CN103397052A - 高表达人cxcr7基因的内皮祖细胞及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞及制备方法和应用。本发明通过将人CXCR7基因克隆至腺病毒载体中，得到的重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒重组，经包装细胞包装，得到携带人CXCR7基因的腺病毒；再将该携带人CXCR7基因的腺病毒感染人脐带血来源内皮祖细胞，得到高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞。该高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞较野生型的EPC有更强的在血清剥夺环境中存活的能力，更强的与活化内皮的粘附、跨内皮迁移以及管样结构形成能力，可望作为种子细胞用于治疗脏器衰竭及缺血性疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞及制备方法和应用。
背景技术
血管生成在机体发育、再生和缺血修复中起关键作用，促进血管生成已经成为组织缺血损伤及器官衰竭治疗的重要策略（Isner and Asahara,Journal of Clinical Investigation,1999,103,1231-1236）。在血管生成过程中，内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPC）起着至关重要作用，见文献“Singh and Lokeshwar,Cancer Research,71,3268-3277；Isner and Asahara,Journal of Clinical Investigation,1999,103,1231-1236；Hristov,Erl et al.,ArteriosclerosisThrombosis and Vascular Biology,2003,23,1185-1189；Rafii and Lyden,Nature Medicine,2003,9,702-712；Ingram,Caplice et al.,Blood,2005,106,1525-1531；Schatteman,Dunnwald et al.,American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2007,292,H1-H18；Hirschi,Ingram et al.,Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology,2008,28,1584-1595；Leone,Valgimigli et al.,European Heart Journal,2009,30,890-899；Tarnowski,Liu et al.,EuropeanJournal of Haematology,2010,85,472-483；Toshner and Morrell,International Journal of ClinicalPractice,2010,64,7-12”。EPC是一类来源于骨髓，并广泛存在于人的脐带血、外周血及血管壁和心肌等组织的内皮前体细胞（Asahara,Murohara et al.,Science,1997,275,964-967,Dzau,Gnecchi et al.,Hypertension,2005,46,7,Khakoo and Finkel,Annual Review of Medicine,2005,56,79-101）。EPC能够掺入血管生成部位，启动并参与形成新生血管，同时还能趋化血管生成部位附近的成熟内皮细胞向新生血管迁移，促进新生血管的形成与稳定（Khakoo and Finkel,Annual Review of Medicine,2005,56,79-101）。脐带血（Murohara,Ikeda et al.,Journal of ClinicalInvestigation,2000,105,1527-1536）、外周血（Kamihata,Matsubara et al.,ArteriosclerosisThrombosis and Vascular Biology,2002,22,1804-1810）或骨髓（Asahara,Masuda et al.,Circulation Research,1999,85,221-228）来源的EPC移植均能有效促进后肢缺血或者心肌缺血的血流恢复。
EPC参与血管生成过程受到包括VEGF、SDF-1在内的多种生化因子调控（Khakoo andFinkel,Annual Review of Medicine,2005,56,79-101）。其中，SDF-1能够激活静息状态的骨髓EPC，动员其进入外周循环（动员），使其募集、停留并掺入组织缺血部位（募集），原位分化成内皮样细胞（分化），形成新血管（Sainz and Sata,Arteriosclerosis,thrombosis,and vascularbiology,2007,27,263）。此外，SDF-1还能抑制EPC凋亡，增强EPC粘附并穿过活化内皮层的能力，促进血管生成（Ceradini,Kulkarni et al.,Nature Medicine,2004,10,858-864）。长久以来，SDF-1被认为是通过其唯一受体CXCR4起作用（Barbero,Bonavia et al.,Cancer Research,2003,63,1969；Rubin,Kung et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences,2003,100,13513；Kuhlmann,Schaefer et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,335,1107-1114；Sainz and Sata,Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology,2007,27,263；Yang,Jackson et al.,Cancer Research,2007,67,651-658），但最近人们发现一个新的SDF-1作用受体—CXCR7（Balabanian,Lagane et al.,Journal of Biological Chemistry,2005,280,35760-35766,Burns,Summers et al.,Journal of Experimental Medicine,2006,203,2201-2213）。CXCR7与SDF-1的结合能力比CXCR4强（Balabanian,Lagane et al.,Journalof Biological Chemistry,2005,280,35760-35766），能够单独介导SDF-1诱导的肿瘤细胞(Burns,Summers et al.,Journal of Experimental Medicine,2006,203,2201-2213)、神经细胞(Bakondi,Shimada et al.,Stem Cells and Development,2010,20,1021-1029)和肾祖细胞(Mazzinghi,Ronconi et al.,The Journal of experimental medicine,2008,205,479-490)的存活，并与CXCR4一同介导SDF-1诱导的肿瘤细胞粘附（Burns,Summers et al.,Journal of Experimental Medicine,2006,203,2201-2213）、增殖（Meijer,Ogink et al.,British Journal of Cancer,2008,99,1493-1501）以及分化（Infantino,Moepps et al.,Journal of Immunology,2006,176,2197-2207），此外，CXCR7还能够不依赖于SDF-1而激活VEGF信号通路（Kollmar,Rupertus et al.,International Journal ofCancer,2010,126,1302-1315）。虽然已有的少量研究初步揭示了CXCR7的部分功能，但人们对CXCR7功能的了解还非常之少，而且已有的结果也存在很多相悖之处。（1）CXCR7是否是一种G蛋白偶联受体尚不明确。Burns等人认为CXCR7不能够介导MCF-7细胞的钙离子迁移（Burns,Summers et al.,Journal of Experimental Medicine,2006,203,2201-2213），而Sierro等人发现共表达CXCR7和CXCR4的HEK293细胞比单独表达CXCR4的HEK293细胞有更强的钙离子流动（Sierro,Frederic et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America,2007.104,14759-14764）。（2）CXCR7在细胞存活和细胞增殖中的作用也存在争议。CXCR7能够促进乳腺癌细胞MDA MB435细胞的存活而不能介导其增殖（Burns,Summers et al.,Journal of Experimental Medicine,2006,203,2201-2213）；但在结肠癌细胞CT26和乳腺癌细胞KEP1中，CXCR7能够促进细胞增殖，而不能介导细胞存活（Meijer,Ogink et al.,British Journal of Cancer,2008,99,1493-1501）。由此可见，CXCR7的功能非常复杂，而且可能存在物种和细胞特异性。
如何改进EPC，使其具有更强的血管生成能力是研究者的一个探索目标。如使用促血管生长因子预处理（Zemani,Silvestre et al.,Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology,2008,28,644-650;）EPC，或者通过向EPC细胞基因转染促血管生长因子基因VEGF（Meng,Li et al.,Chinese Medical Journal,2010,123,471-477;）、SDF-1（Kuliszewski,Kobulnik et al.,CanadianJournal of Cardiology,2007,23,221C-222C;）、HGF（Song,Yu et al.,Vascular Pharmacology,2009,51,205-213;）或eNOS（Zhao,Courtman et al.,Circulation,2004,110,234-234,Vijayaraghavan,Graham et al.,Canadian Journal of Cardiology,2007,23,222C-222C;）表达，都能够增强EPC血管生成能力，促进血管生成。但是，上述方法改进得到的EPC还不能满足人们的需求。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞。
本发明的再一目的在于提供所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，包括以下步骤：将人CXCR7基因克隆至腺病毒载体中，得到的重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒重组，经包装细胞包装，得到携带人CXCR7基因的腺病毒；再将该携带人CXCR7基因的腺病毒感染人脐带血来源内皮祖细胞，得到高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞；
