KR102197562B1 - 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선, 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공한다. 본 발명의 엑소좀 키트는 피부염 증상 및 이로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타내고, 피부염으로 인해 피부 상태가 병적 상태인 것을 완화, 개선 내지는 정상 상태로 회복시켜 주는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 엑소좀 키트는 이온토포레시스 작용에 의해 마스크팩, 마스크시트 또는 패취에 도포되거나 침적되어 있는 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하게 하고 피부 내부 깊숙이 침투시켜 피부염 증상 및 이와 관련하여 나빠진 피부상태를 개선 내지는 호전시키는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선, 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공하는 것에 관한 것이다.
인체의 피부는 물리적, 화학적으로 외부로부터 신체를 보호하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 수행하는 기관이다. 일반적으로 사람의 피부에 나타나는 염증성 피부질환을 피부염이라고 한다. 비교적 흔한 피부염(dermatitis)으로는 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhoic dermatitis) 등이 있다.
접촉성 피부염은 외부 물질과의 접촉에 의해 발생하는 피부염이다. 접촉성 피부염은 발생하는 기전에 따라 자극성 접촉 피부염과 알레르기성 접촉 피부염이 있으며, 한 가지 물질이 이러한 두 가지 반응을 동시에 일으킬 수 있다. 접촉성 피부염을 일으키는 물질의 대부분은 유기 화합물이다. 이러한 물질에 감작된 피부에 재차 피부염 유발 물질이 접촉하게 되면 기억세포가 이를 감지하여 여러 화학 물질이 분비되어 염증을 일으키는 것으로 알려져 있다.
아토피성 피부염은 가려움과 습진성 병변이 특징인 만성적인 염증성 피부질환이다. 지금까지의 연구결과에 따르면 아토피성 피부염의 발병에는 여러 가지 인자들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 아토피성 피부염이 유발될 경우 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil) 및 비만세포(mast cell) 같은 염증 관련 세포가 병변 부위에서 관찰되며, 비만 세포로부터 생성되는 면역글로불린 IgE가 증가한다. 또한 T 세포의 이상증식이 나타나는데, 이 과정에서 염증성 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13 등이 증가하여 면역반응을 증폭시킨다. 최근에는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)가 피부염의 중증도와 연관되어 있고, 아토피성 피부염에서 나타나는 가려움 증세의 원인이라고 알려졌다. 또한, 지루성 피부염은 피지샘의 활동이 증가되어 피지 분비가 왕성한 두피와 얼굴, 그 중에서도 눈썹, 코, 입술 주위, 귀, 겨드랑이, 가슴, 서혜부 등에 발생하는 만성 염증성 피부 질환이다.
염증 및 면역 억제를 통해 피부염 치료제를 개발하고자 하는 노력들이 있다. 현재까지 개발된 피부염 치료제로는 스테로이드, 항히스타민제, 및 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제 등이 있다. 그러나, 이들 약제는 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실, 주사 부위의 과민반응, 내성 및 호중구감소증(neutropenia) 등의 심각한 부작용을 일으키는 문제점이 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 피부염 증상의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용가능한 엑소좀 키트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26)
Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)
본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트 및 이의 응용을 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선, 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀 키트를 이용하여, 치료용을 제외한 피부염의 예방, 억제, 완화 또는 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선, 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트는, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트는, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착시키고, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 이온토포레시스 디바이스를 위치시킴으로써, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 방식으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 엑소좀 이외에, 그 작용(피부염 증상 완화 내지는 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부염 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적층되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 따르면, 상기 이온토포레시스 디바이스로부터 미세전류가 흐름으로써 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하고 피부 내부 깊숙이 침투할 수 있게 된다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트는 가려움을 수반하는 다양한 피부염의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉피부염, 접촉 두드러기 증후군, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 자가감작 피부염, 자가면역 프로게스테론 피부염, 울체 피부염, 여드름 또는 습진에 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 엑소좀 키트를 이용하여, 치료용을 제외한 피부염의 예방, 억제, 완화 또는 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부염 관련 증상 완화 내지는 개선일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 전술한 바와 같은 엑소좀 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은 (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착하는 단계와, (b) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 이온토포레시스 디바이스를 위치시키는 단계와, (c) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미용 방법에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다. 상기 (b) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행될 수 있다.
