CN114836378B - 自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用 - Google Patents

自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用。该体外培养方法包括：分离母乳干细胞；诱导分化母乳干细胞，使得母乳干细胞分化为成纤维细胞，诱导分化采用机械张力条件下，将所母乳干细胞置于张力培养基中进行培养；负载培养成纤维细胞，以得到复合体，复合体为聚乳酸水凝胶与成纤维细胞的复合物。该成纤维细胞高效表达细胞波形蛋白、纤维连接蛋白以及高表达I/III型胶原蛋白。该复合体能够通过PI3K/Akt信号通路机制，促使疤痕皮肤I/III型胶原蛋白高效表达，I/III型胶原蛋纤维排列正常化，具有促进疤痕修复的功能，具有广泛应用于创面修复、皮肤皱纹、疤痕祛除、抗衰老等应用前景。

Description

自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修 复中的应用
技术领域
本申请涉及皮肤损伤修复技术领域，尤其涉及自体母乳干细胞的体外培养方法、注射剂及其在皮肤损伤修复中的应用。
背景技术
干细胞在皮肤损伤修复以及组织再生方面具有巨大潜力，其不仅可以再生丧失的组织，亦可通过旁分泌方式促进伤口修复和愈合。目前，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、组织干细胞、上皮干细胞、脂肪干细胞和造血干细胞等均成为皮肤损伤修复以及组织再生方面研究热点。
其中，移植干细胞也为伤口愈合的研究提供了巨大的进展，但具体作用机制尚不清楚，仍需进一步探究来探索和验证其对伤口的愈合机制，以及大量的临床应用研究进行深入的探索研究，以确定理想的干细胞来源和最有效的细胞传递方式，促进伤口愈合，为创伤患者带来福音，也为其能够应用于皮肤皱纹、疤痕祛除、抗衰老等领域提供帮助。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于通过体外培养获得一种易于注射的细胞复合体，以产生具有皮肤损伤修复的功能。
第一方面，本申请实施例公开了一种自体母乳干细胞的体外培养方法，包括以下步骤：
分离来母乳干细胞；
诱导分化所述母乳干细胞，使得所述母乳干细胞分化为成纤维细胞，所述诱导分化采用机械张力条件下，将所述母乳干细胞置于张力培养基中进行培养；其中，所述机械张力条件为：拉伸最大幅度5～8％，加力频率0.1～0.15Hz，加力波形为正弦波；
负载培养成纤维细胞，以得到复合体，所述复合体为聚乳酸水凝胶与所述成纤维细胞的复合物。
在本申请实施例中，所述张力培养基以DMEM/F-12为基础，向其中添加糖皮质激素和植物甾醇类物质，使得糖皮质激素的浓度为 0.5～1.5mmol/L，植物甾醇的浓度为0.01～0.03mmol/L。
在本申请实施例中，所述植物甾醇选自β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的至少一种。
在本申请实施例中，所述聚乳酸水凝胶的制备方法包括：
将丝素粉加至沸水中，并同时加入碳酸钠，搅拌充分煮沸30min后；
过滤取出丝素粉、纳米聚乳酸粉末充分混合后加入至10mol/L LiBr 溶液中，充分混合后，置于60℃烘箱中6h；
将溶液装入透析袋中透析3天得以去除Liar；
将透析后的溶液离心多次，去除杂质后置于冷冻干燥机中干燥，即可获得所述聚乳酸水凝胶。
在本申请实施例中，加入至10mol/L LiBr溶液中丝素浓度为 1.0～1.5g/L，纳米聚乳酸浓度为0.15～0.3g/L。
在本申请实施例中，所述负载培养步骤包括：
将所述聚乳酸水凝胶进行超声处理后，加入至负载培养基中，水凝胶占所述负载培养基的比例为50～60wt％，并接种所述成纤维细胞，负载培养周期为8～15天。
在本申请实施例中，所述负载培养基以DMEM/F-12为基础，向其中添加成纤维细胞生长因子、维生素C磷酸酯、脯氨酸和赖氨酸，并使得成纤维细胞生长因子浓度为1～10mmol/L，维生素C磷酸酯浓度为 0.01～0.05mmol/L，脯氨酸浓度为0.1～0.5mmol/L，赖氨酸浓度为 0.1～0.5mmol/L。
