CN111500607B - 种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用 - Google Patents

种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用，属于种植体技术领域。本发明所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。基于本发明所述融合基因制备得到的外泌体负载于种植体上后，能够提高种植体的生物相容性，具有显著的抗炎作用。

Description

种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及种植体技术领域，具体涉及种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用。
背景技术
种植体治疗是目前临床上骨缺损和牙缺失治疗的常见手段。然而，种植体作为异物，常引起周围炎症，严重影响种植体的治疗效果。如何增强种植体的组织相容性，减轻炎症，至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用。基于本发明所述融合基因制备得到的抗炎外泌体负载于种植体上后，能够提高种植体的生物相容性，具有显著的抗炎作用。
本发明提供了种植体周围抗炎用融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了基于上述技术方案所述融合基因的表达载体，所述表达载体含上述技术方案所述融合基因。
优选的是，所述表达载体的构建用骨架质粒包括pUC57载体或pWPI载体。
本发明还提供了一种抗炎外泌体，所述抗炎外泌体能够表达上述技术方案所述融合基因。
本发明还提供了上述技术方案所述抗炎外泌体的构建方法，包括以下步骤：
a)将上述技术方案所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-IL10；
b)将步骤a)所述pUC57-IL10和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-IL10；
c)将步骤b)得到的pWPI-IL10转化入Stbl3大肠杆菌，提取pWPI-IL10；
d)将步骤c)得到的pWPI-IL10和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达IL10的病毒载体；
e)将步骤d)得到的过表达IL10的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到抗炎外泌体。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述抗炎外泌体的抗炎生物涂料，所述生物涂料包括PEI溶液、明胶溶液和抗炎外泌体溶液。
优选的是，所述PEI溶液中PEI的质量浓度为0.5～2mg/ml，所述PEI溶液的溶剂为0.15M的氯化钠水溶液；所述明胶溶液中明胶的质量浓度为5mg/ml，所述明胶溶液的溶剂为含有0.15M氯化钠的PBS水溶液；以蛋白质量浓度计，所述抗炎外泌体溶液中抗炎外泌体的质量浓度为100μg/ml，所述抗炎外泌体溶液的溶剂为壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为5mg/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂为含0.15M氯化钠的体积百分含量为1％的醋酸水溶液。
本发明还提供了基于上述技术方案所述生物涂料的种植体的改造方法，包括以下步骤：
1)将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体；
2)将步骤1)酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20～30min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体；
3)将步骤2)得到的吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载明胶的种植体；
4)将步骤3)得到的负载明胶的种植体在抗炎外泌体溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载抗炎外泌体的种植体；
5)重复步骤3)和步骤4)3～5次，得到改造后的种植体。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述改造方法制备得到的抗炎种植体。