所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，更优选包括以下步骤：
（1）根据人CXCR7基因的序列，设计如下引物：
BglII CXCR7-primer F：5'-TTGAGATCTCGCCTCAGAACGATGGATC-3'；
HindIII CXCR7-primer R：5'-CGTAAGCTTAACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'；
（2）以含有人CXCR7基因的序列为模板，利用引物对BglII CXCR7-primer F和HindIIICXCR7-primer R进行PCR扩增，得到BglII-CXCR7-HindIII序列；
（3）通过BglII限制性内切酶和HindIII限制性内切酶分别双酶切BglII-CXCR7-HindIII序列和腺病毒载体；再将双酶切后的BglII-CXCR7-HindIII序列和腺病毒载体连接，得到重组腺病毒载体；
（4）将步骤（3）得到的重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒同源重组，得到重组腺病毒重组子；
（5）将步骤（4）得到的重组腺病毒重组子通过包装细胞包装，得到携带人CXCR7基因的腺病毒；
（6）将步骤（5）得到的携带人CXCR7基因的腺病毒感染人脐带血来源内皮祖细胞，得到高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞；
步骤（2）中所述的含有人CXCR7基因的序列优选通过如下步骤得到：提取人肝癌细胞Hep G2细胞的总RNA，对提取得到的总RNA进行逆转录，得到cDNA；再通过引物对CXCR7-primer F和CXCR7-primer R对cDNA进行PCR扩增，得到含有人CXCR7基因的序列；
CXCR7-primer F：5'-CGCCTCAGAACGATGGATC-3'；
CXCR7-primer R：5'-AACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'；
所述的逆转录的具体操作优选为：1ng总RNA、1μl10pmol/μl的引物oligo(dT)18，加入10μl无RNA酶的水，轻轻混匀后简单离心；65℃孵育5min，冰上冷却后离心；加入5×反应缓冲液4μl，20U/μl的RiboLock RNA酶抑制剂1μl，10mM dNTP混合液2μl，最后加入200U/μl的RevertAid M-MuLV你转录酶1μl；轻轻混匀后，离心；于42℃孵育60min；之后70℃加热5min结束反应；
所述的再通过引物对CXCR7-primer F和CXCR7-primer R对cDNA进行PCR扩增的条件优选为98℃10s、55℃15s、72℃90s，32个循环；
步骤（2）中所述的利用引物对BglII CXCR7-primer F和HindIII CXCR7-primer R进行PCR扩增的条件优选为98℃10s、55℃15s、72℃90s，32个循环；
步骤（3）中所述的腺病毒载体优选为pAdTrack-CMV质粒；
步骤（4）中所述的腺病毒骨架质粒优选为AdEASY-1腺病毒骨架质粒；
步骤（5）中所述的包装细胞优选为人胚肾HEK293细胞；
步骤（5）中所述的将步骤（4）得到的重组腺病毒重组子通过包装细胞包装是指将重组腺病毒重组子线性化，然后通过脂质体转染方式或是电击孔法转染方式将线性化重组腺病毒重组子导入包装细胞中，培养至包装细胞出现细胞病变；
所述的线性化优选为通过限制性内切酶PacI酶切所述的重组腺病毒重组子得到；
一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞，通过上述制备方法得到；
所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞可作为用于移植治疗脏器衰竭及缺血性疾病的种子细胞，用于制备细胞移植的药物进行应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞（EPC）较野生型的EPC有更强的在血清剥夺环境中存活的能力，更强的与活化内皮的粘附、跨内皮迁移以及管样结构形成能力，可望作为种子细胞用于治疗脏器衰竭及缺血性疾病。外源性添加SDF-1能协同促进其功能。
附图说明
图1是pAdTrack-CXCR7穿梭质粒酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DL2000Marker；泳道1为BglII和HindⅢ双酶切后的重组穿梭质粒pAdTrack-CXCR7。
图2是重组腺病毒质粒pAd-CXCR7经PacI酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M1为HindIII酶切λ质粒Marker，泳道M2为DL7000Marker，泳道1和2为PacI酶切不同克隆得到的pAd-CXCR7重组腺病毒质粒。
图3是人脐带血内皮祖细胞的分离与鉴定结果图，其中：A为分离后4天、7天及21天后的内皮祖细胞光镜图；B为通过吞噬ac-LDL及结合UEA-1检测EPC内皮功能结果图；C为免疫荧光检测EPC特异性表面标记VEGFR2、CD133的结果图。
图4是通过Western Blot检测人EPC细胞和Hela细胞中CXCR7及CXCR4表达水平的结果图。
图5是重组腺病毒pAd-CXCR7以不同MOI值转染人脐带血EPC3天后的光镜图及荧光照片图。
