠颏舌肌，置于无菌PBS缓冲液中进行清洗，去除颏舌肌中的脂肪组织及血液，随后放置于含有I型胶原酶的培养皿中，剪碎所述的颏舌肌组织，得到颏舌肌组织碎片和I型胶原酶的混合液；所述小鼠颏舌肌为12-16个月龄的老年C57BL/6小鼠颏舌肌；所述PBS缓冲液中含体积浓度为1%的PS，且使用前先于4℃条件下预冷；所述I型胶原酶的质量分数为0.05%-0.1%；
（2）收集所述步骤（1）得到的混合液置于离心管中，轻轻吹打混合均匀得到颏舌肌悬液，进行第一次消化，第一次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，离心去上清，吸去I型胶原酶后加入胰蛋白酶进行第二次消化，第二次消化期间每隔一段时间用吸管吹打使颏舌肌组织分散，终止消化；所述胰蛋白酶的质量分数为0.05%-0.25%，采用体积浓度为20%的FBS终止消化；
（3）将所述步骤（2）终止消化后得到的颏舌肌悬液进行离心，去上清液，得到的颏舌肌碎片用原代培养基进行重悬，轻轻吹打再混匀制成悬液，然后置于培养箱中采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养，即得到所述的年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞；
所述原代培养基为含体积浓度为20%的FBS、体积浓度为1%的PS和体积浓度为0.6%的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基；
采用差速贴壁培养法和半换液的方式进行培养的具体操作包括如下步骤：将所述悬液均匀转移至6孔板中，摇匀后置于37℃、5% CO2的培养箱中贴壁培养0.5h后，吸取上清液转移至6孔板的另一孔中继续贴壁培养，每隔0.5h转移一次，共转移3-4次，3天后换传代培养基，以后每隔2天半换一次传代培养基，直到小鼠颏舌肌的成肌细胞增殖达到融合；所述传代培养基为含体积浓度为10%的FBS、体积浓度为1%的PS和体积浓度为0.6%的GlutaMAX的高糖型DMEM培养基。
2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述小鼠颏舌肌由以下方法得到：用眼科剪剪开小鼠颏下皮肤，暴露二腹肌，用弯镊分离二腹肌，用眼科剪剔除二腹肌后，暴露颏舌肌，用弯镍分离出颏舌肌后，用眼科剪将其近远心端离断，即得到所述小鼠颏舌肌。
3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中，将所述颏舌肌组织剪碎成0.5-1cm3大小的颏舌肌组织碎片。
4.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述第一次消化的温度为37℃，消化时间为30-40min，每隔10min用吸管吹打使组织分散，离心转速为1000r/min，离心时间为10min。
5.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述第二次消化的温度为37℃，消化时间为30-40min，每隔10min用吸管吹打使组织分散。
6.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中，离心的转速为1000rpm，离心时间为10min。
CN202010018934.3A 2020-01-08 2020-01-08 一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法 Active CN111117953B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010018934.3A CN111117953B (zh) 2020-01-08 2020-01-08 一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010018934.3A CN111117953B (zh) 2020-01-08 2020-01-08 一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111117953A CN111117953A (zh) 2020-05-08
CN111117953B true CN111117953B (zh) 2023-09-19

Family

ID=70488467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010018934.3A Active CN111117953B (zh) 2020-01-08 2020-01-08 一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111117953B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424813A (zh) * 2011-12-25 2012-04-25 复旦大学附属中山医院 一种高纯度小鼠骨骼肌卫星细胞的简易提取方法
CN107142242A (zh) * 2017-05-08 2017-09-08 中国人民解放军第二军医大学 一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102424813A (zh) * 2011-12-25 2012-04-25 复旦大学附属中山医院 一种高纯度小鼠骨骼肌卫星细胞的简易提取方法
CN107142242A (zh) * 2017-05-08 2017-09-08 中国人民解放军第二军医大学 一种裸鼹鼠骨骼肌成肌细胞的分离培养方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁王辉 等.大鼠颏舌肌成肌细胞的分离和鉴定.口腔医学.2015,第35卷(第7期),第523页讨论部分第1段. *
李远远 等.小鼠ERα基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其表达鉴定.口腔颌面外科杂志.2014,第24卷(第2期),第97页右栏第2段. *
王恒琨 等.HIF-1α/BNIP3信号通路对低氧下颏舌肌肌源性干细胞自噬的调控机制.中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑.2019,(第2期),第26页第1段，第29-30页实验方法第1-3部分. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111117953A (zh) 2020-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1874921B1 (en) Transplantation of differentiated immature adipocytes and biodegradable scaffold for tissue augmentation
CN106520676B (zh) 从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用
WO2016168950A1 (zh) 一种唾液腺类器官和类腺泡的体外构建方法
CN106754674A (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN108865986B (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
WO2022110676A1 (zh) 皮肤前体细胞诱导的施万细胞来源的囊泡在构建组织工程神经移植物中的应用
RU2433172C2 (ru) Способ получения гомогенной популяции стволовых клеток и ее применение
CN113549596B (zh) 一种诱导培养基及其使用方法和应用
CN110613737A (zh) 一种子宫内膜干细胞制剂的制备方法及其应用
CN112852709B (zh) 小鼠肺类器官培养方法
CN111117953B (zh) 一种年老小鼠颏舌肌来源的成肌细胞的体外培养方法
RU2384618C2 (ru) Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного
CA2535148A1 (en) Cartilage composition for transplantation
CN110016461A (zh) 一种软骨细胞体外扩增方法
CN111888529B (zh) 基于人羊膜及羊膜间充质干细胞的仿生羊膜及方法和应用
CN112725259B (zh) 一种干细胞向汗腺样细胞分化的诱导培养基和诱导方法
WO2022056991A1 (zh) 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用
CN112608904B (zh) 一种高效快速重编程体细胞为神经干细胞的方法及其应用
CN114807005A (zh) 使用动物尸体制备基质胶的方法
CN114164164A (zh) 一种表皮干细胞体外培养试剂盒及其应用
CN110693805B (zh) 一种间充质干细胞复合因子的制备方法
CN114276986A (zh) 一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用
CN111647550A (zh) 一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法
CN111662864A (zh) 一种体外诱导脐带间充质干细胞分化为真皮干细胞的方法
CN110755453A (zh) 一种用于创口皮肤修复的富含hEGF的冻干粉的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant