CN108088831A - 基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法 - Google Patents

基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法，先利用磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯等脂质，以及荧光染料来制备带有荧光的脂质体；将带有荧光的脂质体分别与血清、血浆及尿液样本混合后使用不同的分离方法，包括超速离心、膜亲和法、聚合物沉淀及色谱等方法进行囊泡分离；对分离得到的囊泡进行荧光测定。通过原始脂质体的荧光强度及分离得到的囊泡中的荧光强度即可计算不同方法囊泡的提取效率及不同临床样本处理过程中的提取效率。本发明利用荧光脂质体来评估囊泡的提取效率，为囊泡应用于临床需求的稳定质控体系提供了强有力的技术支持，同时提供了一种肉眼即可观察跟踪囊泡分离过程的有效方法。

Description

基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法
技术领域
本发明涉及分析检验技术领域，具体地说，涉及一种基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles,EVs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles,MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是其中的外泌体。
外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。
囊泡分离是其应用的关键环节，根据囊泡的大小、密度及生物学特征，其主要的方法包括超速离心、梯度密度离心、聚合物沉淀、膜亲和、色谱法及免疫磁珠捕获等方法。基于这些基础原理，近些年囊泡分离的技术层出不穷，然而针对囊泡分离提取效率评估，特别是可以用于临床样本分离提取效率评估质控的方法并不成熟。目前主要利用Western Blot、NTA(或DLS)及电镜等方法对不同囊泡分离方法进行评估。这些方法要么费时要么需要特殊的设备，需求样本量大，操作繁琐且没法准确定量，无法有效用于临床样本囊泡分离效率的评估和质控。
发明内容
本发明的目的是提供一种带有荧光或有色染料的脂质体及其应用。
本发明的另一目的是提供一种基于脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种带有荧光或有色染料的脂质体，所述带有荧光或有色染料的脂质体是将具有磷脂双分子层结构的脂质体与荧光染料或有色染料结合得到的。
本发明中，用于形成磷脂双分子层结构的脂质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇及鞘磷脂等中的至少一种。
所述脂质体中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯的摩尔比为5-8:1-3:1-3，优选7:1.5:1.5。
本发明所用荧光染料优选Fluorescein DHPE。此外还可以使用Fluorescein、Hydroxycoumarin、R-Phycoerythrin及FluorX等荧光染料，或用这些荧光染料修饰的脂质。
本发明提供的带有荧光或有色染料的脂质体中，所述荧光染料占脂质摩尔总量的1％～20％。
本发明提供的带有荧光或有色染料的脂质体粒径大小为30-1000nm(优选30-150nm)，平均密度为1.06-1.23g/mL。
本发明提供的带有荧光或有色染料的脂质体的直观图及鉴定结果如图1所示。其粒径大小、密度、电镜图像可以与囊泡一致，能够模拟囊泡的特征，其带有的荧光或有色染料可以利用检测荧光或吸收光的酶标仪进行检测。
本发明带有荧光或有色染料的脂质体可按如下方法制备：
S1、通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体：用密封的玻璃注射器将适量氯仿加入玻璃瓶内；然后用密封的玻璃注射器添加适量甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将用于形成磷脂双分子层结构的各种脂质依次加入上述玻璃瓶内，再加入荧光或有色染料；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内以去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入适量PBS缓冲液，通过过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；
S2、游离荧光染料的去除：将上述得到的脂质体转入超速离心管，进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存。
具体制备方法如下：
1)通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体：用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的Fluorescein DHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；