本发明还提供了上述技术方案所述融合基因或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述抗炎外泌体或上述技术方案所述构建方法得到的抗炎外泌体或上述技术方案所述生物涂料在制备种植体抗炎试剂中的应用。
本发明提供了种植体周围抗炎用融合基因。基于本发明所述融合基因制备得到的外泌体负载于种植体上后，能够提高种植体的生物相容性，具有显著的抗炎作用。具体的，本发明所述融合基因能够实现对外泌体的改构，使外泌体中携带IL10的mRNA，当外泌体从涂层释放进入受体细胞，翻译IL10，具有显著的抗炎作用；本发明通过水溶胶(PEI-明胶-壳聚糖)将外泌体负载于种植体表面，能够形成一层生物涂层，增加生物相容性。
附图说明
图1为本发明提供的IL10装载入外泌体的效率图；
图2为本发明提供的外泌体递送的IL10在受体细胞的半衰期结果图；
图3为本发明提供的改造外泌体对种植体周围炎的影响。
具体实施方式
本发明提供了种植体周围抗炎用融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示：Ttaattaaaccatgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaactga(CDS)gacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctcaaccat(新的UTR)taattaa(Pac1)。本发明所述融合基因能够实现IL10的表达，显著抗炎。
本发明还提供了基于上述技术方案所述融合基因的表达载体，所述表达载体含上述技术方案所述融合基因。在本发明中，所述表达载体的构建用骨架质粒包括pUC57载体或pWPI载体。
本发明还提供了一种抗炎外泌体，所述抗炎外泌体能够表达上述技术方案所述融合基因。本发明所述抗炎外泌体作为递药载体，能够实现种植体周围的局部递药，实现种植体周围抗炎。
本发明还提供了上述技术方案所述抗炎外泌体的构建方法，包括以下步骤：
a)将上述技术方案所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-IL10；
b)将步骤a)所述pUC57-IL10和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-IL10；
c)将步骤b)得到的pWPI-IL10转化入Stbl3大肠杆菌，提取pWPI-IL10；
d)将步骤c)得到的pWPI-IL10和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达IL10的病毒载体；
e)将步骤d)得到的过表达IL10的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到抗炎外泌体。
本发明将上述技术方案所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-IL10。本发明对所述克隆的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规克隆方法即可。
得到pUC57-IL10后，本发明将pUC57-IL10和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-IL10。本发明所述酶切优选使用Pac1酶切。本发明对所述酶切、连接的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规酶切、连接方法即可。
得到pWPI-IL10后，本发明将pWPI-IL10转化入Stbl3大肠杆菌，提取高纯度pWPI-IL10。本发明对所述转化的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规转化方法即可。转化后，本发明优选还包括将转化后的细菌进行涂板，本发明所述涂板优选涂在带有Amp抗性的LB细菌培养板上，挑选克隆并鉴定正确后，本发明优选留存菌种。需要时，复苏菌种，抽提质粒，供病毒包装使用。
得到高纯度pWPI-IL10后，本发明将高纯度pWPI-IL10和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达IL10的病毒载体。在本发明中，所述转染时，pWPI-IL10、psPAX2和pMD2G的质量比优选为10:5:1。本发明优选在转染12h后撤换培养基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤器过滤培养基，收集滤液，得到含有病毒的培养液。本发明优选通过CsCl法纯化病毒。本发明对所述培养基的种类没有特殊限定，采用常规细胞培养基即可，如DMEM。本发明所述过滤能够去除大的杂质和细胞碎片。
