CN110484566B - 一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用 - Google Patents

一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用，属于细胞工程和基因重组技术领域。类棕色脂肪外泌体的工程化生产方法，包括以下步骤：从脂肪组织中分离脂肪干细胞；构建同时表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；将所述病毒表达载体包装成病毒；用所述病毒感染所述脂肪干细胞；将感染有病毒的脂肪干细胞经培养，收集类棕色脂肪外泌体。通过基因改造的方法，将PGC1a和PRDM16基因导入脂肪干细胞中激活脂肪干细胞中众多棕色化脂肪相关的基因表达，将脂肪干细胞改造为棕色脂肪干细胞，进而产生类棕色脂肪外泌体，所述类棕色脂肪外泌体具有棕色脂肪外泌体的特征，为肥胖等代谢性疾病提供了潜在的治疗手段。

Description

一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用
技术领域
本发明属于细胞工程和基因重组技术领域，具体涉及一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用。
背景技术
肥胖是代谢性疾病最重要的原因。随着人类生活方式的改变，肥胖发病率逐年增加，增加了包括心血管疾病、肿瘤、糖尿病等在内的各类疾病的风险。截至目前，依然缺乏理想的药物治疗手段。
棕色脂肪的主要功能是消耗能量和产热，是机体拮抗肥胖的重要组织。但随着肥胖加剧和年龄增长，棕色脂肪组织逐渐减少。而棕色脂肪外泌体作为棕色脂肪分泌的囊泡，具有类似于棕色脂肪的功能，是代谢性疾病潜在的治疗药物。然而，棕色脂肪作为一类不可再生资源，获取棕色脂肪，缺乏可行性。
目前，棕色脂肪外泌体只能通过提取棕色脂肪组织或其中的干细胞，然后通过组织块培养或者干细胞培养的方法，从培养液中获取外泌体。体内棕色脂肪不可能获得，且肥胖患者棕色脂肪减少，因此，目前基本上没有办法获取个体特异的棕色脂肪外泌体。现有研究报道，棕色脂肪外泌体也只能从动物中获取。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种类棕色脂肪外泌体的工程化生产方法，解决了棕色脂肪外泌体的来源受限的问题，将肥胖等不需要的白色脂肪干细胞转变棕色脂肪干细胞，在个体特异化的基础上实现工程化生产。
本发明提供了一种类棕色脂肪外泌体的工程化生产方法，包括以下步骤：
1)从脂肪组织中分离脂肪干细胞；
2)构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；
3)将步骤2)所述病毒表达载体包装成病毒；
4)用所述病毒感染步骤1)中所述脂肪干细胞；
5)将感染有病毒的脂肪干细胞经培养，收集类棕色脂肪外泌体；
所述步骤1)和步骤3)之间没有时间顺序的限制。
优选的，步骤2)中所述构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体的方法包括以下步骤：
将PRDM16和PGC1a基因的ORF序列通过P2A序列连接，得到的融合基因插入pWPI载体中Pac1酶切位点处，得到高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
优选的，步骤3)中将所述病毒表达载体包装成病毒的方法包括以下步骤：
将所述高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体与psPAX2、pMD2G载体和转染液共转染HEK293FT细胞，孵育，然后依次在含体积浓度5％～20％FBS不含双抗的DMEM培养基和DMEM完全培养基中培养，培养液离心，收集上清液得到病毒液。
优选的，所述同时表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体、psPAX2、pMD2G载体的质量比为5～10：2：1；3种质粒的总质量和转染液的体积比为0.5～2μg:1μL。
优选的，所述孵育的时间为5～20min；
在含体积浓度10％FBS不含双抗的DMEM培养基上培养的时间为12～18h；
在DMEM完全培养基中培养的时间为60～72h。
优选的，步骤4)中用所述病毒感染所述脂肪干细胞的方法是将病毒颗粒、聚凝胺和脂肪干细胞混合培养，得到感染有病毒的脂肪干细胞。
优选的，1～10×106的病毒颗粒与105的脂肪干细胞混合；
在所述混合前，所述聚凝胺的浓度为2～10mg/ml。
本发明提供了所述工程化生产方法生产得到的类棕色脂肪外泌体。
本发明提供了所述类棕色脂肪外泌体在制备预防和/或治疗脂肪肝、肥胖、创伤愈合或血管生成诱导的药物中的应用。
本发明提供了所述类棕色脂肪外泌体在难愈合伤口或脂肪液化伤口的敷料中的应用。
本发明提供了一种类棕色脂肪外泌体的工程化生产方法，根据PRDM16和PGC1a差异表达是白色脂肪和棕色脂肪功能差异的重要分子基础，本发明通过基因改造的方法，PGC1a和PRDM16基因激活脂肪干细胞中众多棕色化脂肪相关的基因表达，将脂肪干细胞改造为棕色脂肪干细胞，进而使其产生的类棕色脂肪外泌体，所述类棕色脂肪外泌体具有棕色脂肪外泌体的特征，为肥胖等代谢性疾病提供了潜在的治疗手段。
附图说明