在本申请实施例中，经诱导分化后得到的细胞中含成纤维细胞的数量不低于80％。
第二方面，本申请实施例公开了一种注射剂，包含第一方面所述的体外培养方法值得的复合体。
第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的体外培养方法值得的复合体、或第二方面所述的注射剂在皮肤损伤修复中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请实施例通过将自体母乳干细胞的体外培养得到了一种负载有成纤维细胞的复合体，该成纤维细胞高效表达细胞波形蛋白、纤维连接蛋白以及高表达I/III型胶原蛋白。并通过动物实验将该复合体注射至大白鼠疤痕处，能够通过PI3K/Akt信号通路机制，促使大白鼠疤痕处I/III型胶原蛋白高效表达，促使疤痕处真皮组织中I/III型胶原蛋纤维排列正常化，具有促进疤痕修复的功能，具有广泛应用于创面修复、皮肤皱纹、疤痕祛除、抗衰老等应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例1提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
图2为本申请对比例1提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
图3为本申请对比例2提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
图4为本申请对比例3提供的机械张力培养后的细胞镜检图。
图5为大白鼠疤痕处给予本申请实施例1提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
图6为大白鼠疤痕处给予本申请对比例4提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
图7为大白鼠疤痕处给予本申请对比例5提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
图8为大白鼠疤痕处给予本申请对比例6提供的复合体后的皮肤组织石蜡切片HE染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
自体母乳干细胞(BSCs)的体外培养
本申请实施例采用自体母乳干细胞进行体外培养，获得一种体外培养的注射剂，该注射剂包含负载有母乳干细胞的复合体，该复合体具有修复大白鼠疤痕皮肤的作用。其具体的制备过程包括BSCs的分离、细胞机械张力培养处理和制备复合体的过程，具体过程如下：
1、材料与方法
1.1、BSCs的分离
取成熟的大白雌性鼠(大白鼠，体长为16～21cm，体重约300克左右，购自西安交大医学院实验动物中心)母乳(180mL)，于无菌环境中用等体积的PBS(pH7.4)稀释母乳，于1500g条件下离心20min，去除上层的脱脂牛奶液成分和脂肪层，下层的细胞颗粒继续加入同等体积的上述 PBS，1500g离心20min，清洗细胞颗粒，去除上清液，如此重复3次。
再次加入含有10％胎牛血清(默克Sigma-Aldrich)的PBS对细胞颗粒进行重悬。为了确定每个样品的细胞活力和细胞浓度，使用诺鲍尔血细胞计数仪进行检测。
将上述分离的具有较高活力的BSCs的(104个/mL)接种至含有25mL DMEM培养基的T25培养瓶中，接种量为2.5mL，在5％CO2和37℃下培养，并每天更换培养基，培养基为DMEM培养基(赛默飞)，连续培养2代，每代培养融合度至60％时即可进行传代。
1.2、BSCs的机械张力诱导分化形成FBs
取上述培养的融合度达80～90％的第二代BSCs，去除旧培养基，用 15mLPBS清洗2次，以去除残留培养基，再加入10mL 0.25％胰酶 -EDTAC(0.25g胰蛋白酶(Invitrogen)+0.02g EDTA+99mLPBS)，消化3～5 min，用20mL DMEM培养基终止消化，移液管轻轻反复吹打至细胞团完全分散开，1000g 20℃离心5min，去上清，DMEM培养基对沉淀重悬，使得BSCs的浓度为1×107cells；
