CN106065401B - 慢病毒介导cxcr7高表达工程化内皮祖细胞在缺血性疾病中的治疗应用 - Google Patents

慢病毒介导cxcr7高表达工程化内皮祖细胞在缺血性疾病中的治疗应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及慢病毒介导CXCR7高表达工程化内皮祖细胞在缺血性疾病中的治疗应用，公开了一种SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及包含该序列的重组病毒、转基因细胞。本发明还公开了转基因细胞的用途。本发明构建得到了新的表达CXCR7的重组慢病毒以及含有该重组慢病毒的转基因内皮祖细胞，该细胞的跨内皮迁移能力极显著提高，且经实验证实了其可以有效促进血管生成，治疗糖尿病引起的下肢缺血和脑缺血再灌注损伤，临床应用前景良好。

Description

慢病毒介导CXCR7高表达工程化内皮祖细胞在缺血性疾病中 的治疗应用
技术领域
本发明涉及细胞移植治疗领域，具体涉及一种基因修饰的内皮祖细胞。
背景技术
CXCR7，又称RDC1或CCX-CKR2，是基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derivedfactor-1，SDF-1)的新受体。CXCR7在哺乳动物中高度保守，处于人类的二号染色体上，与CXCR1、CXCR2、CXCR4基因处于同一染色体上的临近位置，广泛表达于造血系统、心脏、骨、肾和大脑等组织器官中。现有研究发现，CXCR7与血管形成有密切的关系。
晏小清，“CXCR7促进人脐带血来源内皮祖细胞血管生成的研究”，中国博士学位论文全文数据库(医药卫生科技辑)2013/02构建了一种包含天然CXCR7基因的重组腺病毒，以及包含该腺病毒的转基因内皮细胞(EPC)，证实高表达CXCR7能提高EPCs的存活能力、管样结构形成能力，但是由于腺病毒只能实现瞬时高表达CXCR7，而移植到体内的EPC需要较长时间的存活，且能通过旁分泌或者整合微血管内皮中促进血管新生，因此，瞬时高表达CXCR7对EPC移植治疗缺血性疾病明显存在问题，不能实现EPCs持续稳定高表达CXCR7。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种表达CXCR7的重组慢病毒及转基因细胞。
本发明提供了SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组病毒，它包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。其中，所述重组病毒是重组慢病毒。
本发明提供了一种转基因细胞，转入的基因是前述的重组慢病毒。
所述转基因细胞是包含前述重组病毒的内皮祖细胞。其中，所述内皮祖细胞是人脐带血内皮祖细胞、人骨髓来源内皮祖细胞、小鼠骨髓/外周血来源内皮祖细胞或大鼠骨髓/外周血来源内皮祖细胞。
本发明提供前述细胞在制备促进血管生成的细胞制剂或者制备治疗内皮损伤的细胞制剂中的用途；优选地，所述细胞制剂是治疗动脉粥样硬化引起的内皮损伤的细胞制剂。
本发明提供前述在制备治疗缺血性疾病的细胞制剂中的用途。
其中，所述缺血性疾病是下肢缺血、心肌缺血、脑缺血、肾脏缺血或者血管损伤及其引起的组织、器官损伤。进一步地，所述缺血性疾病是糖尿病下肢缺血或者脑缺血再灌注损伤；所述血管损伤及其引起的组织、器官损伤为创伤、战伤、烧伤、压伤、溃疡。
本发明构建得到了表达CXCR7的重组慢病毒，且通过感染人内皮祖细胞制备得到了转基因内皮祖细胞，该转基因内皮祖细胞中CXCR7的表达显著上调且表达稳定，且其在高脂环境中的存活率高，跨内皮迁移能力强，形成管样结构的能力增强。本发明含有该重组慢病毒的内皮祖细胞其“归巢”到缺血部位的能力显著增加，且能更有效地促进下肢血流恢复，促进毛细血管新生，从而促进循环重建，也在脑缺血再灌注损伤中能改善神经功能，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1CXCR7体外PCR扩增的结果。M:Maker；1:CXCR7；
图2重组质粒的PCR鉴定结果。M:DL2000DNA Marker：2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp，1～8：挑取的8个转化子；
图3重组质粒部分测序图；
图4慢病毒转染293T细胞图片(A:白光照片；B：荧光照片)；
图5人脐带血内皮祖细胞的形态；
图6慢病毒感染后的EPC；
图7各组EPC中CXCR7的mRNA表达变化；**P<0.01vs.Lv-null-EPCs/control；
图8Western-blot检测CXCR7蛋白的表达；**P<0.01vs.Lv-null-EPCs/control；
图9上调EPC中CXCR7的表达可以增强EPC抵抗ox-LDL诱导的凋亡的能力。**P<0.01vs.Lv-null-EPCs/control；#P<0.05,##P<0.01vs.Lv-CXCR7-EPCs/control；$$P<0.01vs.Lv-CXCR7-EPCs/ox-LDL；
图10上调EPC中CXCR7的表达可以显著保护EPC在ox-LDL作用下的跨内皮转移能力。**P<0.01vs.Lv-EPC/control；##P<0.01vs.Lv-CXCR7-EPC/control；++P<0.01vs.Lv-CXCR7-EPC/ox-LDL；
图11上调EPC中CXCR7的表达可以显著保护EPC在ox-LDL作用下的管样结构形成能力。*P<0.05,**P<0.01vs.Lv-null-EPCs/control；#P<0.05vs.Lv-CXCR7-EPCs/control；+P<0.05vs.Lv-CXCR7-EPCs/ox-LDL；
图12Lv-CXCR7-EPC移植促进糖尿病下肢缺血部位的微循环构建。(A)Lv-CXCR7-EPC移植能显著促进血流的恢复；(B)上调CXCR7的表达可以促进EPC“归巢”到缺血肌肉组织中；(C)Isolectin免疫荧光检测发现Lv-CXCR7-EPC移植能促进缺血部位中血管的新生，增加微血管密度。*p<0.05v.s.PBS；#p<0.05v.s.Lv-null-EPC；
图13Lv-CXCR7-EPC移植促脑缺血再灌注损伤的修复。(A)Lv-CXCR7-EPC移植能明显改善神经功能；(B)Lv-CXCR7-EPC移植能减少脑梗死体积；(C)Lv-CXCR7-EPC“归巢”到脑缺血部位的细胞数量明显多于Lv-null-EPC；(D)CD31免疫荧光检测发现Lv-CXCR7-EPC移植能促进脑缺血部位中血管的新生，增加微血管密度。*p<0.05v.s.PBS；&p<0.05v.s.Lv-null-EPC
具体实施方式
实施例1本发明重组慢病毒和转基因细胞的制备
1材料方法
1.1主要试剂
pLVX-3FLAG-EGFP-Puro(pSB44)载体购自上海升博生物技术有限公司；限制性核酸内切酶EcoR I、BamH I和T4DNA连接酶购自中国大连宝生物公司；质粒pCMV-dR8.9和pCMV-VSV-G，购自Addgene；质粒大抽试剂盒(Qiagen)；2×PCR MasterMix、DNA Marker购自中国北京天根生化科技有限公司；DMEM high glucose(GIBCO公司)；Opti-MEM(GIBCO公司)；EGM-2购自美国Lonza公司；纤连蛋白(FN)购自Sigma公司；SunBio Trans-EZ(SunBio,上海)；一抗CXCR7购自abcam公司,Rabbit Anti-GAPDH购自上海博士德公司，二抗GoatAnti-Rabbit IgG购自中杉金桥公司；293T人胚肾细胞和大肠杆菌DH5α感受态细胞为实验室保存。
1.2实验方法
重组慢病毒的制备：
1.2.1 CXCR7引物的设计
根据Genebank中报道的人CXCR7基因的核苷酸序列(NM_020311)，设计CXCR7特异性克隆引物及表达引物，CXCR7的克隆引物如下：5'-CGCCTCAGAACGATGGATC-3'；5'-AACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'。根据载体pSB44上的多克隆位点，上、下游引物的5'端分别引入酶切位点EcoR I、BamH I。设计添加酶切位点的表达引物：CXCR7上游引物：5’-CGGAATTCCGCCTCAGAACGATGGATC-3’；CXCR7下游引物：5'-CGGGAGCC AACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1.2.2 CXCR7基因的克隆
利用Trizol试剂盒提取HCT116细胞总RNA，然后经利用微量紫外分光光度计测总RNA浓度及纯度，并采用1％琼脂糖凝胶电泳进行RNA完整性检测。采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，反应步骤为：1μg模板RNA，1μl Anchored-oligo(dt)18primer，加DEPC-treat water至13μl，轻轻混匀并在微量离心机中离心3～5s，于65℃变性5min；将管放于冰上，按顺序加入下列物质：4μl的Transcriptor Rerverse Transcripcase(5×)，0.5μl的Protecter Rnase Inhibitor，2μl的Deoxynudeotide Mix,0.5μl Transcriptor RerveseTranscriptase,轻轻混匀，短暂离心，于50℃反应60min；85℃反应5min，最后－20℃保存备用。
根据反转录所得的cDNA为模板，利用CXCR7克隆引物及表达引物扩增，以获得可重组到表达载体pSB44上的目的基因(产物上、下游分别带有EcoR I、BamH I酶切位点)。PCR反应体系为：cDNA 1μl，克隆上下游引物各1μl，2×master mix 12.5ul，补dd H2O至25ul。第二次PCR反应基本与第一次相同，除了模板替换为第一次PCR产物。反应条件为：94℃3min、94℃30s、55℃30s、72℃1min、35个循环、72℃5min。将PCR扩增的片段经1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用手术刀片切下相应分子大小的条带，称重后移入EP管中。根据DNA片段纯化/回收试剂盒说明书进行胶回收。
1.2.3 pSB1432慢病毒过表达载体的构建与鉴定
将经过限制性内切酶EcoR I、BamH I双酶切的pSB44质粒和目的基因用琼脂糖凝胶电泳回收后，加入T4DNA连接酶16℃连接过夜。将连接产物转化新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞，先于37℃摇床中培养1h，然后取100μl接种在含有氨苄的LB平板培养基中，37℃下倒置培养16h后随机挑取阳性菌落，摇菌，提取质粒DNA，经验证引物PCR扩增鉴定，选择PCR鉴定为阳性克隆质粒邮寄公司测序鉴定明确有无突变。取测序正确后的克隆，摇菌扩大培养，用除内毒素大提试剂盒提取质粒DNA用于病毒包装。
1.2.4慢病毒颗粒的制备及病毒滴度测定
将293T细胞培养至对数生长期，接种于6孔板，待细胞生长80％汇合。转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入9ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。将三质粒系统(pSB44-CXCR71.5ug、pCMV-dR8.90.5ug、pCMV-VSV-G 1ug)共转染至293T细胞中。6h后，移去细胞上清，更换为10ml的DMEM完全培养基。转染36-48小时后，收集所有培养上清液4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片，然后将上清0.22μm PVDF过滤装置过滤滤膜过滤。超速离心法浓缩与纯化慢病毒，具体步骤为：将预处理的病毒上清液加入32ml于50ml离心管中，并从离心管底部缓慢打出4ml20％的蔗糖溶液，4℃，25000rpm(82700g)离心2小时，倒掉上清，加入200ul不含血清的opti-MEM洗下沉淀，4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡，－80℃分装保存，即得本发明重组慢病毒。
检测：病毒感染前1天，取24孔板接种293T细胞，细胞融合率为40％-60％进行病毒感染，感染前取两个孔细胞计数记为N。取3个EP管分别加入90ul完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)。取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培养基,终体积为500ul。感染开始后20小时，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO2继续培养48小时，观察荧光表达并拍照。用0.25％胰酶-EDTA溶液消化细胞，培养基吹洗整个细胞面，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA，每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量，然后用于定量PCR法测定病毒滴度，在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立，反应体系为50μl。