CN112941026B - 基于密度梯度离心提取细胞内体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，所述方法包括以下步骤：将含有内体的细胞膜破坏获取去核后上清液，将去核后上清液缓慢添加至蔗糖梯度溶液液面，然后进行离心，离心结束后从管底自溶液密度由高至低收集分离液即可获得含有内体的溶液，所述蔗糖梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的浓度范围为15％‑40.6％。本发明方法可以更快速获得更高纯度的内体，获得的内体可以用于研究经内体途径内吞的各类分子。

Description

基于密度梯度离心提取细胞内体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于密度梯度离心提取细胞内体的方法。
背景技术
外来物质在被细胞内吞后，大多数都会经过内体途径。内体为外来物质到达溶酶体降解之前的分选提供了环境。外来物质被内吞后首先形成内吞囊泡，有的囊泡初期会附有包被蛋白，而一旦内吞囊泡去包被，它们就会与早期的内体融合。早期的内体随后在与溶酶体融合之前成熟为晚期的内体。一些物质直接从早期的内体再循环到质膜，但大多数通过循环内体循环。
内体有三种不同类型：早期内体，晚期内体和循环内体。它们的区别在于胞吞材料到达其所需的时间和其上的标记蛋白Rab(一种小分子GTP酶)有所不同。它们也具有不同的形态。早期内体由动态的管状小泡网络组成(直径最大为1μm的小泡，连接的小管直径约为50nm)。标记物包括Rab5A和Rab4，转铁蛋白及其受体和EEA1。晚期内体，也称为MVB，主要是球形的，缺乏小管，并且包含许多密集的腔内囊泡。标记物包括Rab7，Rab9和甘露糖6-磷酸受体。循环内体主要集中在微管组织中心，由一个主要的管状网络组成，标记物为Rab1。
密度梯度离心可用于分离细胞内细胞器，在离心过程中，细胞器会漂浮或沉淀，直到它们到达梯度内的等密度位置。细胞器的密度取决于其内容物，大小，形状和脂质：蛋白质比例。密度梯度离心已经广泛应用于线粒体、溶酶体等细胞器的提取，但在内体提取、验证方面还没有完整可靠的实验方案。内体提取技术可以应用于研究各个不同内吞时期的物质的变化或用于富集快速内吞的部分物质。
在前人研究中，细胞膜破坏多用超声波破碎或电动匀浆方法，但超声破碎法产热明显，且这两种方法容易破坏细胞器结构和细胞内的大分子复合物，不利于内体结构完整性的保留和提取效果的验证。所以建立一种能保存内体完整性且操作简便的提取方法是很有必要的。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，用于解决现有技术中细胞内体提取困难的问题。
为了解决上述问题，本发明一方面提供了基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，所述方法包括以下步骤：
将含有内体的细胞膜破坏获取去核后上清液，将去核后上清液缓慢添加至蔗糖梯度溶液液面，然后进行离心，离心结束后从管底自溶液密度由高至低收集分离液即可获得含有内体的溶液，所述蔗糖梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的浓度范围为15％-40.6％。
进一步地，所述细胞膜破坏获取去核后上清液的方法选自以下任一：
a)将细胞计数离心后，添加缓冲液，转移进匀浆器中研磨，然后倒出研磨好的液体离心获得去核后上清；或
b)将细胞计数离心后，添加缓冲液，用注射器吸取液体，反复吹吸，然后将液体离心获得去核后上清。
进一步地，所述研磨次数为10-30次。
进一步地，所述注射器为1ml注射器，针头大小为23-27G，吹吸次数为15-20次。
进一步地，所述步骤a)或者步骤b)中离心条件为1600-2000g，8-12min，4℃。
进一步地，所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度梯度为连续浓度梯度或者不连续浓度梯度。
进一步地，所述不连续浓度梯度的配制方法为逐层叠加法。根据所要处理细胞的种类不同，其内体在蔗糖溶液中的密度分布也不同。例如，配制三个浓度蔗糖溶液，最低浓度范围在15％-25％，中间浓度范围在25％-35％，最高浓度范围在30.6％-40.6％，其中具体浓度根据细胞种类决定。然后用从下至上、从低浓度至高浓度的顺序，逐层叠加溶液。
更进一步地，针对不连续浓度梯度蔗糖溶液，离心条件为120,000g-150,000g，16-18h，4℃，使用水平转子，且加速度、减速度均调至最低。
进一步地，所述连续浓度梯度的配制方法为逐层冷冻再复融法。例如
分别配制10％-15％的低浓度溶液、35％-40％的高浓度溶液，具体浓度根据细胞种类决定。按体积比2：1和1：2分别混合两种溶液，先加1体积高浓度溶液在管底，置-20℃冷冻，然后加1体积的2：1的溶液冷冻，再加1体积的1：2的溶液冷冻，最后加1体积低浓度溶液冷冻，使用前一天复融，使其自然形成梯度。
更进一步地，针对连续浓度梯度蔗糖溶液，离心条件为18,000g-210,000g，3-4h，4℃，使用水平转子，且加速度、减速度均调制最低。
