CN105331575A - 一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。本发明提供了一种内皮祖细胞的高效扩增培养方法，使得CD34+单个核细胞在保持其原来干性特征的基础上实现有效和大量的扩增，本发明人还优化了内皮生长因子组合贴壁培养技术，对内皮祖细胞进行扩增及分化。本发明的技术方案可提供大量的内皮祖细胞，可解决移植治疗缺血性疾病以及甲型血友病的内皮祖细胞或内皮细胞的来源和数量问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。
背景技术
内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于脐带血、成人外周血、骨髓。内皮祖细胞与造血干细胞来自共同的中胚层前体细胞血液血管母细胞(Hemangioblast)，在生理或病理因素刺激下，可以从骨髓动员到外周血中参与损伤血管的修复，而脐血中的内皮祖细胞起源于胎儿的肝脏。近年来的研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，同时，因其可分化为表达FVIII的血管内皮细胞，可作为一种细胞治疗途径用于FVIII缺乏的甲型血友病。
正常情况下，内皮祖细胞的数量极少，外周血中约为500-1000个/mL，脐血中的数量约高3.5倍。早期的内皮祖细胞表达三种祖细胞分子标志：CD133、CD34和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)，之后逐渐失去CD133表型和祖细胞特性，并开始表达内皮系的特征性分子标志：血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)，假性血友病因子(vWF)以及凝血VIII因子(FVIII)，从而分化为晚期内皮祖细胞，继续分化为成熟的内皮细胞。
目前，内皮祖细胞的培养技术是从脐血、外周血、骨髓等标本中获得的单个核细胞或CD34、CD133阳性选择后的单个核细胞，在体外包被有人纤维连接蛋白(fibronectin，FN)的基底上加入血管内皮生长因子(vascularendotheliagrowthfactor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)等内皮生长因子进行内皮祖细胞的扩增和分化。现有的内皮祖细胞培养技术可以在体外对人血管内皮祖细胞进行一定程度的扩增，但在保持干性和数量上有局限。
目前，内皮祖细胞的培养技术可以获得一定数量供科研需要，但还无法实现较大规模生产的需求，并且不能充分保持祖细胞的干性。因此，本领域亟待提高扩增的效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种内皮祖细胞(人血管内皮祖细胞)的高效扩增培养体系。
在本发明的第一方面，提供一种培养人血管内皮祖细胞的方法(为非治疗性方法)，所述方法包括：
(1)利用干细胞扩增培养基扩增CD34+单个核细胞(较佳地为CD34+、CD133+单个核细胞)；
(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得人血管内皮祖细胞；
其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：
干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；
Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；
血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；
白介素3(IL-3)：5-250ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；和
Sall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL。
其中，所述的内皮祖细胞培养基包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：
血管内皮生长因子(VEGF)：10-100ng/mL；
胰岛素样生长因子(IGF)：5-100ng/mL；
表皮细胞生长因子(EGF)：2-20ng/mL；
成纤维细胞生长因(b-FGF)：5-100ng/mL；
抗坏血酸(AscorbicAcid)：0.5-5μg/mL；
肝素(Heparin)：50-200U/mL；
氢化可的松(Hydrocortisone)：80-300ng/mL；和
L谷胺酰胺(L-glutamine)：1-5mM。
在一个优选例中，所述的干细胞基础培养基选自(但不限于)：ModifiedIMDM培养基或ModifiedStemSpan培养基；或所述的内皮细胞基础培养基选自(但不限于)：EGM-2培养基、M199、M200培养基等类似培养基(较佳地含有15-25％胎牛血清)。
在另一优选例中，步骤(1)包括：CD34+单个核细胞加入到所述的干细胞扩增培养基中，使得细胞浓度为5-40×104个细胞/mL(较佳地为10-25×104个细胞/mL)；培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述的干细胞扩增培养基使得细胞浓度为5-40×104个细胞/mL(较佳地为10-25×104个细胞/mL)；步骤(1)进行5-7天。