본 발명의 엑소좀 키트는 피부염 증상 및 이로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타내고, 피부염으로 인해 피부 상태가 병적 상태인 것을 완화, 개선 내지는 정상 상태로 회복시켜 주는 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 엑소좀 키트는 이온토포레시스 작용에 의해 마스크팩, 마스크시트 또는 패취에 도포되거나 침적되어 있는 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하게 하고 피부 내부 깊숙이 침투시켜 피부염 증상 및 이와 관련하여 나빠진 피부상태를 개선 내지는 호전시키는 효과를 나타낸다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따라 수득된 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 iNOS의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀에 의해 염증 반응의 일종인 NO 형성이 감소되는 것을 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 4에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀, CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀이 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성이 감소되는 것을 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 5에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 6은 THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리(co-treatment)한 경우, 친염증성 사이토카인인 IL-6의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 7 내지 도 9는 THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 전처리(pre-treatment)하고 일정 시간 배양한 다음 LPS 및 IFN-γ를 처리한 경우, 친염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 10은 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 11은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 12는 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 13은 도 12의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 엑소좀 키트를 사람 피부에 처리하고 처리 전후의 피부 상태를 비교하는 사진이다.
도 15는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 포함하는 조성물을 사람의 피부(환부)에 도포한 후 상기 조성물이 도포된 피부(환부)에 미세전류를 흘려주는 이온토포레시스를 수행한 결과, 피부염이 심한 피부(환부)의 홍반 등이 현저히 개선된 것을 보여주는 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 키트(100)의 구성을 나타내는 사시도이다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따라 수득된 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 iNOS의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀에 의해 염증 반응의 일종인 NO 형성이 감소되는 것을 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 4에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀, CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀이 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성이 감소되는 것을 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 5에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 6은 THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리(co-treatment)한 경우, 친염증성 사이토카인인 IL-6의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 7 내지 도 9는 THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 전처리(pre-treatment)하고 일정 시간 배양한 다음 LPS 및 IFN-γ를 처리한 경우, 친염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 10은 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 11은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 12는 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 13은 도 12의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 엑소좀 키트를 사람 피부에 처리하고 처리 전후의 피부 상태를 비교하는 사진이다.
도 15는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 포함하는 조성물을 사람의 피부(환부)에 도포한 후 상기 조성물이 도포된 피부(환부)에 미세전류를 흘려주는 이온토포레시스를 수행한 결과, 피부염이 심한 피부(환부)의 홍반 등이 현저히 개선된 것을 보여주는 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 키트(100)의 구성을 나타내는 사시도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
마우스 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 내지 도 1C에 도시하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
한편, 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 줄기세포 유래의 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 줄기세포 유래의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: 마크로파지 세포주를 이용한 염증 반응 측정
RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 무혈청 배지에 희석한 줄기세포 유래의 엑소좀 (실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 엑소좀 키트에 사용됨)을 적정 농도로 1~24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO 및 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양액 내의 염증 반응은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오 혹은 프로메가에서 구입)를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼대로 수행하여 LPS만을 처리한 군과 줄기세포 유래의 엑소좀이 함께 처리된 군의 염증성 사이토카인 TNF-α 양을 확인하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다. 또한, 위와 같이 처리된 RAW 264.7 세포로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하였고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 iNOS, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 변화량을 측정하였다. 상기 유전자들을 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 1과 같다.
| 유전자 | 서열 | |
| 정방향 프라이머 (5' → 3') | 역방향 프라이머 (5' → 3') | |
| TNF-α | TCT CAT CAG TTC TAT GGC CCA GAC (서열번호 1) | GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG (서열번호 2) |
| iNOS | GCT ACC ACA TTG AAG AAG CTG GTG (서열번호 3) | CCA TAG GAA AAG ACT GCA CCG AAG (서열번호 4) |
| GAPDH | GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG (서열번호 5) | CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT CAT (서열번호 6) |
| IL-6 | GCC AGA GTC CTT CAG AGA GAT ACA (서열번호 7) | ATT GGA TGG TCT TGG TCC TTA GCC (서열번호 8) |
| IL-1β | GCA ACG ACA AAA TAC CTG TGG CCT (서열번호 9) | AGT TGG GGA ACT CTG CAG ACT CAA (서열번호 10) |
우선, 도 3에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 발현량이 감소하였고, NO 생성효소인 iNOS의 mRNA 발현량이 감소하였다.
다음으로, 도 4에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀이 피부염의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용한 기능적 활성, 즉 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 감소시키는 활성을 가지며, 본 발명의 엑소좀 키트는 피부염의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
실시예 6: THP-1 단핵구를 이용한 항염증 효과 확인
THP-1 단핵구(THP-1 human monocyte)를 대식세포로 분화시킨 후 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀의 항염증 효과를 다음과 같이 확인하였다.