得到过表达IL10的病毒载体后，本发明将过表达IL10的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到抗炎外泌体。本发明对MSC细胞的制备方法没有特殊限定，采用MSC常规制备方法即可。本发明优选将过表达IL10的病毒载体复温至室温(20～28℃)后，将过表达IL10的病毒载体、Polybrene和细胞培养基混合，加入细胞中，孵育。本发明所述细胞培养基采用常规细胞培养基即可，如DMEM。在本发明中，每8mL细胞培养基优选与100μl含病毒载体的液体(MOI＝30)混合(本发明优选107细胞加入病毒108TU)，本发明所述Polybrene的在混合后的终浓度优选为8μg/ml。在本发明中，所述孵育的条件优选为37℃、5％CO2和95％相对湿度，在本发明优选在孵育16h后更换新鲜培养基。
本发明通过对抗炎外泌体的构建，使抗炎外泌体中携带IL10融合表达的mRNA，当抗炎外泌体从生物涂层中释放进入受体细胞后，能够在受体细胞中表达IL10，具有显著抗炎功能。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述外泌体的抗炎生物涂料，所述生物涂料包括PEI溶液、明胶溶液和抗炎外泌体溶液。本发明所述生物涂料能够利用层层自组装和水溶胶等技术将抗炎外泌体负载于种植体表面，明胶和抗炎外泌体都能够增加种植体的生物相容性，同时抗炎外泌体携带的基因药物能够显著抗炎。本发明所述生物涂料能够有效增加种植体治疗效果。
在本发明中，所述PEI溶液中PEI的质量浓度为0.5～2mg/ml，更优选为1mg/ml，所述PEI溶液的溶剂为0.15M的氯化钠水溶液；所述明胶溶液中明胶的质量浓度为5mg/ml，所述明胶溶液的溶剂为含有0.15M氯化钠的PBS水溶液；以蛋白质量浓度计，所述抗炎外泌体溶液中抗炎外泌体的质量浓度为100μg/ml，所述抗炎外泌体溶液的溶剂为壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为5mg/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂为含0.15M氯化钠的体积百分含量为1％的醋酸水溶液。在本发明中，所述水优选使用去离子水。
本发明还提供了基于上述技术方案所述生物涂料的种植体的改造方法，包括以下步骤：
1)将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体；
2)将步骤1)酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20～30min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体；
3)将步骤2)得到的吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载明胶的种植体；
4)将步骤3)得到的负载明胶的种植体在抗炎外泌体溶液中浸泡10～15min，清洗，得到负载抗炎外泌体的种植体；
5)重复步骤3)和步骤4)3～5次，得到改造后的种植体。
本发明将种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的种植体。具体的，本发明优选将种植体在60～80℃的1M的氢氧化钠水溶液中浸泡5min，除油，清洗，在氢氟酸和硝酸的混合酸中浸泡10～15s，清洗，得到酸蚀后的种植体。本发明对所述除油的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规除油方法即可。在本发明中，所述清洗优选采用去离子水进行。本发明所述清洗的方式优选为润洗。在本发明中，所述混合酸优选为1M氢氟酸和6M硝酸等体积混合制备得到。在本发明中，所述酸蚀能够去除表面陈旧氧化层。本发明在清洗后，优选进行干燥。本发明对所述干燥的方法没有特殊限定，优选放置在室温下进行干燥即可。在本发明中，所述种植体的材质优选为钛材。
得到酸蚀后的种植体后，本发明将酸蚀后的种植体在PEI溶液中浸泡20min，清洗，得到吸附PEI分子的种植体。本发明在PEI溶液中浸泡后，种植体表面能够吸附带有稳定正电荷的PEI分子，将其作为引发层启动层层自组装过程。本发明所述清洗的次数优选为2次，每次优选清洗1min。本发明所述清洗的方式优选为润洗。
得到吸附PEI分子的种植体后，本发明将吸附PEI分子的种植体在明胶溶液中浸泡10min，清洗，得到负载明胶的种植体。在本发明中，所述清洗的次数优选为2次，每次清洗的时间优选为1min。本发明所述清洗的方式优选为润洗。
得到负载明胶的种植体后，本发明将负载明胶的种植体在外泌体溶液中浸泡10min，清洗，得到负载抗炎外泌体的种植体。在本发明中，所述清洗的次数优选为2次，每次清洗的时间优选为1min。本发明所述清洗的方式优选为润洗。
