CN108424877A - 用于快速繁殖过表达ang-1的epc的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于快速繁殖过表达ANG‑1的EPC的组合物，通过对人体外周血或骨髓中获取的单核细胞进行培养获得干细胞培养基制剂X，将该制剂添加到含有多种细胞培养因子的内皮细胞基础培养基中得到本发明的组合物。通过实验发现，干细胞培养基制剂X能够明缩短过表达ANG‑1的EPC的传代培养周期，并能有效提高表达ANG‑1的EPC的单代增殖倍数。将用本发明的组合物大量培养的过表达ANG‑1的EPC用于构建组织工程骨，有望解决骨组织工程研究中的血管化问题。

Description

用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体地，涉及用于快速繁殖EPC的组合物，更具体地，涉及用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物。
背景技术
由于创伤、感染、肿瘤等原因造成的各种类型骨缺损是我们临床上遇到的常见问题，骨组织工程技术的逐渐兴起为骨缺损的修复提供了有效的解决策略，但在应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时，核心部位往往因为没有有效生成血管造成坏死，因此急需解决组织工程骨血管化问题。
血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)是一群具有游走特性，尚未表达成熟血管内皮细胞表型，能分化为血管内皮细胞直接参与血管形成。它在骨髓、脐带血及外周血中均存在,在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用，并以血管发生方式形成新生血管。
血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG-1)能够调控存在的血管丛以出芽的方式萌生出新生血管，实现血管生成。具体地，ANG-1特异性作用于内皮细胞Tie2受体，召集血管周细胞和平滑肌细胞，通过内皮周围支持细胞的聚集，包装内皮管道，形成完整的血管壁。但是，ANG-1蛋白在体内很快被血液、组织液稀释，半衰期短，很难在局部保持持续的有效作用浓度，而且局部大量应用副作用严重。
随着基因工程技术的发展，转基因的组织工程技术为血管化提供了新的思路和方法。用外源基因ANG-1转染EPC制备过表达ANG-1的EPC，既能使ANG-1基因在EPC内持续、高效的表达，又能优化EPC促血管新生的效果，将这种转染细胞种用于构建血管化组织工程骨，有望解决骨组织工程研究中血管化问题。
EPC数量有限，获取困难，将过表达ANG-1的EPC用于构建血管化组织工程骨，需要对过表达ANG-1的EPC进行体外快速繁殖培养。EPC体外培养时，培养周期长，单代繁殖数量少，且需要经纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)介导贴壁生长才能更好地存活。中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院分离了人外周血、脐带血、骨髓以及脐带来源的内皮祖细胞对其进行了贴壁培养，研究了不同来源的内皮祖细胞的增殖活力、细胞周期和免疫表型。哈尔滨医科大学附属第二医院血管外科研究了不同种类培养基和不同培养血清浓度对EPC培养增殖的影响，但是，通过调整培养基的种类和培养用血清浓度并没有明显提高EPC的单代增殖数量。中国专利公布CN101940590A公布了一种促进创伤愈合的制剂，通过诱导单核细胞获得EPC，进而对EPC进行体外培养，最后分离EPC获得无细胞培养基，用该无细胞培养基制备了促进创伤愈合的制剂，但是，并没有证明该制剂能够促进血管形成，而且制剂在体内应用容易被血液、组织液等稀释，不利于长期发挥功效。
然而，目前并没有专门适用于过表达ANG-1的EPC的培养组合物，在常规的EPC培养基中，由于基因组上各个基因的平衡性以及外源基因对原始基因在表达资源上的竞争，导致培养基中的资源大部分用于ANG-1的表达，而细胞繁殖明显受到抑制，尽管进行过表达，但单个细胞的表达量是非常有限的，一旦细胞繁殖受到抑制，细胞数量低，则ANG-1的总表达量非常有限。因此想要大量生产表达ANG-1，则需要提高细胞数量，实现过表达ANG-1的EPC的快速大量繁殖。
综上所述，需要提供一种用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，缩短EPC体外培养的培养周期，增加EPC体外培养单代繁殖数量。
发明内容
本发明提供了一种用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，该组合物能明显缩短了EPC体外培养的繁殖周期，而且提高了过表达ANG-1的EPC体外培养单代繁殖的数量，能够为解决骨组织工程技术的血管化问题提供大量的过表达ANG-1的EPC。
本发明公开了一种用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，该组合物为包括以下成分的内皮细胞基础培养基：5-120ng/mL的血管内皮生长因子、2-120ng/mL的胰岛素样生长因子、0.5-30ng/mL的表皮细胞生长因子、5-100ng/mL成纤维细胞生长因子、0-5μg/mL的坑坏血酸、0-0.2g/mL的胎牛血清和5-150ng/mL的干细胞培养基制剂X。
优选地，上述组合物中添加的表皮生长因子的浓度为10-20ng/mL。
优选地，上述组合物中添加的干细胞培养基制剂X的浓度为20-130ng/mL。
优选地，上述组合物中添加的血管内皮生长因子的浓度为20-100ng/mL。
优选地，上述组合物所用的内皮细胞基础培养基为DMEM培养基、DMEM+HG培养基、M199培养基、1640培养基、DMEM培养基、EGM-2培养基、M200培养基或DMEM/F12培养基中的一种。
在一些优选的实施方案中，上述组合物中还可包括浓度为0.1-5ng/mL的集落刺激因子。
进一步地，干细胞培养基制剂X的制备方法如下：
(1)从健康人血液中通过密度梯度离心的方法获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；