取上述细胞悬液2mL均匀地接种于弹性基底膜培养板(如6孔 BF-30010，美国Flex-cell公司)中，将弹性基底膜培养板置于多通道细胞应力加载仪(BF-30010，美国Flex-cell公司)上，进行机械张力加载诱导分化培养8～15天，以分化得到成纤维细胞(FBs)，并检测的细胞相关指标符合要求再进行后续处理，本实施例中相关的符合要求的指标包括细胞形态以及细胞波形坦白的表达量。机械张力加载条件为：拉伸最大幅度5～8％，加力频率0.1～0.15Hz，加力波形为正弦波。
张力培养基：以DMEM/F-12(Gibco，赛默飞)为基础，向其中添加糖皮质激素和植物甾醇类物质，使得糖皮质激素(简称为GC，上海通蔚生物科技有限公司)的浓度为0.5～1.5mmol/L，植物甾醇的浓度为 0.01～0.03mmol/L，其中，植物甾醇选自β-谷甾醇(简称为bSS，北京百灵威科技有限公司)、豆甾醇(简称为SS，北京百灵威科技有限公司) 和菜油甾醇(简称为CS，西安康诺化工有限公司)中的至少一种。
张力诱导分化培养的细胞形态及FBs含量分析：取诱导后细胞，PBS 漂洗3次，2.5％戊二醛磷酸缓冲液固定，进行扫描电子显微镜检测，使用Cell Counting Kit-8(默克Sigma-Aldrich)检测上述张力分化实验后的 FBs细胞百分比例，具体该方法分别检测BSCs和FBs的数量，并计算其中FBs的百分比例。
细胞波形蛋白(简称为Vim)及纤维连接蛋白(简称为Fn)表达量分析：取诱导分化后的细胞悬液，去除培养液，PBS置换冲洗细胞3次后，用0.25wt％胰蛋白酶消化液消化处理10min，以使得细胞脱落形成单细胞；再将将细胞接种到预先放置细胞爬片专用玻片的6孔板中，置于培养箱中继续诱导培养3d；取出玻片，PBS冲洗，4％多聚甲醛固定 20min，PBS冲洗，用ABC免疫组织化学试剂盒(赛默飞世尔中国)操作说明行波形蛋白免疫细胞化学染色(一抗，鼠抗大鼠1:100；二抗，羊抗鼠1:200)，DAB显色，BSCs作为对照。采用Image J软件分别对Vim 及Fn的阳性荧光面积进行测量。
1.3、制备复合体
将经过上述张力培养处理的细胞再进行与一种复合聚乳酸水凝胶进行负载培养，得到一种复合体，以用于注射。该复合体的制备过程如下：
1)聚乳酸纳米孔纤维的制备：
一个具体的聚乳酸纳米孔纤维的制备过程如下：将聚乳酸(简称为 PLLA，HBCChem,Inc.)粉末溶解在二氯甲烷与N,N-二甲基甲酞胺体积比为6:1的溶剂中，配制成质量分数为9％的纺丝溶液，充分搅拌后，把纺丝液装入内径为16mm，体积为10mL的注射器(针头规格为18)中，然后将该注射器安置在微量注射泵上，将高压电源的正电极夹在注射器的金属针头上，另一个电极与距针头15cm的铝箔纸收集板相连。纺丝过程中的供料速度15μL/min，制得的纳米纤维孔聚乳酸，在50℃真空干燥 24h，用粉碎机粉碎成粉末，待用；
2)水凝胶的制备
一个具体的水凝胶制备过程如下：
25g丝素粉(湖州丝福生物科技有限公司)加入至煮沸的10L水中，并同时加21.2g入碳酸钠，搅拌充分煮沸30min后，以脱除丝素粉中含有的；
过滤取出丝素粉15g、上述方法制得的纳米聚乳酸粉末3g，充分混合后加入至10L10mol/L LiBr溶液中，充分混合后，置于60℃烘箱中6h；
将溶液装入透析袋(3500截留分子量)中，置入去离子水中开始透析每隔2～3h换水，透析3天得以去除Liar；
将透析后的溶液离心多次，去除杂质后置于冷冻干燥机中干燥，即可获得所述水凝胶。
3)负载BSCs培养
将可先将水凝胶进行超声处理后，加入至负载培养基中，水凝胶占负载培养基的比例为50～60wt％，并接种经过机械张力处理后的细胞进行负载培养，接种量为添加有水凝胶的负载培养基质量的1～3v/w％(如水凝胶的负载培养基质量为100g，则接种含有1×106cells FBs的细胞悬液 1～3mL)，接种FBs的浓度大致为1×106cells。