在另一优选例中，步骤(2)包括：步骤(1)进行5-7天后，将获得的细胞转移到所述的内皮祖细胞培养基中、置于包被有纤维连接蛋白的培养板中培养，细胞在培养基中密度为0.3-3×106个细胞/mL(较佳地0.5-2×106个细胞/mL)，继续培养2-4天后吹散细胞，选择贴壁细胞继续培养；后续每3天更换1次内皮祖细胞培养基；更换3-6次后收获细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基，其中包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：
干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；
Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；
血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；
白介素3(IL-3)：5-250ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；和
Sall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL。
在一个优选例中，所述的用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基，中包括如下细胞因子：
干细胞因子：100-300ng/mL；
Flt3-配体：100-300ng/mL；
血小板因子：10-60ng/mL；
白介素3：10-150ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子：8-20ng/mL；和
Sall样蛋白4B：2-8ng/mL。
在本发明的另一方面，提供一种用于培养人血管内皮祖细胞的培养基，其中包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：
血管内皮生长因子：10-100ng/mL；
胰岛素样生长因子：5-100ng/mL；
表皮细胞生长因子：2-20ng/mL；
成纤维细胞生长因：5-100ng/mL；
抗坏血酸：0.5-5μg/mL；
肝素：50-200U/mL；
氢化可的松：100-300ng/mL；和
L谷胺酰胺：1-5mM。
在一个优选例中，所述的用于培养人血管内皮祖细胞的培养基中，所述组分包括：
血管内皮生长因子：30-80ng/mL；
胰岛素样生长因子：10-60ng/mL；
表皮细胞生长因子：5-15ng/mL；
成纤维细胞生长因：8-80ng/mL；
抗坏血酸：1-4μg/mL；
肝素：80-150U/mL；
氢化可的松：100-200ng/mL；和
L谷胺酰胺：2-4mM。
在本发明的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于制备人血管内皮祖细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备人血管内皮祖细胞的试剂盒，所述试剂盒中包括：
(a)所述的用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基；和
(b)所述的用于培养人血管内皮祖细胞的培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明对人脐血CD34+干细胞及内皮祖细胞的扩增情况(I)。
A、总细胞和CD34+细胞的扩增数目；
B、总细胞和CD34+细胞的扩增倍数；
C、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增数目；
D、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增倍数；
E、贴壁培养内皮祖细胞的扩增数目；
F、贴壁培养内皮祖细胞的扩增倍数。
图2、本发明对人脐血干细胞来源的内皮祖细胞扩增及分化结果的鉴定。
A、人脐血来源的内皮祖细胞扩增及分化的细胞形态图；
B、人脐血来源的内皮祖细胞扩增后免疫荧光鉴定图。
图3、本发明对动员后人外周血CD34+干细胞及内皮祖细胞的扩增(I)。
A、总细胞和CD34+细胞的扩增数目；
B、总细胞和CD34+细胞的扩增倍数；
C、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增数目；
D、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增倍数；
E、贴壁培养内皮祖细胞的扩增数目；
F、贴壁培养内皮祖细胞的扩增倍数。
图4、本发明对动员后人外周血来源的内皮祖细胞贴壁扩增及分化结果的鉴定。
A、动员后人外周血来源的内皮祖细胞扩增及分化的细胞形态图
B、人脐血来源的内皮祖细胞扩增后免疫荧光鉴定图
图5、本发明对人脐血CD34+干细胞及内皮祖细胞的扩增情况(II)。
A、总细胞和CD34+细胞的扩增数目；
B、总细胞和CD34+细胞的扩增倍数；
C、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增数目；
D、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增倍数；
E、贴壁培养内皮祖细胞的扩增数目；
F、贴壁培养内皮祖细胞的扩增倍数。
图6、本发明对动员后人外周血CD34+干细胞及内皮祖细胞的扩增(II)。
A、总细胞和CD34+细胞的扩增数目；
B、总细胞和CD34+细胞的扩增倍数；
C、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增数目；
D、表达CD133和VEGFR-2的早期内皮祖细胞扩增倍数；
E、贴壁培养内皮祖细胞的扩增数目；