(2)采用包括以下成分的干细胞基础培养基对获得的单核细胞进行培养：20-500ng/mL的干细胞因子、25-600ng/mL的FMS样络氨酸激活酶-3-配体、2-300ng/mL的血小板因子、1-300ng/mL的白介素3、1-40ng/mL的粒细胞集落剌激生物因子、0.2-15ng/mL的Sall样蛋白4B；
(3)培养3-5天后分离细胞和培养基，获得无细胞培养基，对获得的无细胞培养基进行过滤细胞碎片、纯化、冻干处理获取干细胞培养基制剂X。
更进一步地，在制备干细胞培养基制剂X的过程中，从外周血或骨髓中通过密度梯度离心获取单核细胞的方法：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为10-30℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。
更进一步地，在制备干细胞培养基制剂X的过程中使用的干细胞基础培养基为Modified IMDM培养基或ModifiedStemSpan培养基。
更进一步地，在制备干细胞培养基制剂X的过程中，干细胞基础培养基中添加的干细胞因子的浓度优选为150-200ng/mL。
更进一步地，在制备干细胞培养基制剂X的过程中单核细胞在干细胞培养基上的接种浓度为2-60×104个细胞/mL。
与现有技术相比较，本发明的有益效果和创新点如下：
(1)通过添加干细胞培养基制剂X，明显提高了过表达ANG-1的EPC培养的单代繁殖数量。
(2)通过添加干细胞培养基制剂X，明显缩短了过表达ANG-1的EPC传代培养的传代周期。
(3)本发明提供的方法能够使得过表达ANG-1的EPC在短时间内快速大量繁殖，为ANG-1的产生提供了细胞基础。
(4)将用本发明的组合物大量培养的过表达ANG-1的EPC用于构建组织工程骨，有望解决骨组织工程研究中的血管化问题。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
基础实施例：用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物
该组合物为包括以下成分的M199内皮细胞基础培养基：80ng/mL的血管内皮生长因子、80ng/mL的胰岛素样生长因子、0.5ng/mL的表皮细胞生长因子、50ng/mL成纤维细胞生长因子、5μg/mL的坑坏血酸、0-0.2g/mL的胎牛血清和5-150ng/mL的干细胞培养基制剂X；
其中，干细胞培养基制剂X的制备方法如下：
(1)用Ficoll-Paque作为梯度剂，在20℃的温度下，以300g的离心力对健康人的外周血进行密度梯度离心分离，密度梯度离心分离时间为30分钟，离心完成后吸取当中不透明层，获得外周血单核细胞；
(2)采用包括以下成分的Modified IMDM干细胞基础培养基对获得的外周血单核细胞进行培养：200ng/mL的干细胞因子、600ng/mL的FMS样络氨酸激活酶-3-配体、30ng/mL的血小板因子、50ng/mL的白介素3、20ng/mL的粒细胞集落剌激生物因子、5ng/mL的Sall样蛋白4B，其中，外周血单核细胞的接种浓度为2-60×104个细胞/mL；
(3)培养3-5天后分离细胞和培养基，获得无细胞培养基，对获得的无细胞培养基进行过滤细胞碎片、纯化、冻干处理获取干细胞培养基制剂X。
通过调整基础实施例中的具体实验参数，得到具体实施例1-12，如表1-4所示。为了突出本发明的有益效果，进一步设置了对比例1，如表2所示。
实验方法：
采用FN按5μg/cm2的浓度对25cm2细胞培养瓶进行包被，将经过包被的25cm2细胞培养瓶置于37℃的温度下孵育2小时；
按照1×106个细胞/mL的浓度将过表达ANG-1的EPC细胞接种至FN包被的25cm2细胞培养瓶中的本发明的组合物中，置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中进行初代培养，3天后换液除去未贴壁的悬浮细胞，贴壁细胞继续进行培养，以后每3天换液1次；
待细胞80％左右融合用消化液进行消化，并按照1:3的比例进行传代培养，所用的消化液中含有质量分数为0.125％的胰蛋白酶和质量分数为0.1％的EDTA，传代培养的培养条件和初代培养的条件相同；
培养期间，每天在倒置相差显微镜下观察贴壁细胞的形态和数量。
解释说明：以下表格中的“N”指未进行该步骤的处理。
通过调整M199内皮细胞基础培养基中胎牛血清和干细胞培养基制剂X的浓度、干细胞培养基制剂X制备过程中外周血单核细胞的接种浓度和培养时间，得到了表1中的实施例1-4。实施例1-4中的实验数据显示，用本发明的组合物对过表达ANG-1的EPC进行体外初代培养时，最快经过8天，最慢经过13天的培养可以达到80％的细胞融合。对经过初代培养的过表达ANG-1的EPC进行传代培养，传代培养的周期最短为4天，最长为8天；各种组合物中平均每代的增殖倍数最多是15倍，最少是9倍。
表1
为了探究M199内皮细胞基础培养基中添加的干细胞培养基制剂X的作用，本发明进一步设置了表2中的实施4-7和对比例1。表2中对比例1的数据显示了相同的实验条件下，199内皮细胞基础培养基中不添加干细胞培养基制剂X时的实验效果。对比例1中过表达ANG-1的EPC初代培养经过18天达到80％的融合，所需时间明显多余实施例中的时间；对比例1的传代培养周期为10天，明显长于实施例中传代培养的周期；对比例1中平均每代的增殖倍数为7，明显低于实施例中的单代增殖倍数：在M199内皮细胞基础培养基中添加干细胞培养基制剂X能够明显缩短过表达ANG-1的EPC传代培养的周期，并且能够提高其培养的单代繁殖倍数。进一步对比实施例4-7中的实验数据发现：M199内皮细胞基础培养基中干细胞培养基制剂X添加的浓度对过表达ANG-1的EPC的传代培养周期和单代增殖倍数均有明显影响，当干细胞培养基制剂X的浓度为80ng/mL时，过表达ANG-1的EPC的传代培养周期最短，单代培养的增殖倍数最大。
表2
表3和表4进一步探究了干细胞培养基制剂X的制备过程中外周血单核细胞接种浓度和培养时间对培养过表达ANG-1的EPC的影响。表3中的实验数据显示外周血单核细胞接种浓度会对过表达ANG-1的EPC的传代培养周期和平均每代增殖倍数产生影响，其中外周血单核细胞的接种浓度为25×104个细胞/mL时，传代培养的周期最短，平均每代的增殖倍数最多。通过调整外周血单核细胞的培养时间，设置了表4中的实施例4和实施例11-12，表4中的实验数据显示，外周血单核细胞的培养时间会影响过表达ANG-1的EPC的传代培养周期和平均每代增殖倍数，其中，经过4天培养制备的干细胞培养基制剂X对细胞生长的促进作用最好。
表3
表4