负载培养基是以DMEM/F-12为基础，向其中添加成纤维细胞生长因子(简称为FGF，吉尔生化(上海)有限公司)、维生素C磷酸酯(简称为pVC，斯百全化学(上海)有限公司)、脯氨酸(简称为Pro，阿拉丁公司)和赖氨酸(简称为Lys，阿拉丁公司)，并使得FGF浓度为1～10mmol/L， pVC浓度为0.01～0.05mmol/L，Pro浓度为0.1～0.5mmol/L，Lys浓度为 0.1～0.5mmol/L。
负载培养周期大约为8～15天后进行下述指标分析。
可注射性分析：取用上述负载培养的1mL复合体，分别用注射器分别吸取后，依次在无针头和有针头的情况下注射水凝胶，观察其可注射情况。以针头推动能够挤出复合体为具有可注射性，表示为“+”，以无针头推动能够基础复合体或有针头均不能挤出复合体为不具有可注射性，表示为“－”。
复合体上活性BSCs负载量分析：采用活死实验来评估负载在SFN 水凝胶中细胞的生存活力。分别在D1、D3按说明书使用LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit对BSCs进行染色。CalceinAM将活细胞标记为绿色，EthD-f将死细胞标记为红色，使用激光共聚焦显微镜对样本进行拍摄，然后应用Image J软件对图像进行分析，定量计算复合体上活性BSCs负载量(个/mL)。
复合体上负载的BSCs中I型、III型胶原mRNA表达量分析：
1)细胞总RNA提取
将复合体在液氮环境中充分预冷4-5次后，再复合体进行研磨成粉末后，每0.1g粉末大约加入Trizol试剂大约15mL后，转入玻璃匀浆器中，充分匀浆5min，加入Trizol试剂1/5体积的氯仿后，激烈震荡15s，室温静置3min，再将匀浆装入至离心管中，4℃12000rpm离心处理15min后，溶液分为上中下三层，取上层有机相转入至另一无菌离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min后；再次以4℃12000rpm离心处理10min，去除上清，用与有机相等体积的75％的乙醇溶液洗涤沉淀，4℃ 12000rpm离心，去除上清，留取沉淀即为所提取的总量RNA，室温静置 3min，晾干，加入DEPC水以充分溶解。得到的总RNA使用超微量紫外分光光度计检测各组RNA的纯度及浓度，测量A260/A280值，该值在 1.8-2.0之间，说明RNA纯度较高，可以继续检测浓度，以浓度最小的所在组的RNA为标准来均衡各组间RNA的浓度，使用DEPC水稀释调平，保存于-80℃冰箱中备用。
2)逆转录合成cDNA
将冻存于-80℃冰箱的RNA冻融、离心，置于冰上；将无酶PCR管置于冰上，以此加入总RNA溶液3μL、随机引物(Oligo dT)18primer 1μL (北京百奥莱博科技有限公司)和DEPC水(赛默飞)8μL，总共12μL，将上述溶液体系充分混匀，短暂离心，置于PCR仪中70℃孵育5min，短暂离心，置于冰上，按顺序依次加入5倍稀释的反应缓冲液(Reaction Buffer，赛默飞，后述试剂同)4μL，RNA酶抑制剂(Ribo lock RI)1μL， dNTPs合溶液(10mM dNTPs Mix)2μL，总量19μL，将上述样本充分混匀，短暂离心，置于PCR仪中70℃孵育5min,短暂离心，即为合成的cDNA 试剂，置于-20℃冰箱保存。
2)RT-PCR
将上述合成的cDNA及相关试剂解冻，短暂离心，立即置于冰上；按照下述表1反应体系进行PCR：
表1
试剂 体积
cDNA 2μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
2×Master 12.5μL
RnasefreedH2O 9.5μL
总体积 25μL
引物序列如：GAPDH-F：caaggtcatccatgacaactttg；GAPDH-R：gtccaccaccctgttgctgtag；扩增长度为496bp；COL-I-F：ggtcccaaaggtgctgatgg； COL-I-R：gaccagcctcaccacggtct；扩增长度为182bp；COL-III-F： cgaggtgacagaggtgaaaga；COL-III-R：aacccagtattctccgctctt；扩增长度为336bp；引物均由上海生工公司合成并提供。