图6是转染不同腺病毒的EPC中CXCR7及CXCR4蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中：A为代表性的WB结果图；B为蛋白表达的定量结果图。
图7是转染不同腺病毒的EPC在血清剥夺环境下的细胞凋亡结果图。
图8是转染不同腺病毒的EPC与活化内皮细胞粘附结果图。
图9是转染不同腺病毒的EPC跨内皮迁移结果图。
图10是转染不同腺病毒的EPC体外管样结构形成能力图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
携带人CXCR7基因腺病毒的构建
（1）引物设计
根据Genebank数据库（基因编号：BC036661.2）提供的人CXCR7的cDNA序列，按照一般引物设计原则和酶切的要求，采用primer5.0以编码区为模板分别设计CXCR7全长cDNA的上下游引物和带酶切位点及保护碱基的CXCR7上下游引物。
上游引物CXCR7-primer F：5'-CGCCTCAGAACGATGGATC-3'；
下游引物CXCR7-primer R：5'-AACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'；
含Bgl II酶切位点及保护碱基的CXCR7上游引物：
BglII CXCR7-primer F：5'-TTGAGATCTCGCCTCAGAACGATGGATC-3'；
含HindIII酶切位点及保护碱基的CXCR7下游引物：
HindIII CXCR7-primer R：5'-CGTAAGCTTAACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'。
（2）总RNA的提取
用含10%FBS（v/v）DMEM培养基将人肝癌细胞Hep G2（中科院细胞库，目录号：TCHu72）细胞培养至90%融合，吸去培养基，PBS缓冲液（0.01M、pH=7.4）洗涤3遍后，立即加入1ml TRIZOL LS Reagent，用移液枪轻轻吹打混匀。裂解的细胞匀浆在15～30℃条件下保温5min以便核蛋白复合体的解离。将细胞裂解液转移至无RNA酶的1.5ml EP管，加入0.2ml氯仿。盖紧瓶盖后，漩涡混匀15s，再室温孵育3min；之后于4℃、12000rpm离心10min。将水相转移至一个新的无RNA酶的EP管中。加入等体积的70%（v/v）乙醇，颠倒混匀后转入吸附柱RA中，于10000rpm离心1min，弃废液后将吸附柱重新套回收集管；加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃废液；加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃废液；再12000rpm离心2min，尽可能除干净漂洗液；向吸附膜的中间部位加入50μl预热至50-60℃的无RNA酶水，室温放置2min后，12000rpm离心1min；将得到的液体重新加入吸附柱中，室温放置2min后，12000rpm离心1min。将获得的RNA电泳鉴定后，置于-80℃保存；
（3）反转录合成单链cDNA
单链cDNA的合成按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas,Cat.NO.K1621）所提供的方法，采用oligo(dT)primer为引物进行，概述如下：取1μl总RNA（约含有1ng总RNA），加入1μl浓度为10pmol/μl的oligo(dT)18引物，加入10μl无RNA酶的水，轻轻混匀后简单离心；65℃孵育5min，冰上冷却后简单离心；加入5×Reaction Buffer4μl，RiboLock RNase Inhibitor（20U/μl）1μl，10mM dNTP Mix2μl，最后加入RevertAid M-MuLVReverse Transcriptase（200U/μl）1μl；轻轻混匀后，离心；于42℃孵育60min；之后70℃加热5min结束反应。
（4）扩增CXCR7全长cDNA
以CXCR7-primer F及CXCR7-primer R为引物，利用Primer STAR高保真酶（Takara,Cat.NO.R010A）扩增CXCR7全长cDNA.反应体系为：
PCR热循环程序为：98℃10s、55℃15s、72℃90s，32个循环；4℃维持。得到CXCR7全长cDNA的PCR产物。
（5）将获得的CXCR7全长序列连接到pMD19-T质粒，得到pMD19T-CXCR7质粒
在200μl EP管中加入pMD19-T质粒（Takara）1μl，CXCR7全长cDNA的PCR产物1μl，dH2O3μl以及5μl Solution I；16℃反应过夜；将全部液体（10μl）加入1管大肠杆菌DH5α感受态细胞（200μl，Takara）中，冰上放置30min；42℃热激90s后，再放置在冰上3min；加入790μl LB液体培养基后，37℃、100rpm振荡培养60min；用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基铺板，得到LB平板；取200μl菌液涂布LB平板；37℃培养14h后，挑取菌落。经菌液PCR鉴定（使用引物CXCR7-primer F和CXCR7-primer R，扩增条件同步骤（4））后，用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基扩增阳性菌落。采用高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型，百泰克,Cat.NO.DP1001）提取pMD19T-CXCR7质粒，具体操作参见说明书。测序确定pMD19T-CXCR7质粒中CXCR7cDNA正确扩增。
（6）穿梭质粒pAdTrack-CXCR7构建