F、贴壁培养内皮祖细胞的扩增倍数。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，开辟了一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养方法，使得CD34+单个核细胞在保持其原来干性特征的基础上实现有效和大量的扩增，本发明人还优化了内皮生长因子组合贴壁培养技术，对内皮祖细胞进行扩增及分化。本发明的技术方案可提供大量的内皮祖细胞，可解决移植治疗缺血性疾病以及甲型血友病的内皮祖细胞或内皮细胞的来源和数量问题。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”“基本上由……构成”、和“由……构成”。
培养基
本发明人根据人血管内皮祖细胞扩增培养的不同阶段，提供了不同的培养基，包括：干细胞扩增培养基和内皮祖细胞培养基。
所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞因子(SCF)、Flt3-配体(FLT-3L)、血小板因子(TPO)、白介素3(IL-3)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)和Sall样蛋白4B(Sall4B)。上述各细胞因子以适合的比例添加到干细胞基础培养基中，可为CD34+单个核细胞(较佳地为CD34+、CD133+单个核细胞)提供适合的离体生长环境的培养基，促进CD34+单个核细胞的生长和扩增。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的干细胞扩增培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
表1配方的细胞因子被添加于干细胞基础培养基中，得到干细胞扩增培养基，从而为CD34+单个核细胞提供适宜的生长和扩增环境。所述的细胞培养基可以选择ModifiedIMDM培养基、ModifiedStemSpan培养基或类似的细胞培养基。
所述的内皮祖细胞培养基包括：血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因(b-FGF)、抗坏血酸(AscorbicAcid)、肝素(Heparin)、氢化可的松(Hydrocortisone)和L谷胺酰胺(L-glutamine)。上述各组分以适合的比例添加到内皮细胞基础培养基中，获得本发明的内皮祖细胞培养基。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的内皮祖细胞培养基的各组分的用量如表2所示。
表2
| 含量 | 优选量 | 更优选量 | |
| 血管内皮生长因子(VEGF) | 10-100ng/mL | 30-80ng/mL | 50ng/mL |
| 胰岛素样生长因子(IGF) | 5-100ng/mL | 10-60ng/mL | 20ng/mL |
| 表皮细胞生长因子(EGF) | 2-20ng/mL | 5-15ng/mL | 10ng/mL |
| 成纤维细胞生长因(b-FGF) | 5-100ng/mL | 8-80ng/mL | 10ng/mL |
| 抗坏血酸(Ascorbic Acid) | 0.5-5μg/mL | 1-4μg/mL | 2μg/mL |
| 肝素(Heparin) | 50-200U/mL | 80-150U/mL | 100U/mL |
| 氢化可的松(Hydrocortisone) | 80-300ng/mL | 100-200ng/mL | 100ng/mL |
| L谷胺酰胺(L-glutamine) | 1-5mM | 2-4mM | 4mM |
表2配方的组分被添加于内皮细胞基础培养基中，得到本发明的内皮细胞培养基，从而为内皮祖细胞提供了优选的简化的培养基配方。
经本发明人优化后的上述培养基，含有足够且合理的促进细胞生长和扩增的成份、以及有利于细胞保持干性或实现分化的成分，有利于内皮祖细胞的培养。
用于配制培养基的Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、IL3、GM-CSF、VEGF、IGF、EGF、b-FGF等细胞因子均是本领域技术人员易于获得的，例如可通过商业途径购买，或可通过人工合成或重组表达获得。
培养方法
目前的研究表明，循环系统中的血管内皮祖细胞可参与血管再生及损伤血管的修复，同时因其可以表达FVIII和游走的移植特性，使其成为治疗缺血性疾病以及血友病的一个新思路，但数量不足的问题是研发成为细胞治疗途径的严重障碍。
因此，本发明还提供了一种培养人血管内皮祖细胞的方法，所述方法包括：(1)利用干细胞扩增培养基扩增CD34+单个核细胞(较佳地为CD34+、CD133+单个核细胞)；(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得内皮祖细胞。
本发明中，所述的CD34+单个核细胞(较佳地为CD34+、CD133+单个核细胞)可分离自脐血、动员后外周血以及其它来源(例如购自一些培养机构)。
本发明首先分离CD34+单个核细胞，通过更换优化后的干细胞扩增培养基和内皮祖细胞培养基，实现CD34+单个核细胞先大量扩增后其中表达CD34+/CD133+/VEGFR2+的内皮祖细胞贴壁扩增及分化的过程。第一步使用促进增殖的干细胞扩增培养基，第二步使用贴壁生长的内皮祖细胞扩增培养基。本发明可以高效获得临床级别的内皮祖细胞，使其作为自体回输移植和细胞制剂的宝贵资源能够充分获得，为临床上的缺血性疾病、血友病提供一种安全有效的治疗手段。