扩增条件：GAPDH(内参)：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃ 30s，共36个循环；72℃延伸10min。COL-I：95℃5min，95℃30s，58℃ 30s，72℃30s，共36个循环；72℃延伸10min。COL-III:95℃5min，95℃ 30s，55℃30s，72℃30s，共34个循环；72℃延伸10min。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，采集图像结果，每组样本重复实验3次，用Gel-Pro analyzer分析软件进行灰度值分析，本实验选择GAPDH 作为RT-PCR目的基因的标准化内参，以CoL-I/GAPDH、CoL-III/GADPH 的比值作为该基因的相对表达量。
1.4、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-wayANOVA)和DunCan’s 多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
本申请在进行自体母乳干细胞的体外培养时，共进行了大量实施例和对比例，将这些实施例和对比例的制备过程进行统计，将其中涉及的相关步骤条件列入表2-3中。
表2各实施例和对比例细胞机械张力培养处理条件
Figure SMS_1
Figure SMS_2
表3各实施例和对比例细胞复合体的制备条件
Figure SMS_3
Figure SMS_4
表2和表3分别列出流实施例1-10和对比例1-12在制备复合体的过程中的细胞机械张力培养处理条件以及复合体的制备条件。表1中列举了张力培养基中GC含量以及各种植物甾醇的含量，其中，对比例1采用的是DMEM/F-12基础培养基，对比例2和3的张力培养基仅在基础培养基中添加了不同含量的GC。表3列举了水凝胶制备过程中每10L 10mol/LLiBr溶液丝素粉浓度和纳米聚乳酸粉末浓度，以及负载培养基的成分，其中，对比例12采用DMEM/F-12作为基础培养基。
为对BSCs体外机械张力诱导分化后，培养结果进行分析，本申请对机械张力诱导分化后10天的FBs细胞数量、波形蛋白以及纤维连接蛋白的表达量进行了分析，结果列入表4。
表4
Figure SMS_5
Figure SMS_6
表4中，实施例1-6诱导分化的细胞中FBs数量百分比显著高于对比例1-3，对比例1中并未明显观察到有FBs形成，故未做统计。另外，表4还列举了细胞中Vim和Fn的表达情况，实施例1-6诱导分化后的细胞均具有Vim和Fn的表达，而对比例1-3均未检测到Vim和Fn的表达，这说明实施例1-6通过机械张力诱导分化形成了大量的成纤维细胞。
实施例还进一步通过镜检发现了，如图1所示，实施例1中形成了明显的FBs(图中长条形细胞)，可见少量BSCs(图中圆形细胞)，其他实施例亦产生了明显的FBs，而对比例1并未可见明显的FBs(如图2)，如图3、4，对比例2和3虽然形成了FBs，但含量过低。结合表1可知，实施例1-6在对BSCs进行机械张力诱导分化培养式采用的张力培养基以 DMEM/F-12为基础，添加了糖皮质激素以及植物甾醇，而对比例1仅以 DMEM/F-12作为张力培养基，对比例2、3仅在基础培养基中添加糖皮质激素，这些张力培养基均不能很好地诱导BSCs向FBs分化。
表5
实施方式 可注射性 COL-ImRNA COL-IIImRNA
实施例1 + 1.34±0.25ab 1.17±0.12ab
实施例2 + 1.36±0.12a 1.19±0.05a
实施例3 + 1.39±0.34a 1.16±0.11ab
实施例4 + 1.41±0.16a 1.19±0.07a
实施例5 + 1.42±0.18a 1.21±0.16a
实施例6 + 1.43±0.24a 1.26±0.21a
