CN102225054B - 一种载有抗肿瘤药物微粒的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种载有抗肿瘤药物微粒的制剂及其制备方法，属医药技术领域。所述制剂以多药耐药间充质干细胞作为抗肿瘤药物微粒的载体，所述多药耐药间充质干细胞为表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞。本发明很好的解决了抗肿瘤药物蓄积导致间充质干细胞坏死的问题，能够将抗肿瘤药物微粒运输至恶性肿瘤并在局部缓释药物，实现肿瘤的靶向治疗，从而提高疗效，降低毒副作用，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物制剂，特别是涉及一种载有抗肿瘤药物微粒的制剂，属医药技术领域。
背景技术
恶性肿瘤的靶向治疗一直是国内外医药工作者共同关注的热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多向分化潜能的非造血干细胞，除了具有造血支持、免疫调节和多向分化的特性外,还具有特异性地迁移到损伤部位和肿瘤组织的特性。近年来的研究表明间充质干细胞可以在转染腺病毒、反转录病毒和慢病毒后却不改变间充质干细胞的生物学特性。因此以间充质干细胞为细胞载体的靶向肿瘤的基因治疗，可以特异性地迁移到肿瘤的原发灶及转移灶，传递和表达多种抗肿瘤因子，提高治疗效果。同时，抗肿瘤因子可以在肿瘤局部表达上调而避免全身的药物分布，减少全身用药产生的不良反应。间充质干细胞易于分离和体外培养,体外培养后仍可用于移植，因此，无免疫排斥和无伦理道德问题。间充质干细胞可以体外扩增50代以上，并且保持其原有的表型和分化潜能。因此，间充质干细胞有望成为新的抗肿瘤治疗的新策略。
然而，对间充质干细胞的研究仅局限在作为靶向肿瘤基因治疗的载体。由于抗肿瘤化学药物的细胞毒性作用，使得将具有良好靶向作用的间充质干细胞作为抗肿瘤化学药物细胞载体成为十分棘手的难题。
MDR1基因编码的P-糖蛋白又称P-gp (p-glycoprotein)，P-170，是一种分子量为170 KD的糖蛋白。P-gp是ATP结合转运蛋白超家族成员之一，具有ATP依赖的外排泵功能，一旦与药物结合，就可通过ATP分解提供能量，将药物泵出细胞外，药物在细胞内浓度不断下降，对肿瘤细胞而言将导致耐药。对正常细胞而言则可以避免药物对细胞的损害。
P-gp对药物的特异性很小，因此多药耐药细胞能对许多结构和作用机制不同的药物产生耐药。P-gp产生多药耐药相关的化疗药物主要有：(1)烷化剂类，如环磷酰胺；(2)抗肿瘤抗生素类，如柔红霉素；(3)植物碱类抗肿瘤药，如长春新碱、紫杉醇等；(4)蒽环类化疗药，如阿霉素；(5)激素类，如孕激素、三苯氧胺等。
中国学者已率先采用MDR1基因转染的方法，使骨髓间充质干细胞获得了耐药性（叶明珠，韩丽英，岳鑫，李荷莲，中国实验诊断学，2007,11(1), 10-12；叶明珠，韩丽英，李荷莲，张海英，中国实用妇科与产科杂志，2007,23(3), 181-183；陈慧玲，白海，中国实验血液学杂志，2009,17(3),690-694）。但这一技术的目的是对恶性肿瘤患者进行化疗保护，即增强了间充质干细胞耐受多种化疗药物的能力，在降低肿瘤化疗副反应的同时增强大剂量化疗对肿瘤细胞的杀伤性，提高肿瘤化疗的临床治疗效果。
目前仍然没有有效技术解决抗肿瘤药物蓄积导致间充质干细胞坏死并实现抗肿瘤药物微粒运输至恶性肿瘤并在局部缓释药物的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷、提供一种载有抗肿瘤药物微粒的制剂，该制剂能够靶向至恶性肿瘤局部并且缓释药物，从而提高疗效、降低毒副作用。
本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
一种载有抗肿瘤药物微粒的制剂及其制备方法，所述制剂以多药耐药间充质干细胞作为抗肿瘤药物微粒的载体。
上述制剂，所述多药耐药间充质干细胞为表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞；所述表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞是通过以病毒（逆转录病毒或慢病毒）为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞而获得。
上述制剂，所述抗肿瘤药物微粒粒径为10nm~500μm，并由以下重量百分比的组分构成：
抗肿瘤药物 0.01~30%；
辅料 余量；
其中，所述抗肿瘤药药物选自盐酸阿霉素、盐酸平阳霉素、盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸柔红霉素、高三尖杉酯碱、长春新碱、羟基喜树碱、硫酸长春地辛、硫酸长春碱、重酒石酸长春瑞宾、紫杉醇、长春质碱、长春瑞宾碱、多烯紫杉醇、秋水仙碱、9-氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、米托蒽醌或环磷酰胺中一种或多种；
所述辅料选自聚乳酸（PLA）或乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)中的一种或两种。
上述制剂，所述抗肿瘤药物微粒粒径为20nm~200μm；所述抗肿瘤药物用量优选为0.1~10% 。
上述制剂，所述辅料为聚乳酸与乳酸-羟基乙酸聚合物的混合物，其重量比为0.1/100~100/0.1，优选重量比为40/60~60/40。
上述制剂，所述乳酸-羟基乙酸聚合物中丙内酯与乙内酯的摩尔比为99/1~1/99，优选摩尔比为85/15、75/25或50/50。
一种制备上述载有抗肿瘤药物微粒的制剂的方法，它按如下步骤进行：
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将抗肿瘤药物和PLA或PLGA溶于DMSO、二氯甲烷、氯仿、丙酮、醇类或醚类、以及上述溶剂组成的混合溶剂中，形成有机相。将上述有机相在含有表面活性剂的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥发，制备抗肿瘤药物微粒。
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以病毒（逆转录病毒或慢病毒）为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用。
制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到多药耐药间充质干细胞（MDR-MSCs）细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含0.1~20.0mg抗肿瘤药物的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育1~8小时，离心，收集包覆抗肿瘤药物微粒的多药耐药间充质干细胞，即得发明产物。
本发明所述的间充质干细胞由骨髓血、外周血、脂肪、羊膜、羊水、胎盘、脐血或脐带等体液或组织中分离而得。分离可采用密度梯度离心法、贴壁筛选法或流式细胞仪分选法，使用这些分离方法可以实现很好的分离。
本发明所述的多药耐药基因MDR1，位于人类第7号染色的长臂上（7q21）， 基因组序列长度为209 kb，其编码的P-gp蛋白包含了1280个氨基酸片断（Bodor M, Kelly EJ, Ho RJ, Characterization of the human MDR1 gene, AAPS J, 2005, 7(1):E1-5 ）。
本发明所述的间充质干细胞具有特异性地迁移到损伤部位和肿瘤组织的特性，而表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞又能够避免抗肿瘤药物的毒性，能够很好的实现承载抗肿瘤药物并靶向指至肿瘤部位而本身不失去生物活性。抗肿瘤药物微粒具有缓释作用，可长时间释放药物。本发明采用表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞技术与微粒技术相结合，很好地解决了抗肿瘤药物蓄积导致间充质干细胞坏死的问题，能够将抗肿瘤药物微粒运输至恶性肿瘤并在局部缓释药物，实现肿瘤的靶向治疗，从而提高疗效，降低毒副作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞承载阿霉素微粒组（DOX-NPs-MDR-MSCs）对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用曲线图。
图2是 表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞承载紫杉醇微粒组（PTX-NPs-MDR-MSCs）对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
一、制备载有抗肿瘤药物微粒的制剂及方法
实施例1 承载盐酸阿霉素微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将盐酸阿霉素和PLA溶于DMSO中，形成有机相。将上述有机相在含有PVA205的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径120nm、含药量为2.5%的盐酸阿霉素PLA微粒。
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以逆转录病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用。
制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒，以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.5mg盐酸阿霉素的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育3小时，离心，收集包覆盐酸阿霉素微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例2 承载紫杉醇微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将紫杉醇和PLA溶于二氯甲烷中，形成有机相。将上述有机相在含有吐温80的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径95nm、含药量为4.1%的紫杉醇PLA微粒
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以慢病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒，以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.1mg紫杉醇的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育3小时，离心，收集包覆紫杉醇微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例3 承载多烯紫杉醇微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将多烯紫杉醇和PLGA溶于丙酮中，形成有机相。将上述有机相在含有泊洛沙姆188的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径80nm、含药量为0.01%的多烯紫杉醇PLGA微粒，其中PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为1/99；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以逆转录病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；
制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.1mg多烯紫杉醇的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育1小时，离心，收集包覆多烯紫杉醇微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例4 承载羟基喜树碱微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将羟基喜树碱和PLGA溶于丙酮—乙醇组成的混合溶剂中，形成有机相。将上述有机相在含有泊洛沙姆188的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径500μm、含药量为3%的羟基喜树碱PLGA微粒，其中PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为99/1；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以慢病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.5mg羟基喜树碱的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育4小时，离心，收集包覆羟基喜树碱微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例5 承载盐酸吡柔比星微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将盐酸吡柔比星和PLGA溶于丙酮—乙醇组成的混合溶剂中，形成有机相。将上述有机相在含有吐温80的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径200μm、含药量为1%的盐酸吡柔比星PLGA微粒，其中PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为85/15；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以逆转录病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.1mg的盐酸吡柔比星的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育1小时，离心，收集包覆盐酸吡柔比星微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例6 承载环磷酰胺微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将环磷酰胺和PLGA溶于丙酮—乙醇组成的混合溶剂中，形成有机相。将上述有机相在含有泊洛沙姆188的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径100nm、含药量为2%的环磷酰胺PLA-PLGA微粒，其中PLA与PLGA的重量比为0.1/100, PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为75/25；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以慢病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含0.4mg环磷酰胺的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育2小时，离心，收集包覆环磷酰胺微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例7 承载长春瑞宾碱微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将长春瑞宾碱和PLA及PLGA溶于二氯甲烷中，形成有机相。将上述有机相在含有吐温80的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径400μm、含药量为25%的长春瑞宾碱PLA-PLGA微粒，其中PLA与PLGA的重量比为100/0.1, PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为50/50；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以逆转录病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；
制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.0mg长春瑞宾碱的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育7小时，离心，收集包覆长春瑞宾碱微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例8 承载米托蒽醌微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将米托蒽醌和PLA及PLGA溶于二氯甲烷中，形成有机相。将上述有机相在含有PVA205的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径50nm、含药量为8%的米托蒽醌PLA-PLGA微粒，其中PLA与PLGA的重量比为40/60, PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为50/50；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以慢病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.1mg米托蒽醌的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育1小时，离心，收集包覆米托蒽醌微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例9 承载秋水仙碱微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将秋水仙碱和PLA及PLGA溶于二氯甲烷中，形成有机相。将上述有机相在含有泊洛沙姆188的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径300nm、含药量为5%的秋水仙碱PLA-PLGA微粒，其中PLA与PLGA的重量比为60/40, PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为75/25；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以逆转录病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含1.2mg秋水仙碱的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育1小时，离心，收集包覆秋水仙碱微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
实施例10 承载长春新碱微粒的制剂
a.制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备。制备过程为：将长春新碱和PLGA溶于丙酮中，形成有机相。将上述有机相在含有吐温80的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备平均粒径300μm、含药量为10%的长春新碱PLGA微粒，其中PLGA中丙内酯与乙内酯的摩尔比为75/25；