图1外泌体粒径分析。
具体实施方式
本发明提供了一种类棕色脂肪外泌体的工程化生产方法，包括以下步骤：
1)从脂肪组织中分离脂肪干细胞；
2)构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；
3)将步骤2)所述病毒表达载体包装成病毒；
4)用所述病毒感染步骤1)中所述脂肪干细胞；
5)将感染有病毒的脂肪干细胞经培养，收集类棕色脂肪外泌体；
所述步骤1)和步骤3)之间没有时间顺序的限制。
本发明从脂肪组织中分离脂肪干细胞。
在本发明中，所述脂肪干细胞优选为白色脂肪干细胞。所述分离的方法优选为酶解法，优选具体包括以下步骤：将脂肪组织去筋膜清洗干净后剪成糜状，和含0.1％胶原酶I溶液混合，在5％CO2、37℃的条件下消化，间隔10min震荡摇晃一次，直至脂肪组织完全消化成悬液；向悬液中加入等量的完全培养基DMEM(含1％青-链霉素、10％胎牛血清)稀释悬液，200目过滤出滤液，离心，取上清与上层未完全消化的脂肪组织，加入完全培养基DMEM吹打重悬后，将细胞在5％CO2、37℃条件下静置培养48小时后换液，此后每2-3天换液一次，至细胞融合80-90％后，0.25％胰酶溶液进行消化，离心、重悬、传代。
在本发明中，所述脂肪组织的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的脂肪组织即可。
本发明构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体。在本发明中，所述构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体的方法优选包括以下步骤：将PRDM16和PGC1a基因的ORF序列用P2A序列连接，得到的融合基因插入pWPI载体中Pac1酶切位点处，得到高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；所述融合基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
在本发明中，PRDM16基因的ORF序列不包含终止子序列，PGC1a基因的ORF序列包括终止子序列。本发明对融合基因的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的融合基因来源即可。在本发明实施例中，所述融合基因委托金斯瑞公司合成。融合基因插入pWPI载体中Pac1酶切位点处的方法优选将融合基因和pWPI载体分别用Pac1酶进行酶切，得到的两个酶切产物进行连接。本发明对所述酶切和连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的酶切和连接方法即可。本发明对所述pWPI载体的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的pWPI载体的来源即可。
得到病毒表达载体后，本发明将所述病毒表达载体包装成病毒。
在本发明中，所述将所述病毒表达载体包装成病毒的方法优选包括以下步骤：将所述高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体与psPAX2、pMD2G载体和转染液共转染HEK293FT细胞，孵育，然后依次在含体积浓度5％～20％FBS不含双抗的DMEM培养基和DMEM完全培养基中培养，培养液离心，收集上清液得到病毒液。所述同时表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体、psPAX2、pMD2G载体的质量比为5～10：2：1；3种质粒的总质量和转染液的体积比为0.5～2μg:1μL。所述转染液为Lipofectamine2000。psPAX2、pMD2G均是慢病毒包装质粒。所述孵育的时间优选为5～20min；在含体积浓度5～20％FBS不含双抗的DMEM培养基上培养的时间为12～18h；在DMEM完全培养基中培养的时间为60～72h。本发明对HEK293FT细胞、psPAX2、pMD2G载体和转染液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的购买途径即可。将病毒表达载体包装成病毒，以病毒作为改造基因的媒介，将改造基因的序列转入哺乳动物细胞中，实现对哺乳动物细胞的改造。
得到病毒后，本发明用所述病毒感染所述脂肪干细胞。
在本发明中，用所述病毒感染所述脂肪干细胞的方法优选是将病毒颗粒、聚凝胺和脂肪干细胞混合培养，得到感染有病毒的脂肪干细胞。
在本发明中，1～10×106的病毒颗粒优选与105的脂肪干细胞混合；在所述混合前，所述聚凝胺的浓度为2～10mg/ml，更优选为4mg/ml。培养6h后补液1ml完全培养基，每隔12h后换液。
病毒感染细胞后，本发明将感染有病毒的脂肪干细胞进行培养，收集类棕色脂肪外泌体。
在本发明中，所述培养优选为无血清培养。所述无血清培养优选为用DMEM培养基培养感染有病毒的脂肪干细胞，在37℃、含5％CO2的条件下培养，每隔1天半数更换新鲜培养基。
在本发明中，所述收集类棕色脂肪外泌体的方法优选用试剂盒收集。本发明对所述试剂盒来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂盒的来源即可。在本发明实施例中，所述试剂盒购自System Biosciences公司的Exosome Isolation Kits。