实施例7 + 1.19±0.17bc 1.12±0.06ab
实施例8 + 1.16±0.08bc 1.09±0.13ab
实施例9 + 1.31±0.13ab 1.22±0.07a
实施例10 + 1.29±0.19b 1.19±0.21a
对比例4 - 1.03±0.03c 0.99±0.06b
对比例5 - 1.07±0.06c 0.97±0.08b
对比例6 + 1.06±0.18c 0.92±0.11b
对比例7 + 1.11±0.21c 0.89±0.04b
对比例8 + 1.09±0.16c 0.86±0.12bc
对比例9 + 1.08±0.14c 0.91±0.05b
对比例10 + 1.10±0.06c 0.96±0.07b
对比例11 + 1.46±0.19a 0.76±0.12bc
对比例12 + 0.42±0.23d 0.82±0.02c
表5进一步列举了负载培养后的结果，由于对比例1-3经机械张力诱导分化培养得到的细胞悬液中FBs含量较少或者没有形成FBs，因而并未进一步进行负载培养。
表5中，除对比例4、5外，其他各实施例和对比例制备得到的负载培养后的复合体均具有注射性，可以作为注射剂的原料或者直接作为注射剂进行进一步的动物实验。
表5中，实施例1-10负载得到的复合体上FBs中COL-I和COL-III 的mRNA表达量均显著高于对比例4-12，结合表3的制备过程条件可知，水凝胶制备过程中每10L 10mol/LLiBr溶液丝素粉浓度和纳米聚乳酸粉末浓度，以及负载培养基的成分均对最终的复合体上FBs中COL-I和 COL-III的mRNA表达量产生了显著影响。
具体的，对比例4、5在水凝胶制备过程中每10L 10mol/L LiBr溶液丝素粉浓度和纳米聚乳酸粉末浓度分别超出了1.0～1.5g/L和0.15～0.3g/L 的范围，而而致使其制得的负载在复合体中的FBs中COL-I和COL-III 的mRNA表达量显著降低，同样还导致其复合体不具有可注射性。
具体的，对比例6-12使用的负载培养基成分不合理，使得负载在负载在复合体中的FBs中COL-I和COL-III的mRNA表达量显著降低。
动物实验
为进一步验证本申请实施例提供的上述复合体作为注射剂，能够在机体内产生相应功能，本申请还进行了动物实验。
1、材料与方法
1.1、实验动物
大白鼠，体长为16～21cm，体重约300克左右，购自西安交大医学院实验动物中心。
1.2、实验过程
将大白鼠分为空白组、模型组、给药对照组和给药组。
模型组：在各组大白鼠背部剃毛形成3cm×3cm范围的暴露皮肤，保持背部光滑，用无菌小刀在模型区画十字型伤口，使得鼠背流血结痂，大约2周，十字型伤口自愈形成十字型疤痕，以作为模型区。
给药组：在造模后，每天向大白鼠的模型区的十字型疤痕处注射0.1mL复合体，复合体由实施例1-10和对比例4-12分别制得。
阳性对照组：在造模后，每天向大白鼠的模型区的十字型疤痕处注射0.1mL伊肤泉微针(可月月目医疗美容伊肤泉微针，商品编号： 10035290956456)。
其中，给药组和给药对照组的注射层次均为真皮深层，可见有明显的皮肤隆起，注射点用甲紫作标记；每两周时，每点均重复注射一次，共注射3次。
1.3、组织学检测
各组大白鼠在注射后第12周，取大白鼠真皮组织，组织块用10％甲醛固定，梯度脱水后石蜡包埋，切成5μm组织薄片，每个组织块切片均行HE染色，以观测其胶原分布。
SOD活性的测定：SOD的活力可根据氧自由基的含量求出，取适量的生理盐水大白鼠皮肤匀浆上清液按SOD试剂盒(江莱生物)说明书操作测定皮肤组织中SOD的活性。