以pMD19T-CXCR7质粒为模板，BglII CXCR7-primer F和HindIII CXCR7-primer R为引物，利用Primer STAR高保真酶扩增出带BglII和HindIII酶切位点的CXCR7cDNA，扩增条件同步骤（4）。用限制性内切酶Bgl II（Takara）和HindⅢ（Takara）双酶切（Buffer K，37℃酶切6小时）带酶切位点的CXCR7cDNA和穿梭质粒pAdTrack-CMV（Addgene,Cat.NO：16405），并纯化酶切产物。带粘性末端的pAdTrack–CMV载体与带粘性末端的CXCR7全长片段按摩尔比1∶7混合，T4DNA连接酶（Takara）16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含50μg/ml卡那霉素的LB培养基筛选阳性细胞。扩增后提取质粒，Bgl II和HindⅢ双酶切鉴定含CXCR7基因全长的重组穿梭质粒pAdTrack-CXCR7（结果如图1所示），测序确定CXCR7基因未在扩增中出现基因突变。
（7）同源重组获得携带人CXCR7基因的腺病毒质粒
使用限制性内切酶Pme I（NEB）于37℃酶切重组质粒pAdTrack-CXCR7及野生型pAdTrack质粒各3h，使其线性化；接着使用碱性去磷酸化酶（CIAP，Takara）去磷酸化处理。在0.1cm电转杯中，将5μl线性化的pAdtrack-CXCR7穿梭质粒或野生型pAdTrack穿梭质粒分别电转入50μl含有AdEASY-1腺病毒骨架质粒的大肠杆菌E.coli BJ5183电转感受态细胞（Stratagene,Cat.NO:200157,）中进行同源重组，电转参数为：1.8KV，200Ω，25μF，t=4～5ms。电转后，迅速向电转杯中加入1ml预热至37℃的不含抗生素的无菌LB液体培养基，混匀。37℃，150rpm振荡培养1h。菌液涂布50μg/ml卡那霉素的LB培养基筛选阳性克隆，菌液PCR初筛阳性克隆。摇菌扩增后提质粒，PacI限制性内切酶（NEB）鉴定阳性重组子（结果如图2所示）。对CXCR7重组腺病毒质粒测序确定CXCR7没有发生突变。
（8）利用Lipofectamine2000转染试剂盒将重组腺病毒质粒及空腺病毒质粒分别转染入人胚肾HEK293细胞（中科院细胞库，目录号：GNHu43）中，包装腺病毒。野生型pAdTrack质粒与AdEASY-1腺病毒骨架质粒同源重组后，得到空腺病毒质粒。
①Pac I线性化携带人CXCR7基因的重组腺病毒质粒pAd-CXCR7或空腺病毒质粒
取4μg重组腺病毒质粒pAd-CXCR7，用限制性内切酶PacⅠ进行酶切线性化，线性化体系如下：
37℃酶切过夜。向酶切产物中加入10μl（0.1倍体积）3M NaAc溶液，再加入200μl（2倍体积）无水乙醇，混匀；-20℃冷冻20min，4℃、13000rpm离心15min；70%（v/v）乙醇洗涤2次；在超净台中开风机晾干，加20μl水溶解质粒，微量分光光度计测质粒浓度。
②利用Lipofectamine2000转染试剂盒将线性化pAd-CXCR7或空腺病毒质粒分别转染入HEK293细胞中，包装CXCR7高表达腺病毒及空腺病毒。
将HEK293细胞以2×104/孔的密度接种于12孔板中，用含10%（v/v）胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养，待细胞培养至50%～70%融合时进行转染。用100μl Opti-MEM I去血清培养基溶解1.6μg线性化pAd-CXCR7重组质粒或空腺病毒质粒，轻轻混匀，得到混合物I；将Lipofectamine2000摇匀，取4μl与100μl Opti-MEM I去血清培养基混匀，室温孵育5min，得到混合物II；将混合物I和混合物II混合，轻轻混匀后室温孵育20min，得到混合物III；将200μl混合物III加入细胞孔，前后摇晃平板混匀；将孔板转移至37℃，5%CO2、饱和湿度的CO2孵箱中，4-6h后换液，培养18-48h；转染后约7天，HEK293细胞出现细胞病变（CPE）。
将出现CPE的细胞转入离心管中，2000r/min离心10min，弃上清；细胞团块用PBS溶液重悬，-70℃～37℃反复冻融4次裂解细胞，2000r/min离心10min离心后收集病毒上清；取病毒上清的30%～50%二次感染HEK293细胞，荧光显微镜监测GFP表达。重复前面的操作，反复感染HEK293细胞至病毒扩增至所需滴度，收集病毒于-80℃保存。
实施例2
携带人CXCR7基因腺病毒转染人脐带血来源EPC获得工程化的高表达CXCR7的人脐带血EPC。
（1）人脐带血来源内皮祖细胞分离培养纯化鉴定。
无菌取人脐带血（重庆）20ml，枸橼酸钠（2ml）抗凝，用Hanks液按1：1的体积比稀释后，小心加入盛有等体积人淋巴细胞分离液Histopaque1077的上层；室温400g离心30分钟；管内液体分成4层，取中间白膜层细胞；Hanks液洗涤两次。用添加含多种生长因子的SingleQuots并加入含2%（v/v）胎牛血清的内皮细胞基础培养基EGM-2进行重悬细胞；将细胞接种于预先用人纤维连接蛋白（human FN,BD Bioscience,MA,USA；）按用量为2μg/cm2包被的孔板中，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。细胞培养的前七天，每天换液，之后隔天换液。观察细胞形态并拍照。结果显示分离出的单个核细胞在EGM-2完全培养基中培养7天后，细胞形态呈圆形或者“鹅卵石”状，并且能够形成典型的细胞集落，并在分离培养后21天集落融合（结果如图3A所示），这些特征与内皮细胞的形态特征一致。
（2）内皮功能鉴定