本发明提供了所述工程化生产方法生产得到的类棕色脂肪外泌体，所述类棕色脂肪外泌体的粒径包括75～175nm，75～99nm粒径的类棕色脂肪外泌体的浓度为1.6×108/mL，100～124nm粒径的类棕色脂肪外泌体的浓度为3.5×108/mL，125～149nm粒径的类棕色脂肪外泌体的浓度为1.8×108/mL，150～175nm粒径的类棕色脂肪外泌体的浓度为1.6×108/mL。
本发明提供了所述类棕色脂肪外泌体在制备预防和/或治疗脂肪肝、肥胖、创伤愈合或血管生成诱导的药物中的应用。药物的剂型为针剂，即外泌体悬液。小鼠实验为200μL/次，蛋白浓度为1μg/μL，一周一次。如果是人体实验，理论上是注射5ml，同等浓度。
本发明提供了所述类棕色脂肪外泌体在难愈合伤口或脂肪液化伤口的敷料中的应用。所述敷料还包括医学上可接受的辅料。所述敷料的制备方法包括将外泌体与胶原制成水溶胶，将所述水溶胶制作成胶原海绵。胶原海绵可以成为伤口敷料促进伤口愈合。其操作方法可以如下：将胶原溶液(购自BD公司)，与外泌体溶液混匀，然后将上述混合溶液在4℃真空干燥36～72h，获得冷冻干燥成型的携带外泌体的高纯度胶原蛋白海绵，即为创伤修复敷料。按每1ml(1mg/ml)胶原蛋白液与100μg(蛋白含量，体积为100微升左右)的外泌体溶液混合。
下面结合实施例对本发明提供的一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1)获取皮下脂肪干细胞(白色脂肪干细胞)
无菌条件下，对脂肪组织剔尽筋膜。将取下的脂肪组织转移至含无菌PBS的培养皿中，清洗2～3遍取出并置于培养皿中剪碎。当组织剪成糜状后，转移组织至含0.1％胶原酶I的离心管中，在条件为5％CO2、37℃的孵箱中消化，间隔10分钟震荡摇晃一次，直至脂肪组织完全消化成悬液。加入等量的完全培养基DMEM(含1％青-链霉素、10％胎牛血清)进一步稀释悬液，以便200目的钢筛更好的过滤出滤液。将滤液转移至离心管，室温下以1000r/min的转速离心5min。取上清与上层未完全消化的脂肪组织，加入完全培养基DMEM吹打重悬后，将细胞均匀接种于培养皿中。在5％CO2、37℃的孵箱中静置培养，48小时后首次换液，此后每2-3天换液一次，至细胞融合80-90％后，0.25％胰酶进行消化，离心、重悬、传代。
2)构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体
将PRDM16(不含终止码)和PGC1a(含终止码)的ORF序列通过P2A序列连接，交由金斯瑞公司合成，然后整个序列通过Pac1酶切位点，连入pWPI载体。
3)将病毒载体包装成病毒(与psPAX2，pMD2G载体共转染HEK293FT细胞)
培养293T细胞，将细胞均匀接种于6cm的中皿中，待细胞融合至70-80％的时候准备转染。准备DMEM无血清培养基与DMEM含10％FBS不含双抗培养基，备用。包装过程中病毒表达载体(pwpi)：psPAX2：pMD2G的质量比为5μg：2μg：1μg。具体在上述质粒溶液中加入16μlLipofectamine2000，混匀，37℃孵育5min后。同时弃去293T细胞培养基，更换成2.5ml含10％FBS不含双抗的DMEM培养基，然后加入脂质体-质粒混合物；12h后换DMEM完全培养基，48h后各EP管补液1ml，72h后将含病毒的培养基分别移入离心管中，3000r/min，4℃离心10min，去上清病毒液。将病毒液分别用0.45μm的滤器过滤，分装并冻存于-80℃冰箱备用。
4)病毒感染脂肪干细胞
待脂肪干细胞融合至80～90％后，传代接种于6孔板中。待6孔板内的ADSCs融合达60～70％，弃去培养，准备进行病毒感染。将约106的病毒颗粒(含4mg/ml的polybrene)加入到105的细胞中。将病毒液分别加入6孔板中，6h后补液1ml完全培养基，12h后换液。
5)获取改造后的脂肪干细胞的外泌体。
将病毒感染脂肪干细胞换成无血清的培养基(即普通的DMEM)，在37℃、含5％CO2的孵箱中培养，每隔1天半数更换新鲜培养基。培养24h后，收取上清液至10ml无菌离心管，分别依次经过500g 5min和3000g 10min以去除细胞碎片，然后依次通过400nm孔径滤器、220nm孔径滤器过滤；将上清液移至灭菌离心管中，按照样本体积：Exoquick试剂体积5:1的标准加入Exoquick，上下颠倒混匀后，4℃静置过夜；在4℃12000g离心60min弃上清，取沉淀无菌PBS重悬，BCA蛋白定量，-80℃冻存备用。
为了检测外泌体粒径区间，将不同处理的外泌体稀释至500ng/ml，通过Nano plus检测所提取的外泌体的大小分布及浓度。
检测结果见图1所示。
由图1可知，外泌体的粒径大部分分布在75～175nm之间，其中100～125nm的外泌体数量最大，达到3.5×108/mL。
实施例2
将实施例1制备的类棕色脂肪外泌体，通过尾静脉注射入肥胖小鼠(100μg/只小鼠，一周一次)，以不注射外泌体的肥胖小鼠组为对照，相同方法饲养3周后，注射类棕色脂肪外泌体的小鼠体重由原先的平均35.5g显著下降至31.2g。而对照组小鼠的体重无明显变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 一种类棕色脂肪外泌体及其工程化生产方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttaattaacc atgcgatcca aggcgagggc gaggaagcta gccaaaagtg acggtgacgt 60