免疫组织化学染色法测定I型、III型胶原蛋白含量：将大白鼠皮肤组织标本经4％甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋后制作石蜡切片，采用有 I型、III型胶原多克隆抗体和链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，按抗体稀释度1:100倍进行操作，将大白鼠的石蜡切片经抗原修复后，滴加50g/L牛血清白蛋白封闭液，再分别滴加小鼠抗人I型胶原(一抗)50μL、小鼠抗人II型胶原(一抗)50μL和0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.3)，室温反应1h后置于4℃下过夜。次日室温先恢复1h，再统一滴加生物素化抗小鼠IgG(二抗)50μL，室温下静置1h后再滴加试剂SABC静置1h，加入二氨基联苯胺显色，棕黄色为阳性染色。以上各步骤处理的石蜡切片均采用PBS液冲洗。采用计算机图像分析系统测定阳性面积占总面积的百分比，每张切片随机选择3 个视野，以平均值和标准偏差进行表示。
WesternBlot检测PI3K/Akt信号转导通路PI3K和p-Akt蛋白的表达：
1)细胞总蛋白提取
将复合体在液氮环境中充分预冷4-5次后，再复合体进行研磨成粉末后，每0.1g粉末大约加入RIPA裂解液约10mL，冰水裂解处理10min，转置于离心管中，4℃12000rpm离心处理20min，取沉淀即为总蛋白，用PBS溶液调整为含20μg/μL的蛋白溶液，进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应后，将PVDF膜进行曝光处理，定影后，用Gel-Pro analyzer分析软件进行灰度值分析，以β-actin作为PI3K和p-Akt蛋白的标准化内参，将每个样本测得的PI3K和p-Akt蛋白条带的灰度值与本样品的β-actin条带的灰度值相比，得到的比值即为目的蛋白的相对含量。
其中，所用试剂鼠PI3Kp110α一抗和鼠p-Akt一抗均购自美国cell signalingtechnology公司；鼠β-actin一抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗和 HRP标记的山羊抗鼠二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.4、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-wayANOVA)和DunCan’s 多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
表6
Figure SMS_7
Figure SMS_8
如图5为实施例1的石蜡切片HE染色图，图中呈红色形状即为胶原，可见皮肤组织真皮层中含有大量呈束状排列的胶原纤维，胶原纤维中可见梭形的被染成蓝色的成纤维细胞核，其他实施例2-10大白鼠皮肤组织石蜡切片HE染色图中胶原纤维分布情况大致与实施例1相同。而图6-8 为对比例4-6的石蜡切片HE染色图，给药大白鼠后，其真皮层中胶原纤维排列紊乱，而且蓝染的梭型细胞核数量明显少于实施例1，与模型组相当；其他对比例7-12大白鼠皮肤组织石蜡切片HE染色图中胶原纤维分布情况大致与对比例4相同。由此可见，本申请实施例提供的复合体具有促进大白鼠损伤皮肤中胶原纤维分布正常化，促使其创口的疤痕愈合。
在40倍光学显微镜下，于每个皮肤组织切片中随机选取6个点进行真皮厚度的测量，以px(pixel像素)为长度单位，每个样本的的真皮厚度用平均值和标准差来表示，结果如表6。
如表6所示，模型组中由于对大白鼠的模型区进行了划伤，使得其 SOD活性显著降低，并且其真皮组织中I型、III型胶原显著降低，这表明紫外不仅损伤了模型区的皮肤表面，还对真皮组织产生了损伤作用。而阳性对照组给药大白鼠模型区以伊肤泉微针，但是其对于模型区皮肤的修复作用有限。
而给药组中，实施例1-10给予大白鼠模型区注射本申请实施例制备的复合体后，其SOD活性均显著高于模型组，皮肤组织中I型、III型胶原含量亦相对于模型组显著提升，这表明本申请实施例提供的复合体能够修复对大白鼠皮肤组织的损伤。而给药组中，对比例4-12予大白鼠模型区注射本申请实施例制备的复合体后，其SOD活性、皮肤组织中I型、III型胶原含量提升效果与实施例1-10相差显著。结合表3和表5的结果可知，对比例4、5在水凝胶制备过程中每10L 10mol/L LiBr溶液丝素粉浓度和纳米聚乳酸粉末浓度分别超出了1.0～1.5g/L和0.15～0.3g/L的范围，对比例6-12使用的负载培养基成分不合理，这些因素均导致了其制备的复合体中复合体上FBs中COL-I和COL-III的mRNA表达量显著降低，进而其对大白鼠真皮组织中I型、III型胶原含量修复作用有限，同时还决定了其对大白鼠真皮组织中抗紫外氧化的修复作用有限。