选取培养7d左右的细胞，吸取孔内的培养液，用PBS（0.01M、pH=7.4）缓冲液洗3次，洗去不贴壁的细胞；将荧光Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）用2%FBS（v/v）EGM-2完全培养基稀释成10μg/ml后加入选定的培养孔内，每孔300μl，37℃，饱和湿度，5%CO2条件下孵育4h，然后吸出孔内液体，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；加入预冷的4%（v/v）多聚甲醛固定10min。再用PBS缓冲液洗涤两次，每次5min；以10μg/ml的浓度加入FITC-UEA-1，每孔300μl，37℃，饱和湿度，5%CO2条件下孵育1h；吸出孔内液体，用PBS缓冲液浸洗3次，每次5min；70%（v/v）甘油封片，荧光显微镜观察、拍照。结果显示：分离出的单个核细胞基本呈Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双阳性（结果如图3B所示），显示细胞具有内皮细胞的功能。
（3）EPC特异性表面标记CD133/VEGFR-2鉴定
选取培养7d的细胞，吸去孔内培养液，用PBS缓冲液洗3次，洗去不贴壁的细胞；以冰冷的4%（v/v）多聚甲醛固定l0min，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；0.01%（v/v）Triton-X100孵育6min（室温），PBS缓冲液洗3次，每次5min；加入1%（v/v）兔血清（用0.01M、pH7.4的PBS缓冲液稀释得到）于湿盒内室温封闭1h；加入300μl PE标记的CD133一抗（1∶1000，Miltenyi Biotec），37℃，饱和湿度，5%CO2条件下暗箱孵育60min，PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；再在每孔中加入300μl FITC标记的VEGFR2抗体（1∶1000，Santa Cruz），37℃，饱和湿度，5%CO2条件下暗箱孵育60min，PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；最后用蒸馏水冲洗1次，每孔加入50μg/ml4',6二脒基-2-苯吲哚（DAPI）溶液20μl染核30min，PBS缓冲液冲洗3次，每次5min；70%甘油封片，荧光显微镜观察、拍照。结果显示绝大部分细胞呈现CD133及VEGFR-2双阳性（结果如图3C所示）。
（4）Western Blot检测EPC中CXCR7表达
取培养至90%融合的人脐带血来源EPC细胞及人宫颈癌Hela细胞（中科院细胞库，目录号：TCHu187），裂解细胞并提取蛋白进行Western Blotting检测。根据蛋白定量结果，将等量的蛋白样品与2×上样缓冲液以1:1体积比混合，上样于10%SDS PAGE胶，60V电泳30min；待样品进入分离胶后，将电压调整至110V，电泳至溴酚蓝条带跑出胶外后终止电泳。以200mA恒流湿法转膜2h将蛋白转至PVDF膜。根据Marker指示，确定目的蛋白的大概位置剪膜，用5%（w/w）脱脂奶粉于室温下摇床震荡封闭1h；加入兔抗人CXCR7一抗（抗体稀释比例1：1000，Sigma,SAB4502446），小鼠抗人CXCR4（抗体稀释比例1:1000，Santa Cruz，sc-53534）或兔抗人GAPDH一抗（抗体稀释比例1：1000，Abcam，ab9483），4℃孵育过夜；用1×TBST于摇床上洗涤3次，每次10min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠（1:2000稀释）或者辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（1:2000稀释）二抗，室温孵育1h；1×TBST于摇床上洗涤3次，每次10min。DAB显色。待PVDF膜上出现明显棕色条带后，加入自来水终止显色，将膜晾干后进行扫描。结果显示，EPC有与Hela细胞相近的CXCR4蛋白表达，但其CXCR7表达水平远低于Hela细胞（结果如图4所示）。
（5）筛选腺病毒转染EPC最优MOI
用第2-4代的EPC以2×104/孔的密度种植在24孔板中，过夜培养至90%融合后，选取一个细胞孔，消化细胞，用血球计数板进行细胞计数，计数结果记为每孔细胞数量N0；根据之前测得的腺病毒滴度和每孔细胞数量N0，分别取MOI=10、100、200、400，将定量的腺病毒用无血清的EGM-2培养基补足至400μl；将含有腺病毒的培养基加入细胞孔，每个MOI值设3个重复试验组。让病毒吸附5h，期间每小时晃动一次培养板使病毒均匀吸附；之后用含有2%（v/v）FBS的EGM-2培养基更换培养基，于37℃，饱和湿度的CO2孵箱中培养36h；培养36h后，于光镜及荧光显微镜下分别拍照，观察细胞状态并计数总细胞数量及荧光细胞数量，计算荧光细胞占总细胞百分比。MOI=100、200、400组荧光细胞占总细胞比大于95%，MOI=400组部分细胞变圆脱落，确认MOI=100为携带人CXCR7腺病毒感染人脐带血来源EPC的最佳MOI（结果如图5所示）。
（6）Western Blotting检测腺病毒转染后CXCR7的表达