本发明前期使用了SCF、Flt-3L、TPO、IL3、GM-CSF和Sall4B-TAT的干细胞扩增配方，后期采用了VEGF、IGF、EGF、FGF等的内皮祖细胞生长扩增配方，首次实现内皮祖细胞在体外的大量扩增，建立起了利用血液干细胞制备通用型血管内皮祖细胞的技术。本发明的几个主要特点和优势：第一，本发明在整个培养体系采用临床级别的人源细胞生长因子，不引入外源性基因，因此不改变原干细胞的基因组稳定性，无致瘤风险；第二，本发明可使干细胞在体外培养6天后CD34+细胞数扩增100倍以上，具有CD133+/VEGFR2+双阳标志的内皮祖细胞数量扩增40倍以上，贴壁培养至第21天可继续扩增30倍以上，整个体系可以在三周内达到1400倍以上的扩增效率。第三，本发明前期培养加入的干细胞生长因子可以较好的维持细胞的干性，使早期内皮祖细胞的数量较多，有助于移植后向病灶的游走及归巢。
本发明的应用将有效解决现存的问题，同时与现有技术相比，本发明的优点和进步主要体现在从血液CD34+干细胞中分离纯化培养血管内皮祖细胞之前，先对CD34+干细胞进行了高效扩增，使得CD34+/CD133+/VEGFR-2+的早期内皮祖细胞在进入指数生长期之前既提升了数量也保持了干性，可更加有效地用于移植治疗。
目前已有的干细胞扩增方法有使用饲养层细胞和插入外源性基因，饲养层细胞的方法不能使子干细胞维持与母干细胞相同的成熟状态，且引入了外源性的细胞干扰，而引入外源性基因表达会对于造血干细胞的干性和基因稳定性造成了干扰。本发明可以在分离纯化培养内皮祖细胞之前，使CD34+细胞安全有效的扩增到100倍以上，其中CD133+/VEGFR2+的早期内皮祖细胞扩增达到41.9倍，在此基础上，从第6天到第21天的贴壁培养期，内皮祖细胞可继续扩增33.6倍，因此整个培养体系可以在三周内达到1400倍以上安全有效的扩增效率，并且在这整个培养体系中没有引入外源性基因载体和非人源性蛋白，确保了临床应用的安全性。本发明突破了现有技术的缺陷，采用临床级别的细胞因子组合，对来源安全可靠的脐血中的CD34+干细胞进行高效扩增和分离培养内皮祖细胞，具有更高的临床应用和科研价值。
本发明的结合干细胞扩增和内皮细胞生长的培养技术可以在体外获得大量的人血管内皮祖细胞，所获得的细胞能够应用于治疗血管生成及修复障碍的缺血类疾病和FVIII缺乏的血友病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、培养基的配制
本发明的培养体系包含CD34+干细胞扩增、内皮祖细胞贴壁扩增分化两个部分：
一、CD34+干细胞扩增期：干细胞扩增培养基
采用ModifiedIMDM培养基(无血清)作为基础培养基，在其中添加选自表3中任一配方的细胞因子：
表3(单位：ng/mL)
| 配方A | 配方B | 配方C | |
| SCF | 200 | 100 | 400 |
| FLT-3L | 200 | 100 | 400 |
| TPO | 20 | 10 | 150 |
| IL-3 | 10 | 5 | 200 |
| GM-CSF | 12.5 | 8 | 20 |
| Sall4B | 3 | 2 | 8 |
二、贴壁扩增期：内皮祖细胞扩增分化培养基
采用EGM-2培养基(20％胎牛血清)作为基础培养基，在其中添加选自表4中任一配方的细胞因子和其他成分：
表4(除另外标示的以外，单位为ng/mL)
| 配方D | 配方E | 配方F | |
| VEGF | 50 | 10 | 100 |
| IGF | 20 | 10 | 100 |
| EGF | 10 | 4 | 16 |
| b-FGF | 10 | 20 | 80 |
| 抗坏血酸 | 2μg/mL | 1μg/mL | 4μg/mL |
| 肝素 | 100U/mL | 50U/mL | 200U/mL |
| 氢化可的松 | 100ng/mL | 150ng/mL | 250ng/mL |
| L谷胺酰胺 | 4mM | 2mM | 5mM |
实施例2、对人脐血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(I)
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在ModifiedIMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF200ng/mL、Flt-3L200ng/mL、IL-310ng/mL、TPO20ng/mL、Sall4B3ng/mL、GM-CSF12.5ng/mL(即实施例1中配方A)作为扩增培养基。
(2)分离纯化脐血CD34+干细胞
取新鲜足月健康新生儿脐带血，使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞，获得细胞数量为1.5×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为15×105个细胞/mL，吸100μL细胞悬液加入24孔板每孔1mL的CD34+干细胞扩增培养基中，即15×104个细胞/孔(n＝3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测
取2×105细胞置于15ml离心管中，平均分配5×104细胞置于1.5mLEP管中，共4个EP管，每管加入1mL含1％BSA的PBS洗涤液，室温下1200rpm离心5分钟，弃去上清，用100μL含1％BSA的PBS重悬细胞沉淀，管1-1加入2μLCD34抗体(PE-Mouseanti-humanCD34)，管1-2加入2μL相对应的同型对照(PE-Mouseanti-humanIgG1κ)。管2-1加入2μLVEGFR-2抗体(PE-Mouseanti-humanVEGFR-2)和2μLCD133抗体(APC-Mouseanti-humanCD133)，管2-2加入相对应的同型对照(PE-Mouseanti-humanIgG1κ和APC-Mouseanti-humanIgG1κ)抗体2μL，抗体加入后室温避光孵育15分钟，而后每管加入1mLPBS洗涤，1200rpm离心5分钟，弃去上清，用100μLPBS重悬细胞，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR2的表达情况。