得到负载抗炎外泌体的种植体后，本发明优选重复步骤3)在明胶溶液中浸泡和步骤4)在抗炎外泌体溶液中浸泡的操作3～5次，得到改造后的种植体，即涂覆了含外泌体的生物涂层的种植体。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述改造方法制备得到的抗炎种植体。本发明通过明胶将抗炎外泌体负载于种植体表面，形成一层生物涂层，增加了种植体的生物相容性。且本发明所述改造后的种植体与未改造的种植体比较，种植体周围的炎症显著减轻。
本发明还提供了上述技术方案所述融合基因或上述技术方案所述表达载体或上述技术方案所述外泌体或上述技术方案所述构建方法得到的外泌体或上述技术方案所述生物涂料在制备种植体抗炎试剂中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1)外泌体加载IL10的mRNA
构建IL10的病毒载体
1.设计表达IL10的病毒系统
(1)通过公司合成序列，包括IL10前体mRNA，具体序列如SEQ ID NO.1所示：Ttaattaaaccatgcacagctcagcactgctctgttgcctggtcctcctgactggggtgagggccagcccaggccagggcacccagtctgagaacagctgcacccacttcccaggcaacctgcctaacatgcttcgagatctccgagatgccttcagcagagtgaagactttctttcaaatgaaggatcagctggacaacttgttgttaaaggagtccttgctggaggactttaagggttacctgggttgccaagccttgtctgagatgatccagttttacctggaggaggtgatgccccaagctgagaaccaagacccagacatcaaggcgcatgtgaactccctgggggagaacctgaagaccctcaggctgaggctacggcgctgtcatcgatttcttccctgtgaaaacaagagcaaggccgtggagcaggtgaagaatgcctttaataagctccaagagaaaggcatctacaaagccatgagtgagtttgacatcttcatcaactacatagaagcctacatgacaatgaagatacgaaactga(CDS)gacccctggaccaccagccccagcaagagcacaagaggaagagagagaccctcactgctggggagtccctgccacactcagtcccccaccacactgaatctcccctcctcacagttgccatgtagaccccttgaagaggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagtaccctgtgctcaaccat(新的UTR)taattaa(Pac1)。
然后将上述序列克隆至pUC57载体，命名为pUC57-IL10。
(2)通过Pac1酶切pUC57-IL10和pWPI载体，然后将上述含有IL10的序列克隆至pWPI载体，称为pWPI-IL10。
(3)连接产物转化入高效率的Stbl3 E.Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，留存菌种。需要时，复苏菌种，重新抽提质粒，供病毒包装使用。
(4)将提取好的高纯度pWPI-IL10、psPAX2、pMD2G按照10：5：1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤器过滤培养基，获得含有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。
将过表达IL10病毒载体感染MSC细胞
(1)取新鲜抗凝骨髓穿刺液(稀释前骨髓液)约10ml，(EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)。用等体积PBS或生理盐水稀释全血。
(2)稀释骨髓液，具体过程如下：将Ficoll分离液(达科为生物公司，中国深圳)、稀释前骨髓液、PBS(或生理盐水)按体积比为1:1:1混合，将稀释后的骨髓液缓慢平铺到Ficoll分离液上方，保持液面界面清晰。
(3)室温，水平转子700-800g，离心20-30min。
(4)离心结束后，管底主要为红细胞，中间层为分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆/组织匀浆层与分离液层之间是一层薄且致密的白膜，即：单个核细胞(mononuclear cell,MNC)层。小心吸取白膜层到另一离心管中。
(5)用适量PBS稀释洗涤细胞，颠倒混匀。室温，水平转子250g，离心10min，弃上清。重复洗涤1-2次。