tgtaaataat atgtatgaac ctgacccgga cctgctggcc ggccagagtg ccgaggagga 120
gaccgaagac ggcatcctgt cccccatccc catggggcca ccgtccccct tccccaccag 180
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gccccttgtc tccgcggtca gcaatagcag ccagggtgcc acagcggcca ccgggtcaga 1740
ggagaaattt gatggccgct tggaagacgc atatgcggag aaggtcaaaa ataggagccc 1800
tgacatgtcg gatggcagtg actttgagga tatcaacacc acgaccggga cagacttgga 1860
cactaccacg ggcacggggt cagacctgga cagcgacctg gacagtgaca gagacaaagg 1920
caaggacaag gggaagccag tggagagcaa acctgagttt gggggtgcat ctgtgccccc 1980
tggggccatg aacagtgtgg ccgaggtacc ggccttctac tcacagcatt ccttcttccc 2040
gccacccgag gaacagctgc tgacggcctc gggagctgcc ggcgactcca tcaaggccat 2100
cgcgtccatc gcggagaaat acttcggtcc tggcttcatg agcatgcagg agaagaagct 2160
gggctcacta ccctaccact ccgtgttccc cttccagttc ctgcctaact ttccccactc 2220
cctctacccc tttacggacc gagccctcgc ccacaacttg ctggtcaagg ctgagccaaa 2280
gtcaccccgg gatgccctca aggtgggcgg ccccagtgcg gagtgcccct tcgacctcac 2340
caccaaacca aaagaggcca aacccgccct gctcgcaccc aaggtccccc tcatcccctc 2400
atctggcgag gaacagccac tggacctgag catcggcagc agggccaggg caagccagaa 2460
cggaggtggc cgtgagccgc ggaagaacca cgtctacggt gaacggaagc cgggggtcag 2520
cgaggggctg cctaaggtgt gcccagcaca gctgccccag cagccctcct tgcattatgc 2580
taagccttca ccgttcttca tggatcccat ctacagggta gaaaagcgga aggtggcaga 2640
ccctgtggga gtcctgaaag agaagtacct gcggccgtcc ccacttctgt tccaccccca 2700
gatgtcagcc atagaaacca tgacggagaa gctggagagc tttgcagcca tgaaggccga 2760
ctcaggcagc tccctgcagc ccctgcctca ccacccgttc aacttccgct ccccaccccc 2820
aacgctctcg gatcccatcc tcaggaaggg gaaggagaga tacacgtgca ggtactgtgg 2880
caagatcttc cccagatctg caaatctcac aagacatctg aggacacaca caggggagca 2940
gccatacagg tgcaagtact gtgaccggtc attcagcatc tcctccaacc tccagcggca 3000
cgtgaggaac atccacaaca aagagaagcc gttcaagtgc catctgtgca accgctgctt 3060
cgggcagcag accaacctag accggcacct gaagaagcac gaacacgagg gcgcaccagt 3120
gagccagcac tccggggtgc tcacgaacca cctgggcacc agcgcctcct cccccacctc 3180
cgagtcggac aaccatgcac ttttagatga gaaggaagat tcttacttct ccgagatccg 3240
aaacttcatc gccaacagcg agatgaacca ggcatccact cgaatggaca aacggcctga 3300
gatccaagac ctggacagca acccaccgtg tccaggctca gccagtgcaa agccagagga 3360
cgtagaggag gaggaagagg aggagctgga ggaagaggat gatgacagct tagccgggaa 3420
gtcacaggag gacacggtgt cccccacacc tgagccccaa ggagtctatg aagatgaaga 3480
ggatgaggaa ccacccagcc tgaccatggg ctttgaccat acccggaggt gtgttgagga 3540
gcgaggaggc ggcctgttag ctttggagcc gacgccgacc tttgggaagg ggctggatct 3600
ccgcagagca gctgaggaag catttgaagt taaagatgtg cttaattcca ccttagattc 3660
tgaggtttta aaacaaaccc tgtacaggca ggctaagaac caggcatatg caatgatgct 3720
gtccctctct gaagacactc ctctccacgc cccctcccag agctcactgg atgcttggtt 3780
gaacatcaca ggaccctcgt cagagtccgg agcctttaac cccatcaacc acctcggatc 3840
cggcgcaaca aacttctctc tgctgaaaca agccggagat gtcgaagaga atcctggacc 3900
ggcttgggac atgtgcagcc aagactctgt atggagtgac atagagtgtg ctgctctggt 3960
tggtgaggac cagcctcttt gcccagatct tcctgaactt gacctttctg aacttgatgt 4020
gaatgacttg gatacagaca gctttctggg tggattgaag tggtgtagcg accaatcgga 4080
aatcatatcc aaccagtaca acaatgagcc tgcgaacata tttgagaaga tagatgaaga 4140
gaatgaggca aacttgctag cggttctcac agagacactg gacagtctcc ccgtggatga 4200
agacggattg ccctcatttg atgcactgac agatggagcc gtgaccactg acaacgaggc 4260
cagtccttcc tccatgcctg acggcacccc tccccctcag gaggcagaag agccgtctct 4320
acttaagaag ctcttactgg caccagccaa cactcagctc agctacaatg aatgcagcgg 4380
tcttagcact cagaaccatg cagcaaacca cacccacagg atcagaacaa accctgccat 4440
tgttaagacc gagaattcat ggagcaataa agcgaagagc atttgtcaac agcaaaagcc 4500
acaaagacgt ccctgctcag agcttctcaa gtatctgacc acaaacgatg accctcctca 4560
caccaaaccc acagaaaaca ggaacagcag cagagacaaa tgtgcttcga aaaagaagtc 4620
ccatacacaa ccgcagtcgc aacatgctca agccaaacca acaactttat ctcttcctct 4680
gaccccagag tcaccaaatg accccaaggg ttccccattt gagaacaaga ctattgagcg 4740
aaccttaagt gtggaactct ctggaactgc aggcctaact cctcccacaa ctcctcctca 4800
taaagccaac caagataacc ctttcaaggc ttcgccaaag ctgaagccct cttgcaagac 4860
cgtggtgcca ccgccaacca agagggcccg gtacagtgag tgttctggta cccaaggcag 4920
ccactccacc aagaaagggc ccgagcaatc tgagttgtac gcacaactca gcaagtcctc 4980
agggctcagc cgaggacacg aggaaaggaa gactaaacgg cccagtctcc ggctgtttgg 5040
tgaccatgac tactgtcagt cactcaattc caaaacggat atactcatta acatatcaca 5100
ggagctccaa gactctagac aactagactt caaagatgcc tcctgtgact ggcaggggca 5160
catctgttct tccacagatt caggccagtg ctacctgaga gagactttgg aggccagcaa 5220
gcaggtctct ccttgcagca ccagaaaaca gctccaagac caggaaatcc gagcggagct 5280
gaacaagcac ttcggtcatc cctgtcaagc tgtgtttgac gacaaatcag acaagaccag 5340