b.制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以慢病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；制备过程如下：采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCIPGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的MSCs接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染MSCs，在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的MDR-MSCs 细胞。
c.制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含0.3mg长春新碱的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育4小时，离心，收集包覆长春新碱微粒的多药耐药间充质干细胞，即得本发明产品。
二、本发明制剂对肺癌皮下移植瘤治疗效果试验
实施例A
以实施例1所得制剂进行如下实验：
以C57小鼠为实验动物，建立Lewis肺癌皮下移植瘤模型，并将动物分为空白对照组、阿霉素溶液组、阿霉素微粒组、多药耐药间充质干细胞承载阿霉素微粒组（DOX-NPs-MDR-MSCs），空白对照组血管注射等量生理盐水，其余各组血管注射的阿霉素含量相等。采用小鼠尾静脉、按5mg/kg阿霉素给药。
在不同时间点，测量肿瘤体积，经统计学处理，比较上述各组的体内药效。统计学处理采用SPSS 11．0软件处理，采用单因素方差分析比较组间差异，检验水平为0.05。
结果显示DOX-NPs-MDR-MSCs组与其他各组见有显著性差异（P<0.05），说明表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞承载阿霉素微粒制剂对Lewis肺癌皮下移植瘤有较好治疗效果。见附图1。
实施例B
以实施例2所得制剂进行如下实验：
以C57小鼠为实验动物，建立Lewis肺癌皮下移植瘤模型，并将动物分为空白对照组、紫杉醇(PTX)溶液组、紫杉醇微粒组、多药耐药间充质干细胞承载紫杉醇微粒组（PTX-NPs-MDR-MSCs），空白对照组血管注射等量生理盐水，其余各组血管注射的紫杉醇含量相等。采用小鼠尾静脉、按5mg/kg阿霉素给药。在不同时间点，测量肿瘤体积，经统计学处理，比较上述各组的体内药效。统计学处理采用SPSS 11．0软件处理，采用单因素方差分析比较组间差异，检验水平为0.05。
结果显示DOX-NPs-MDR-MSCs组与其他各组见有显著性差异（P<0.05），说明表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞承载紫杉醇微粒制剂对Lewis肺癌皮下移植瘤有较好治疗效果。见附图2。
显然，本发明所提供的技术方案可以组合出很多实施例，而本发明的实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种制备载有抗肿瘤药物微粒的制剂的方法，其特征在于，它按如下步骤进行：
a. 制备抗肿瘤药物微粒：采用乳化-溶剂挥发法制备，制备过程为：将抗肿瘤药物和PLA或PLGA溶于DMSO、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醇醇或乙醚、以及上述溶剂组成的混合溶剂中，形成有机相；将上述有机相在含有表面活性剂的pH 7.4磷酸盐缓冲液中采用超声进行乳化，有机溶剂采用减压干燥的方式快速挥走，制备抗肿瘤药物微粒；
b. 制备表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞：以病毒为载体，将多药耐药基因转染间充质干细胞获得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞，备用；所述病毒为逆转录病毒或慢病毒；
制备过程如下：
采用脂质体转染法将pMX-mdr1-GFP与外膜蛋白质粒PCI VSV、PCI PGB共同导入293T包装细胞，制备病毒上清液并测定病毒滴度；将待转染的间充质干细胞接种于培养板，37℃、5%CO2全湿条件下培养，24 h后弃旧培养基，加入逆转录病毒上清，感染间充质干细胞在无菌条件下用流式细胞仪分选，得到的多药耐药间充质干细胞；
c. 制备制剂：将b中所得表达P-糖蛋白的多药耐药间充质干细胞与a中所得抗肿瘤药物微粒以每106个多药耐药间充质干细胞比相当于含0.1～20.0mg抗肿瘤药物的比例，在37℃、5%CO2全湿条件下共同孵育1～8小时，离心，收集包覆抗肿瘤药物微粒的多药耐药间充质干细胞，即得发明产物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制剂是以多药耐药间充质干细胞作为载体，包覆粒径为10nm～500μm、含药量为0.01～30%的抗肿瘤药物微粒形成的制剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药药物选自盐酸阿霉素、盐酸平阳霉素、盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸柔红霉素、高三尖杉酯碱、长春新碱、羟基喜树碱、硫酸长春地辛、硫酸长春碱、重酒石酸长春瑞宾、紫杉醇、长春质碱、长春瑞宾碱、多烯紫杉醇、秋水仙碱、9-氨基喜树碱、7-乙基喜树碱、米托蒽醌或环磷酰胺中一种或多种；所述辅料选自聚乳酸或乳酸-羟基乙酸聚合物中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物微粒粒径为20nm～200μm；所述抗肿瘤药物用量为0.1～10% 。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述辅料为聚乳酸与乳酸-羟基乙酸聚合物的混合物，其重量比为0.1/100～100/0.1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸与乳酸-羟基乙酸聚合物重量比为40/60～60/40。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸-羟基乙酸聚合物中丙内酯与乙内酯的摩尔比为99/1～1/99。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸-羟基乙酸聚合物中丙内酯与乙内酯的摩尔比为85/15、75/25或50/50。
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