用携带人CXCR7的腺病毒和空腺病毒分别以MOI=100感染人脐带血来源EPC，分别记为CXCR7high-EPC和wt-EPC。转染72h后，裂解细胞提取蛋白进行Western Blotting检测。根据蛋白定量结果，将等量的蛋白样品与2×上样缓冲液以1:1体积比混合，上样于10%SDSPAGE胶，60V电泳30min；待样品进入分离胶后，将电压调整至110V，电泳至溴酚蓝条带跑出胶外后终止电泳。以200mA恒流湿法转膜2h将蛋白转至PVDF膜。根据Marker指示，确定目的蛋白的大概位置剪膜，用5%脱脂奶粉于室温下摇床震荡封闭1h；加入兔抗人CXCR7一抗（抗体稀释比例1：1000），小鼠抗人CXCR4(抗体稀释比例1:1000，Santa Cruz，sc-53534)或兔抗人GAPDH一抗（抗体稀释比例1：1000），4℃孵育过夜；用1×TBST于摇床上洗涤3次，每次10min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠（1:2000稀释）或者辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（1:2000稀释）二抗，室温孵育1h）；1×TBST于摇床上洗涤3次，每次10min。DAB显色。待PVDF膜上出现明显棕色条带后，加入自来水终止显色，将膜晾干后进行扫描。结果显示，携带人CXCR7基因的腺病毒转染能显著提高EPC CXCR7蛋白表达（结果如图6所示）。
实施例3
CXCR7高表达EPC与野生型EPC存活、与活化内皮细胞粘附、跨内皮迁移及管样结构形成等血管生成相关比较
细胞存活实验：CXCR7high-EPC和wt-EPC分别用胰酶消化，离心沉淀后洗涤2次，用无血清MCDB131培养基重悬细胞，调整细胞密度为2.5×104/ml；向96孔板6个孔中加入200μlCXCR7high-EPC细胞悬液铺板，向另6个孔中加入200μl wt-EPC，使得各孔待测细胞密度为约5×103/孔；待细胞贴壁后，将加入细胞的孔分成4组，分别为A组：wt-EPC对照组（仅加入空白培养基）；B组：CXCR7high-EPC对照组（仅加入空白培养基）；C组：wt-EPC SDF-1处理组（加入100ng/ml SDF-1）；D组：CXCR7high-EPC SDF-1处理组（加入100ng/ml SDF-1）；每组设置3个复孔；置于孵箱中孵育24h；之后向每个孔加入20μl0.5%MTT溶液，继续培养4h，用1ml注射器小心吸去孔内培养液。向每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），置于脱色摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上检测490nm处各孔的吸光值OD490nm。结果显示，携带人CXCR7的腺病毒转染能显著提高EPC在血清剥夺情况下的存活能力（结果如图7所示）。
细胞粘附实验：人脐静脉内皮细胞（HUVEC，ATCC,PCS-100-010）以1×105/孔的密度种于24孔板，培养至细胞融合。吸去培养基，PBS缓冲液（0.01M、pH=7.4）洗涤2次后，用含有10ng/ml TNF-α和10ng/ml IL-1β的F-12K培养基处理5h，活化内皮细胞单层。将CXCR7high-EPC和wt-EPC用胰酶消化，PBS缓冲液重悬并计数，调整两种细胞的密度至2.5×104/ml；将细胞孔分成4组，分别为A组：wt-EPC对照组（仅加入空白培养基）；B组：CXCR7high-EPC对照组（仅加入空白培养基）；C组：wt-EPC SDF-1处理组（加入100ng/mlSDF-1）；D组：CXCR7high-EPC SDF-1处理组（加入100ng/ml SDF-1）；每组设置3个复孔；将细胞加入到内皮细胞单层上后，置于恒温孵箱中37℃孵育15min；孵育后，用PBS缓冲液将未贴壁的细胞完全洗掉；荧光显微镜下，每孔随机选取5个视野，计数带绿色荧光的细胞。结果显示，携带人CXCR7的腺病毒转染能显著提高EPC与活化内皮细胞的粘附能力（结果如图8所示）。
细胞跨内皮迁移实验：将原代培养的HUVEC以5×104/孔的密度种在24孔Transwell的上腔，置于24孔板中培养至细胞融合。吸去培养基，PBS缓冲液洗涤2次后，用含有10ng/ml TNF-α和10ng/ml IL-1β的F-12K培养基处理5h，活化内皮细胞单层；将CXCR7high-EPC和wt-EPC分别用胰酶消化，用PBS缓冲液重悬并计数，分别调整两种细胞的密度至2.5×104/ml。将细胞孔分成4组，分别为A组：wt-EPC对照组（transwell上腔加入wt-EPC细胞悬液，下腔仅加入空白培养基）；B组：CXCR7high-EPC对照组（transwell上腔加入CXCR7high-EPC细胞悬液，下腔仅加入空白培养基）；C组：wt-EPC SDF-1处理组（transwell上腔加入wt-EPC细胞悬液，下腔加入100ng/ml SDF-1）；D组：CXCR7high-EPC SDF-1处理组（transwell上腔加入CXCR7high-EPC细胞悬液，下腔加入100ng/ml SDF-1）；每组设置3个复孔；37℃孵育12h，让EPC穿过内皮细胞单层和Transwell的膜；孵育后，将transwell小室取出，用棉签将上腔的细胞刮掉。于荧光显微镜下，每个transwell随机选取5个视野，计数穿过transwell的带绿色荧光的细胞。结果显示，携带人CXCR7的腺病毒转染能显著提高SDF-1诱导条件下的EPC跨内皮迁移能力（结果如图9所示）。