(6)用含有5％人血小板裂解产物(HELIOS，美国)，1％谷氨酰胺(Gibco，美国)，1％青/链霉素(Gibco，美国)的α-MEM培养基(Gibco,美国)，重悬细胞。按照106MNC/cm2密度接种细胞。3天后移除未贴壁细胞，PBS清洗。继续培养至80-90％融合度后按照1:3传代。P3-P5代细胞(MSC)用于后续实验。
(7)将上述P3-P5代细胞(MSC)培养于10cm培养板中，至细胞密度达到80％时，同时感染前述病毒。感染方法为：使病毒液复温至室温，取8ml细胞培养基、100μl病毒液(MOI＝30)和终浓度为8μg/ml的Polybrene混合后，加入细胞中。在37℃、5％CO2和95％相对湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基，最终得到病毒感染的细胞。
2)提取外泌体
(1)上述病毒感染的细胞换成含无外泌体血清的培养基，进行培养。
(2)培养48h后，用吸管收集细胞培养上清于无菌50ml离心管中；将细胞培养液离心，设置转速为：300g/min，温度为：4℃，时间为：10min；离心完成后，取上清至另一无菌离心管中，弃沉淀。
(3)将步骤(2)中得到的细胞培养上清离心，设置转速为：2000g/分，温度为：4℃，时间为：10min；离心完成后，取上清至另一无菌离心管中，弃沉淀。
(4)将步骤(3)中得到的细胞培养上清离心，设置转速为：10000g/分，温度为：4℃，时间为：30min；离心完成后，取上清至无菌超速离心管中，弃沉淀。
(5)使用超速离心机，将步骤(4)中得到的细胞培养上清进行超速离心，设置转速为：100000g/分，温度为：4℃，时间为：70min；超速离心后弃上清，收集沉淀(此时沉淀为外泌体和蛋白质)。
(6)在步骤(5)中得到的沉淀中加入适量无菌PBS洗涤，进行超速离心，设置转速为：100000g/分，温度为：4℃，时间为：70min；超速离心后弃上清，此时收集的沉淀即为外泌体。用适量PBS重悬外泌体，立即使用或冻存于-80℃冰箱中用于后续实验。
3)外泌体溶液、PEI溶液与明胶水溶液的配置
溶液的配置：PEI溶于含有0.15M NaCl的去离子水中，明胶溶于含有0.15MNaClPBS溶液中，浓度为5mg/ml。壳聚糖溶于含有0.15M NaCl的1％(v/v)HAc溶液中，浓度为5mg/ml。外泌体以100μg/ml蛋白浓度混入配置好的壳聚糖溶液中。
4)将钛材种植体浸泡在60-80℃1M氢氧化钠溶液中，5min后进行除油处理，用去离子水清洗样本，然后浸在氢氟酸和硝酸的混合酸中10-15s，以去除表面陈旧氧化层，再用去离子水清洗，置于室温下干燥，得到酸蚀后的钛材种植体。
将酸蚀后的钛材种植体沉浸于PEI溶液中20min，在钛材种植体表面吸附带有稳定正电荷的PEI分子，将其作为引发层启动层层自组装过程。用去离子水润洗两次，每次1min。
将钛材种植体置于明胶溶液中浸泡10min，用去离子水润洗两次，每次1min。
将钛材种植体置于外泌体溶液中浸泡10min，用水润洗两次，每次1min。
重复在明胶溶液中浸泡和在外泌体溶液中浸泡的操作3～5次，得到涂覆生物涂层的种植体。
图1为IL10装载入外泌体的效率图，设置空载体和不含有rUTR的IL10为对照。如图1所示，IL10 CDS后增加rUTR序列并不影响在外泌体的装载。
将收集的外泌体添加到受体细胞RAW264.7。图2为外泌体递送的IL10在受体细胞的半衰期。结果发现，当外泌体装载的是IL10 CDS后增加rUTR的序列时，随着时间的推移，携带rUTR的IL10在受体细胞存在的时间更长。即改造的IL10在受体细胞能够作用更长时间
图3为改造外泌体对种植体周围炎的影响图，由图3可知，种植体经外泌体改造后，移植小鼠2天后，取种植体周围组织，qPCR检测组织炎症因子表达。发现携带IL10+rUTR的外泌体处理，最能有效抑制种植体周围细胞的炎症因子表达。
与未改造的种植体比较，种植体周围的炎症显著减轻。
种植体周围炎，是临床常见的问题，本发明将外泌体作为递药载体，利用层层自组装或水溶胶等技术将外泌体负载于种植体表面。通过PEI、明胶和壳聚糖形成的水溶胶，序贯将改构的具有抗炎功能的外泌体负载于种植体表面。胶原和外泌体都增加了种植体的生物相容性，同时外泌体携带的抗炎基因进一步减轻炎症。本发明能够有效减轻种植体炎症，增加种植体治疗效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京口腔医院
<120> 种植体周围抗炎用融合基因、外泌体、生物涂料以及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 757
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaattaaac catgcacagc tcagcactgc tctgttgcct ggtcctcctg actggggtga 60