THP-1 단핵구를, 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 100nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-myristate 13-acetate)(Sigma에서 구입)가 첨가된 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 12웰 플레이트에 6×105 세포/mL의 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하여 THP-1 유래 대식세포(THP-1 derived macrophage)로 분화를 유도하였다. 이후 분화된 세포를 PBS로 1회 세척하고, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화하였다.
동시처리(co-treatment) 실험군의 경우, THP-1 유래 대식세포에 대해 FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배지와 100 ng/mL LPS(sigma 에서 구입) 및 20 ng/mL IFN-γ(Peprotech에서 구입)를 처리하여 THP-1 유래 대식세포를 활성화시키고, 또한 양성대조군인 덱사메타손(Sigma에서 구입) 또는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 처리하여 24시간 배양하였다. 한편, 전처리(pre-treatment) 실험군의 경우, THP-1 유래 대식세포에 대해 FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배지와 양성대조군인 덱사메타손(Sigma에서 구입) 또는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 처리하여 24시간 배양한 다음, 100 ng/mL LPS(sigma 에서 구입) 및 20 ng/mL IFN-γ(Peprotech에서 구입)를 처리하고 4시간 동안 배양하여 THP-1 유래 대식세포를 활성화하였다.
배양이 끝난 THP-1 유래 대식세포(THP-1 derived macrophage)로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 친염증성 사이토카인(Pro-inflammatory Cytokine)인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현량을 측정하였다. 상기 유전자들을 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH를 사용하였다. PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 2와 같다.
| 유전자 | 서열 | |
| 정방향 프라이머 (5'→3') | 역방향 프라이머 (5'→3') | |
| IL-6 | AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA (서열번호 11) | TGTCCTGCAGCCACTGGTTC (서열번호 12) |
| IL-1β | ACCTGTCCTGCGTGTTGAAAGATG (서열번호 13) | TGGGCAGACTCAAATTCCAGCTTG (서열번호 14) |
| TNF-α | CTGCCTGCTGCACTTTGGAG (서열번호 15) | ACATGGGCTACAGGCTTGTCACT (서열번호 16) |
| GAPDH | CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC (서열번호 17) | GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT (서열번호 18) |
도 6에 도시된 바와 같이, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리(co-treatment)한 경우, 음성대조군에 비해 친염증성 사이토카인인 IL-6의 mRNA 발현량이 감소하였다. 또한, 도 7 내지 도 9에 도시된 바와 같이, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ 처리 전에 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 전처리(pre-treatment)한 경우, 음성대조군에 비해 친염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현량이 감소하였다. 친염증성 사이토카인인 IL-6, IL-1β 및 TNF-α는 친염증성 M1 대식세포에서는 발현이 증가하고 항염증성 M2 대식세포에서는 발현이 감소한다.
따라서, 상기 결과들은 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀이 염증반응 및 이로 인한 피부염 증상을 억제, 완화 및 감소시킬 수 있는 것을 시사하며, 또한 본 발명의 엑소좀 키트가 피부염의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는 것임을 강력히 뒷받침하는 결과라고 할 수 있다.
실시예 7: 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀의 피부 투과 능력 시험
형광염색된 엑소좀을 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 엑소좀(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)으로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(ThermoFisher Scientific에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과 엑소좀과 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후, PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 10).
PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 또한, PKH-엑소좀을 돼지 피부 바깥면에 도포하고 부직포를 덮어 준 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 이상의 방법으로 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조). 도 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀은 표피를 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀 키트는 피부염의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료 등에 있어서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
다음으로, 헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 또한, PKH-엑소좀을 부직포와 피부조직 사이에 주입한 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 12 및 도 13 참조).
이상의 실험결과들을 종합하면, 본 발명의 엑소좀 키트를 피부에 적용할 경우, 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하여 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료 등에 있어서 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.
실시예 8: 사람 피부에 대한 엑소좀 키트의 처치
도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 키트(100)는 액상 침적 시트 마스크(10)(줄기세포 유래의 엑소좀을 함유하는 조성물이 도포되거나 침적된 흰색 시트 마스크)와 이온토포레시스 디바이스인 경피투과 촉진 시트 마스크(은색 시트 마스크)(20)로 구성되어 있다. 액상 침적 시트 마스크(10)의 표면 내지는 내부에는 줄기세포 유래의 엑소좀(12)이 도포되거나 침적되어 있다. 또한, 경피투과 촉진 시트 마스크(20)에는 미세전류를 발생시키는 전지(22)가 장착되어 있고, 이러한 전지(22)와 전기적으로 연결되어 있는 도전성 패턴(24)이 경피투과 촉진 시트 마스크(20) 상에 형성되어 전지(22)로부터 발생된 미세전류를 경피투과 촉진 시트 마스크(20) 전반에 골고루 전달할 수 있다. 도전성 패턴(24)은 금, 은, 또는 구리 등의 도전성 금속이 프린팅되거나 도금(plating)되어 형성된다.