tgaactaagg gatggcgact tcagtaatga acaattctcc aaactacctg tgtttataaa 5400
ttcaggacta gccatggatg gcctatttga tgacagtgaa gatgaaagtg ataaactgag 5460
ctacccttgg gatggcacgc agccctattc attgttcgat gtgtcgcctt cttgctcttc 5520
ctttaactct ccgtgtcgag actcagtgtc accaccgaaa tccttatttt ctcaaagacc 5580
ccaaaggatg cgctctcgtt caagatcctt ttctcgacac aggtcgtgtt cccgatcacc 5640
atattccagg tcaagatcaa ggtccccagg cagtagatcc tcttcaagat cctgttacta 5700
ctatgaatca agccactaca gacaccgcac acaccgcaat tctcccttgt atgtgagatc 5760
acgttcaagg tcaccctaca gccgtaggcc caggtacgac agctatgaag cctatgagca 5820
cgaaaggctc aagagggatg aataccgcaa agagcacgag aagcgggagt ctgaaagggc 5880
caaacagaga gagaggcaga agcagaaagc aattgaagag cgccgtgtga tttacgttgg 5940
taaaatcaga cctgacacaa cgcggacaga attgagagac cgctttgaag tttttggtga 6000
aattgaggaa tgcaccgtaa atctgcggga tgatggagac agctatggtt tcatcaccta 6060
ccgttacacc tgtgacgctt tcgctgctct tgagaatgga tatactttac gcaggtcgaa 6120
cgaaactgac ttcgagctgt acttttgtgg acggaagcaa tttttcaagt ctaactatgc 6180
agacctagat accaactcag acgattttga ccctgcttcc accaagagca agtatgactc 6240
tctggatttt gatagtttac tgaaggaagc tcagagaagc ttgcgcaggt aattaattaa 6300

Claims (7)

1.类棕色脂肪外泌体在制备减肥药物中的应用，其特征在于，所述类棕色脂肪外泌体的工程化生产方法，包括以下步骤：
1)从脂肪组织中分离脂肪干细胞；
2)构建同时表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；
3)将步骤2)所述病毒表达载体包装成病毒；
4)用所述病毒感染步骤1)中所述脂肪干细胞；
5)将感染有病毒的脂肪干细胞经培养，收集类棕色脂肪外泌体；
所述步骤1)和步骤3)之间没有时间顺序的限制。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤2)中所述构建同时高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体的方法包括以下步骤：
将PRDM16和PGC1a基因的ORF序列通过P2A序列连接，得到的融合基因插入pWPI载体中Pac1酶切位点处，得到高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤3)中将所述病毒表达载体包装成病毒的方法包括以下步骤：
将所述高表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体与psPAX2、pMD2G载体和转染液共转染HEK293FT细胞，孵育，然后依次在含体积浓度5％～20％FBS不含双抗的DMEM培养基和DMEM完全培养基中培养，所得培养液离心，收集上清液得到病毒液。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述同时表达PGC1a和PRDM16的病毒表达载体、psPAX2、pMD2G载体的质量比为5～10：2：1；3种质粒的总质量和转染液的体积比为0.5～2μg:1μL。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述孵育的时间为5～20min；在含体积浓度10％FBS不含双抗的DMEM培养基上培养的时间为12～18h；在DMEM完全培养基中培养的时间为60～72h。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤4)中用所述病毒感染所述脂肪干细胞的方法是将病毒颗粒、聚凝胺和脂肪干细胞混合培养，得到感染有病毒的脂肪干细胞。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，1～10×106的病毒颗粒与105的脂肪干细胞混合；
在所述混合前，所述聚凝胺的浓度为2～10μg/ml。
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