gggccagccc aggccagggc acccagtctg agaacagctg cacccacttc ccaggcaacc 120
tgcctaacat gcttcgagat ctccgagatg ccttcagcag agtgaagact ttctttcaaa 180
tgaaggatca gctggacaac ttgttgttaa aggagtcctt gctggaggac tttaagggtt 240
acctgggttg ccaagccttg tctgagatga tccagtttta cctggaggag gtgatgcccc 300
aagctgagaa ccaagaccca gacatcaagg cgcatgtgaa ctccctgggg gagaacctga 360
agaccctcag gctgaggcta cggcgctgtc atcgatttct tccctgtgaa aacaagagca 420
aggccgtgga gcaggtgaag aatgccttta ataagctcca agagaaaggc atctacaaag 480
ccatgagtga gtttgacatc ttcatcaact acatagaagc ctacatgaca atgaagatac 540
gaaactgaga cccctggacc accagcccca gcaagagcac aagaggaaga gagagaccct 600
cactgctggg gagtccctgc cacactcagt cccccaccac actgaatctc ccctcctcac 660
agttgccatg tagacccctt gaagagggga ggggcctagg gagccgcacc ttgtcatgta 720
ccatcaataa agtaccctgt gctcaaccat taattaa 757

Claims (2)

1.基于生物涂料的钛材料种植体的改造方法，包括以下步骤：
1）将钛材料种植体进行酸蚀，得到酸蚀后的钛材料种植体；
2）将步骤1）酸蚀后的钛材料种植体在PEI溶液中浸泡20~30min，清洗，得到吸附PEI分子的钛材料种植体；
3）将步骤2）得到的吸附PEI分子的钛材料种植体在明胶溶液中浸泡10~15min，清洗，得到负载明胶的钛材料种植体；
4）将步骤3）得到的负载明胶的钛材料种植体在抗炎外泌体溶液中浸泡10~15min，清洗，得到负载抗炎外泌体的钛材料种植体；
5）重复步骤3）和步骤4）3~5次，得到改造后的钛材料种植体；
所述生物涂料包括PEI溶液、明胶溶液和抗炎外泌体溶液；
所述PEI溶液中PEI的质量浓度为0.5~2mg/ml，所述PEI溶液的溶剂为0.15M 的氯化钠水溶液；所述明胶溶液中明胶的质量浓度为5 mg/ml，所述明胶溶液的溶剂为含有0.15M氯化钠的PBS水溶液；以蛋白质量浓度计，所述抗炎外泌体溶液中抗炎外泌体的质量浓度为100μg/ml，所述抗炎外泌体溶液的溶剂为壳聚糖溶液；所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为5 mg/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂为含0.15M氯化钠的体积百分含量为1%的醋酸水溶液；
所述抗炎外泌体能够表达融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SEQ ID NO.1为基于编码IL10的CDS和3’UTR序列构成的IL10的mRNA序列；
所述抗炎外泌体的构建方法，包括以下步骤：
a）将所述融合基因克隆至pUC57载体，得到pUC57-IL10；
b）将步骤a）所述pUC57-IL10和pWPI载体酶切，连接，得到pWPI-IL10；
c）将步骤b）得到的pWPI-IL10转化入Stbl3大肠杆菌，提取pWPI-IL10；
d）将步骤c）得到的pWPI-IL10和psPAX2、pMD2G转染包装细胞HEK293细胞，得到过表达IL10的病毒载体；
e）将步骤d）得到的过表达IL10的病毒载体感染MSC细胞，培养、分离得到抗炎外泌体，获得携带IL10的mRNA序列的外泌体。
2.一种基于权利要求1所述改造方法制备得到的抗炎钛材料种植体，该种植体是经过权利要求1所述生物涂料改造的种植体，该种植体含有携带IL10的mRNA序列的外泌体。
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《鼠 IL-10 基因腺病毒载体的构建及在骨髓间充质干细胞中的表达》;张文婷等;《中国当代儿科杂志》;20190731;第21卷(第7期);参见对比文件1摘要、第709页左栏第2段、第709-710页"材料与方法" *

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