상기와 같은 구성을 갖는 "엑소좀 키트(100)"를 피부염 증상과 관련이 있는 홍조 증상과 피부 트러블이 심한 사람(이하, "case 1"이라 함)의 얼굴에 1회 적용하여 피부염으로 인한 피부 트러블과 홍조 증상이 완화 내지는 개선되는지를 평가하였다. 또한, 본 발명의 엑소좀 키트(100)를 피부염 증상과 관련이 있는 홍조 증상이 있는 사람(이하, "case 2"라 함)의 얼굴에 1회 적용하여 전체적인 피부톤과 홍조 증상이 개선되는지를 평가하였다. 5×105 입자의 엑소좀(12)이 포함된 액상 침적 시트 마스크(10)를 눈과 입 부분에 맞추어 case 1 및 2의 얼굴 전체에 고르게 밀착시킨 다음, 약 0.3~0.4 mA의 미세 전류가 흐르도록 액티베이션된 경피투과 촉진 시트 마스크(20)를 액상 침적 시트 마스크(10) 위에 적층시켜 25~30분 정도 사용하였다.
그 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀(12)을 5×105 입자/마스크의 농도로 함유하는 액상 침적 시트 마스크(10)와 경피투과 촉진 시트 마스크(20)로 구성된 "엑소좀 키트(100)"의 한번의 사용만으로 "case 1"에서 홍조 및 피부 트러블이 현저히 개선되었고(도 14의 case 1 참조), "case 2"에서도 전체적인 피부톤이 개선되었으며 홍조가 완화되었다(도 14의 case 2 참조). 따라서, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물이 침적된 액상 침적 시트 마스크(10)와 경피투과 촉진 시트 마스크(이온토포레시스 디바이스)(20)로 구성된 본 발명의 엑소좀 키트(100)는 피부염 증상과 이와 관련이 있는 홍조 증상 및 피부트러블을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
또한, 줄기세포 유래의 엑소좀을 0.29×108 입자/mL의 농도로 함유하는 조성물(엑소좀 현탁액)을, 가려움증을 호소하는 중증 아토피 환자 3인의 환부(손, 목, 팔 등)에 도포한 후 이온토포레시스 장비(IONZYME DF MACHINE)(Environ에서 구입)를 사용하여 상기 조성물이 도포된 환부에 20분 동안 0.4 mA의 미세전류를 흘려주는 이온토포레시스를 수행하였다. 상기와 같은 처치를 2주 동안 주3회에 걸쳐 시행한 결과, 환자들의 극심한 가려움증이 현저히 완화되었고, 홍반 증상 역시 현저히 개선되었다(도 15). 줄기세포 유래의 엑소좀을 함유하는 조성물을 적용한 환자들 모두 극심한 가려움증과 홍반이 완화되어 스테로이드나 항히스타민 제제의 처방을 중단해도 될 정도로 증상이 개선되었다.
따라서, 본 발명의 엑소좀 키트(100)는 상기와 같은 임상시험을 통해 확인되는 바와 같이 피부염 및 이와 관련된 증상의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
100: 엑소좀 키트
10: 액상 침적 시트 마스크 12: 줄기세포 유래의 엑소좀
20: 경피투과 촉진 시트 마스크 22: 전지
24: 도전성 패턴
10: 액상 침적 시트 마스크 12: 줄기세포 유래의 엑소좀
20: 경피투과 촉진 시트 마스크 22: 전지
24: 도전성 패턴
<110> ExoCoBio Inc.
<120> New use of exosome kit comprising exosomes derived from stem
cells
<130> P18-0060KR
<150> KR 10-2017-0114487
<151> 2017-09-07
<150> KR 10-2018-0017355
<151> 2018-02-13
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha forward primer
<400> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> iNOS forward primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS reverse primer
<400> 4
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<220>
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<400> 6
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<223> IL-1beta (THP-1) reverse primer
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<223> GAPDH (THP-1) reverse primer
<400> 18
gtagaggcag ggatgatgtt ct 22
Claims (7)
- 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와,
상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스가 구비된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취로서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와는 별도로 분리되어 준비되는 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포함하되,
사용 시에는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착시키고, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층시킴으로써, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 것을 특징으로 하는, 피부염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 엑소좀 키트. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하는, 엑소좀 키트. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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2018
- 2018-08-28 KR KR1020180101494A patent/KR102197562B1/ko active IP Right Grant
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