进一步地，所述从管底自溶液密度由高至低收集分离液采用蠕动泵，蠕动泵流速为0.5-1ml/min。吸出分离液时从底端向顶端(高密度到低密度)吸出
本发明的另一方面提供了上述方法分离提取的内体。
如上所述，本发明的基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，具有以下有益效果：
本发明方法可以更快速获得更高纯度的内体，获得的内体可以用于研究经内体途径内吞的各类分子。
附图说明
图1为连续密度梯度提取方法蛋白免疫印迹(western blot)结果图。
图2为不连续密度梯度提取方法蛋白免疫印迹(western blot)结果图。
图3为分离液密度分布图。
图4为纳米颗粒跟踪分析(nanosight)结果图。
其中，左图为内体分离液的粒径分部图。
右图为检测统计数据，包括粒子浓度、粒径峰值及90％粒子粒径均值。
图5为120kV透射电镜(TEM)内体表征图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
本发明中，缩写符号表示如下：
缩写名称 中文全称
PDI 粒径分布系数
EDTA 乙二胺四乙酸
HB 匀浆缓冲液
PBS 磷酸缓冲液
PNS 去核后上清液
NC 硝酸纤维素膜
SDS 十二烷基硫酸钠
实施例1jurkat细胞的均质化
1.1试剂的准备
HB：250mM蔗糖，3mM咪唑，1mM EDTA溶于超纯水。使用前按1/100的比例添加蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物；
PBS：取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。
1.2均质化方法——杜氏匀浆器匀浆法：
a)将Jurkat细胞取出后离心，用4℃预冷的PBS重悬，细胞计数，取7×107个细胞。600g离心5min，4℃，弃上清。
b)加1ml添加了酶抑制剂的HB重悬细胞。转移进杜氏匀浆器中，匀浆25次。
c)倒出研磨好的匀浆，用HB稀释匀浆液，匀浆：HB＝1：0.7，然后2000g离心10min，收集上清，同样条件再离心一次。收集上清即为PNS。
实施例2超速离心获取分离液
2.1试剂的准备
蔗糖梯度溶液：15％蔗糖溶液，取0.45M蔗糖，3mM咪唑溶于超纯水；40％蔗糖溶液，取1.375M蔗糖，3mM咪唑溶于超纯水。
2.2操作步骤——蔗糖连续梯度分离
a)分别配制15％和40％浓度的蔗糖溶液，然后按体积比2：1和1：2分别混合两种溶液；
b)先加2.5ml 40％溶液在离心管底，置-20℃冰箱冷冻，然后加2：1的溶液2.5ml冷冻，再加1：2的溶液2.5ml冷冻，最后加等量15％溶液冷冻；
c)使用前一天将离心管放4℃冰箱复融，蔗糖溶液自然形成梯度；
d)将PNS缓慢加至蔗糖梯度溶液液面，保证每支离心管填满液体，无空气。使用Beckman超高速离心机水平转子离心，离心管规格为12ml。离心条件为150,000g，16h，4℃，加速度、减速度均为1；
e)离心结束后用蠕动泵从管底溶液密度由高至低开始收集分离液，蠕动泵流速调为1ml/min，每1ml收集一管分离液，共收集12管。
蔗糖不连续梯度分离
a)分别配制3.5ml的25％，35％，40.6％三种由低到高不同浓度的蔗糖溶液；
b)使用带25G，120mm规格不锈钢长针头的注射器将25％浓度溶液加入离心分离管中，然后将针头沿管壁伸至离心管底部，缓慢加入35％浓度溶液，同理加入40.6％浓度溶液，可见液面间清晰分界线；
c)将PNS缓慢加至蔗糖梯度溶液液面，保证每支离心管填满液体，无空气。使用Beckman超高速离心机水平转子离心，离心管规格为12ml。离心条件为210,000g，4h，4℃，加速度、减速度均为1；
d)离心结束后用蠕动泵从管底溶液密度由高至低开始收集分离液，蠕动泵流速调为1ml/min，每1ml收集一管分离液，共收集12管。
实施例3几种方法验证内体所在位置及内体的表征
3.1蛋白免疫印迹(western blot)检测内体所在位置
3.1.1试剂的准备
生物试剂：anti-rabbit rab7 antibody，Thermo fisher micro BCA kit，Thermofisher protein ladder；
碧云天快速凝胶试剂盒；
BeyoECL Plus试剂盒；
RIPA裂解液；
1×蛋白电泳缓冲液(running buffer)：3.03g Tris，18.77g甘氨酸，1g SDS，定容至1L；
5×蛋白上样缓冲液(loading buffer)：0.6ml 1M Tris-HCl，5ml 50％甘油，2ml10％SDS，1ml 1％溴酚蓝；
1×转膜缓冲液(transfer buffer)：甘氨酸14.4g，Tris 3.03g，加水至400ml溶解，再加200ml甲醇，定容至1000ml，4℃冰浴；
TBST溶液：10×TBS缓冲液(Tris-base 12.1g，NaCl 40g，PH 7.6)100ml,tween201ml，加去离子水定容至1L；