基质胶中形成管样结构实验：将基质胶用碎冰包埋，置于4℃冰箱，过夜解冻，将移液枪枪头，48孔板等置于4℃预冷。向预冷的48孔板中每孔加入150μl基质胶，“8”字型摇动孔板，使胶铺平。将48孔放入细胞培养箱中37℃孵育30min，让基质胶聚合；将CXCR7high-EPC和wt-EPC用无血清MCDB131培养基饥饿处理12h，以排除EGM-2中包含的生长因子的影响；饥饿处理后，用胰酶消化细胞，离心后用无血清MCDB131培养基重悬细胞，分别调整CXCR7high-EPC和wt-EPC细胞密度至1×105/ml。将基质胶孔分成4组，分别为A组：wt-EPC对照组（仅加入wt-EPC细胞悬液）；B组：CXCR7high-EPC对照组（加入CXCR7high-EPC细胞悬液）；C组：wt-EPC＋SDF-1处理组（加入wt-EPC细胞悬液和100ng/ml SDF-1）；D组：CXCR7high-EPC＋SDF-1处理组（加入CXCR7high-EPC细胞悬液和100ng/ml SDF-1）。每组设置3个复孔；“8”字型摇动48孔板，使得细胞均匀铺在胶上。将48孔板置于细胞培养箱中，37℃培养18h。将孔板置于光镜下观察、拍照，用ImageJ测量管样结构的长度。结果显示，携带人CXCR7的腺病毒转染能显著提高EPC的管样结构形成能力（结果如图10所示）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将人CXCR7基因克隆至腺病毒载体中，得到的重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒重组，经包装细胞包装，得到携带人CXCR7基因的腺病毒；再将该携带人CXCR7基因的腺病毒感染人脐带血来源内皮祖细胞，得到高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞。
2.根据权利要求1所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）根据人CXCR7基因的序列，设计如下引物：
BglII CXCR7-primer F：5'-TTGAGATCTCGCCTCAGAACGATGGATC-3'；
HindIII CXCR7-primer R：5'-CGTAAGCTTAACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'；
（2）以含有人CXCR7基因的序列为模板，利用引物对BglII CXCR7-primer F和HindIIICXCR7-primer R进行PCR扩增，得到BglII-CXCR7-HindIII序列；
（3）通过BglII限制性内切酶和HindIII限制性内切酶分别双酶切BglII-CXCR7-HindIII序列和腺病毒载体；再将双酶切后的BglII-CXCR7-HindIII序列和腺病毒载体连接，得到重组腺病毒载体；
（4）将步骤（3）得到的重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒同源重组，得到重组腺病毒重组子；
（5）将步骤（4）得到的重组腺病毒重组子通过包装细胞包装，得到携带人CXCR7基因的腺病毒；
（6）将步骤（5）得到的携带人CXCR7基因的腺病毒感染人脐带血来源内皮祖细胞，得到高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞。
3.根据权利要求2所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的含有人CXCR7基因的序列通过如下步骤得到：提取人肝癌细胞Hep G2细胞的总RNA，对提取得到的总RNA进行逆转录，得到cDNA；再通过引物对CXCR7-primerF和CXCR7-primer R对cDNA进行PCR扩增，得到含有人CXCR7基因的序列；
CXCR7-primer F：5'-CGCCTCAGAACGATGGATC-3'；
CXCR7-primer R：5'-AACAAGTAAACCCGTCCCAGA-3'。
4.根据权利要求3所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于：所述的逆转录的具体操作为：1ng总RNA、1μl10pmol/μl的引物oligo(dT)18，加入10μl无RNA酶的水，轻轻混匀后简单离心；65℃孵育5min，冰上冷却后离心；加入5×反应缓冲液4μl，20U/μl的RiboLock RNA酶抑制剂1μl，10mM dNTP混合液2μl，最后加入200U/μl的RevertAid M-MuLV你转录酶1μl；轻轻混匀后，离心；于42℃孵育60min；之后70℃加热5min结束反应。
5.根据权利要求3所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于：所述的再通过引物对CXCR7-primer F和CXCR7-primer R对cDNA进行PCR扩增的条件为98℃10s、55℃15s、72℃90s，32个循环。
6.根据权利要求2所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的利用引物对BglII CXCR7-primer F和HindIII CXCR7-primer R进行PCR扩增的条件为98℃10s、55℃15s、72℃90s，32个循环。
7.根据权利要求2所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的腺病毒载体为pAdTrack-CMV质粒；
步骤（4）中所述的腺病毒骨架质粒为AdEASY-1腺病毒骨架质粒；
步骤（5）中所述的包装细胞为人胚肾HEK293细胞；
步骤（5）中所述的将步骤（4）得到的重组腺病毒重组子通过包装细胞包装是指将重组腺病毒重组子线性化，然后通过脂质体转染方式或是电击孔法转染方式将线性化重组腺病毒重组子导入包装细胞中，培养至包装细胞出现细胞病变；
所述的线性化为通过限制性内切酶PacI酶切所述的重组腺病毒重组子得到。
8.一种高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞，通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞的应用，其特征在于：所述的高表达人CXCR7基因的内皮祖细胞作为用于移植治疗脏器衰竭及缺血性疾病的种子细胞，用于制备细胞移植的药物进行应用。
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