Claims (10)

1.用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于，该组合物为包括以下成分的内皮细胞基础培养基：5-120ng/mL的血管内皮生长因子、2-120ng/mL的胰岛素样生长因子、0.5-30ng/mL的表皮细胞生长因子、5-100ng/mL成纤维细胞生长因子、0-5μg/mL的坑坏血酸、0-0.2g/mL的胎牛血清和5-150ng/mL的干细胞培养基制剂X；
内皮细胞基础培养基为DMEM培养基、DMEM+HG培养基、M199培养基、1640培养基、DMEM培养基、EGM-2培养基、M200培养基或DMEM/F12培养基中的一种；
干细胞培养基制剂X的制备方法如下：
(1)从健康人血液中通过密度梯度离心的方法获取外周血单核细胞，或从骨髓中通过密度梯度离心的方法获取骨髓单核细胞；
(2)采用包括以下成分的干细胞基础培养基对获得的单核细胞进行培养：20-500ng/mL的干细胞因子、25-600ng/mL的FMS样络氨酸激活酶-3-配体、2-300ng/mL的血小板因子、1-300ng/mL的白介素3、1-40ng/mL的粒细胞集落剌激生物因子、0.2-15ng/mL的Sall样蛋白4B；
(3)培养3-5天后分离细胞和培养基，获得无细胞培养基，对获得的无细胞培养基进行过滤细胞碎片、纯化、冻干处理获取干细胞培养基制剂X。
2.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的表皮生长因子的浓度为10-20ng/mL。
3.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的干细胞培养基制剂X的浓度为20-130ng/mL。
4.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的血管内皮生长因子的浓度为20-100ng/mL。
5.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的密度梯度离心用Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品作为梯度剂。
6.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的密度梯度离心的温度为10-30℃，离心力为200g-500g。
7.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的密度梯度离心时间为20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。
8.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的干细胞基础培养基为Modified IMDM培养基或Modified StemSpan培养基。
9.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的干细胞因子的浓度为150-200ng/mL。
10.根据权利要求1所述的用于快速繁殖过表达ANG-1的EPC的组合物，其特征在于：所述的单核细胞在干细胞培养基上的接种浓度为2-60×104个细胞/mL。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101940590A (zh) * 2010-08-27 2011-01-12 上海士腾生物技术有限公司 促进创伤愈合的制剂及其制备方法
CN105331575A (zh) * 2014-08-13 2016-02-17 苏州方舟基因药业有限公司 一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系

Patent Citations (2)

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