病毒序列检测时扩增质粒标准品和待测样品基因组，人基因组序列检测时扩增基因组标准品和待测样品基因组，同时以无菌水做为无模板对照，所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统，循环条件设定为：50℃2min，95℃10min，然后是95℃15s，60℃1min的40个循环。测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。滴度(integration units perml，IU ml-1)的计算公式如下：IU ml-1＝(C×N×D×1000)/V其中：C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数，N＝感染时细胞的数目(约为1×105)，D＝病毒载体的稀释倍数，V＝加入的稀释病毒的体积数。
转基因细胞的制备：
1.2.5内皮祖细胞的分离培养
EPC是一种原代培养的内皮前体细胞，脂质体转染效率极低，选择合适的基因载体是对EPC进行基因修饰的关键所在。慢病毒载体是以Ⅰ型HIV为基础的新型载体，具有可高效感染分裂期及非分裂期细胞(优于逆转录病毒)、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达记免疫反应小(优于腺病毒)等特点，现已成为转移目的基因的理想载体。
无菌取人脐带血20ml，枸橼酸钠抗凝，用Hanks液按1：1的体积比稀释后，小心加入盛有等体积人淋巴细胞分离液Histopaque 1077的上层；室温400g离心30分钟；管内液体分成4层，取中间白膜层细胞；Hanks液洗涤两次。用添加含多种生长因子的SingleQuots并加入2％的胎牛血清的内皮细胞基础培养基EGM-2进行重悬细胞；将细胞接种于预先用人纤维连接蛋白(human FN,BD Bioscience,MA,USA；表衬浓度为2μg/cm2)包被的孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱内培养。细胞培养的前七天，每天换液，之后隔天换液。观察细胞形态并拍照。结果显示分离出的单个核细胞在EGM-2完全培养基中培养7天后，细胞形态呈圆形或者“鹅卵石”状，并且能够形成典型的细胞集落，并在分离培养后14天集落融合(图5)，这些特征与内皮细胞的形态特征一致。
1.2.6慢病毒感染内皮祖细胞
取P4代内皮祖细胞，按2×104/孔接种到24孔板，待其培养至40﹪汇合时用于病毒感染。以MOI＝50感染细胞，同时设置对照病毒感染组(感染空载体慢病毒)，于培养箱中培养24h，第二天更换培养基，3天后于倒置荧光显微镜下观察细胞感染率并拍照，即得本发明转基因细胞Lv-CXCR7-EPC，对照组细胞为Lv-null-EPC。
1.2.7 EPC中CXCR7的表达检测
(1)RT-PCR检测EPC中CXCR7的mRNA表达变化
在EPC感染慢病毒5天后，分别收集取正常EPC、对照病毒组感染EPC、CXCR7重组慢病毒组感染EPC各1×106个，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA，然后以cDNA为模版，采用RT-PCR(Real-time polymerase chain reaction)检测各组细胞中CXCR7的mRNA表达水平，以GAPDH为内参。相对基因的表达水平采用2-ΔΔCt分析法进行分析，ΔCt＝目的基因Ct值-GAPDH Ct值；ΔΔCt＝各样品ΔCt-空白对照组ΔCt平均值。同一实验重复三次，取均值，并求组内标准差。
(2)WB检测EPC中CXCR7蛋白表达变化
慢病毒感染5天后，分别收集正常EPC、对照病毒组感染EPC、CXCR7重组慢病毒组感染EPC，加入裂解液进行蛋白抽提，BCA法进行蛋白定量。从每个样品中抽取20μg分别进行凝胶电泳，经转膜、封闭、一抗(1:200)4℃孵育过夜(以β-actin作为内参)，洗膜，37℃下孵育二抗(1:1000)1h。洗膜后采用ECL试剂盒进行显色，在暗房中进行X胶片曝光，经显影定影处理后胶片用扫描仪扫，然后使用Gel-Pro analyzer软件分析各条带灰度值进行半定量比较分析，采用自身灰度值校正，将各组细胞CXCR7的灰度与对应管家基因β-actin灰度比值作为CXCR7基因的相对表达量。
2实验结果
2.1 CXCR7基因扩增结果
以HCT116细胞cDNA为模板，经PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，结果发现扩增条带在1100bp左右，与预测片段大小一致(图1)。
2.2重组表达质粒pSB1432的PCR鉴定结果
挑取阳性菌落进行扩大培养后，提取重组质粒，以质粒DNA为模板、质粒通用引物进行PCR鉴定，结果发现扩增出1367bp左右的条带，与预期结果一致(图2)，证明CXCR7已成功克隆到pSB44表达载体中。
2.3重组表达质粒测序鉴定
将经PCR鉴定为阳性的重组表达质粒4号送公司测序，经测序与GenBank上人类CXCR7基因序列进行比对分析，目的片段序列与预期一致，证明成功地克隆到慢病毒表达载体中(图3)。
阳性克隆测序结果分析:
测序结果表明，目的序列已经正确插入位点，图中突变为同义突变。
pSB1432所示序列(SEQ ID NO.1)为本发明克隆的CXCR7片段。psb1432seqsplicing是指CXCR7的天然表达序列。
2.5重组慢病毒颗粒的制备及滴度测定
利用脂质体将鉴定的阳性重组pSB44/CXCR7表达载体、pCMV-dR8.9和pCMV-VSV-G三个质粒共转染到293T细胞中，在荧光显微镜下观察到293T细胞中绿色荧光蛋白的表达(图4)；转染48h后收获上清，包装产生慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染293T细胞，检测病毒滴度，病毒的有效滴度约为2.03×108IU ml-1。
2.6内皮祖细胞的分离培养及病毒感染
培养3d后出现典型的“克隆集落”样结构，培养7d后，“集落”样结构逐渐地消失，大部分细胞铺展开来，呈“铺路石”样结构，与内皮细胞的形态特征相似(图5)。用所得CXCR7过表达慢病毒颗粒和空载体慢病毒颗粒分别感染EPCs,在MOI值为50时，感染72h后，GFP在EPC中大量表达(图6)，感染效率达到90％以上，同时发现，在感染CXCR7重组慢病毒载体的EPC中，GFP蛋白在细胞膜周边分布，由于GFP与CXCR7是融合蛋白，因而CXCR7是一个跨膜蛋白，所以GFP的分布与CXCR7的细胞中的表达分布有关。
2.7 CXCR7重组慢病毒表达载体上调EPC中CXCR7的表达
经RT-PCR检测发现(图7)，CXCR7重组慢病毒感染EPC中的CXCR7的mRNA表达量显著高于正常EPC组(1.28±0.123vs 0.67±0.06,p<0.01)，而转染空病毒EPC中的CXCR7mRNA表达与正常EPC组相当(0.64±0.062vs 0.67±0.06,p>0.05)；同时我们也通过western-blot检测分析发现(图8)，CXCR7重组慢病毒感染EPC组中的CXCR7蛋白表达量显著高于正常EPC组(1.18±0.132vs 0.46±0.113,p<0.01)，而转染空病毒组中的CXCR7蛋白表达与正常EPC组相当(0.45±0.101vs 0.46±0.113,p>0.05)，无显著性差异。
3结论
本发明成功构建得到了CXCR7过表达慢病毒载体，并制备了高滴度、能在细胞中稳定高效表达CXCR7的慢病毒颗粒，且通过感染人EPCs制备得到了转基因内皮祖细胞，该转基因EPCs中，CXCR7的表达显著上调且表达稳定。
以下用具体试验例的方式来证明本发明的有益效果：
试验例1本发明含有CXCR7重组慢病毒的转基因内皮祖细胞(转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC))在高脂环境中的血管生成能力，抵抗ox-LDL诱导EPC的凋亡的能力
利用ox-LDL处理模拟体内高脂环境，体外实验比较转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)(实施例1制备)和转染空慢病毒的EPC(Lv-null-EPC)(实施例1制备)在SDF-1诱导的存活、跨内皮迁移及管样结构形成能力：
1.1细胞存活实验
方法：Lv-CXCR7-EPC和Lv-null-EPC分别用胰酶消化，离心沉淀后洗涤2次，用含5％FBS的EBM2基础培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×104/ml；实验分为6个组，A组：Lv-null-EPC对照组(仅加入培养基)；B组：Lv-CXCR7-EPC对照组(仅加入培养基)；C组：Lv-null-EPC ox-LDL处理组(100μg/ml ox-LDL)；D组：Lv-CXCR7-EPC ox-LDL处理组(100μg/mlox-LDL)；E组：Lv-null-EPC ox-LDL+SDF-1处理组(100μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1)；F组：Lv-CXCR7-EPC 100μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1处理组(100μg/ml ox-LDL+100ng/mlSDF-1)；每组设置3个重复。将两种EPC分别加入12孔板中，每孔加入1ml EPC，使得各孔待测细胞密度为约5×104/孔；置于孵箱中孵育24h；然后用不含EDTA的胰酶消化细胞，利用Annexin V和PI进行双染，然后于流式细胞仪下法测定细胞凋亡率。
结果：如图9所示，与转染空慢病毒的EPC(Lv-null-EPC)相比，本发明转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)在高脂环境中的凋亡率显著降低，说明本发明转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)免受氧化损伤的能力显著提高。
1.2细胞跨内皮迁移实验
方法：将原代培养的HUVEC以5×104/孔的密度种在24孔Transwell的上腔，置于24孔板中培养至细胞融合。吸去培养基，PBS洗涤2次；将Lv-CXCR7-EPC和Lv-null-EPC分别用胰酶消化，用PBS重悬并计数，分别调整两种细胞的密度至5×104/ml。将细胞孔分成6个组，A组：Lv-null-EPC对照组(仅加入空白培养基)；B组：Lv-CXCR7-EPC对照组(仅加入空白培养基)；C组：Lv-null-EPC ox-LDL处理组(100μg/ml ox-LDL)；D组：Lv-CXCR7-EPC ox-LDL处理组(100μg/ml ox-LDL)；E组：Lv-null-EPC ox-LDL+SDF-1处理组(100μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1)；F组：Lv-CXCR7-EPC 100μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1处理组(100μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1)；每组设置3个复孔；A、B组上室加细胞，下室加5％FBS的EBM2培养液；C、D组细胞用ox-LDL预处理12h，然后加入transwell小室的上室，下室加入5％FBS的EBM2培养液；E、F组细胞先用ox-LDL与SDF-1预处理12h，然后同C、D组进行迁移实验。37℃孵育12h，让EPC穿过内皮细胞单层和Transwell的膜；孵育后，将transwell小室取出，用棉签将上腔的细胞刮掉。于荧光显微镜下，每个transwell随机选取5个视野，计数穿过transwell的带绿色荧光的细胞。
结果：如图10所示，与转染空慢病毒的EPC(Lv-null-EPC)相比，本发明转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)的迁移数量极显著提高，说明本发明转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)的跨内皮迁移能力显著提高。
1.3基质胶中形成管样结构实验
方法：将基质胶用碎冰包埋，置于4℃冰箱，过夜解冻，将移液枪枪头，48孔板等置于4℃预冷。向预冷的48孔板中每孔加入150μl基质胶，“8”字型摇动孔板，使胶铺平。将48孔放入细胞培养箱中37℃孵育30min，让基质胶聚合；将Lv-CXCR7-EPC和Lv-null-EPC用无血清培养基饥饿处理12h，以排除EBM2中包含的生长因子的影响；饥饿处理后，用胰酶消化细胞，离心后用无血清EBM2培养基重悬细胞，分别调整Lv-CXCR7-EPC和Lv-null-EPC细胞密度至1×105/ml。将基质胶孔分成6组，A组：Lv-null-EPC对照组；B组：Lv-CXCR7-EPC对照组；C组：Lv-null-EPC ox-LDL处理组(50μg/ml ox-LDL)；D组：Lv-CXCR7-EPC ox-LDL处理组(50μg/ml ox-LDL)；E组：Lv-null-EPC ox-LDL+SDF-1处理组(50μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1)；F组：Lv-CXCR7-EPC 50μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1处理组(50μg/ml ox-LDL+100ng/ml SDF-1)；每组设置3个复孔；“8”字型摇动48孔板，使得细胞均匀铺在胶上。将48孔板置于细胞培养箱中，37℃培养12h。将孔板置于光镜下观察、拍照，计算单个视野下管样结构的数量。
结果：如图11所示，与转染空慢病毒的EPC(Lv-null-EPC)相比，本发明转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)的管样结构数量极显著提高，说明本发明转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)的管样结构形成能力能力显著提高。
实验结果说明，本发明含有CXCR7重组慢病毒的转基因内皮祖细胞(转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC))在高脂环境中的存活率高，迁移能力强，形成管样结构的能力强，且效果显著优于CXCR7正常表达的EPC细胞。
试验例2本发明含有CXCR7重组慢病毒的转基因内皮祖细胞(转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC))对糖尿病下肢缺血的修复作用
转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)(实施例1制备)和转染空慢病毒的EPC(Lv-null-EPC)(实施例1制备)用于糖尿病缺血治疗：
方法：利用Db/Db小鼠采用股动脉结扎术构建糖尿病下肢缺血模型，采用在模型制作成功后1h，进行细胞移植，实验分为三个组：wt-EPCs移植组；CXCR7-EPC移植组；PBS对照组；取106个EPCs重悬于0.2ml PBS中，经尾静脉注射进行EPCs移植，对照组仅注射同体积的PBS。于移植后的1d,3d,1w,2w,3w,4w对各组动物进行多普勒血流扫描，评价血流恢复情况，同时还通过组织学检测评价EPC在缺血区的分布情况以及缺血组织中微血管的密度，从而判断CXCR7对EPC归巢能力以及缺血修复中发挥的作用。
结果：如图12所示，输注Lv-CXCR7-EPC与Lv-Null-EPC一周后，糖尿病小鼠缺血后肢血流情况均较PBS组有改善，输注Lv-CXCR7–EPC比Lv-Null-EPC效果明显更好(图12A)。一个月后截取缺血后肢腓肠肌进行组织学检测。通过慢病毒转让的EPC自带的绿色荧光示踪，结果显示Lv-CXCR7–EPC组小鼠有更多的EPC细胞掺入缺血部位(图12B)，并在缺血部位形成了更多的毛细血管(CD31染色，图12C)。
实验结果说明，本发明含有CXCR7重组慢病毒的转基因内皮祖细胞(转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC))可以有效促进血管生成，治疗糖尿病引起的下肢缺血，且效果显著优于CXCR7正常表达的EPC细胞。
试验例3本发明含有CXCR7重组慢病毒的转基因内皮祖细胞(转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC))对大鼠局灶性缺血再灌注损伤的修复中的作用
转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC)(实施例1制备)和转染空慢病毒的EPC(Lv-null-EPC)(实施例1制备)用于局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗：
方法：线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型(造模方法参见Li W etal,Curcumin bydown regulating NF-kB and elevating Nrf2,reduces brain edema and neurologicaldysfunction after cerebral I/R.Microvasc Res.2015Dec 11)，缺血后2h拔出线栓再灌注。待模型制作成功后24h，进行细胞移植，实验分为三个组：wt-EPCs移植组；CXCR7-EPC移植组；PBS对照组；取5*106个EPCs重悬于0.5ml PBS中，经尾静脉注射进行EPCs移植，对照组仅注射同体积的PBS。在移植后2周后，分别比较神经功能评分、梗死灶体积、微血管密度，评价EPC对脑缺血再灌注损伤的修复作用。
结果：如图13所示，发现Lv-CXCR7-EPC移植组，能明显改善神经功能(图13A)；促进缺血组织的修复，减少梗死体积(图13B)；并且发现Lv-CXCR7-EPC在缺血区中的分布也明显多于Lv-null-EPC(图13C)；且该组中的微血管密度显著增加(图13D)。由此可见，上调EPC中CXCR7的表达能够促进EPCs“归巢”到缺血部位，参与血管新生，促进微循环重构，从而改善神经功能。
实验结果说明，本发明含有CXCR7重组慢病毒的转基因内皮祖细胞(转染CXCR7高表达慢病毒的EPC(Lv-CXCR7-EPC))可以有效促血管生成，促进大鼠局灶性缺血再灌注损伤的修复，改善神经功能，且效果显著优于CXCR7正常表达的EPC细胞。
综上，本发明制备得到了高滴度的CXCR7重组慢病毒，其能在细胞中稳定高效表达CXCR7，且通过感染人内皮祖细胞制备得到了转基因内皮祖细胞，该转基因内皮祖细胞中CXCR7的表达显著上调，且其在高脂环境中的存活率高，迁移能力强，形成管样结构的能力强，在体内移植治疗缺血性疾病的研究中发现，上调EPC中CXCR7的表达，能显著促进EPC“归巢”到缺血组织，效促进糖尿病下肢缺血的血流恢复，促进微血管新生，在脑缺血再灌注损伤中能改善神经功能。综上所述，CXCR7高表达EPC在治疗缺血性疾病的临床应用前景良好。

Claims (1)

1.带有序列如SEQ ID NO.1所述核苷酸的重组慢病毒在制备提高内皮祖细胞抗氧化损伤能力的制剂中的用途；
所述重组慢病毒所对应的慢病毒载体为pLVX-3FLAG-EGFP-Puro载体，SEQ ID NO.1所述核苷酸序列被插入到该载体的EcoR I和BamH I酶切位点之间。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108355133A (zh) * 2017-01-26 2018-08-03 中国医学科学院阜外医院 靶向cxcr7的药物组合物和方法
EP3607023B1 (en) 2017-04-06 2023-06-07 Nissan Chemical America Corporation Hydrocarbon formation treatment micellar solutions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101199550A (zh) * 2007-11-16 2008-06-18 中国医学科学院血液学研究所 利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法及其用途
CN103397052A (zh) * 2013-08-15 2013-11-20 温州医科大学 高表达人cxcr7基因的内皮祖细胞及制备方法和应用
CN105331575A (zh) * 2014-08-13 2016-02-17 苏州方舟基因药业有限公司 一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101199550A (zh) * 2007-11-16 2008-06-18 中国医学科学院血液学研究所 利用脐带或胎盘制备含有内皮祖细胞制剂的方法及其用途
CN103397052A (zh) * 2013-08-15 2013-11-20 温州医科大学 高表达人cxcr7基因的内皮祖细胞及制备方法和应用
CN105331575A (zh) * 2014-08-13 2016-02-17 苏州方舟基因药业有限公司 一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Synthetic construct DNA, clone_ pF1KB4249, Homo sapiens CXCR7 gene for - Nucleotide;AB385537.1;《GENBANK》;20081003;全文 *
CXCR7-shRNA慢病毒载体对人肝癌细胞生长及侵袭能力的抑制作用;戴小珍等;《南方医科大学学报》;20130715;第33卷(第7期);1.2.1 CXCR7-shRNA慢病毒载体构建 *

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