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方A)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。结果如图1所示，总细胞和CD34+细胞的绝对数目分别为2.68×107±2.90×106和1.57×107±2.28×106(n＝3，图1A)；扩增倍数分别为178.6±31.6和108±15.6(n＝3，图1B)；CD133+/VEGFR-2+细胞绝对数目为5.28×104±4.81×103，扩增倍数为41.9±5.07(n＝3，图1C，1D)。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EGM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF50ng/mL、IGF20ng/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、抗坏血酸2μg/mL、肝素100U/mL、氢化可的松100ng/mL、L-谷胺酰胺4mM(即实施例1中配方D)。
(2)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(3)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的所有细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，分别培养至第15，18，21天(n＝3)。
第9天：
吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。
第12天：
更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方D)。
第15-21天：
(1)每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方D)。
(2)分别在第15，18，21天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁细胞绝对数目，与第6天起始的内皮祖细胞相比，贴壁的内皮祖细胞绝对数目为4.72×104±3.74×103(n＝3，图1E)，扩增倍数为33.7±2.67(n＝3，图1F)，累积总扩增倍数为1412.03±102.25(n＝3)。记录第3天，6天，15天，21天的细胞形态图，结果见图2A。
(3)细胞鉴定：取第21天细胞用1％多聚甲醛固定，PBS洗5min，3遍，5％BSA固定1h后加入CD31(rabbitantihuman；1：500)和FVIII(mouseantihuman；1：500)一抗，4℃孵育过夜，PBS洗5min，3遍，加入二抗(Cy-3-Donkeyantirabbit和FITC-Donkeyantimouse；1:1000)室孵育1h，PBS洗5分钟，3遍，Hochest33324(1：1000)染细胞核10min，PBS洗5min，3遍后用显微镜拍照，90％以上的贴壁细胞可见细胞膜表达红色的CD31，胞浆内表达绿色的FVIII，结果见图2B。说明已从体外扩增后的人脐血来源CD34+干细胞中获得具有内皮相关功能的晚期内皮祖细胞，可直接移植或继续分化为成熟的内皮细胞后移植，用于缺血性疾病的血管生成及甲型血友病的FVIII支持。
实施例3、对动员后人外周血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(I)
人骨髓动员后外周血采集：采集前5天，采用5μg/kg给予健康成年志愿者G-CSF，连续动员3天，每次采集200-300mL外周血。
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在ModifiedIMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF200ng/mL、Flt-3L200ng/mL、IL-310ng/mL、TPO20ng/mL、Sall4B3ng/mL、GM-CSF12.5ng/mL(即实施例1中配方A)作为扩增培养基。
(2)分离纯化外周血CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血10mL，PBS稀释20倍，使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞，获得细胞数量为2.5×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为15×105个细胞/mL，吸100μL细胞悬液加入24孔板每孔1mL的CD34+干细胞扩增培养基中，即15×104个细胞/孔(n＝3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测：同实施例2中相应部分(第0天，(3))。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方A)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。结果如图3所示，总细胞和CD34+细胞的绝对数目分别为1.72×107±2.80×106和1.06×107±4.60×106(n＝3，图3A)，扩增倍数分别为114.9±13.9和73.0±10.1(n＝3，图3B)，CD133+/VEGFR-2+细胞绝对数目为2.70×104±3.49×103，扩增倍数为38.6±6.67(n＝3，图3C，3D)。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EGM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF50ng/mL、IGF20ng/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、AscorbicAcid2μg/mL、Heparin100U/mL、Hydrocortisone100ng/mL、L-glutamine4mM(即实施例1中配方D)。