2)游离荧光染料的去除：将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。
优选地，所述制备方法为：
(1)通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体：用250μL密封的玻璃注射器将100μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加30μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱216μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺42μL和11mg/mL胆固醇酯20μL依次加入上述玻璃瓶内；加入0.2mmol的Fluorescein DHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液2mL，通过孔径100nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；
(2)游离荧光染料的去除：将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。
本发明还提供所述带有荧光或有色染料的脂质体在囊泡分离效率评估和质控中的应用。
本发明进一步提供基于上述脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法，按照每1～4mL血浆样本加入40μL脂质体，或者每20～100mL尿液样本加入40μL脂质体，或者每2～7mL胸腹水样本加入40μL脂质体的量，或者每1～3mL唾液样本加入40μL脂质体的量，或者每2-7mL乳汁样本加入40μL脂质体的量，将采集的样本与浓度为0.05-100mg/mL的类似囊泡粒径大小的脂质体(根据待评估的囊泡类型，采用特定分布的脂质体，例如，在评估外泌体分离效率时，采用粒径分布在30～150nm的荧光脂质体)进行混合，用特定的方法进行囊泡的分离，分别测定原始脂质体以及不同分离方法得到的囊泡(实为囊泡和脂质体的混合物)中的荧光强度；然后用得到囊泡中的荧光强度除以原始脂质体的荧光强度，即可得到相应的特定方法对实际临床样本中囊泡的分离提取效率。
优选地，所述特定的方法选自超离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠捕获法等。
前述的方法，可采用酶标仪测定原始脂质体以及不同分离方法得到的囊泡中的荧光强度。
本发明的囊泡来自于正常人及肿瘤患者的体液，所述体液包括血液、尿液等。
本发明方法特别适合于外泌体分离效率的评估和质控。
本发明先通过恒压力控制挤出的方法利用磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、氯仿及荧光染料(Fluorescein DHPE)来制备带有荧光的脂质体；去除体系中游离荧光染料后，测定脂质体的粒径大小、荧光强度。将带有荧光的脂质体分别与PBS、无外泌体血清、血清、血浆及尿液混合后使用不同的分离方法，包括超速离心、膜亲和法(Qiagen ExoEasy)、聚合物沉淀(SBI Exoquick)及色谱等方法进行囊泡分离；对分离得到的囊泡进行荧光的测定。通过原始脂质体的荧光强度及分离得到的囊泡中的荧光强度即可计算不同方法囊泡的提取效率及不同临床样本处理过程中的提取效率。整体流程如图2所示。
本发明利用荧光脂质体来评估囊泡的提取效率，为囊泡应用于临床需求的稳定质控体系提供了强有力的技术支持，同时提供了一种肉眼即可观察跟踪囊泡分离过程的有效方法。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(一)本发明可以快速(10分钟内)评估不同囊泡分离方法(包括超速离心、膜亲和法、聚合物沉淀及色谱法)的提取效率；
(二)本发明可准确地对囊泡的提取效率进行定量；
(三)本发明可以用于每个临床样本囊泡分离的效率评估和质控，不影响下游的DNA、RNA及蛋白的测定。
附图说明
图1为本发明中荧光脂质体中的实物图(A)及电镜(TEM)鉴定结果(B)。
图2为本发明基于荧光脂质体的囊泡分离效率评估和质控方法的整体流程示意图。
图3为本发明实施例3中不同分离方法在血清中的囊泡提取效率结果比较。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1荧光脂质体的制备
1、通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体
使用250μL密封的玻璃注射器将100μL氯仿转移到玻璃小瓶(容积20mL)；使用100μL密封的玻璃注射器添加30μL甲醇至相同的玻璃小瓶；转移216μL 10mg/mL的磷脂酰胆碱、42μL 10mg/mL的磷脂酰乙醇胺和20μL 11mg/mL胆固醇酯及0.2mmol的Fluorescein DHPE至上述玻璃瓶里；使用慢流速的氮气挥发有机溶剂直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃小瓶放置在真空干燥器至少30分钟去除残留溶剂；加入2ml PBS缓冲液，通过孔径100nm的过滤器即可得到类似囊泡(外泌体)粒径大小的脂质体。