封闭液：将10g脱脂奶粉溶于200ml 1×TBST溶液中，制成5％脱脂牛奶。
3.1.2操作步骤
a)向上述所获每管分离液中均加入100ul RIPA裂解液，冰上放置10min，然后10,000g离心5min，取上清；
b)用BCA试剂盒测定每管中的蛋白总含量；
c)以未经处理的jurkat细胞全蛋白为阳性对照，向所有样品中加入蛋白上样缓冲液，沸水中煮5min使蛋白变性。每孔上样10ug蛋白；
d)配制12％分离胶，上样完成后以120v，60min条件进行电泳；
e)使用NC膜进行转膜，转膜条件为200mA，60min；
f)转膜完成后先用封闭液4℃封闭膜过夜，再将anti-rabbit Rab7 antibody一抗按1：1000体积比用配套稀释液稀释，室温摇床孵育1h。然后用TBST溶液进行脱色，洗3次，每次10min。再用1：1000体积比稀释后的二抗HRP-labeled goat anti-rabbit lgG与膜室温摇床孵育1h，然后TBST溶液进行脱色，洗3次，每次10min。
g)用化学发光显影试剂盒BeyoECL Plus试剂盒及荧光成像仪检测印迹条带。
3.1.3结果分析
见图1和2，分离液从1-12编号，顺序为密度从高到低，其中M代表marker，T代表未经处理的全细胞蛋白阳性对照。图1中，从WB结果可以看出7，8，9号样品有明显条带，判断为内体所在位置，1，2，3号样品有微弱条带，判断为可溶蛋白所在位置。
图2中，从WB结果可以看出，1，2，3号样品为可溶蛋白所在位置，此外仅8号样品有不完整条带，全蛋白量(T条带)明显高于各样品蛋白总量，所以推测蛋白有一定程度降解，无法确认内体位置。
3.2纳米颗粒跟踪分析仪(nanosight)检测内体大小及浓度
3.3.1操作步骤
将上一步WB检测证明含有内体的几管分离液7，8，9合并，稀释10倍，体积1ml，上样至nanosight观察粒径分布情况。
3.3.2结果分析
见图3-4，分离液的粒子浓度为4.2×108，而细胞上样总量为7×107个，说明细胞成功被裂解并获取了胞内含物。而粒径峰值为211nm，90％粒子平均粒径为315nm，符合文献中提到内体粒径在200-1000nm间的数据，因此可以判断该分离液中包含有内体。
3.3透射电镜(120kV TEM)表征内体大小及形状
3.3.1试剂的准备
磷钨酸染色液：用磷酸缓冲液将磷钨酸配置成1％浓度溶液。
3.3.2操作步骤
a)取确定含有内体的7，8，9号样品合并分离液2ul，滴加至铜网上；
b)取磷钨酸染色液一滴滴加至铜网上，2min后用剪成尖角的滤纸吸去染色液，再滴一滴超纯水在铜网上，用滤纸吸去，反复两次以吸去多余染料，然后静置干燥，镜下观察。
3.3.3结果分析
见图5，内体可见清晰膜结构，粒径在200nm左右，较小，因此判断该视野下的内体为早期内体而非晚期内体。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，所述方法包括：
将含有内体的细胞膜破坏获取去核后上清液，将去核后上清液缓慢添加至蔗糖梯度溶液液面，然后进行离心，离心结束后从管底自溶液密度由高至低收集分离液即可获得含有内体的溶液，所述蔗糖梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的浓度范围为15％～40.6％；
所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度梯度为连续浓度梯度，所述连续浓度梯度的配制方法为逐层冷冻再复融法，
所述逐层冷冻再复融法为分别配制10％～15％的低浓度溶液、35％～40％的高浓度溶液，按体积比2：1和1：2分别混合两种溶液，先加1体积高浓度溶液在管底，冷冻，然后加1体积的2：1的溶液冷冻，再加1体积的1：2的溶液冷冻，最后加1体积低浓度溶液冷冻，使用前复融，使其自然形成梯度，所述细胞为Jurkat细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞膜破坏获取去核后上清液的方法选自以下任一：
将细胞离心后，添加缓冲液，转移进匀浆器中研磨，然后倒出研磨好的液体离心获得去核后上清；或
将细胞离心后，添加缓冲液，用注射器吸取液体，反复吹吸，然后将液体离心获得去核后上清。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述研磨次数为10～30次。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述注射器为1ml注射器，针头大小为23～27G，吹吸次数为15～20次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a)或者步骤b)中离心条件为1600～2000g，8～12min，4℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述从管底自溶液密度由高至低收集分离液采用蠕动泵，蠕动泵流速为0.5～1ml/min。
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