(3)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(4)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，分别培养至第15，18，21天(n＝3)。
第9天：
吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。
第12天：
更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方D)。
第15-21天：
(1)每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方D)。
(2)分别在第15，18，21天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁的内皮祖细胞绝对数目，与第6天起始的内皮祖细胞相比，贴壁的内皮细胞绝对数目为3.43×104±4.15×103(n＝3，图3E)，扩增倍数为21.90±2.65(n＝3，图3F)，累积总扩增倍数为834.58±119.03(n＝3)，同时记录第3天，6天，15天，21天的细胞形态图，结果见图4A。
(3)细胞鉴定：方法同实施例2，结果见图4B。说明已从体外扩增后的人动员后外周血来源CD34+干细胞中获得具有内皮相关功能的晚期内皮祖细胞，可直接移植或继续分化为成熟的内皮细胞后移植，用于缺血性疾病的血管生成及甲型血友病的FVIII支持。
实施例4、对人脐血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(II)
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在ModifiedIMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF100ng/mL、Flt-3L100ng/mL、IL-35ng/mL、TPO10ng/mL、Sall4B2ng/mL、GM-CSF8ng/mL(即实施例1中配方B)作为扩增培养基。
(2)分离纯化脐血CD34+干细胞
取新鲜足月健康新生儿脐带血，使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞，获得细胞数量为1.2×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为20×105个细胞/mL，吸100μL细胞悬液加入24孔板每孔1mL的CD34+干细胞扩增培养基中，即20×104个细胞/孔(n＝3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测：同实施例2中相应部分(第0天，(3))。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方B)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。结果如图5所示，总细胞和CD34+细胞的绝对数目分别为2.48×107±3.55×106和1.56×107±3.14×106(n＝3，图5A)；扩增倍数分别为124.09±9.18和80.20±8.73(n＝3，图5B)；CD133+/VEGFR-2+细胞绝对数目为4.77×104±7.81×103，扩增倍数为27.24±3.42(n＝3，图5C，1D)。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EGM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF10ng/mL、IGF10ng/mL、EGF4ng/mL、b-FGF20ng/mL、抗坏血酸1μg/mL、肝素50U/mL、氢化可的松150ng/mL、L-谷胺酰胺2mM(即实施例1中配方E)。
(2)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(3)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的所有细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，分别培养至第15，18，21天(n＝3)。
第9天：
吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。
第12天：
更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方E)。
第15-21天：
(1)每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方E)。
(2)分别在第15，18，21天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁细胞绝对数目，与第6天起始的内皮祖细胞相比，贴壁的内皮祖细胞绝对数目为4.16×104±4.22×103(n＝3，图5E)，扩增倍数为21.67±2.95(n＝3，图5F)，累积总扩增倍数为590.29±46.81(n＝3)。