2、游离于脂质体外的荧光染料的去除
将上述得到的脂质体转入超速离心管，使用100000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，放置4℃保存。还可以将上述得到的脂质体转入50KD或者100KD的超滤管，使用PBS反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。
实施例2脂质体的鉴定
取实施例1制备的脂质体40μL，用PBS缓冲液稀释至200μL，用马尔文激光粒度仪Zetasizer Nano ZS进行脂质体的粒径测定，并记录结果。取10μL脂质体用dd H2O按1:10体积比稀释；将稀释液体转至碳膜上吸附10min，再采用DI水清洗，醋酸双氧铀UO2(CH3COO)2·2H2O，染色1分钟后利用透射电镜(TEM)，型号：JEOL-JEM1400进行脂质体形态的直观检测，并拍照记录。
结果表明，所得脂质体的粒径大小为30-150nm，平均密度为1.06-1.23g/mL。
实施例3脂质体用于评估不同囊泡分离方法的提取效率
分别取实施例1制备的1mg/ml脂质体40μL，用PBS稀释至250μL，加入750μL正常人血清，分别用超速离心[参见Théry C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolation andCharacterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and BiologicalFluids[M]//Current Protocols in Cell Biology.John Wiley&Sons,Inc.2006:Unit3.22.]、膜亲和(Qiagen exoEasy)[参见Enderle D,Spiel A,Coticchia C M,etal.Characterization of RNA from Exosomes and Other Extracellular VesiclesIsolated by a Novel Spin Column-Based Method[J].Plos One,2015,10(8):e0136133.]、聚合物沉淀(SBI Exoquick)[参见Tang Y T,Huang Y Y,Zheng L,etal.Comparison of isolation methods of exosomes and exosomal RNA from cellculture medium and serum:[J].International Journal of Molecular Medicine,2017,40(3):834.]，按照产品经典的protocol进行囊泡的分离，使用酶标仪分别测定原始脂质体及不同分离方法得到的囊泡中的荧光强度；用得到囊泡中的荧光强度除以原始脂质体的荧光强度，即可得到血清中不同方法提取囊泡的效率，结果见图3。
实施例4脂质体用于评估不同临床样本囊泡分离的提取效率
按照每1mL血浆样本加入40μL脂质体，或者每50mL尿液样本加入40μL脂质体，或者每5mL胸腹水样本加入40μL脂质体的量，或者每2mL唾液样本加入40μL脂质体的量，或者每4mL乳汁样本加入40μL脂质体的量，将采集的样本与实施例1制备的浓度为1mg/mL的类似囊泡粒径大小为30～150nm的脂质体进行混合，用特定的方法进行囊泡的分离，使用酶标仪分别测定原始脂质体及不同分离方法得到的囊泡中的荧光强度；用得到囊泡中的荧光强度除以原始脂质体的荧光强度，即可得到特定方法在实际的临床样本中囊泡的提取效率。
实施例5脂质体评估患者样本血浆外泌体分离的提取效率
分别取前列腺癌和肺癌患者血浆各2ml，13000g离心30min去除凋亡小体及大型囊泡，加入实施例1制备的浓度为1mg/mL粒径分布在30～150nm之间的荧光脂质体40μL，用PBS稀释至20ml，用0.2um滤膜过滤后，以100000g离心2h后，去掉上清，将沉淀用PBS重悬转至1.5ml超离管，100000g离心1h后去除上清，沉淀用100μL PBS重悬，测定40μL荧光脂质体的初始荧光及患者血浆分离得到的外泌体中的荧光，计算得到两步超离分离外泌体的效率分别为8.27％(前列腺癌患者血浆)和8.54％(肺癌患者血浆)，低于血清中的分离效率10.47％(图3中正常人血清二次超离分离效率)。这是因为血浆黏度要高于血清黏度，同等条件下，血浆中的外泌体更难沉降所致。
实施例6脂质体评估尿液样本外泌体分离的提取效率
取前列腺癌患者尿液2管，20ml/管，3000g离心15min去掉细胞后，13000g离心30min去掉凋亡小体和大型囊泡，加入实施例1制备的浓度为1mg/mL粒径分布在30～150nm之间的荧光脂质体40μL，用0.2um的滤膜过滤后，分别使用两步超速离心和Qiagen ExoEasy试剂盒分离尿液中的外泌体。测定初始荧光和分离得到外泌体中的荧光，得到超离分离效率为12.34％，ExoEasy分离效率为48.53％。尿液样本的黏度相对血浆要低，而且外泌体的浓度要低，有更好的沉降效率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种带有荧光或有色染料的脂质体，其特征在于，所述带有荧光或有色染料的脂质体是将具有磷脂双分子层结构的脂质体与荧光染料或有色染料结合得到的；
其中，用于形成磷脂双分子层结构的脂质选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、胆固醇酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇及鞘磷脂中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯的摩尔比为5-8:1-3:1-3，优选7:1.5:1.5。
3.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述荧光染料选自Fluorescein DHPE、Fluorescein、Hydroxycoumarin、R-Phycoerythrin、FluorX，或用这些荧光染料修饰的脂质；优选Fluorescein DHPE；
所述荧光染料占脂质摩尔总量的1％～20％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体的粒径大小为30-1000nm，平均密度为1.06-1.23g/mL。
5.权利要求1-4任一项所述脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体：用密封的玻璃注射器将适量氯仿加入玻璃瓶内；然后用密封的玻璃注射器添加适量甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将用于形成磷脂双分子层结构的各种脂质依次加入上述玻璃瓶内，再加入荧光或有色染料；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内以去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入适量PBS缓冲液，通过过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；
S2、游离荧光染料的去除：将上述得到的脂质体转入超速离心管，进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过恒压力控制挤出的方法制备脂质体：用250μL密封的玻璃注射器将50～150μL氯仿加入20mL玻璃瓶内；然后用100μL密封的玻璃注射器添加20～50μL甲醇至相同的玻璃瓶内；然后将10mg/mL磷脂酰胆碱150～250μL、10mg/mL磷脂酰乙醇胺30～50μL和11mg/mL胆固醇酯10～30μL依次加入上述玻璃瓶内；加入占磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和胆固醇酯总摩尔量1％～20％的Fluorescein DHPE；用氮气挥发有机溶剂氯仿和甲醇直到观察到薄膜脂质在瓶底形成；将玻璃瓶放置在真空干燥器内至少30分钟去除残留有机溶剂；然后向玻璃瓶中加入PBS缓冲液1～5mL，通过孔径50～800nm的过滤器或滤膜即可得到类似囊泡粒径大小的脂质体；
2)游离荧光染料的去除：将上述得到的脂质体转入超速离心管，100000～200000g进行超速离心，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀，4℃保存；优选地，将上述得到的脂质体悬浮液转入50KD或100KD的超滤管，用PBS缓冲液反复多次进行清洗超滤，以去除游离于脂质体外的荧光染料。
7.权利要求1-4任一项所述脂质体在囊泡分离效率评估和质控中的应用。
8.基于权利要求1-4任一项所述脂质体的囊泡分离效率评估和质控的方法，其特征在于，按照每1～4mL血浆样本加入40μL脂质体，或者每20～100mL尿液样本加入40μL脂质体，或者每2～7mL胸腹水样本加入40μL脂质体的量，或者每1～3mL唾液样本加入40μL脂质体的量，或者每2～7mL乳汁样本加入40μL脂质体的量，将采集的样本与浓度为0.05-100mg/mL的类似囊泡粒径大小的脂质体进行混合，用特定的方法进行囊泡的分离，分别测定原始脂质体以及不同分离方法得到的囊泡中的荧光强度；然后用得到囊泡中的荧光强度除以原始脂质体的荧光强度，即可得到相应的特定方法对实际临床样本中囊泡的分离提取效率。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述特定的方法选自超离心、梯度密度离心、膜亲和法、聚合物沉淀、色谱法、免疫磁珠捕获法。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述囊泡来自于正常人及肿瘤患者的体液，所述体液包括血液、尿液。
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