为进一步分析，本申请实施例提供的复合体注射大白鼠模型区后，对其COL-I和COL-III胶原含量促进的调节机制，本申请实施例还对大白鼠真皮组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达量进行分析，结果如表7 所示。
表7相对β-actin表达量
Figure SMS_9
Figure SMS_10
由表7可知，模型组中由于对大白鼠的模型区进行了划伤，使得其 PI3K和p-Akt表达量显著降低。
而给药组中，实施例1-10给予大白鼠模型区注射本申请实施例制备的复合体后，其PI3K和p-Akt表达量显著升高，表现出了与I型、III型胶原含量提升趋势相同，由此推断，本申请实施例提供的复合体是通过激活大白鼠真皮组织PI3K/Akt信号通路，来实现其I型、III型胶原含量提升的作用。并且，结合表6的结果可知，III型胶原含量相对于I型胶原含量的提升比例上，实施例1-10也相对模型组具有提高效果。由此进一步说明，本申请实施例提供的复合体是通过激活大白鼠真皮组织 PI3K/Akt信号通路，来实现其I型、III型胶原含量提升的作用，同时还具有促进其III型胶原含量的比例的效果。而Ⅲ型胶原，纤维细小且具有良好的弹性，对受损真皮组织具有“桥梁”的作用，连接在Ⅰ型胶原纤维之间，起到稳定真皮组织胶原纤维结果，完善修复作用的效果。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种自体母乳干细胞的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离得到母乳干细胞；
诱导分化所述母乳干细胞，使得所述母乳干细胞分化为成纤维细胞，所述诱导分化采用机械张力条件下，将所述母乳干细胞置于张力培养基中进行培养；其中，所述机械张力条件为：拉伸最大幅度5~8%，加力频率0.1~0.15Hz，加力波形为正弦波；所述张力培养基以DMEM/F-12为基础，向其中添加糖皮质激素和植物甾醇类物质，使得糖皮质激素的浓度为0.5~1.5mmol/L，植物甾醇的浓度为0.01~0.03mmol/L；以及
负载培养成纤维细胞，以得到复合体，所述复合体为聚乳酸水凝胶与所述成纤维细胞的复合物；
其中，所述负载培养步骤包括：
将所述聚乳酸水凝胶进行超声处理后，加入至负载培养基中，水凝胶占所述负载培养基的比例为50~60wt%，并接种所述成纤维细胞，负载培养周期为8~15天；所述负载培养基以DMEM/F-12为基础，向其中添加成纤维细胞生长因子、维生素C磷酸酯、脯氨酸和赖氨酸，并使得成纤维细胞生长因子浓度为1~10mmol/L，维生素C磷酸酯浓度为0.01~0.05 mmol/L，脯氨酸浓度为0.1~0.5mmol/L，赖氨酸浓度为0.1~0.5mmol/L；
所述聚乳酸水凝胶的制备方法包括：
将丝素粉加至沸水中，并同时加入碳酸钠，搅拌充分煮沸30min后；
过滤取出丝素粉、纳米聚乳酸粉末充分混合后加入至10mol/L LiBr溶液中，充分混合后，置于60℃烘箱中6h；加入至10mol/L LiBr溶液中丝素浓度为1.0~1.5g/L，纳米聚乳酸浓度为0.15~0.3g/L；
将溶液装入透析袋中透析3天得以去除LiBr；
将透析后的溶液离心多次，去除杂质后置于冷冻干燥机中干燥，即可获得所述聚乳酸水凝胶。
2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述植物甾醇选自β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，经诱导分化后得到的细胞中含成纤维细胞的数量不低于80%。
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