实施例5、对动员后人外周血来源的内皮祖细胞的扩增及分化II
人骨髓动员后外周血采集：同实施案例3中相应部分。
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在ModifiedIMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF400ng/mL、Flt-3L400ng/mL、IL-3200ng/mL、TPO150ng/mL、Sall4B8ng/mL、GM-CSF20ng/mL(即实施例1中配方C)作为扩增培养基。
(2)分离纯化外周血CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血10mL，PBS稀释20倍，使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+单个核细胞，获得细胞数量为2×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为10×105个细胞/mL，吸100μL细胞悬液加入24孔板每孔1mL的CD34+干细胞扩增培养基中，即10×104个细胞/孔(n＝3)。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测：同实施例2中相应部分(第0天，(3))。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方C)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、CD133、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和CD133+/VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。结果如图6所示，总细胞和CD34+细胞的绝对数目分别为1.44×107±1.90×106和0.96×107±1.30×106(n＝3，图6A)，扩增倍数分别为144.0±23.5和96.0±11.1(n＝3，图6B)，CD133+/VEGFR-2+细胞绝对数目为2.27×104±2.36×103，扩增倍数为35.43±2.17(n＝3，图6C，6D)。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EGM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF100ng/mL、IGF100ng/mL、EGF16ng/mL、b-FGF8ng/mL、AscorbicAcid4μg/mL、Heparin200U/mL、Hydrocortisone250ng/mL、L-glutamine5mM(即实施例1中配方F)。
(3)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(4)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，分别培养至第15，18，21天(n＝3)。
第9天：
吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。
第12天：
更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方F)。
第15-21天：
(1)每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方F)。
(2)分别在第15，18，21天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁的内皮祖细胞绝对数目，与第6天起始的内皮祖细胞相比，贴壁的内皮细胞绝对数目为6.59×104±6.65×103(n＝3，图6E)，扩增倍数为41.85±4.48(n＝3，图6F)，累积总扩增倍数为1482.75±131.20(n＝3)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种培养人血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)利用干细胞扩增培养基扩增CD34+单个核细胞；
(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得人血管内皮祖细胞；
其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：
干细胞因子：50-500ng/mL；
Flt3-配体：50-500ng/mL；
血小板因子：5-200ng/mL；
白介素3：5-250ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子：5-25ng/mL；和
Sall样蛋白4B：1-10ng/mL。
其中，所述的内皮祖细胞培养基包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：
血管内皮生长因子：10-100ng/mL；
胰岛素样生长因子：5-100ng/mL；
表皮细胞生长因子：2-20ng/mL；
成纤维细胞生长因：5-100ng/mL；
抗坏血酸：0.5-5μg/mL；
肝素：50-200U/mL；
氢化可的松：80-300ng/mL；和
L谷胺酰胺：1-5mM。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞基础培养基选自：ModifiedIMDM培养基或ModifiedStemSpan培养基；
所述的内皮细胞基础培养基选自：EGM-2培养基、M199、M200培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：CD34+单个核细胞加入到所述的干细胞扩增培养基中，使得细胞浓度为5-40×104个细胞/mL；培养2-4天后根据细胞数目增加量添加所述的干细胞扩增培养基使得细胞浓度为5-40×104个细胞/mL；步骤(1)进行5-7天。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：步骤(1)进行5-7天后，将获得的细胞转移到所述的内皮祖细胞培养基中、置于包被有纤维连接蛋白的培养板中培养，细胞在培养基中密度为0.3-3×106个细胞/mL，继续培养2-4天后吹散细胞，选择贴壁细胞继续培养；后续每3天更换1次内皮祖细胞培养基；更换3-6次后收获细胞。
5.一种用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基，其特征在于，其中包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：
干细胞因子：50-500ng/mL；
Flt3-配体：50-500ng/mL；
血小板因子：5-200ng/mL；
白介素3：5-250ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子：5-25ng/mL；和
Sall样蛋白4B：1-10ng/mL。
6.如权利要求5所述的用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基，其特征在于，其中包括如下细胞因子：
干细胞因子：100-300ng/mL；
Flt3-配体：100-300ng/mL；
血小板因子：10-60ng/mL；
白介素3：10-150ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子：8-20ng/mL；和
Sall样蛋白4B：2-8ng/mL。
7.一种用于培养人血管内皮祖细胞的培养基，其特征在于，其中包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：
血管内皮生长因子：10-100ng/mL；
胰岛素样生长因子：5-100ng/mL；
表皮细胞生长因子：2-20ng/mL；
成纤维细胞生长因：5-100ng/mL；
抗坏血酸：0.5-5μg/mL；
肝素：50-200U/mL；
氢化可的松：100-300ng/mL；和
L谷胺酰胺：1-5mM。
8.如权利要求7所述的用于培养人血管内皮祖细胞的培养基，其特征在于，所述组分包括：
血管内皮生长因子：30-80ng/mL；
胰岛素样生长因子：10-60ng/mL；
表皮细胞生长因子：5-15ng/mL；
成纤维细胞生长因：8-80ng/mL；
抗坏血酸：1-4μg/mL；
肝素：80-150U/mL；
氢化可的松：100-200ng/mL；和
L谷胺酰胺：2-4mM。
9.权利要求5-8任一所述的培养基的用途，用于制备人血管内皮祖细胞。
10.一种用于制备人血管内皮祖细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(a)权利要求5或6所述的用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基；和
(b)权利要求7或8所述的用于培养人血管内皮祖细胞的培养基。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Qin Meng Inventor after: Jiang Yongping Inventor after: Guan Xin Inventor after: Dai Wei Inventor before: Qin Meng Inventor before: Jiang Yongping Inventor before: Dai Wei |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190510 Address after: 215126 Qingqiu Street 277, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Suzhou Ark Biomedicine Co., Ltd. Address before: 215126 Qingqiu Street 277, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee before: Suzhou Fangzhou Gene Pharmaceutical Co., Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201210 Address after: 215126 Qingqiu Street 277, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Patentee after: Suzhou Ark Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 215126 Qingqiu Street 277, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee before: Suzhou Ark Biomedicine Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |