KR20200078536A - 세포 집단의 증대를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포 집단뿐만 아니라 다른 세포 집단을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, 그 중에서도, 줄기세포 및/또는 다른 세포 집단, 특히 조혈 줄기세포 집단을 증대시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

세포 집단의 증대를 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 PCT 출원으로 출원 중에 있으며, 2017년 10월 9일에 출원된 미국 특허출원 제62/570,076호 및 2018년 7월 9일에 출원된 미국 특허출원 제62/695,820호에 대한 우선권 혜택을 주장하며, 상기 출원은 둘 다 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 세포 집단 및 특히 조혈 줄기세포 집단과 같은 줄기세포 집단을 증대(expanding)시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
조혈 줄기세포(HSC)는 자가-재생(증대)의 특성과 모든 유형의 성숙한 혈액 세포를 발생시키는 다계통 분화능(multilineage potential)의 특성 둘 다를 갖는 클론원성 세포이다. HSC는 조혈을 책임지고 있으며 증식과 분화를 거쳐, 이의 자가-재생 능력을 여전히 유지하면서 다양한 계통의 성숙한 혈액 세포를 생산한다. 자가-재생 능력은 동물의 일생 동안 유지되고 또한 HSC가 치사량의 방사선 조사된 유사유전자형 숙주의 골수를 재증식시킬 수 있게 한다.
초기 HSC 발생은 광범위한 자가-재생 능력을 갖는 장기적(LT-) HSC부터 시작하여 단기적(ST-) HSC(제한된 자가-재생 능력을 가짐) 및 증식성 다분화능 선조세포(multipotent progenitor: MPP)(다분화능 잠재성을 갖지만 자가-재생 능력은 없음)에 상응하는 증대 상태가 뒤따르는 계층적 배열을 나타낸다. MPP는 분화를 위한 기폭 및 준비 단계이기도 하다. MPP는 분화하여, 모든 림프 계통을 발생시키는 공통 림프계 선조세포(common lymphoid progenitor: CLP) 또는 모든 골수 계통을 생성하는 공통 골수 선조세포(common myeloid progenitor: CMP) 중 하나가 되는 것으로 정해져 있다. 이러한 과정 동안, 더 원시적인 집단이 덜 원시적인 세포 집단을 발생시키고, 상기 덜 원시적인 세포 집단은 더 원시적인 세포의 집단을 발생시킬 수 없다. HSC의 다분화능, 자가-재생 및 활성화(또는 일시적 증폭) 및 MPP로부터 CLP 또는 CMP로의 계통 수임(lineage commitment)을 포함하는 이들 과정을 제어하는 고유한 유전적 프로그램은 대부분이 여전히 알려져 있지 않다.
개체의 일생 동안 혈액 세포의 일정한 생성을 유지하기 위해, 골수의 니치(niche)에 있는 HSC(Zhang, J. et al. Nature 425, 836-841, 2003; Calvi, L. M. et al. Nature 425, 841-846, 2003; Kiel, M. J., et al. Cell 121, 1109-1121, 2005; Arai, F. et al. Cell 118, 149-161, 2004)는 휴지 상태와 활성화 상태 사이의 균형을 유지하여 즉각적인 조혈에 대한 요구를 충족시켜야 하며, 이러한 동안 장기적 줄기세포 유지도 보장된다. 성체에서, 줄기세포의 휴지 상태와 활성화 상태 사이의 항상성은 HSC가 이의 자가-재생 잠재성을 상실하는 것을 방지하고 동시에 진행중인 조직 재생을 지지하기 위해 중요하다(Li, L. and Xie, T. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21, 605-631, 2005). 줄기세포의 과도한 활성화 및 증대는 결국 줄기세포 집단의 고갈과 종양이 발생하기 쉬운 소인이라는 위험 둘 다가 있다. 줄기세포의 활성화에 중요한 일부 인자가 밝혀졌지만(Heissig, B. et al. Cell 109, 625-637, 2002), 휴지 상태와 활성화 상태 사이의 이행을 통제하는 분자 이벤트는 잘 이해되어 있지 않다.
HSC는 항상성 및 스트레스 조건 하에 평생의 조혈을 책임지고 있으며, 이는 줄기세포 자가-재생과 분화 사이의 절묘한 균형에 의존한다(Li et al. Science, 327: 542-545, 2010; Weissman et al. Cell, 100: 157-168, 2000). 따라서, HSC 이식은 혈액, 면역 및 유전 질환뿐만 아니라 암을 포함하는 광범위한 장애에 대한 인명 구조 요법이다(Walasek et al. Annals of the New York Academy of Sciences 1266: 138-150, 2012). 그러나, HSC-기반 치료는 주로 HLA-매칭 공여자 골수(BM)의 부족에 의해 제한될 수 있다. 동종 이식이 대안적 접근법을 제공하지만, 이식편대숙주 질환(GvHD)은 면역 억제제 복용이 면역 회복 지연, 혈전성 미세혈관병증과 같은 수많은 부작용을 가지고 있기 때문에 평생의 도전 과제로 남아있다(Sung et al. Stem Cells Translational Medicine, 2: 25-32 (2013) ;Shlomchik et al. Nature Reviews. Immunology, 7: 340-352, 2007). hUCB로부터의 HSC의 이식은 GvHD의 위험을 감소시킨다; 그러나, BM 또는 동원된 말초혈보다 적은 수의 hUCB 내의 HSC는 이의 적용을 제한한다(Walasek et al. Annals of the New York Academy of Sciences, 1266: 138-150, 2012). 단일 분자 또는 경로를 표적화하는 것은 hUCB HSC 증대를 위해 연구되어 왔다(Huang et al. Leukemia, 30: 144-153, 2016; Boitano et al. Science, 329: 1345-1348, 2010; Fares et al. Science, 345; 1509-1512, 2014; Ansellem et al. Nature Medicine, 9: 1423-1427, 2003; Antonchuk et al. Cell, 109: 39-45, 2002; Rentas et al. Nature, 532: 508-511, 2016; Himburg et al. Nature Medicine, 16: 475-482, 2010; North et al. Nature, 447: 1007-1011, 2007; Guo et al. Nature Medicine, 2018); Varnum-Finney et al. Nature Medicine, 6: 1278-1281, 2000; and Chou et al. Experimental Hematology, 41: 479-490 e474, 2013). 그러나, 분화에 비해 줄기세포 자가-재생을 상대적으로 유리하게 하기 위해 다른 접근법이 모색되고 있다(Zhao et al. Molecular Cell Biology, 18: 31-42, 2017).
m6A는 RNA 프로세싱, 국소화, 번역 및 최종 붕괴를 조정함으로써 유전자 발현의 결과를 조절하는 mRNA 내의 만연한 내부 변형으로, 마크의 "기록인자(writer)", "소거인자(eraser)" 및 "판독인자(reader)"에 의해 조정된다(Roundtree et al. Cell, 169: 1187-1200, 2017; Li et al. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 15: 127-150, 2014). 최근의 연구는 배아발생 동안 줄기세포 운명 결정 및 내피에서 조혈로의 이행(endothelial-to-hematopoietic transition)(Batista et al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014; Geula et al. Science, 347: 1002-1006, 2015; Yoon et al. Cell, 2017; Zhang et al. Nature, 549: 273-276, 2017; Zhao et al. Nature, 542: 475-478, 2017)뿐만 아니라 백혈병 발병(Li et al. Cancer Cell, 31: 127-141, 2017; Vu et al. Nature Medicine, 2017; Barbieri et al. Nature, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199, 2018)에서의 m6A 변형의 역할을 밝혔다. 흥미롭게도, m6A 기록인자 복합체인 Mettl3 및 Mettl14의 결함은 상이한 유형의 줄기세포에서 별개의 결과를 초래한다. 예를 들어, Mettl3 또는 Mettl14 KO는 마우스 배아 줄기세포(mESC) 및 배아 뉴런 줄기세포(NSC)에서 줄기세포 자가-재생 및 유지를 향상시키면서(Batista et al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014; Yoon et al. Cell, 2017) HSC에서 분화를 촉진하였다(Vu et al. Nature Medicine, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199, 2018; Barbieri et al. Nature, 2017). 게다가, 줄기세포 및 백혈병에서 m6A의 생리적 기능은 상이한 메커니즘을 통해 매개된다. 줄기세포에서, m6A 변형은 줄기세포 운명 결정인자를 암호화하는 mRNA의 m6A-매개 붕괴에 의해 줄기세포 운명 결정을 조절하는 한편(Batista et al. Cell Stem Cell, 15 : 707-719, 2014; Yoon et al. Cell, 2017), 급성 골수성 백혈병(AML)에서, m6A 변형은 종양유전자(oncogene)의 mRNA를 안정화시키고/시키거나 이들의 번역을 증가시키므로 Mettl3 및 Mettl14는 백혈구생성을 촉진한다 (Vu et al. Nature Medicine, 2017; Barbieri et al. Nature, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199, 2018). 더욱이, 이전의 연구는 FTO 및 Mettl14의 백혈구생성 기능이 YTHDF 판독인자 단백질과 무관하다는 것을 보고하였다(Li et al. Cancer Cell, 31: 127-141, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199, 2018).
m6A RNA 변형이 마크의 "기록인자", "소거인자" 및 "판독인자"에 의해 조정됨에 따라(Wang et al. Nature, 505 (7481) : 117-120, 2014), 이 마크 및 다른 마크를 설치, 인식 및 제거하는 과정들은 세포 과정, 발달 과정 및 질환 과정에 다양한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 연구는 m6A 마크가 마이크로RNA(miRNA) 생물발생의 개시를 촉진하는 주요 전사후 변형으로서 작용할 수 있음을 보여주었다(Alarcon et al. Nature, 519 (7544) : 482-485, 2015). 증거도 또한 줄기세포의 특정 계통으로의 분화(Batista, Cell stem Cell, 15(6): 707-719, 2014; Zhang et al. Nature, 549(7671): 273-276, 2017) 및 유전자 발현의 조절(Dominissini et al., Nature 485(7397):201-206, 2012; Haussmann et al, Nature 540(7632): 301-304, 2016)에 관여할 수 있는 m6A RNA 변형을 가리킨다. m6A 트랜스퍼라제 METTL3은 뮤린 완전 만능성(naive pluripotency)을 종결시키기 위한 조절인자로서 동정되었다(Geula et al. Science, 347 (6225) : 1002-1006, 2015). m6A "기록인자" 단백질 METTL3은 또한 마우스 T 세포에서 T 세포 항상성 및 분화를 방해하는 것으로 입증되었으며(Li et al. Nature, 548(7667): 338-342, 2017), m6A RNA 메틸화는 XIST-매개 전사 억제를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(Patil et al. Nature, 537(7620): 369-373, 2016). M6A RNA 변형은 또한 자외선-유도 DNA 손상 반응을 조절하는 것으로 나타났다(Xiang et al. Nature, 543(7646): 573-576, 2017). 제브라피쉬에서와 같이 모체에서 접합체로의 이행(MZT)에 대한 연구는 또한 전사체 전환 및 동물 발달에서 m6A mRNA 메틸화의 역할을 나타냈다(Zhao et al. Nature, 542(7642): 475-478, 2017). 따라서, 누적된 증거가 m6A의 생물학적 기능에 대한 통찰력을 제공하였지만(Lence et al. Nature, 540 (7632); 242-247, 2016), 성체 줄기세포에서의 m6A의 기능은 대체로 알려져 있지 않다.
골수(BM)의 조혈 줄기세포(HSC)는 평생 동안 항상성 조혈을 유지시키고 또한 골수제거(myeloablation) 후 재생을 지지한다(Weissman, 2000). 휴지기 HSC는 치사량의 방사선 조사된 마우스에서 증식성 HSC보다 우수하게 작용하는데, 이는 HSC를 DNA 손상으로부터 보호하는 휴지 상태에 주로 기인한다(Arai et al., 2004; Fleming et al., 1993; Wilson et al., 2008) (Walter et al., 2015). 그러나, 최근의 연구는 HSC 내의 DNA 손상 축적이 HSC 휴지에 의존적인 DNA 복구 및 반응 경로의 광범위한 감쇠와 연관된다는 것을 보여주었다(Beerman et al., 2014). 실제로, 대다수의 HSC는, 이의 휴지 상태에도 불구하고, 5-플루오로우라실(5FU)과 같은 화학요법 약물로 인한 DNA 손상에 민감하다(Lerner and Harrison, 1990). 해결되지 않은 문제는 조혈계가 골수제거의 결과를 어떻게 극복하는가이다. 발달 동안 및 성체에서의 HSC의 현저한 이질성과 관련하여(Benveniste et al., 2010; Benz et al., 2012; Fleming et al., 1993; Morita et al., 2010; Zhou et al., 2016), 약물 내성의 특징 및 스트레스-유발된 골수제거를 극복하기 위해 HSC를 대량으로 재생하는 능력의 특징을 갖는 예비 HSC(reserve HSC: rHSC) 아집단의 존재가 제안되었다(Haug et al., 2008; Li and Clevers, 2010; Wilson et al. al., 2008). 그러나, 현재까지 혈액계에서 rHSC의 존재를 지지하는 기능적 증거는 제공되지 않았다.
HSC는 이의 유지 및 재생을 위해 복잡한 BM 니치(niche)에서 보존된다(Li and Clevers, 2010; Mendelson and Frenette, 2014; Morrison and Scadden, 2014; Scadden, 2014; Schofield, 1978). 지난 수십년 동안, 다수의 연구들은 골내막(내골 표면) 세포(Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003), 굴모양 내피 세포(Hooper et al., 2009; Kiel et al., 2005), Cxcl12 풍부 세망(CAR) 세포(Sugiyama et al., 2006), 네스틴(Nestin)+ 및 NG2+ 혈관주위 세포(Kunisaki et al., 2013; Mendez-Ferrer et al., 2010), LepR+ 및 Prx-1+ 중간엽 줄기 및 선조세포(mesenchymal stem and progenitor cell)(Ding and Morrison, 2013; Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013), 비수초성 슈반세포(Yamazaki et al., 2011) 및 거핵구(Bruns et al., 2014; Zhao et al., 2014)를 포함하는 HSC 골수 니치 구성성분들의 복잡성을 밝혀냈다. 그러나, BM 니치 복잡성이 HSC 이질성 조절에 기여하는지 여부 및 BM 니치 복잡성이 어떻게 HSC 이질성 조절에 기여하는가는 대체로 불분명하게 남아있다(Itkin et al., 2016). 게다가, 최초의 HSC 니치는 처음에 소주골(trabecular bone) 영역의 골내막에서 스핀들 모양의 N-카데린+(N-cad+) 전-골모세포(pre-osteoblastic cell)로서 동정되었지만(Calvi et al., 2003; Xie et al., 2009; Zhang et al., 2003), BM 내의 N-cad+ 니치 세포의 성질과 기능은 불분명하게 남아있다.
따라서, 줄기세포 증식 및 분화의 분자적 조절에 대한 통찰력을 제공하기 위해 m6A 및 m6A mRNA 경로의 역할에 대한 설명과 이해가 여전히 필요하다. 생체내 및 생체외 둘 다에서 줄기세포 집단을 증대시키는 방법 및 적합한 대상체로의 이식을 통한 것과 같은 이러한 증대된 줄기세포 집단으로의 치료를 제공하는 방법에 대한 추가의 필요성이 여전히 남아있다.
본 개시내용의 일 실시형태에서, 줄기세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 줄기세포 집단이 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는 방법이 제공된다. 상기 방법은 줄기세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 미분화된 줄기세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포 집단의 현저한 분화 없이 미분화된 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 조혈 줄기세포(HSC) 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 HSC 집단이 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되고, 상기 방법이 HSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 HSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 HSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함하는, 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 조혈 줄기세포(HSC)를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법으로서, 증대된 HSC가 이를 필요로 하는 포유동물로 이식시 HSC 계통을 재구성할 능력이 있고, 상기 방법이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하는 단계 및 HSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에 따르면, 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
다른 추가의 실시형태에서, 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 추가의 실시형태에서, 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, (a) HSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, (a) HSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 조혈 세포(HSC) 집단을 HSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하는, HSC 집단을 증대시키는 방법으로서, 증대된 HSC 집단이 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적합한, 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 증대시키는 방법으로서, (a) HSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 HSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 HSC 집단이 적어도 2배 증대되고; (ii) 증대된 HSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는, 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 조혈 줄기세포 계통의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 조혈 줄기세포 계통을 재구성하는 방법으로서, (a) HSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 HSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 HSC 집단이 적어도 2배 증대되고; (ii) 증대된 HSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는, 단계; 및 (c) 증대된 HSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 이식하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 조혈 줄기세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 조혈 줄기세포 집단을 증대시키는 방법으로서, N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을, 포유동물에서 조혈 계통을 재구성하는 능력을 갖는 HSC와 함께 HSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 MSC 집단이 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되고, 상기 방법이 MSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 MSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함하는, 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC)를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법으로서, 증대된 MSC가 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식시 MSC 계통을 재구성할 능력이 있고, 상기 방법이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하는 단계 및 MSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포 집단(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포 집단(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
다른 추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 중간엽 조혈 세포(MSC) 집단을 MSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하는, MSC 집단을 증대시키는 방법으로서, 증대된 MSC 집단이 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적합한, 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 증대시키는 방법으로서, (a) MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되고, (ii) 증대된 MSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포 계통의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 중간엽 줄기세포 계통을 재구성하는 방법으로서, (a) MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되고; (ii) 증대된 MSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는 단계; 및 (c) 증대된 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 이식하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 중간엽 줄기세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 중간엽 줄기세포 집단을 증대시키는 방법으로서, N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을, 포유동물에서 중간엽 계통을 재구성하는 능력을 갖는 HSC와 함께 MSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 MSC 집단이 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되고, 상기 방법이 MSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여, MSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함하는, 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC)를 적어도 2배 생체외 증대시키는 방법으로서, 증대된 MSC가 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식시 MSC 계통을 재구성할 능력이 있고, 상기 방법이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 상기 줄기세포 내로 도입하는 단계 및 MSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포 집단(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포 집단(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.
다른 추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 중간엽 세포(MSC) 집단을 HSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하는, MSC 집단을 증대시키는 방법으로서, 증대된 MSC 집단이 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적합한, 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 증대시키는 방법으로서, (a) MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되는, 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 중간엽 줄기세포 계통의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 중간엽 줄기세포 계통을 재구성하는 방법으로서, (a) MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되는, 단계; 및 (c) 증대된 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태에서, 중간엽 줄기세포 집단의 재구성을 필요로 하는 포유동물에서 중간엽 줄기세포 집단을 재구성하는 방법으로서, N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을, 포유동물에서 중간엽 계통을 재구성하는 능력을 갖는 MSC와 함께 MSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함하는 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 생물학적 샘플로부터 중간엽 줄기세포(MSC)를 단리하는 방법으로서, MSC 집단을 갖는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시킴을 포함하는 방법이 제공된다.
추가의 실시형태에서, 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 생성된 바와 같은 단리된 중간엽 줄기세포 집단이 제공된다. 또 다른 실시형태에 따르면, 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 생성된 바와 같은 증대된, 단리된 중간엽 줄기세포 집단이 제공된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식을 위해 단리하기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 MSC를 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시키기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) MSC 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시킴으로써 상기 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하는 단계 및 (b) 단리된 MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시킴으로써 상기 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하는 단계; 및 (b) 단리된 MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 MSC 집단을 대상체에게 투여함을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시켜 생성된 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 증대 방법이 제공된다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 CAR-T 세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 생체외 증대 방법이 제공된다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 CAR-T 세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시켜 생성된 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 생체외 증대 방법이 제공된다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여, CAR T-세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포의 생체외 증대 방법으로서, 증대된 CAR T-세포가 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식시 암 및/또는 혈액 장애를 치료할 능력이 있은 방법이 제공된다. 상기 방법은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 내로 도입하는 단계 및 CAR T-세포 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식을 위해 증대시키기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함한다.
다른 추가의 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, CAR T-세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 추가의 실시형태에서, 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재하에, 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단을 CAR T-세포 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하며, 여기서 증대된 CAR T-세포 집단은 이를 필요로 하는 포유동물로의 이식에 적합하다.
또 다른 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 T-세포 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 T-세포 집단을 키메라 항원 수용체(CAR)로 변형시켜 CAR T-세포 집단을 형성하는 단계; 및 (c) 상기 샘플로부터 CAR T-세포 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) CAR T-세포 집단이 적어도 2배 증대되는 단계를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 암 및/또는 혈액 장애를 앓는 대상체의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 T-세포 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 T-세포 집단을 키메라 항원 수용체(CAR)로 변형시켜 CAR T-세포 집단을 형성하는 단계; (c) 상기 샘플로부터 CAR T-세포 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) CAR T-세포 집단이 적어도 2배 증대되는 단계; 및 (d) 증대된 CAR T-세포 집단을 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다.
다른 추가의 실시형태에서, 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을, 포유동물에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 능력을 갖는 CAR T-세포와 함께 CAR T-세포 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 혈액 장애를 앓는 대상체의 치료 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 줄기세포 및 T-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 집단을 수득하는 단계; (b) 임의로, 세포 집단이 T-세포를 포함하는 경우, T-세포를 키메라 항원 수용체(CAR)로 변형시켜 CAR T-세포를 제공하는 단계; (c) 상기 세포에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 세포의 수를 증대시킴으로써 세포 집단을 증대시키는 단계; 및 (d) 증대된 세포를 대상체에게 이식하여 혈액 장애를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 하기 상세한 설명 및 실시예에서 추가로 개개시된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고 본 발명의 특정의 측면을 추가 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적 실시형태들의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 하여 더 잘 이해할 수 있다.
도 1a 내지 도 1h: Ythdf2 KO는 마우스에서 표현형 HSC의 증가를 야기한다. 도 1a는 Mx1-cre;Ythdf2 f/f 조건부 KO(cKO) 마우스(conditional KO(cKO) mice)의 HSPC에서의 Ythdf2 결실을 나타내는 도식이다; 도 1b는 마우스 HSPC에서 넉아웃(knockout) Ythdf2의 세포내 흐름 검증(flow validation)을 나타내는 웨스턴 블롯(좌측) 및 히스토그램(우측)을 도시한다; 도 1c는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스(n = 각 그룹에 대해 5)로부터의 BM 내의 HSPC의 대표적인 유세포계측 분석 플롯이다; 도 1d 및 도 1E는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스(n = 각 그룹에 대해 5)로부터의 BM 내의 HSPC의 총 유핵 세포(TNC) 중 빈도(1d) 및 절대 세포 수(1e)를 나타내는 막대 그래프이다; 도 1f는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스(n = 각 그룹에 대해 5)로부터의 BM TNC의 절대 수를 나타내는 막대 그래프이다; 및 도 1g 및 도 1h는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스(n = 각 그룹에 대해 5)의 BM 내의 수임(committed) 선조세포(1g) 및 계통 세포(1h)의 절대 수를 나타내는 막대 그래프이다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정(unpaired t-test). n.s., 비유의적.
도 2a 내지 도 2j: Ythdf2 KO는 마우스에서 기능적 HSC의 증대를 초래한다. 도 2a는 기능적 HSC의 빈도를 결정하는 제한 희석 이식 검정(LDA)을 위한 실험 계획을 도시한다; 도 2b는 이식 후 16주차에서의 ELDA(극단 제한 희석 분석)(n = 그룹당 10)에 의해 CRU 빈도를 결정하기 위한 1차 LDA를 나타내는 그래프이다; 도 2c는 200K 구제 세포와 200K 전체 골수(WBM) 세포를 방사선 조사된 수용자에게 이식함으로써 경쟁적 재구성 검정을 나타내는 그래프이다. (n = 각 그룹에 대해 10); 도 2d 및 도 2e는 (2c)로서 이식 수용자 마우스로부터의 BM 내의 공여자 유래 HSPC의 TNC 중 빈도(2d) 및 절대 세포 수(2e)를 나타내는 막대 그래프이다(n = 각 그룹에 대해 10); 도 2f 및 2g는 1차 200K BM 이식 수용자 마우스로부터의 BM 내의 공여자 유래(CD45.2+) 수임 선조세포(2f) 및 계통 세포(2g)의 절대 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다(n = 각 그룹에 대해 9 내지 10); 및 도 2h는 2차 이식 후 16주차에서의 ELDA에 의해 장기적 CRU 빈도를 결정하기 위한 2차 LDA의 플롯을 도시한다(n = 10); 도 2i 및 2j는 각각, 이식 후 4주차에 총 생착된 공여자 세포에 대한 말초혈 분석과 이식 검정에 의한 기능적 마우스 조혈 줄기세포(HSC)의 정량을 나타내는 막대 그래프(2i) 및 이식 후 4주차에서의 B 세포, T 세포 및 골수 계통 세포의 백분율과 이식 검정에 의한 기능적 마우스 HSC의 정량을 나타내는 막대 그래프(2j)이다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 3a 내지 도 3i: Ythdf2는 m 6 A 판독인자로서 기능하고 mRNA 붕괴를 매개함으로써 HSC 유전자 발현을 조절한다. 도 3a는 irCLIP-seq 작업흐름의 개략도이다; 도 3b는 모든 3개의 복제물에서 발견된 모든 irCLIP 피크와 MEME에 의해 동정된 Ythdf2 결합 모티프를 나타내는 개략도이다; 도 3c는 5개의 각 전사 세그먼트 내의 Ythdf2 결합 피크의 분율을 도시하는 원형 차트이다; 도 3d는 3개의 Ythdf2 irCLIP-seq 복제물의 교차 유전자로부터 Ythdf2 표적의 GO 풍부화 분석을 나타내는 차트이다; 도 3e는 m6A 피크 및 Ythdf2 irCLIP 피크를 보유하는 Tal1의 대표적인 트랙을 도시한 것이며, m6A 면역침전 및 투입 단편의 커버리지(coverage)는 각각 적색 및 회색으로 표시되어 있고 Ythdf2 irCLIP 판독은 노란색으로 강조되어 있다; 도 3f는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터 분류(sorting)된 LSK 세포의 총 mRNA의 qPCR 분석을 나타내는 차트이다. 모든 Ct 값은 먼저 Actb 대조군(m6A-태그 없음)에 대해 정규화되었다. 이어서, 비(wt 대비 Ythdf2 KO)를 계산하였다. (n = 3); 도 3g는 TAL1(녹색)에 대한 wt(n = 65) 및 Ythdf2 KO(n = 54) HSPC의 염색 강도의 대표적 이미지(좌측) 및 이의 막대 그래프를 통한 정량(우측)을 도시한다; 도 3h는 wt 및 Ythdf2 KO HSPC에서 Tal1 mRNA의 형광 인 시츄 하이브리드화(in situ hybridization)(적색) 및 Dcp1a(P-바디 마커)의 형광 면역염색(자홍색), Ythdf2(녹색)를 나타내는 이미지를 도시하고, 여기서 화살표는 공동-국소화된 염색을 나타낸다. 스케일 바, 5 ㎛; 도 3i는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터 분류된 LSK 세포 내의 Tal1 mRNA 및 DCP1a 공동-국소화의 정량을 도시한다. 백분율은 각 LSK 세포에서 총 Tal1 mRNA 수준에 대한 DCP1a와 공동-국소화된 Tal1 mRNA의 평균 빈도를 나타낸다(n = 9 내지 17). 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정.
도 4a 내지 도 4i: m 6 A-seq 및 RNA-seq 분석에 의한 사람 제대혈 HSC에서의 YTHDF2의 역할. 도 4a는 TSS(좌측) 및 정지 코돈(우측)을 둘러싸는 윈도우에서의 서열 커버리지를 나타내는 메타유전자 프로파일을 도시하며, 여기서 m6A IP 및 대조 (투입) 단편의 커버리지는 각각 적색 및 회색으로 표시된다; 도 4b는 5개의 각 비중첩 전사체 세그먼트 내의 m6A 피크의 분율을 나타내는 파이 차트를 도시한 것이다; 도 4c는 마우스 HSPC와 hUCB HSPC에서 공유된 m6A-태그된 유전자와 독특한 m6A-태그된 유전자를 나타내는 벤다이어그램을 도시한다; 도 4d는 마우스 HSPC와 hUCB HSPC 둘 다에서 공유된 m6A-태그된 전사체의 GO 풍부화 분석의 차트를 도시한다; 도 4e는 m6A 피크를 보유한 HOXB4의 대표적인 트랙을 도시하며, 여기서 색 코드는 도 4a에서와 동일하다; 도 4f는 RNA-seq에 대한 hUCB CD34+ HSPC에서의 렌티바이러스 매개 YTHDF2 KD의 개략도를 도시한다; 도 4g는 대조군 및 YTHDF2 KD hUCB CD34+ 세포에 있어, m6A-마크된 유전자(자주색 선) 및 비-m6A-마크된 유전자(검은색 선)에 대한 log2(배수 변화)의 누적 분포의 플롯이다; 도 4h는 대조군 hUCB CD34+ 세포와 비교하여 YTHDF2 KDdml m6A-태그된 유전자 HOXB4의 판독이 증가하였지만 비-m6A-태그된 유전자 ACTB는 아님을 나타내는, RNA-seq 분석으로부터 대표적인 커버리지 플롯을 도시한다; 도 4i는 대조군 및 YTHDF2 KD hUCB CD34+ 세포에서 줄기세포 자가-재생과 관련된 비-m6A 표지된 ACTB(대조군으로서) 및 m6A-마크된 전사 인자의 상대적 mRNA 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. RNA-seq 분석으로부터의 RPKM을 대조군에 대해 정규화화였다. 조정된 P 값을 표시하였다. n.s., 비유의적.
도 5a 내지 도 5f: YTHDF2 KD는 생체외 인간 제대혈 HSC의 증대를 촉진한다. 도 5a 내지 도 5b는 7일 배양 후 대조군 세포와 대비한 YTHDF2 KD에서의 표시된 세포들의 빈도(5a) 및 절대 수(5b)의 배수 변화를 도시하는 막대 그래프이다; 도 5c는 형질도입된 CD34+ CD38- hUCB 세포로부터의 CFU 결과 및 CFU-과립구 적혈구 단핵구 거핵구(GEMM)의 이미지(스케일 바, 200㎛)를 도시하는 막대 그래프를 도시한다; 도 5d는 7일 배양된 대조군 또는 YTHDF2 KD hUCB 세포로부터의 적혈구 돌발형성단위(burst-forming unit-erythroid: BFU-E)(좌측) 및 콜로니-형성 단위 과립구/대식세포(CFU-GM)(우측)의 이미지를 포함하며(스케일 바, 200㎛), 여기서 독립적인 제대혈 샘플이 사용되었고 패널에 대해 2회 반복되었다; 도 5e는 아넥신 V 염색(n = 3개의 독립적인 CB 샘플)에 의한 형질도입된 CD34+ hUCB 세포의 7일 배양물 중의 CD34+ CD38- 세포의 아폽토시스(apoptosis) 분석을 나타내는 막대 그래프이다; 도 5f는 표시된 인간 제대혈 HSC(n = 3개의 개별적 인간 샘플)에서 대조군 대비Tthdf2 넉다운(knockdown: KD)의 배수 변화를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 대조군 shRNA 또는 인간 Ythdf2 shRNA를 분류된 CD34+ CD38- 제대혈 HSC로 전달하기 위해 렌티바이러스가 사용되었다. 파선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 6a 내지 6g: YTHDF2 KD는 인간 제대혈 기능적 장기적 HSC의 증대를 촉진한다. 도 6a는 생체내 증대 후 HSC의 빈도를 측정하기 위한 실험 계획을 나타내는 이미지이다; 도 6b는 가장 높은 2가지 세포 용량을 받는 1차 수용자 마우스로부터의 hCD45+ GFP+ 재구성의 대표적인 흐름도를 포함한다. hCD45 = 인간 CD45; 도 6c는 가장 높은 2가지 용량(n = 8)을 받은 1차 수용자 마우스로부터의 BM에서의 hCD45+ GFP+ 생착을 나타내는 플롯이다; 도 6d는 1차 LDA에 의해 결정된 HSC 빈도를 나타내는 플롯이다. 파선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다; 도 6e는 가장 높은 2가지 세포 용량을 받은 2차 수용자 마우스로부터의 hCD45+ GFP+ 재구성의 대표적인 흐름도를 포함한다; 도 6f는 가장 높은 2가지 용량(n = 6)을 받은 2차 수용자 마우스로부터의 BM 내의 hCD45+ GFP+ 생착을 나타내는 플롯이다; 도 6d는 2차 LDA에 의해 결정된 HSC 빈도를 나타내는 그래프이다. 파선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 7a 내지 7i : Ythdf2 KO HSC는 계통 편향의 징후 또는 휴지 및 귀소(homing) 능력의 차이를 보이지 않지만, 더 낮은 아폽토시스율을 나타낸다. 도 7a는 pI:pC 주사 부재 하의 Mx1-cre - ; Ythdf2f/f 마우스 및 Mx1-cre + ; Ythdf2f/f 마우스(n = 그룹당 3)로부터의 BM 내의 HSPC의 절대 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다; 도 7b는 wt(n = 3) 및 Ythdf2 KO(n = 4) 마우스에서의 HSPC의 세포주기 분석을 나타내는 막대 그래프이다; 도 7c는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스에서의 BM HSPC의 아폽토시스 분석을 나타내는 막대 그래프이다(n = 각 그룹에 대해 5); 도 7d는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 비장의 이미지 및 중량을 도시한다; 도 7e 내지 도 7h는 wt(n = 3) 및 Ythdf2 KO(n = 4) 마우스의 비장 내의 TNC(7e), LSK CD48- CD150+ HSC(7f), 수임 선조세포(7g) 및 계통 세포(7h)의 절대 수를 나타내는 막대 그래프이다; 도 7i는 wt 및 Ythdf2 KO 세포의 귀소 능력이 치사량의 방사선 조사된 마우스에 1×106 CFDA SE-표지된 BM 세포를 이식함으로써 결정되었음을 나타내는 막대 그래프이다. 18시간 후, BM을 귀소 이벤트(n = 그룹당 6마리 마우스)에 대해 분석하였다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 8a 내지 도 8f: Ythdf2 KO BM의 이식 수용자 마우스는 이식 후 16주차에 계통 변화 또는 결함을 나타내지 않는다. 도 8a 내지 도 8c는 2차 이식 후 16주차에 2차 200K 이식 수용자 마우스로부터의 BM 내의 공여자 유래된(CD45.2+) TNC (8a), 수임 선조세포(8b) 및 계통 세포(8c)의 절대 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다. (n = 각 그룹에 대해 7 내지 10); 도 8d 내지 도 8f는 2차 이식 후 16주차에 2차 200K 이식 수용자 마우스로부터의 비장 내의 공여자 유래 (CD45.2+) TNC(8d), 수임 선조세포(8e) 및 계통 세포(8f)의 절대 세포 수를 도시하는 막대 그래프이다(n = 각 그룹에 대해 7 내지 10). 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 9a 내지 도 9k: Ythdf2 KO는 계통 편향을 유발하지 않으면서 생체내 마우스 HSC 증대에 장기적인 영향을 미친다. 도 9a는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터 수집된 BM 및 비장이 pI:pC 유도 후 5 내지 7개월차에 유세포계측에 의해 분석되었음을 나타내는 도식이다; 도 9b 내지 도 9e는 유도 후 5 내지 7개월차에 wt 및 Ythdf2 KO 마우스의 BM 내의 TNC(도 9b), HSPC(도 9c), 수임 선조세포(도 9d) 및 계통 세포(도 9e)의 절대 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다. (n = 그룹당 4 내지 7마리 마우스); 도 9f는 유도 후 5 내지 7개월차에 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 비장의 중량을 나타내는 막대 그래프이다. (n = 그룹당 4 내지 7마리 마우스); 도 9g 내지 도 9j는 유도 후 5 내지 7개월차에 wt 및 Ythdf2 KO 마우스의 비장 내의 TNC(도 9g), LSK CD48- CD150+ HSC(도 9h), 수임 선조세포(도 9i) 및 계통 세포(도 9j)의 절대 수를 나타내는 막대 그래프이다. (n = 그룹당 4 내지 7마리 마우스); 도 9k는 pI:pC 주사 후 5개월차에 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 75k WBM가 200K 구제 세포와 함께 치사량의 방사선 조사된 수용자에게 이식되었음을 나타내는 그래프이다. 이식 수용자로부터의 말초혈을 이식 후 4주마다 분석하여 공여자 유래의 생착을 결정하였다(n = 각 그룹에 대해 10). 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 10a 내지 도 10d : 마우스 HSPC에서 m 6 A 변형의 분자적 특성규명. 도 10a는 TSS(상단) 및 정지 코돈(하단)을 둘러싸는 윈도우에서의 서열 커버리지를 나타내는 메타유전자 프로파일의 플롯을 도시하며, 여기서 m6A IP 및 대조(투입) 단편의 커버리지는 각각 적색 및 회색으로 표시된다; 도 10b는 5개의 각 전사 세그먼트 내의 m6A 피크의 분율을 나타내는 파이 차트를 도시한다; 도 10c는 발현 수준의 함수로서 각 세그먼트 내의 m6A 피크를 갖는 마우스 HPSC의 유전자 분율의 플롯을 도시한다; 도 10d는 HSPC에서 악티노마이신 D 처리 후 0시간 및 4시간차에서 발현 수준의 분석에 의해 결정된 m6A-태그된 및 비-m6A-태그된 mRNA 분해 속도의 그래프를 도시한다.
도 11a 내지 도 11e: 마우스 HSPC에서의 Ythdf2 기능을 irCLIP-seq에 의해 정의한다. 도 11a는 대조군 또는 Flag-Ythdf2 과발현된 HPC7 세포에서의 Ythdf2의 면역침전을 나타내는 이미지이다; 도 11b는 IR800 표지된 RNA-Ythdf2 복합체를 나타내는 irCLIP 막 이미지이고, 여기서 적색 박스는 라이브러리 구축을 위해 수집된 RNA-Ythdf2 복합체를 나타내고, UV 가교결합이 없는 샘플이 대조군으로서 작용한다; 도 11c는 3가지의 독립적인 Ythdf2 irCLIP-seq 실험에서 동정된 교차 유전자를 나타내는 벤다이어그램이다; 도 11d는 Ythdf2 결합 표적과 m6A 표지된 mRNA의 중첩을 나타내는 벤다이어그램이다; 도 11e는 m6A 피크 및 Ythdf2 irCLIP 피크를 보유하는 Gata2의 대표적인 트랙을 도시하며, 여기서 m6A 면역침전 및 투입 단편의 커버리지는 각각 적색 및 회색으로 표시되어 있고, Ythdf2 irCLIP 판독은 노란색으로 강조 표시되어 있다.
도 12a 내지 도12f: Ythdf2 KO는 m 6 A-태그된 mRNA 발현을 증가시켜 HSC 증대에 기여하였다. 도 12a는 총 RNA가 15,000개의 분류된 BM LSK Flk2- 세포로부터 추출되었음을 나타내는 막대 그래프이다; 도 12b는 wt 및 Ythdf2 KO Lin- 세포 내의 m6A RNA 메틸화의 정량을 도시한다(n = 6); 도 12c는 wt LT-HSC와 비교하여 Ythdf2 KO LT-HSC에서 증가된 TAL1, GATA2, RUNX1 및 STAT5 발현의 세포내 흐름 검증을 나타내는 정량(우측) 및 히스토그램(좌측)을 도시한다(n = 그룹당 3마리 마우스); 도 12d는 wt 및 Ythdf2 KO HSPC에서 Gata2 mRNA(적색)의 형광 인 시츄 하이브리드화 및 Dcp1a(P-체 마커)(자홍색), Ythdf2(녹색)의 형광 면역염색을 나타낸다. 화살표는 공동국소화된 염색을 나타낸다. 스케일 바, 5㎛; 도 12e는 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터 분류된 LSK 세포 내의 Gata2 mRNA 및 DCP1a 공동국소화의 정량을 도시한다. 백분율은 각 LSK 세포 내의 총 Gata2 mRNA 수준에 대한, DCP1a와 공동국소화된 Gata2 mRNA의 평균 빈도를 나타낸다(n = 12 내지 20); 도 12f는 이식 후 4주차에 CD45+ 집단 내의 GFP+ 세포의 백분율을 도시한다(n = 10). 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 13a 내지 도 13g: YTHDF2는 인간 제대혈 줄기세포에서 줄기세포 자가-재생과 관련된 전사 인자의 발현을 조절한다. 도 13a는 3개의 독립적인 제대혈 샘플을 사용하여 3개의 독립적인 m6A-seq 실험에서 동정된 교차 유전자들을 보여주는 벤다이어그램이다; 도 13b는 m6A 피크를 함유하는 mRNA 및 비-암호화 RNA의 백분율을 갖는 파이 차트를 도시한다; 도 13c는 hUCB CD34+ 세포에서 m6A 변형을 보유하는 전사 인자의 GO 풍부화 분석을 나타내는 막대 그래프이다; 도 13d는 YTHDF2의 넉다운 효율을 나타내는, 분류된 GFP+ 대조군 및 YTHDF2 KD hUCB 세포에서 YTHDF2(상단) 및 β-액틴(하단)의 웨스턴 블롯팅의 이미지를 도시한다; 도 13e는 YTHDF2의 넉다운 효율을 나타내는, 대조군 및 YTHDF2 KD hUCB CD34+ 세포의 RNA-seq 분석으로부터 YTHDF2의 발현 수준(좌측) 및 대표적인 트랙 플롯(우측)을 갖는 막대 그래프를 도시한다; 도 13f 내지 도 13g는 m6A 피크를 보유하는 표시된 전사 인자들의 대표적인 트랙 플롯(상단) 및 RNA-seq 분석으로부터의 이의 대표적인 커버리지 플롯(하단)이다. 조정된 P 값이 표시된다.
도 14a 내지 도 14c: hUCB 세포의 YTHDF2 KD는 계통 결과를 변화시키지 않으면서 HSC 증대를 초래하였다. 도 14a는 7일 배양 후 대조군 및 YTHDF2 KD hUCB 세포 내의 GFP+ CD34+ CD38- CD45RA- EPCR+ HSC의 대표적인 흐름도를 도시한다; 도 14b는 형질도입된 Hela 세포에서의 YTHDF2 단백질 넉다운 및 과발현의 확인을 도시한다; 도 14c는 10일 배양물로부터의 YTHDF2 OE 및 대조군 형질도입된 CD34+ CD38- CB에 의한 CFU 생성을 도시한다(n = 3개의 독립적인 인간 샘플). 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 15a 내지 도 15d: hUCB 세포의 YTHDF2 KD는 계통 결과를 변화시키지 않으면서 HSC 증대를 초래하였다. 도 15a는 1차 NSG 수용자 BM 내의 hCD45+ GFP+ 단핵구, 거핵구(MK 세포), B 세포 및 적혈구의 대표적인 흐름도를 포함한다; 도 15b 및 15c는 이식 후 10주차에 1차 NSG 수용자로부터의 hCD45+ GFP+(도 15b) 및 총 CD45+ (도 15c) BM 세포 중 계통 세포의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다(n = 13 내지 15); 도 15d는 이식 후 12주차에서의 2차 NSG 수용자로부터의 총 CD45+ BM 세포 내의 인간 공여자 유래 계통 키메리즘의 요약을 도시하는 막대 그래프이다. 데이터는 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 비대응 t-검정. n.s., 비유의적.
도 16: 생체내 중간엽 줄기세포의 증대. 도 16은 wt Ythdf2 및 Ythdf2 넉아웃(KO) 둘 다를 갖는 TNC 중 N-Cad+ CD105+의 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 17a 내지 도 17j: rHSC 집단의 기능적 동정. 도 17a는 rHSC, pHSC, ST-HSC 및 MPP에 대한 FACS 분류의 개략도이다; 도 17b는 이식 검정에 의한 rHSC 및 pHSC 기능의 정량을 도시한다. 이식 후 표시된 주수에서 생착된 총 공여자 세포 및 이식 후 20주차에 공여자 유래 B 세포, T 세포 및 골수 계통 세포의 백분율에 대한 PB 분석(n = 그룹당 10마리 마우스); 도 17c는 이식 후 40주차에서의 rHSC 또는 pHSC 이식된 마우스로부터의 공여자 유래 세포를 도시한다; 도 17d은 추적 후 130일차에서의 rHSC 및 pHSC 중 H2B-GFP 표지 보유 세포를 도시한다(n = 그룹당 4마리 마우스); 도 17e는 rHSC 및 pHSC에서의 세포 주기 유전자 발현을 도시한다(n = 20마리 마우스로부터의 3개 복제물); 도 17f는 표시된 바와 같이 rHSC 및 pHSC 이식된 수용자가 이식 후 4주차에 5FU 주사를 받았다는 것을 도시한다. 이식 후 표시된 주수에 공여자 생착 세포에 대한 PB 분석. 이식 후 20주차에서의 공여자 유래 B 세포, T 세포 및 골수성 계통 세포의 백분율이 도시되었다(n = 그룹당 10마리 마우스); 도 17g는 5FU 처리 후 3일차에서의 rHSC 및 pHSC를 도시한다(15마리 마우스로부터의 풀(pool)); 도 17h는 rHSC 및 pHSC에서의 DNA 손상 유전자 발현을 도시한다(n = 20마리 마우스로부터의 3개의 복제물). 도 17i는 대조군 마우스 및 5FU 후 3일차의 마우스로부터의 rHSC 내 DNA 손상 유전자를 나타낸다(n = 대조 마우스 그룹에서 20마리, n = D3 5FU 마우스 그룹에서 40마리). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 오차막대, s.e.m; 도 17j는 rHSC, pHSC 및 5FU rHSC 내의 스트레스 반응 유전자의 열지도를 도시한다.
도 18a 내지 도 18i: BM 니치 내의 골내막 영역에 의해 밝혀진 rHSC. 도 18a는 골(흰색, 제2 고조파 발생에 의해 발생됨, SHG), MK(노란색, 크기, 형태특징(morphology) 및 CD41 발현에 의해 구별됨)를 갖는 마우스 흉골 골수(BM)의 대표적인 홀마운트 이미지를 도시한다. 녹색 화살촉은 표현형 Lin- CD48-CD41-CD150+CD49b-rHSC를 나타내고, 흰색 화살촉은 표현형 Lin-CD48- CD41-CD150+CD49b+ pHSC를 나타낸다; 도 18b는 rHSC, pHSC 및 5FU rHSC의 대표적인 이미지를 도시한다. 흰색 화살표는 표현형 Lin-CD48-CD41-CD150+CD49b-rHSC, 표현형 Lin-CD48-CD41-CD150+CD49b+ pHSC 및 표현형 Lin-CD48-CD41- CD150+CD49b- 5FU rHSC를 나타낸다; 도 18c 내지 도 18e는 rHSC, pHSC 및 5FU rHSC 간의 혈관, MK 또는 골까지의 상대적 거리를 도시한다(n = 144개 rHSC, n = 685개 pHSC, n = 707개 5FU rHSC); 도 18f는 대조군 마우스 및 5FU 처리 후 1일차의 마우스에서의 건강한, 아폽토시스 및 사멸된 VE-Cad+ CD31+ 혈관 세포의 절대 수를 도시한다; 도 18f 내지 도 18g는 대조군 마우스 및 5FU 처리 후 1일차의 마우스로부터의 중심 골수(CM)의 아넥신V+ SytoxG─ħ 아폽토시스 Ve-Cad+ CD31+ 내피세포 또는 CM과 골 둘다의 N-cad-토마토(tomato)+ 세포의 절대 수를 도시한다. N = 각 그룹에서 3. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 오차막대, s.e.m; 도 18h 내지 도 18i는 대조군 마우스 및 5FU 처리 후 3일차의 마우스의 N-cad-토마토+ 및 Ve-Cad+ CD31+ 혈관의 대표적인 이미지를 보여준다.
도 19a 내지 도 19j: N-cad + 세포는 BM 니치 내의 기능적 HSC를 유지시킨다. 도 19a는 도 19b 내지 도 19g에 도시된 실험에서 사용된 N-cad-CreER T ;iDTR 마우스에의 DT 투여를 위한 계획을 도시한다. D 표시된 날(예를 들어, D0은 0일을 나타낸다); 도 19b는 N-cad-CreER T ;iDTR 마우스에서 토마토+ 세포에 의해 표시된 N-cad+ 세포 제거(ablation) 효율을 도시한다; 도 19c 내지 도 19d는 TMX 및 DT 주사 후 N-cad-CreER T ;iDTR 마우스로부터의 골수(BM) 내의 총 유핵 세포(TNC) 및 HSPC의 절대 수를 결정하기 위한 유세포계측 분석을 도시한다; 도 19e 내지 도 19h는 1차 1° 및 2차 2°이식에서 이식 검정에 의한 기능적 HSC의 정량을 도시한다. 이식 후 표시된 주수에서의 총 생착된 공여자 세포에 대한 PB 분석으로부터의 총 BM 세포 및 이식 후 16주차에서의 공여자 유래의 B 세포, T 세포 및 골수 계통 세포의 백분율을 도시한다(n = 그룹당 10마리 마우스); 도 19i 내지 도 19j는 TMX 및 DT 주사 후 N-cad-CreER T ;SCFf/f(N-cad-CreER T _;SCFf/f, n=4마리 마우스, N-cad-CreER T+ ;SCFf/f, n=6마리 마우스) 및 N-cad-CreER T+ ;Cxcl12f/f 마우스(N-cad-CreER T _;Cxcl12f/f, n=3마리 마우스, N-cad-CreER T+ ;Cxcl12f/f, n=6마리 마우스)로부터의 골수(BM) 내의 HSPC의 절대 수를 결정하기 위한 유세포계측 분석을 도시한다. (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 오차막대, s.e.m.).
도 20a 내지 도 20k: 조혈 세포 및 니치 세포에 대한 전사체 분석. 도 20a 내지 도 20b는 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC)에 대한 피어슨 거리 트리 및 PCA 분석을 도시한다; 도 20c 내지 도 20d는 BM 니치 세포에 대한 피어슨 거리 트리 및 PCA 분석을 도시한다; 도 20e는 조혈 줄기 및 선조세포에서의 HSC 시그너처 유전자 발현을 도시한다; 도 20f는 니치 세포에서의 BM 니치 유전자 발현을 도시한다; 도 20g는 BM 니치 세포에 대한 용어 분석을 도시한다; 도 20h는 골내막 구역 및 혈관주위 구역으로부터의 니치 세포 내의 간질세포 발달 유전자 발현을 도시한다; 도 20i는 3회의 TMX 주사 후 N-cad-CreER T ; R26-tdT; Nestin-GFP 마우스 및 3회의 TMX 주사 후 N-cad-CreER T ; R26-ZsG; Cxcl12-DsR 마우스에 대한 계통 추적을 도시한다; 도 20j는 TMX 주사 후 N-cad-CreERT; R26-tdT 마우스로부터의 효소적으로 분해된 골수 세포를 도시한다; 항체에 의해 염색된 LepR 및 Pdfgrα는 적색 피크로서 도시되어 있다. 이소타입(isotype) 대조군은 회색 피크로서 도시되어 있다; 도 20k는 골내막 구역과 혈관주위 구역으로부터의 니치 세포의 CFU-F 활성을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21g: N-cad + 유래 세포의 시험관내 분화 잠재성 및 국소화. 도 21a는 실험 설계를 도시한다; 도 21b는 Cell Trace™으로 염색된, 효소적으로 분해된 골수로부터 배양된 살아있는 CFU-F 콜로니 및 고배율의 1개의 콜로니 내의 토마토+ 세포를 도시한다; 도 21c 내지 도 21e는 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스로부터 유래된 간질세포의 시험관내 분화를 도시한다: 골-분화 21일 후의 배양물의 살아있는 td토마토+ 세포 및 알칼리 포스파타제 염색(도 21c); 지방-분화 21일 후의 살아있는 토마토+ 세포 및 오일 레드 O 지질 염색(도 21d); 토마토+ 세포의 연골-분화 21일 후의 아그레칸 항체 염색된 연골세포 및 톨루이딘 블루 염색된 연골세포(도 21e); 도 21f 내지 도 21g는 (F-G) 실험 설계를 도시한다; 도 21h는 TMX 주사 후 6시간, 14시간, 24시간, 1주 및 4주차에서의 N-cad-CreERT; R26-tdT 마우스로부터 유래된 세포의 국소화를 도시한다; 도 21i는 TMX 주사 후 1주, 2주, 4주 및 6주차에서의 소주, 피질골 및 중심 골수 내 토마토+ 세포의 백분율을 도시한다(n = 1주 및 2주 그룹에서 2마리 마우스, n = 4주 및 6주 그룹에서 3마리 마우스). * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 오차막대, s.e.m.).
도 22a 내지 도 22k: N-cad+ 간질세포는 성체 마우스에서 골모세포 및 지방 세포를 발생시킨다. 도 22a는 토마토+ Col2.3-GFP+ 골모세포의 해부학적 분포 및 생성 증가를 나타내는, TMX 주사 후 상이한 시점의 N-cad-CreER T ; R26-tdT; Col2.3-GFP 마우스로부터의 대표적인 대퇴골 단면도를 도시한다. 스케일 바, 100㎛; 도 22b 내지 도 22c는 6시간(22b) 및 14시간(22c)에서 나타난 영역 i, 영역 ii, 영역 iii, 영역 iv, 영역 v 및 영역 vi 내의, TMX 후 초기 시점에서의 N-cad-CreER T ; R26-tdT; Col2.3-GFP 마우스의 고배율 이미지를 도시한다. 속이 빈 화살촉은 TMX 후 6시간 및 14시간차에서의 토마토+ Col2.3GFP+ 골모세포(노란색 세포)를 도시하는 반면, 흰색 화살촉은 N-cad가 소주(ii, iv, v) 영역과 피질(iii, vi) 영역 둘다에서 재조합되었음을 나타낸다(녹색). 이들 세포는 Col2.3-GFP의 부재로 나타난 바와 같이 잠재적으로 미분화된 것이다. 스케일 바, 50㎛; 도 22d 내지 도 22e는 TMX 주사 후 6시간, 14시간, 24시간, 2주 및 4주차의 소주(22d) 및 치밀골(22e) 내의 토마토+ Col2.3-GFP+ 및 토마토+ Col2.3-GFP- 세포의 백분율을 나타내는 이미지 정량을 도시한다; 도 22f는 소주와 치밀골 간에 잠재적인 미분화된 토마토+ Col2.3-GFP-의 백분율을 비교하는 이미지 정량화를 도시한다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 오차막대, s.e.m; 도 22g는 TMX 주사 후 4주차에서의 N-cad-CreER T ; R26-tdT; Col2.3-GFP 마우스의 치밀골의 소주골(TB) 및 피질골(CB)의 대표적인 이미지를 도시한다. 스케일 바, 20㎛; 도 22h는 TMX 주사 후 4주차에서의 페릴리핀 염색을 갖는 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스로부터의 대퇴골 단면의 대표적인 저배율 및 고배율 이미지를 도시한다. 골막(periosteal) 영역(i), 소주 영역 근처의 골수(ii) 및 중심 골수(iii)에서, 흰색 화살촉은 N-cad+ MSC로부터 유래된 토마토+ 페릴리핀+을 도시한다; 도 22i는 BODIPY 염색이 토마토+ 페릴리핀+ 지방세포(화살촉) 내부의 지질 액적(녹색)을 나타냈음을 도시한다. 스케일 바, 20㎛; 도 22j 내지 도 22k는 TMX 주사 후 6시간, 14시간, 24시간, 2주 및 4주차에서의 소주골(22j) 및 골막 영역(22k) 내 토마토+ 페릴리핀+ 지방세포의 이미지 정량을 도시한다. (* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 오차막대, s.e.m.).
도 23a 내지 도 23j: N-cad + MSC는 발달 동안 및 손상 후 연골세포를 생성한다. 도 23a는 실험 설계를 도시한다; 도 23b는 E14.5(TMX 유도 후 2일)에서 늑골 내의 아그레칸+ 연골세포와 함께 부분적으로 공동국소화된 토마토+를 도시한다; 도 23c는 대퇴골에서의 연골세포 발달의 예시를 도시한다; 도 23d는 E12.5에서 TMX 유도된 2일령 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 대퇴골 단면을 도시한다. 토마토+ 세포가 관절 표면(i) 및 발달하는 2차 골화 중심(ii)에서 아그레칸+ 연골세포를 생성하였음을 주지한다. 화살촉은 토마토+ 아그레칸+ 세포를 나타낸다; 도 23e는 E12.5에서 TMX 유도된 10개월령 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 대퇴골 단면을 도시한다. 토마토+ 세포는 초기 배아기로부터 페릴리핀+ 지방세포로 분화하였다; 도 23f는 E12.5에서 TMX 유도된 2개월령 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 대퇴골 단면을 도시한다; 토마토+ 세포는 초기 배아기로부터 오스테오폰틴+ 비대 연골세포(i 및 ii) 및 골모세포(iii, iv, v 및 vi)로 분화하였다; 도 23g는 E12.5에서 TMX 유도된 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스에 대한 대퇴 고랑(femoral groove) 손상을 위한 실험 설계를 도시한다; 도 23h는 대조군 마우스 및 무릎 연골 손상 후 3주차의 마우스의 토마토+ 연골세포의 정량을 도시한다. (도 23i) 연골 손상이 없는 또는 연골 손상 후 3주차의 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 원위 대퇴골 단면. 대조군 마우스(i)의 무릎 표면에 군집된 토마토+ 아그레칸+ 세포가 연골 손상 후 3주차의 마우스(ii)의 상응하는 영역에서 유의적으로 증가하였음을 주지한다; 도 23j는 대조군(i) 및 연골 손상 위치(ii) 내의 알시안 블루 양성 연골세포를 나타내는, 도 6h의 단면의 AHO 염색을 도시한다.
도 24a 내지 24k: 5FU 후의 BrdU 검정 및 N-cad 리포터 마우스 주(line). 도 24a 내지 도 24f는 5FU 처리 후 0일, 2일, 3일, 4일 및 6일차에서의 마우스의 대퇴골 내의 BrdU+ 세포를 나타내는 대표적인 이미지를 도시한다. BrdU+ 세포가 5FU 후 2일차에는 감소하고 5FU 후 3일차부터 6일차까지는 골(적색 점선) 또는 혈관/지방 구조(녹색 점선) 근처에서 재활성화되었음을 주지한다; 도 24g는 BrdU+ 세포의 역학 모델을 도시한다; 도 24h는 5FU 처리 후 3일차부터 6일차까지의 골수의 BrdU+ 세포 대 골 표면의 BrdU+ 세포의 비를 도시한다; 도 24i는 5FU 처리 후 3일차부터 6일차까지의 골 표면 근처 및 혈관/지방 구조 근처의 BrdU+ 세포의 백분율을 도시한다; 도 24j는 골 표면과 중심 골수 둘다의 N-cad 구동 토마토+ 세포를 나타내는 대표적인 전체 골 단면을 도시한다; 도 24k는 대조군의 N-cad-TdT 마우스 및 5FU 처리 후 3일차의 마우스의 중심 골수(CM) 및 골 내의 N-cad 구동 토마토+ 세포의 절대 수를 도시한다. N=각 그룹에서 3. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 오차막대, s.e.m.
도 25a 내지 도 25b: N-cad-CreER T 마우스 스트레인(strain)의 생성. 도 25a는 N-cad-CreERT 마우스 주의 생성을 도시한다; 도 25b는 3회의 TMX 주사 후 N-cad-CreER T , R26-tdT; Col2.3-GFP 마우스에 대한 계통 추적을 도시한다; CD31 및 Ve-카데린 항체로 염색된 혈관.
도 26a 내지 도 26e: 니치 세포의 분류 전략 및 시그너처 유전자 발현. 도 26a는 분해된 골 세포로부터 수거된 골내막 영역 내의 니치 세포를 도시한다; 도 26b는 분해된 골수 세포로부터 수거된 혈관주위 구역 및 굴모양(sinusoid) 구역의 니치 세포를 도시한다; 도 26c는 골내막 영역과 동맥주위 영역 내의 NG2-RFP+ 세포의 국소화를 도시한다; 도 26d 내지 도 26e는 니치 세포에서의 골-연골형성 선조세포 유전자 및 지방형성 선조세포 유전자 발현의 열지도를 도시한다.
도 27a 내지 도 27e: TMX 유도 후 초기 시점에서 N-cad-CreERT; R26-tdT 마우스에서의 계통 추적. 도 27a 내지 도 27b는 TMX 유도 후 24시간 및 2주차에서의 N-cad-CreERT; R26-tdT; Col2.3-GFP 마우스의 소주골(TB) 및 피질골(CB)의 대표적인 이미지를 도시한다. 스케일 바, 20㎛; 도 27c 내지 도 27e는 TMX 유도 후 6시간, 14시간 및 24시간차에서의 N-cad-CreERT; R26-tdT 마우스의 대표적인 고배율 대퇴골 단면 이미지를 도시한다. 페릴리핀 항체 염색으로 나타난 지방세포.
도 28a 내지 도 28d: 초기 발달 및 손상 회복시의 N-cad + MSC의 특성규명. 도 28a는 생후 D2에서 TMX 유도 후 24시간차의 N-cad-CreER T ; R26-tdT에서 아그레칸 염색을 갖는 N-cad+ MSC를 나타내는 대퇴골 단면의 대표적인 이미지를 도시한다; 도 28b는 E12.5에서 TMX 유도된 2개월령 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 대퇴골 단면을 도시한다. 페릴리핀 항체 염색으로 나타난 지방세포; 도 28c는 E12.5에서 TMX 유도된 2일령 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 대퇴골 단면을 도시한다. 오스테오폰틴 항체 염색으로 나타낸 발달하는 골 세포; 도 28d는 대조군 및 무릎 연골 손상 후 2주차의 E12.5 TMX 유도된 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대표적인 시상(sagittal) 무릎 단면을 도시한다; 스케일 바, 1mm.
도 29: 5FU 처리 후 3일차의 생존 rHSC(녹색, CD150+ Lin- CD49b-)의 이미지는 종종 골 표면에 인접한 단일 세포(흰색, SHG)로서 검출되었고, 증식하는 HSC는 종종 MK(CD150+ Lin+)와 연관되거나 혈관 근처(적색, CD31+)에 있었다.
도 30: 생체내 10K ncad+ hMSC 및 1000k 총 hMSC에 의한 인간 Thpo 생성을 나타내는 플롯.
본 발명의 일 실시형태는 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 줄기세포 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 줄기세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시켜 수득된 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 세포 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
본 발명에서, 줄기세포 및/또는 T-세포의 집단은 예를 들어 인간과 같은 임의의 포유동물로부터 및 줄기세포 및/또는 선조세포 및/또는 T-세포를 함유하는 임의의 조직으로부터 수득될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 바람직한 실시형태에서 조직은 말초혈, 제대혈 또는 골수일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "증대시키다", "증대시키는" 및 유사한 용어는 집단 내의 줄기세포 및/또는 CAR T-세포의 수를 본원에 개시된 임의의 방법을 사용하여 생체내 또는 생체외에서 본래 집단 내의 줄기세포 및/또는 CAR-T 세포의 수에 비해 증가시키는 것을 의미한다. 증대는 집단 내의 줄기세포 및/또는 CAR T 세포의 본래 수와 비교하여 적어도 40배일 수 있다. 보다 바람직하게는, 증대는 줄기세포의 본래 수와 비교하여 적어도 2배, 4배, 5배, 8배, 10배, 15배, 20배 또는 그 이상이다.
본 발명에서 "줄기세포 집단"은 다수의 상이한 유형의 세포를 생성하는 능력을 갖고 자가-재생 능력을 갖는 실질적으로 미분화된 세포 그룹을 의미한다. 본 발명에 따른 줄기세포의 대표적인 비제한적 예에는 기관지폐포 줄기세포(BASC), 벌지 상피 줄기세포(bulge epithelial stem cell: bESC), 각막 상피 줄기세포(CESC), 심장 줄기세포(CSC), 표피 신경능선 줄기세포(eNCSC), 배아 줄기세포(ESC), 내피 선조세포(EPC), 간 난원형 세포(HOC), 조혈 줄기세포(HSC), 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC), 각질세포 줄기세포(KSC), 중간엽 줄기세포(MSC), 뉴런 줄기세포(NSC), 췌장 줄기세포(PSC), 망막 줄기세포 (RSC) 및 피부 유래의 전구체(skin-derived precursor: SKP)가 포함된다.
조혈 줄기세포는, 예를 들어, 자가-재생(즉, 증대)하는 능력을 가지며 모든 유형의 선조세포(예를 들어, CMP, GMP, MEP 및 CLP) 및 궁극적으로 모든 유형의 혈액 세포(적혈구, B 림프구, T 림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포 및 혈소판)를 조혈계에서 생성할 수 있다. 다른 예로서, 중간엽 줄기세포는 다양한 세포 유형(예를 들어, 골모세포, 연골세포, 근육세포 및 지방세포)으로 분화할 수 있는 다분화능 간질세포이다.
본 발명에서, "키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단"은 암 세포의 표면상의 항원과 같은 특이적 항원에 결합할 수 있는 키메라 항원 수용체로 변형된 T-세포 그룹을 의미하고, 이러한 암 세포를 표적으로 하여 사멸하는 능력을 지닐 수 있다. CAR T-세포는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 DNA를 T-세포 내로 도입하는 것과 같이 T-세포를 키메라 항원 수용체로 변형시킴으로써 T-세포의 표면에 키메라 항원 수용체를 발현시켜 생성할 수 있다(Davila et al. Sci Transl Med 6(224), 224ra25 (2014); Tasian et al. Ther Adv Hematol 6(5), 228-241 (2015).
본 발명에서, "조정하는", "조정" 및 유사한 용어는 신호전달 경로, 예를 들어 단백질의 발현 수준을 저하 또는 증가시키는 것, 이러한 단백질의 서열을 변경시키는 것(돌연변이, 번역 전 또는 번역 후 변형 또는 그 밖의 방식에 의해) 또는 이러한 단백질을 억제 또는 활성화시키는 것(결합, 인산화, 글리코실화, 전위 또는 그 밖의 방식에 의해)을 포함하나 이에 제한되지 않는 m6A mRNA 변형 경로의 단백질을 변경시키는 것을 의미한다. 이러한 조정은 유전적으로 또는 약리학적으로 달성될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 줄기세포 및/또는 CAR-T 세포 집단 내로 돌연변이를 도입함을 포함하며, 상기 돌연변이는 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래한다. 본 발명의 다른 측면에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 또한 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 m6A mRNA 경로의 분자의 조정제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 조정제의 대표적인 비제한적 예는 소분자, 생물제제(biologic), 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에서, "m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정"이라는 어구는 m6A mRNA 변형 경로의 구성원의 기능을 변경하는 것을 의미하며, 변경된 기능은 mRNA의 m6A 변형의 상류 및/또는 하류 과정에 관여하는 분자의 기능을 억제하거나 감소시키는 것과 유사한 효과를 가질 수 있다. 이러한 "조정"의 비제한적 예는 mRNA 내 N 6-메틸아데노신 변형의 혼입, N 6-메틸아데노신 mRNA 변형의 mRNA로의 이동 및/또는 N 6-메틸아데노신 변형된 mRNA의 인식 및 프로세싱 중 어느 하나에 관여하는 단백질의 발현 또는 기능을 증가 또는 감소시킴을 포함한다. 예를 들어, 조정은 mRNA 내의 N 6-메틸아데노신 변형을 증가 또는 감소시키는 것 및/또는 예컨대 m6A 기록인자(예: 메틸트랜스퍼라제) 및 m6A 소거인자(예: 데메틸라제) 중 하나 이상의 활성을 조정함으로써 이러한 mRNA의 변형의 유형 및/또는 분포에 영향을 미치는 것을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 조정은 예컨대 m6A 판독인자(예: 메틸화된 아데노신을 인식하는 RNA 결합 단백질)의 활성을 조정함으로써 m6A-의존적 기능을 매개하는 mRNA에 대한 N 6-메틸아데노신 변형을 인식하는 단백질의 발현 또는 기능을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 따라서, m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제는 m6A mRNA 변형 과정의 상류 또는 하류에 있는 분자의 활성 및/또는 발현의 조정을 초래할 수 있다.
일 측면에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자, m6A mRNA 변형 소거인자 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자의 조정을 포함한다. m6A 변형 기록인자의 비제한적 예는 전사 후에 메신저 RNA에 m6A 변형을 설치할 수 있는 메틸트랜스퍼라제를 포함하고, METTL3, METTL14, WTAP, KIAA1429 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것을 포함할 수 있다. m6A 변형 소거인자의 비제한적 예는 메틸화를 역전시킬 수 있는 데메틸라제를 포함하고, FTI, ALKBH5 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것을 포함할 수 있다. M6A 변형 판독인자는 m6A-메틸화된 mRNA에 선택적으로 결합하여 메틸화된 mRNA의 선택적 인식을 통해 조절 기능을 발휘할 수 있는 단백질을 포함한다. 적합한 m6A 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1, elF3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것을 포함할 수 있다. 일 측면에 따르면, m6A 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2 및 이들의 조합을 포함하는 단백질의 YTH 도메인 패밀리의 단백질을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Wang et al. Nature, 505(7481):117-120, 2014; Frayling et al. Science, 316: 889-894, 2007; Zheng et al. Mol. Cell., 49: 18-29, 2012; Cao et al. Open Biol., 6(4): 160003, 2016; Maity et al. The FEBS Journal, 283(9): 1607-1630, 2016]을 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이의 도입"은 줄기세포 집단 및/또는 CAR T-세포 집단의 유전자 구성에 변경을 일으키는 임의의 통상적인 방법을 의미한다. 줄기세포 집단 및/또는 CAR T-세포 집단 내로 돌연변이를 도입하기 위한 비제한적 예는 자외선 광 조사를 통한 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 줄기세포 및/또는 CAR T-세포의 부위 특이적 돌연변이유발과 같은 표적화된 돌연변이유발 및 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 생성을 포함한다. 일 측면에 따르면, 돌연변이는 줄기세포 및/또는 CAR T-세포 내로 도입되어, m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자, m6A mRNA 변형 소거인자 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자와 같은 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킬 수 있다. 일 측면에서, 돌연변이는 도입되어 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1, elF3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것과 같은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 바람직한 측면에서, 돌연변이는 도입되어 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 도입되어 METTL3, METTL14, WTAP, KIAA1429 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것과 같은 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 도입되어 FTI, ALKBH5 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것과 같은 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다.
일 측면에서, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템(예를 들어, 문헌[Kuhn et al. Science, 269(5229): 1427-1429, 1995]을 참조)에 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 노출시킴으로써 도입될 수 있다. 또 다른 측면에서, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 줄기세포 및/또는 CAR T-세포 내로 혼입시키는 돌연변이가 도입되어 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킨다. 예를 들어, shRNA는 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 shRNA를 전달하는 벡터에 노출시킴으로써 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터일 수 있다(예를 들어, 문헌[Chira et al. Oncotarget, 6(31): 30675-30703, 2015]을 참조). shRNA는 유전자 사일런싱(gene silencing)을 촉발하여 유전자 발현을 조절할 수 있다(예를 들어, 문헌[Paddison et al. Genes Dev., 16(8): 948-958, 2002]을 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "N 6-메틸아데노신 mRNA 변형 경로의 조정제"(또는 "m6A mRNA 변형 경로 조정제")는 m6A mRNA 변형 경로의 임의의 구성원의 활성을 조절하는 임의의 제제이며, 이는 예를 들어, 예컨대 m6A 기록인자(예: 메틸트랜스퍼라제) 및 m6A 소거인자(예: 데메틸라제) 중 하나 이상의 활성을 조정함으로써 mRNA 내의 N 6-메틸아데노신 변형의 증가 또는 감소 및/또는 mRNA 내의 이러한 변형의 유형 및/또는 분포의 변화를 초래한다. 다른 예로서, 제제는 예컨대 m6A 판독인자(예: 메틸화된 아데노신을 인식하는 RNA 결합 단백질)의 활성을 조정함으로써 m6A- 의존적 기능을 매개하는 mRNA에 대한 N 6-메틸아데노신 변형을 인식하는 단백질의 활성을 증가 또는 감소시키는 것일 수 있다. 따라서, m6A mRNA 변형 경로 조정제는 mRNA에 대한 m6A 변형에 영향을 미치는 제제에 작용하거나 이의 상류 또는 하류에 작용할 수 있다.
일 실시형태에서, m6A mRNA 변형 경로는 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절 및/또는 억제하는 것과 같이 m6A mRNA 변형 경로의 구성원을 하향조절 및/또는 억제함으로써 조정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "하향조절"은 m6A mRNA 변형 경로의 구성원의 양을 억제 또는 감소시키거나 또는 활성을 억제 또는 감소시키는 것을 의미한다. 이러한 하향조절은, 예를 들어 안티센스 RNA, siRNA, 항체 또는 소분자를 사용하여 달성될 수 있다. 다른 예로서, m6A mRNA 변형 판독인자는 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 m6A mRNA 판독인자의 억제제와 접촉시켜 m6A 판독인자에 의한 m6A 변형된 mRNA의 결합 및/또는 인식을 억제함으로써 하향조절될 수 있다. 일 측면에서, 하향조절되는 m6A mRNA 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1, elF3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 측면에서, 하향조절되는 m6A mRNA 변형 판독인자는 Ythdf2이다. m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제는 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e (예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013; Whisnant et al., MBio 4(2), 2013:e000193]을 참조); (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p(예를 들어, 문헌[Hafner et al. Cell, 141(1): 129-141, 2010; Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013]을 참조); (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262(예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013; Selbach et al. Nature, 455(7209): 58-63, 2008; Yang et al. J Biol Chem., 292(9): 3614-3623, 2017]을 참조); (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296 (예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-656, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209):58-63, 2008; Baek et al, Nature, 455(7209):64-71, 2008; Leivonen et al. Mol Cell Proteomics, 10(7), 2011: M110.005322]을 참조): (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262 (예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013; Hafner et al. Cell, 141(1): 129-141, 2010; Kishore et al, Nat Methods, 8(7):559-64, 2011; Memczak et al. Nature, 495(7441):333-8, 2013; Selbach et al. Nature, 455(7209):58-63, 2008; Chi et al. Nature. 460(7254):479-86, 2009]을 참조)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "소분자"는 생물학적 과정에 영향을 미치는, 특히 m6A mRNA 변형 경로의 구성원을 조정하는 작용을 할 수 있는, 폴리펩타이드 및 핵산 이외의 임의의 화학적 또는 기타 모이어티를 포함한다. 소분자는 현재 공지되어 있고 사용되는 많은 치료제를 포함할 수 있거나, 생물학적 기능(들)의 스크리닝을 위해 이러한 분자의 라이브러리에서 합성된 소분자일 수 있다. 소분자는 크기에 따라 거대분자와 구별된다. 본 발명의 소분자는 일반적으로 약 5,000 달톤(Da) 미만, 바람직하게는 약 2,500 Da 미만, 더욱 바람직하게는 1,000 Da 미만, 가장 바람직하게는 약 500 Da 미만의 분자량을 갖는다.
소분자는 제한 없이 유기 화합물, 펩티도미메틱(peptidomimetics) 및 이의 접합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유기 화합물"은 핵산 및 폴리펩타이드와 같은 거대 분자 이외의 임의의 탄소계 화합물을 지칭한다. 유기 화합물은, 탄소 이외에도, 칼슘, 염소, 불소, 구리, 수소, 철, 칼륨, 질소, 산소, 황 및 기타 원소를 포함할 수 있다. 유기 화합물은 방향족 또는 지방족 형태일 수 있다. 유기 화합물의 비제한적 예는 아세톤, 알코올, 아닐린, 탄수화물, 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 아미노산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 지질, 레티노이드, 스테로이드, 프로테오글리칸, 케톤, 알데하이드, 포화, 불포화 및 다불포화 지방, 오일 및 왁스, 알켄, 에스테르, 에테르, 티올, 설파이드, 사이클릭 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 이미디졸 및 페놀을 포함한다. 본원에서 사용되는 유기 화합물은 또한 질산화 유기 화합물 및 할로겐화(예를 들어, 염소화) 유기 화합물을 포함한다.
바람직한 소분자는 비교적 더 쉽고 덜 비싸게 제조, 제형화 또는 달리 생성된다. 바람직한 소분자는 다양한 저장 조건 하에 안정하다. 바람직한 소분자는 거대분자와 밀접하게 회합되어, 생물학적으로 활성이고 약제학적 특성이 개선된 분자를 형성할 수 있다. 개선된 약제학적 특성은 원하는 생물학적 활성에 유리한 순환 시간, 분포, 대사, 변형, 배설, 분비, 제거 및 안정성의 변화를 포함한다. 개선된 약제학적 특성은 화학 물질의 독성 및 효능 특성의 변화를 포함한다.
일반적으로, 폴리펩타이드 모방체("펩티도미메틱(peptidomimetic)")는 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 모사하지만, 화학적 성질면에서 펩타이드가 아닌 분자이다. 반면, 특정의 실시형태에서, 펩티도미메틱은 펩타이드 결합(즉, 아미노산들 사이의 아미드 결합)을 함유하지 않는 분자이고, 용어 펩티도미메틱은 슈도-펩타이드, 세미-펩타이드 및 펩토이드와 같은, 특성면에서 완전히 펩타이드가 아닌 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적"은 화학적 과정과 대조적으로 살아있는 공급원으로부터 유래된 생성물을 의미한다. "생물학적"의 비제한적 예는 단백질, 조정 배지(conditioned media) 및 조직으로부터 부분적으로 정제된 생성물을 포함한다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드"및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에서, 이들 용어는 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있는 아미노산의 연결된 서열을 의미한다. 상기 용어는 항체, 항체 모방체, 도메인 항체, 리포칼린 및 표적화된 프로테아제를 포함한다. 상기 용어는 또한 펩타이드 또는 펩타이드 단편에 대한 항체를 발생시키고자 의도된 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 함유하는 백신을 포함한다.
본원에서 사용되는 "항체"는 Fab, F(ab')2, Fd 및 단일쇄 항체, 디아바디, 이특이적 항체 및 이기능성 항체를 포함하는, 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함한다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 대한 충분한 결합 특이성을 나타내는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 친화성 정제된 항체 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 항체는 또한 키메라 항체일 수 있다. 항체는 당업계에 공지된 하나 이상의 화학적, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 모이어티의 부착에 의해 유도체화될 수 있다. 항체는 화학적 모이어티와 접합될 수 있다. 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 이들 및 기타 항체는 미국 공개 특허출원 제20070065447호에 개시되어 있다.
다른 항체-유사 분자도 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 항체-유사 분자는 예를 들어 수용체 트랩(예컨대, 엔타너셉트), 항체 모방체(예컨대, 예를 들어 컴파운트 쎄라퓨틱스사(Compound Therapeutics, Inc.)로부터의 피브로넥틴 기반 "어드레스 가능한(addressable)" 치료 결합 분자인 아드넥틴), 도메인 항체(천연 발생 단일-도메인 항체의 가장 작은 기능적 단편(예컨대, 예를 들어 나노바디; 예를 들어 문헌[Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15;64(8):2853-7]을 참조))를 포함한다.
적합한 항체 모방체는 일반적으로 본원에 기재된 항체 및 항체 단편에 대한 대용물로서 사용될 수 있다. 이러한 항체 모방체는 유리한 특성과 연관될 수 있다(예를 들어, 이들은 수용성, 단백질분해에 대해 내성 및/또는 비면역원성일 수 있다). 예를 들어, 모노클로날 항체의 제2 상보성 결정 영역(CDR)을 모방하는 합성 베타-루프 구조를 포함하는 펩타이드가 제안되고 생성되었다. 예를 들어, 문헌[Saragovi et al., Science. Aug. 16, 1991;253(5021):792-5]을 참조한다. 펩타이드 항체 모방체는 또한 다수의 CDR로부터의 항원 접촉 잔기를 함유하는 펩타이드 모방체를 설계하기 위해, "활성" 항원 인식 잔기를 결정하는 펩타이드 맵핑, 분자 모델링 및 분자 역학 궤적(molecular dynamics trajectory) 분석을 사용함으로써 생성되었다. 예를 들어, 문헌[Cassett et al., Biochem Biophys Res Commun. Jul. 18, 2003;307(1):198-205]을 참조. 본 발명의 맥락에서 적용될 수 있는 관련 원리, 방법 등에 대한 추가 논의는 예를 들어 문헌[Fassina, Immunomethods. October 1994;5(2):121-9]에 제공되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "펩타이드"는 표적화된 프로테아제를 포함하고, 이는 예를 들어, 예를 들어 미국 특허출원 공개 제20060275823호에 개시된 바와 같은 번역 후 변형의 기질-표적화 억제가 가능하다.
본원에서 사용되는 "안티센스" 분자는 표적 mRNA(센스) 또는 DNA(안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일가닥 핵산 서열(RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 단백질을 암호화하는 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오타이드를 유도하는 능력은 예를 들어 문헌[Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, (1988) and van der Krol et al., BioTechniques 6:958, (1988)]에 설명되어 있다.
안티센스 분자는 변형되거나 변형되지 않은 RNA, DNA 또는 혼합된 중합체 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 이들 분자는 매칭 서열에 특이적으로 결합하여 입체 차단하거나 RNase H 효소를 활성화시킴으로써 펩타이드 합성의 억제를 초래하는 기능을 한다((Wu-Pong, November 1994, BioPharm, 20-33). 안티센스 분자는 또한 RNA 프로세싱 또는 핵으로부터 세포질로의 이동을 방해함으로써 단백질 합성을 변경할 수 있다(Mukhopadhyay & Roth, 1996, Crit. Rev. in Oncogenesis 7, 151-190). 또한, 단일가닥 DNA의 RNA에의 결합은 이형이중가닥(heteroduplex)의 뉴클레아제-매개 분해를 초래할 수 있다(Wu-Pong, 상기). 지금까지 RNase H의 기질로서 작용하는 것으로 나타난 골격 변형된 DNA 화학은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 보론트리플루오리데이트 및 2'-아라비노 및 2'-플루오로 아라비노-함유 올리고뉴클레오타이드이다.
안티센스 분자는, 예를 들어 WO 91/04753에 기재된 바와 같이, 리간드 결합 분자와의 접합체의 형성에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 리간드 결합 분자는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 기타 사이토카인 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 기타 리간드를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합은 리간드 결합 분자가 이의 상응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 능력을 실질적으로 방해하지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 이의 접합된 버젼의 세포로의 진입을 차단하지 않는다. 대안적으로, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 WO 90/10448에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드-지질 복합체의 형성에 의해 표적 핵산 서열을 함유하는 세포 내로 도입될 수 있다.
용어 소형 간섭 RNA("siRNA")는 RNA 간섭(RNAi) 경로를 유도하는 소형 억제성 RNA 이중가닥을 지칭한다. (Elbashir, S. M. et al. Nature 411:494-498 (2001); Caplen, N. J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747 (2001); Harborth, J. et al. J Cell Sci. 114:4557-4565 (2001).) 이들 분자는 길이가 다양할 수 있고(일반적으로 18 내지 30개의 염기쌍) 안티센스 가닥 내의 이들의 표적 mRNA에 대한 다양한 상보성 정도를 함유한다. 전부는 아니지만 일부 siRNA는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5 '또는 3' 말단에 짝을 이루지 않는 돌출된 염기를 갖는다. 용어 "siRNA"는 2개의 개별 가닥의 이중가닥뿐만 아니라 이중가닥 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, siRNA 분자는 RNA 분자로 제한되지 않고, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. siRNA 유전자-표적화는 세포로의 일시적 siRNA 전달(리포좀-매개 형질감염, 전기천공 또는 미세 주사와 같은 고전적인 방법에 의해 달성됨)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에서, 줄기세포 및/또는 CAR T-세포의 수는 적어도 2 배의 배수만큼 증가된다. 바람직하게는, 줄기세포 및/또는 CAR T-세포의 수는 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 예컨대 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 5배의 배수만큼 증가된다. 놀랍고도 예기치 않게, 이러한 줄기세포 및/또는 CAR T-세포 증대 수준은 본 발명의 방법을 사용하여 달성된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 임의의 줄기세포의 임의의 집단을 증대시키는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 증대될 수 있는 줄기세포는 조혈 줄기세포(HSC), 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC), 내피 선조세포(EPC), 중간엽 줄기세포(MSC), 심장 줄기세포(CSC), 뉴런 줄기세포(NSC) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일 측면에 따르면, 줄기세포는 HSC이다. 또 다른 측면에 따르면, 줄기세포는 MSC이다.
본 발명의 방법은 또한 증대된 세포가 총 콜로니 형성 단위(CFU)의 적어도 5배, 예컨대 8배, 10배 및 심지어 15배 이상 증가를 갖도록 줄기세포를 증대시킬 수 있다. 추가로, 상기 방법은 적어도 3.8배, 예컨대 적어도 4배, 5배 및 심지어 적어도 8배 또는 그 이상의 CFU-과립구 적혈구 단핵구 거핵구(GEMM) 콜로니의 증가를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단의 생체외 증대 방법이다. 상기 방법은 미분화된 줄기세포 집단에서 N 6-메틸아데노신 mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포 집단의 현저한 분화 없이 미분화된 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
이러한 실시형태에서, 줄기세포 집단은, 그 집단 내의 충분한 수의 세포가 자가-재생 능력을 유지하고, 예를 들어 HSC 집단의 경우, 이식될 때 HSC 계통을 재증식시키는(또는 MSC 집단의 경우, 이식될 때 MSC 계통을 재증식시키는) 등 수용자에게 이식될 때 다양한 분화된 세포 유형을 발생시킬 수 있다면, "실질적으로 미분화"된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "현저한 분화 없이"는 증대된 줄기세포 집단이 다계통 분화 잠재성을 유지하는 충분한 수의 세포를 가짐으로써, 증대된 줄기세포 집단을 수용자에게 이식시 표적 줄기 계통의 전체 범위가 재생될 수 있음을 의미한다. 따라서, 예를 들어, HSC 집단의 경우, 증대된 HSC 집단은 수용자에게 이식될 때 전체 조혈 세포 계통을 재생시킬 수 있다. MSC 집단의 경우, 증대된 MSC 집단은 수용자에게 이식될 때 전체 중간엽 세포 계통을 재생시킬 수 있다.
다른 실시형태는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 생체외 증대 방법이다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 CAR T-세포의 수를 증대시킴을 포함한다.
본 발명의 추가 실시형태는 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 조혈 줄기세포(HSC) 집단의 생체외 증대 방법이다. 상기 방법은 HSC 집단에서 N 6-메틸아데노신 mRNA 변형 경로를 조정하여, HSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 HSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 후속 이식하기에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시형태는 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법이다. 상기 방법은 MSC 집단에서 N 6-메틸아데노신 mRNA 변형 경로를 조정하여, MSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 후속 이식하기에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시형태는 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시켜 생성된 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 생체외 증대 방법이다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 CAR T-세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 조직으로부터 "수득된"은 공여자로부터 조직을 수거하거나 분리하는 임의의 통상적인 방법을 의미한다. 앞서 언급한 바와 같이, 조직은 HSC 및/또는 MSC와 같은 줄기세포 및/또는 키메라 항원 수용체로 변형될 수 있는 T-세포를 함유하는 임의의 조직일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조직은 말초혈 또는 제대혈 샘플과 같은 혈액 샘플로부터 수득되거나, 골수로부터 수거될 수 있다. 이러한 샘플을 수득하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 본 발명에서, 샘플은 신선할 수 있는데, 즉 동결 없이 공여자로부터 수득될 수 있다. 더욱이, 샘플은 증대 전에 외부 또는 원치않는 구성성분을 제거하도록 추가로 조작될 수 있다. 샘플은 보존된 스톡으로부터 수득될 수도 있다. 예를 들어, 말초혈 또는 제대혈의 경우, 샘플은 극저온으로 또는 다른 방식으로 보존된 이러한 혈액 은행으로부터 회수 될 수 있다. 이러한 샘플은 임의의 적합한 공여자로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 공여자는 포유동물, 예를 들어 인간과 같은 영장류이다. 또한, 샘플은 자가 또는 동종이계 공여자 또는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 자가 공급원으로부터 수득된다.
이러한 방법에서, "다계통 분화 잠재성을 유지하는"은 증대된 HSC 및/또는 MSC 집단이 이러한 이식을 필요로 하는 대상체에게 이식될 때 모든 유형의 선조세포, 예를 들어 CMP, GMP, MEP 및 CLP 및 궁극적으로 적혈구, B 림프구, T 림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포 및 혈소판을 포함한 모든 유형의 혈액 세포를 재생시킬 수 있는 능력을 가짐을 의미한다.
본 발명에서, "후속 이식에 충분한" 양의 증대된 HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포의 양은 일반적으로 이식 후 약 1% 초과의 생착을 야기할 수 있는 HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포의 수에 상응한다. 이것은 성공적인 이식에 대한 하나의 인정된 척도이다. 본 발명에서, 실시예에 제시된 것을 포함하는 임의의 통상적인 방법을 사용하여 생착%를 결정할 수 있다. 이러한 측정은 전형적으로 경쟁 세포의 존재 또는 부재 하에 수행할 수 있으며, 경쟁 세포의 부재 하에 수행하는 것이 전형적이고 바람직하다(Zhang, C.C., et al., Nat Med, 12(2): 240-5, 2006. Zhang, C.C. and H.F. Lodish, Blood, 105(11): 4314-20, 2005).
상기 설명한 생체외 증대 방법에서, N 6-메틸아데노신 mRNA 변형 경로의 조정은 이미 제시한 바와 같이 달성할 수 있다. N 6-메틸아데노신 mRNA 변형 경로의 조정은 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 및/또는 CAR T-세포 내로 도입하거나, 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
생체외 증대 방법의 일 측면에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자, m6A mRNA 변형 소거인자 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자의 조정을 포함한다. m6A 변형 기록인자의 비제한적 예는 전사 후에 메신저 RNA에 m6A 변형을 설치할 수 있는 메틸트랜스퍼라제를 포함하고, METTL3, METTL14, WTAP, KIAA1429 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것을 포함할 수 있다. m6A 변형 소거인자의 비제한적 예는 메틸화를 역전시킬 수 있는 데메틸라제를 포함하고, FTI, ALKBH5 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것을 포함할 수 있다. M6A 변형 판독인자는 m6A-메틸화된 mRNA에 선택적으로 결합하여 메틸화된 mRNA의 선택적 인식을 통해 조절 기능을 발휘할 수 있는 단백질을 포함한다. 적합한 m6A 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1, elF3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것을 포함할 수 있다. 일 측면에 따르면, m6A 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2 및 이들의 조합을 포함하는 단백질의 YTH 도메인 패밀리의 단백질을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Wang et al. Nature, 505(7481):117-120, 2014; Frayling et al. Science, 316: 889-894, 2007; Zheng et al. Mol. Cell., 49: 18-29, 2012; Cao et al. Open Biol., 6(4): 160003, 2016; Maity et al. The FEBS Journal, 283(9): 1607-1630, 2016]을 참조).
생체외 방법의 일 측면에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 줄기세포 및/또는 CAR-T 세포 내로 도입함을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자, m6A mRNA 소거인자 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 일 측면에서, 돌연변이는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, HNRNPC, HNRNPA2B1, elF3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자와 같은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 바람직한 측면에서, 돌연변이는 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 FTO, ALKBH5 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자와 같은 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 METTL3, METTL14, WTAP, KIAA1429 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자와 같은 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다.
생체외 증대 방법의 일 측면에서, 돌연변이는 본원에서 앞서 개시된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 노출시킴으로써 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kuhn et al. Science, 269(5229): 1427-1429, 1995]을 참조). 또 다른 측면에서, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 줄기세포 및/또는 CAR T-세포 내로 혼입시켜 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 돌연변이가 도입된다. 예를 들어, shRNA는 줄기세포 및/또는 CAR-T 세포를 shRNA를 전달하는 벡터에 노출시킴으로써 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터일 수 있다(예를 들어, 문헌[Chira et al. Oncotarget, 6(31): 30675-30703, 2015]을 참조). shRNA는 유전자 사일런싱을 촉발하여 유전자 발현을 조절할 수 있다(예를 들어, 문헌[Paddison et al. Genes Dev., 16(8): 948-958, 2002]을 참조).
이러한 생체외 증대 방법에서, 일 측면에 따르면, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 m6A 변형 판독인자를 하향조절 및/또는 억제하는 것과 같이 m6A mRNA 변형 경로의 구성원을 하향조절 및/또는 억제함을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "하향조절"은 m6A mRNA 변형 경로의 구성원의 양을 억제 또는 감소시키거나 활성을 억제 또는 감소시킴을 의미한다. 이러한 하향조절은 예를 들어 안티센스 RNA, siRNA, 항체 또는 소분자를 사용하여 달성될 수 있다. 다른 예로서, m6A mRNA 변형 판독인자는 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 m6A mRNA 판독인자의 억제제와 접촉시켜 m6A 판독인자에 의한 m6A 변형된 mRNA의 결합 및/또는 인식을 억제함으로써 하향조절될 수 있다. 일 측면에서, 하향조절되는 m6A mRNA 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1, elF3 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 측면에서, 하향조절되는 m6A mRNA 변형 판독인자는 Ythdf2이다. Ythdf2의 RNA 붕괴 역할은 이전에 밝혀졌다(예를 들어, 문헌[Wang et al. Nature 505(7481): 117-120, 2014]을 참조). m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제는 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e (예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013; Whisnant et al., MBio 4(2), 2013:e000193]을 참조); (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p(예를 들어, 문헌[Hafner et al. Cell, 141(1): 129-141, 2010; Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013]을 참조); (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262(예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013; Selbach et al. Nature, 455(7209): 58-63, 2008; Yang et al. J Biol Chem., 292(9): 3614-3623, 2017]을 참조); (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296(예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-656, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209):58-63, 2008; Baek et al, Nature, 455(7209):64-71, 2008; Leivonen et al. Mol Cell Proteomics, 10(7), 2011: M110.005322]을 참조): (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262(예를 들어, 문헌[Helwak et al. Cell, 153(3): 654-655, 2013; Hafner et al. Cell, 141(1): 129-141, 2010; Kishore et al, Nat Methods, 8(7):559-64, 2011; Memczak et al. Nature, 495(7441):333-8, 2013; Selbach et al. Nature, 455(7209):58-63, 2008; Chi et al. Nature. 460(7254):479-86, 2009]을 참조)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 것일 수 있다.
이들 생체외 증대 방법에서, 줄기세포는 HSC, 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC), 내피 선조세포(EPC), 중간엽 줄기세포(MSC), 심장 줄기세포(CSC), 뉴런 줄기세포(NSC) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 특정의 측면에 따르면, 줄기세포는 HSC이다. 다른 측면에 따르면, 줄기세포는 MSC이다. 생체외 증대 방법은 또한 CAR T-세포를 포함하는 세포 집단을 사용할 수 있다. 이들 방법에서, 어떠한 HSC 및/또는 MSC 함유 조직이라도 사용될 수 있지만, HSC 및/또는 MSC는 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물, 예를 들어 영장류 또는 인간 조직으로부터 수득된다.
조혈 줄기세포(HSC) 집단의 생체외 증대 방법의 다른 측면에서, 줄기세포의 수의 증대는 예를 들어 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배와 같고 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배 또는 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 2배이다.
중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법의 다른 측면에서, 줄기세포의 수의 증대는 예를 들어 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배와 같고 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배 또는 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 2배이다.
CAR T-세포 집단의 생체외 증대 방법의 다른 측면에서, CAR T-세포 수의 증대는 예를 들어 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배와 같고 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배 또는 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 2배이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 예를 들어 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단의 생체외 증대 방법 또는 조혈 줄기세포 (HSC) 집단의 생체외 증대 방법과 같은 본 발명의 방법에 의해 생성된, 증대되고 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 예를 들어 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단의 생체외 증대 방법 또는 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법과 같은 본 발명의 방법에 의해 생성된, 증대되고 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 예를 들어 CAR T-세포 집단의 생체외 증대 방법과 같은 본 발명의 방법에 의해 생성된, 증대된 CAR T-세포 집단이다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 조혈 줄기세포(HSC)를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법이며, 여기서 증대된 HSC는 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 이식시 HSC 계통을 재구성할 능력이 있다. 상기 방법은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하고 HSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양함을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 중간엽 줄기세포(MSC)를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법이며, 여기서 증대된 MSC는 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에게 이식시 MSC 계통을 재구성할 능력이 있다. 상기 방법은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하고 MSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양함을 포함한다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법이며, 여기서 증대된 CAR T-세포는 이를 필요로 하는유 포유동물 대상체에게 이식시 암 및/또는 혈액 장애를 치료할 능력이 있다. 상기 방법은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 내로 도입하고 CAR T-세포 집단을 적합한 배양 배지에서 배양함을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면에서, "HSC 계통을 재구성할 능력이 있는"은 증대된 HSC가 적합한 포유동물 대상체에게 이식될 때 수용자에서 1% 초과의 생착을 초래하고 생착된 세포가 정상적인 기능적 조혈계를 갖는데 필요한 세포 계통으로 분화할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 이러한 측면에서, "MSC 계통을 재구성할 능력이 있는"은 증대된 MSC가 적합한 포유동물 대상체에게 이식될 때 수용자에서 1% 초과의 생착을 초래하고 생착된 세포가 정상적인 기능적 조혈계를 갖는데 필요한 세포 계통으로 분화할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 이러한 측면에서, "암 및/또는 혈액 장애를 치료할 능력이 있은"은 증대된 CAR T-세포가 적합한 포유동물 대상체에게 이식될 때, 예를 들어 백혈병 및 림프종 중 하나 이상과 같은 포유동물 대상체가 앓고 있는 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 제공할 수 있음을 의미한다. 상기 방법에서, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "적합한 배양 배지", "유체 배지" 및 "배지"는 필요한 시간 기간 동안 줄기세포 집단 및/또는 CAR T-세포 집단을 유지할 수 있는 생리학적으로 균형잡힌 염 용액을 의미하며, 이러한 용액에는 본 발명의 적합한 m6A mRNA 변형 경로 조정제가 임의로 보충될 수 있다. 이러한 기본 배양 배지는 당업계에 익히 공지되어 있다. HSC에 적합한 기본 배양 배지의 비제한적인 예는 10ug/ml 헤파린, 5X 페니실린/스트렙토마이신, 10ng/ml 재조합 마우스(rm) 줄기세포 인자 및 20ng/ml rm-트롬보포이에틴이 보충된 StemSpan 배지(Stem Cell Technologies; 카탈로그 번호 09600)이다.
본 발명의 일 측면에서, HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 것은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 방법은 Ythdf2와 같은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 결실 또는 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 도입함을 포함할 수 있다. 또한, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포 및/또는 CAR T-세포를 노출시키는 것과 같은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. shRNA를 줄기세포 및/또는 CAR-T 세포에 혼입시킴으로써 돌연변이를 도입하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킬 수도 있다. 본원에 기재된 다른 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적화하는 돌연변이 및 돌연변이들을 도입하는 다른 방법이 또한 제공될 수 있다.
이러한 실시형태의 일 측면에서, HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포는 제대혈, 말초혈 및 골수로부터 선택되는 포유동물 조직, 바람직하게는 영장류 또는 인간 조직으로부터 수득된다. 이러한 실시형태에서, HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포의 수는 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배와 같고 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 2배의 배수만큼 증대된다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 조혈 줄기세포(HSC) 집단, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단 및/또는 CAR T-세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트이다. 키트는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC, MSC 및/또는 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함한다. 바람직하게는, 키트에서, 돌연변이를 HSC, MSC 및/또는 CAR-T 세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템은 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC, MSC 및/또는 CAR-T 세포 집단 내로 도입할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함한다. 예를 들어, 키트는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템을 포함하는 돌연변이를 HSC, MSC 및/또는 CAR-T 세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함할 수 있다. 키트는 또한 돌연변이를 HSC, MSC 및/또는 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함할 수 있으며, 이러한 시스템은 shRNA를 HSC, MSC 및/또는 CAR T-세포 집단 내로 혼입시키는 렌티바이러스를 전달하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 시약을 포함한다. 키트는 돌연변이를 도입하여 예컨대 Ythdf2를 포함하는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실 또는 교체시키거나 이의 발현을 감소시킴으로써 m6A mRNA 변형 경로를 조정하기 위한 본원에 제시된 다른 시스템/방법을 포함할 수 있다. 키트 및 그 안의 구성성분은 분배 및/또는 저장에 적합한 임의의 방식으로 포장될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 조혈 줄기세포(HSC) 집단 및/또는 중간엽 줄기세포(MSC) 집단 및/또는 CAR-T 세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식을 위해 증대시키기 위한 키트가 제공된다. 키트는 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하며, 여기서 상기 억제제는 예를 들어 Ythdf2의 억제제와 같은 본원에 개시된 억제제 중 임의의 것일 수 있다.
이러한 실시형태의 일 측면에서, 키트는 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼의 줄기세포 및/또는 CAR T-세포의 수의 증대를 제공할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이를 도입하는 방법 및 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적으로 하는 돌연변이는 예를 들어 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는 돌연변이 또는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시키는 돌연변이와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, HSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이를 도입하는 방법 및 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적으로 하는 돌연변이는 예를 들어 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는 돌연변이 또는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 MSC 집단 내로 혼입시키는 돌연변이와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, MSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이를 도입하는 방법 및 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적으로 하는 돌연변이는 예를 들어 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는 돌연변이 또는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 CAR T-세포 집단 내로 혼입시키는 돌연변이와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, CAR T-세포는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이다. 상기 방법은 (a) HSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 억제제는 예를 들어 Ythdf2의 억제제와 같이 이미 개시한 바와 같다. 또한, HSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이다. 상기 방법은 (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 억제제는 예를 들어 Ythdf2의 억제제와 같이 이미 개시한 바와 같다. 또한, MSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이다. 상기 방법은 (a) CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 억제제는 예를 들어 Ythdf2의 억제제와 같이 이미 개시한 바와 같다. 또한, CAR T-세포는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법이다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이를 도입하는 방법 및 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적으로 하는 돌연변이는 예를 들어 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는 돌연변이 또는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시키는 돌연변이와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, HSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법이다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이를 도입하는 방법 및 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적으로 하는 돌연변이는 예를 들어 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는 돌연변이 또는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 MSC 집단 내로 혼입시키는 돌연변이와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, MSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 방법이다. 상기 방법은 (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계; (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 돌연변이를 도입하는 방법 및 m6A mRNA 변형 판독인자를 표적으로 하는 돌연변이는 예를 들어 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는 돌연변이 또는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 CAR T-세포 집단 내로 혼입시키는 돌연변이와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, CAR T-세포는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) HSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) HSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 억제제는 예를 들어 Ythdf2의 억제제와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, HSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 또 다른 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 억제제는 예를 들어 Ythdf2의 억제제와 같이 이미 개시한 바와 같다. 게다가, MSC는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
이들 방법에서, "골수의 재구성"은 정상적인 골수 기능이 손상된 질환을 앓는 대상체에서 골수의 전부 또는 일부분을 복원하는 것을 의미한다. 이러한 질환의 비제한적 예는 재생불량성 빈혈과 같은 혈액 장애, 골수형성이상 증후군(MDS), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH) 및 백혈병과 같은 혈액 암을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "재구성된"은 이식된 HSC 및/또는 MSC가 숙주에 성공적으로 생착하고 골수에서 전형적으로 발견되거나 골수로부터 유래된 모든 세포 계통으로 분화될 수 있음을 의미한다. 본원의 방법의 측면은 백혈병 및 림프종과 같은 혈액 장애의 치료를 위해, 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 HSC 및/또는 MSC를 대상체에게 이식함을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 또 다른 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 키메라 항체 수용체(CAR) T-세포 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; (b) 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및 (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 억제제는 Ythdf2의 억제제와 같이 이미 개시한 바와 같다. 또한, CAR T-세포를 생성하기 위해 변형된 T-세포는 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득될 수 있으며, 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
이들 방법에서, "대상체에서 암 및/또는 혈액 장애의 치료"는 암 세포를 근절하거나 증상을 완화하거나 또는 암 및/또는 혈액 장애를 앓는 대상체에서 질환 상태를 달리 감소시키는 것을 의미한다. 암 및/또는 혈액 장애의 비제한적인 예는 재생불량성 빈혈과 같은 혈액 장애, 골수형성이상 증후군(MDS), 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 및 백혈병 및 림프종과 같은 혈액 암을 포함한다.
이들 방법에서, "HSC의 수를 증대시키기에 충분한 시간 기간"은 배양물 중의 HSC를 1회 이상의 이식을 위해 충분한 수의 HSC가 있는 지점까지 증대시키기 위한 최소량의 시간을 의미하고, "MSC의 수를 증대시키기에 충분한 시간 기간"은 배양물 중의 MSC를 1회 이상의 이식을 위해 충분한 수의 MSC가 있는 지점까지 증대시키기 위한 최소량의 시간을 의미한다. 마찬가지로, "CAR T-세포의 수를 증대시키기에 충분한 시간 기간"은 배양물 중의 CAR T-세포를 1회 이상의 이식을 위해 충분한 수의 CAR T-세포가 있는 지점까지 증대시키기 위한 최소량의 시간을 의미한다. 전형적으로, 이러한 시간 기간은 배양물 중에서 적어도 약 10일일 수 있다. 특정 상황에서는, 줄기세포 및/또는 CAR T-세포, 예를 들어 HSC 및/또는 MSC 집단을 단일 이식에 필요한 것 이상으로 증대시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 및/또는 CAR T-세포, 예를 들어 HSC 및/또는 MSC 집단을 예를 들어 약 2회 내지 약 100회의 이식과 같은 다수의 이식에 충분한 수까지 증대시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 상황에서, 과량의 세포는 나중에 사용하기 위해, 예를 들어 동결보존과 같은 임의의 통상적인 방법에 의해 보존될 수 있다.
이미 나타낸 바와 같이, "이식하기에 충분한 수"는 수용자에서 1% 초과의 생착을 달성하는데 필요한 줄기세포, 예를 들어 HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포의 최소 수를 의미한다. "대상체에게 HSC를 투여하는"은 HSC를 외과적으로 및/또는 정맥내로 전달함을 포함하지만 이에 한정되지 않는, HSC를 대상체에게 전달하는 통상적인 방법을 의미한다. "대상체에게 MSC를 투여하는"은 MSC를 외과적으로 및/또는 정맥내로 전달함을 포함하지만 이에 한정되지 않는, MSC를 대상체에게 전달하는 통상적인 방법을 의미한다. "대상체에게 CAR T-세포를 투여하는"은 CAR T-세포를 외과적으로 및/또는 정맥내로 전달함을 포함하지만 이에 한정되지 않는, CAR T-세포를 대상체에게 전달하는 통상적인 방법을 의미한다. 이들 실시형태에서, HSC 및/또는 MSC 및/또는 T-세포는 조직으로부터 수득되고, m6A mRNA 변형 판독인자 억제제는 앞서 개시한 바와 같다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 HSC 집단을 HSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하며, 여기서 증대된 HSC 집단은 이를 필요로 하는 포유동물로의 이식에 적합하다. 이러한 실시형태에서, "HSC 집단의 증대를 초래하기에 충분한 조건"은 배양물 중의 HSC의, 예를 들어, 적어도 2배, 예를 들어 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상의 증대를 초래할 수 있는 조건이다. "포유동물로의 이식에 적합한"은 HSC의 수 및 품질이 예를 들어, 인간 수용자를 포함하는 영장류 수용자와 같은 이를 필요로 하는 포유동물 수용자에서 1% 초과의 생착을 지지하기에 충분하다는 것을 의미한다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 HSC 집단을 MSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 HSC 집단을 배양함을 포함하며, 여기서 증대된 MSC 집단은 이를 필요로 하는 포유동물로의 이식에 적합하다. 이러한 실시형태에서, "MSC 집단의 증대를 초래하기에 충분한 조건"은 배양물 중의 MSC의, 예를 들어, 적어도 2배, 예를 들어 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상의 증대를 초래할 수 있는 조건이다. "포유동물로의 이식에 적합한"은 MSC의 수 및 품질이 예를 들어, 인간 수용자를 포함하는 영장류 수용자와 같은 이를 필요로 하는 포유동물 수용자에서 1% 초과의 생착을 지지하기에 충분하다는 것을 의미한다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 CAR T-세포 집단을 CAR T-세포의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 HSC 집단을 배양함을 포함하며, 여기서 증대된 CAR T-세포 집단은 이를 필요로 하는 포유동물로의 이식에 적합하다. 이러한 실시형태에서, "CAR T-세포 집단의 증대를 초래하기에 충분한 조건"은 배양물 중의 CAR T-세포의, 예를 들어, 적어도 2배, 예를 들어 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상의 증대를 초래할 수 있는 조건이다. "포유동물로의 이식에 적합한"은 CAR T-세포의 수 및 품질이 예를 들어, 인간 수용자를 포함하는 영장류 수용자와 같은 이를 필요로 하는 포유동물 수용자에서 1% 초과의 생착을 지지하기에 충분하다는 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 골수 이식, 말초혈 이식 또는 제대혈 이식을 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 본원에 개시된 방법, 특히 조혈 줄기세포(HSC) 집단의 증대 방법에 의해 수득된 HSC 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는 방법이다. 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 골수 이식, 말초혈 이식 또는 제대혈 이식을 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 본원에 개시된 방법, 특히 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 증대 방법에 의해 수득된 MSC 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는 방법이다. 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 암 및/또는 혈액 장애를 앓는 대상체의 치료 방법으로서, 본원에 개시된 방법, 특히 CAR T-세포 집단의 증대 방법에 의해 수득된 CAR T-세포 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는 방법이다. 대상체는 인간과 같은 포유동물일 수 있다.
본 발명의 추가 실시형태는 조혈 줄기세포(HSC)의 집단의 증대 방법이다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 HSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 HSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 HSC 집단이 적어도 2배 증대되고; (ii) 증대된 HSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는, 단계를 포함한다. 이러한 실시형태의 일 측면에서, HSC 집단은 적어도 4배, 예를 들어 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 5배 증대된다. 이러한 실시형태의 다른 측면에서, 포유동물은 인간을 포함하는 영장류이다. 바람직하게는, 인간은 말초혈 이식, 제대혈 이식 또는 골수 이식을 필요로 한다. 추가 측면에서, 조직 샘플은 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득된다.
본 발명의 추가의 실시형태는 중간엽 줄기세포(MSC)의 집단의 증대 방법이다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되는, 단계를 포함한다. 이러한 측면의 일 실시형태에서, MSC 집단은 적어도 2.5배, 예컨대 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 예를 들어 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 5배 증대된다. 이러한 실시형태의 다른 측면에서, 포유동물은 인간을 포함하는 영장류이다. 바람직하게는, 인간은 말초혈 이식, 제대혈 이식 또는 골수 이식을 필요로 한다. 추가 측면에서, 조직 샘플은 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득된다.
본 발명의 추가의 실시형태는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 증대 방법이다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 CAR T-세포 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 T-세포 집단을 키메라 항원 수용체로 변형시켜 CAR T-세포 집단을 제공하는 단계; (c) 상기 샘플로부터 CAR T-세포 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 CAR T-세포 집단이 적어도 2배 증대되는 단계를 포함한다. 이러한 측면의 일 실시형태에서, CAR T-세포 집단은 적어도 2.5배, 예컨대 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 예를 들어 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 5배 증대된다. 이러한 실시형태의 다른 측면에서, 포유동물은 인간을 포함하는 영장류이다. 바람직하게는, 인간은 암 및/또는 혈액 장애를 앓고 있다. 추가 측면에서, 조직 샘플은 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득된다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 조혈 줄기세포 계통의 재구성을 필요로 하는 수용자에서 조혈 줄기세포 계통을 재구성하는 방법이다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 HSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 HSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 HSC 집단이 적어도 2배, 예를 들어 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 4배 증대되고; (ii) 증대된 HSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는, 단계; 및 (c) 증대된 HSC 집단을 영장류 또는 인간을 포함하는 포유동물과 같은 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 인간 수용자는 말초혈 이식, 제대혈 이식 또는 골수 이식을 필요로 한다. 따라서, 추가의 측면에서, 조직 샘플은 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득된다. 샘플은 자가 또는 동종이계 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 자가 공급원으로부터 수득된다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 중간엽 줄기세포(MSC) 계통의 재구성을 필요로 하는 수용자에서 중간엽 줄기세포(MSC) 계통을 재구성하는 방법이다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배, 예를 들어 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 4배 증대되는 단계; 및 (c) 증대된 MSC 집단을 영장류 또는 인간을 포함하는 포유동물과 같은 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 인간 수용자는 말초혈 이식, 제대혈 이식 또는 골수 이식을 필요로 한다. 따라서, 추가의 측면에서, 조직 샘플은 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득된다. 샘플은 자가 또는 동종이계 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 자가 공급원으로부터 수득된다.
본 발명의 추가적인 실시형태는 암 및/또는 혈액 장애를 앓고 있는 대상체의 치료 방법이다. 상기 방법은 (a) 포유동물로부터 T-세포 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계; (b) 상기 T-세포 집단을 키메라 항원 수용체(CAR)로 변형시켜 CAR T-세포 집단을 형성하는 단계; (c) 상기 샘플로부터 CAR T-세포 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 CAR T-세포 집단이 적어도 2배, 예를 들어 적어도 8배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배 또는 그 이상을 포함하여 적어도 4배 증대되는 단계; 및 (c) 증대된 CAR-T 세포 집단을 영장류 또는 인간을 포함하는 포유동물과 같은 이를 필요로 하는 대상체에게 이식하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 인간 수용자는 예를 들어 백혈병 및/또는 림프종을 앓을 수 있다. 따라서, 추가의 측면에서, 조직 샘플은 예를 들어 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직과 같은 임의의 적절한 조직으로부터 수득된다. 샘플은 자가 또는 동종이계 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 자가 공급원으로부터 수득된다.
본 발명의 측면에서, 증대된 HSC 집단이 가장 원시적이고 장기간 미분화된 인간 HSC에 대한 마커인 CD34- 또는 CD34+/CD38-/low/Thy-1+/CD90+/Kit-/lo/Lin-/CD133+VEGFR2+; 인간 HSC 및 이들의 선조세포에 대한 마커인 CD150+/CD48-/CD244-; 및/또는 비-자가-재생 다분화능 조혈 선조세포에 대한 마커인 CD150-/CD48-/CD244+ 및 CD150-/CD48+/CD244+ 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표현형을 갖는 HSC를 포함하는 것이 바람직하다(예를 들어, 문헌[Mimeault, M., et al., Stem Cells: A Revolution in Therapeutics - Recent Advances in Stem Cell Biology and Their Therapeutic Applications in Regenerative Medicine and Cancer Therapies. Clin Pharmacol Ther., 82(3):252-64 (2007)]을 참조한다). 본 발명의 측면에서, 증대된 MSC 집단 및/또는 증대의 대상이 되는 MSC 집단은 N-카데린+ 및 CD105+ 및 이들의 조합로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표현형을 갖는 MSC를 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 본원에 설명된 실시형태들 중 임의의 것의 MSC 집단은 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, MSC 집단은 N-카데린+ MSC를 포함한다.
증대된 HSC 및/또는 MSC 집단이 전체적으로 수용자에서 적어도 1% 생착을 초래하기에 충분하다면, 집단 내의 이들 마커를 갖는 HSC 및/또는 MSC의 정확한 비율은 중요하지 않다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 조혈 줄기세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 조혈 줄기세포 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을 포유동물에서 조혈 계통을 재구성하는 능력을 갖는 HSC와 함께 HSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 중간엽 줄기세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 중간엽 줄기세포 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을 포유동물에서 중간엽 계통을 재구성하는 능력을 갖는 MSC와 함께 MSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법이다. 상기 방법은 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을 포유동물에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료할 수 있는 능력을 갖는 CAR T-세포와 함께 CAR T-세포 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함한다.
이들 방법에서, 조정제는 본원에서 이미 개시한 바와 같을 수 있고/있거나 조정은 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 조정제는 Ythdf2와 같은 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 HSC 및/또는 MSC 및/또는 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 조정제는 Ythdf2의 억제제와 같은 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자의 억제제를 포함할 수 있다. 증대를 필요로 하는 포유동물은 인간일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 샘플로부터 중간엽 줄기세포(MSC) 단리하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 MSC 집단을 갖는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 특정의 측면에 따르면, 생물학적 샘플은 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직을 포함한다. 또한, 특정의 실시형태에서, MSC를 단리하는 방법은 예컨대 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 MSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 중간엽 줄기세포의 수를 증대시킴으로써 생물학적 샘플로부터 MSC 집단을 증대시키는 단계 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, MSC 집단은 생물학적 샘플로부터 단리된 후에 증대된다. 다른 실시형태에서, 생물학적 샘플 중의 MSC 집단은 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하기 전에 증대된다. 일 실시형태에서, MSC 집단은 MSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 이를 필요로 하는 대상로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대되며, 이로써 본 방법에 의해 단리된 MSC는 이러한 이식을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 MSC는 인간 대상체에게 이식될 수 있다. 또 다른 실시형태에 따르면, MSC는 추가로 N-카데린 항체에 추가하여 또는 이에 대한 대안으로서 CD105 항체와 접촉시킴으로써 생물학적 샘플로부터 단리할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, N-카데린 항체는, 생물학적 샘플을 N-카데린 항체와 접촉시키고 N-카데린 항체에 결합하는 세포를 검출함으로써 생물학적 샘플 중에서 MSC를 동정하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, MSC를 단리하는 방법은, 예컨대 본원에 설명된 임의의 조정 방법에 의해, m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하거나 줄기세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시켜 m6A mRNA 변형 경로를 조정함으로써 MSC 집단을 증대시킴을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 돌연변이는 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자 및 m6A mRNA 소거인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 돌연변이는 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 다른 실시형태에서, 돌연변이는 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킨다.
다른 실시형태에서, MSC를 단리하는 방법은 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포를 노출시켜 m6A mRNA 변형 경로를 조정함으로써 MSCS 집단을 증대시킴을 포함한다. 일 실시형태에서, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입시켜 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, shRNA는 줄기세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입된다. 또 다른 실시형태에 따르면, m6A mRNA 변형 경로의 조정은 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함한다. 일 실시형태에서, m6A mRNA 변형 판독인자는 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, m6A mRNA 변형 판독인자는 Ythdf2를 포함한다.
일 실시형태에서, MSC를 단리하는 방법은 줄기세포를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것들 중 임의의 것과 같은 본원에 설명된 것들 중 임의의 것인 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시켜 m6A 변형 판독인자를 하향조절함으로써 MSC의 집단을 증대시키는 것을 추가로 포함한다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명은 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 생성된, 단리된 중간엽 줄기세포 집단을 포함한다. 예를 들어, 특정의 실시형태에서 본 발명은 본원에 설명된 임의의 증대 및/또는 단리 방법에 의해 생성된, 증대되고 단리된 중간엽 줄기세포 집단을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 단리하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 MSC를 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시키기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함한다. 일 실시형태에서, 키트는 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하여 MSC 집단을 증대시키기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, MSC 집단 내로 돌연변이를 도입하기 위한 시스템은 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, MSC 집단 내로 돌연변이를 도입하기 위한 시스템은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템을 포함한다. 일 실시형태에서, MSC 집단 내로 돌연변이를 도입하기 위한 시스템은 shRNA를 MSC 집단 내로 혼입시키는 렌티바이러스를 전달하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 시약을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시켜 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하는 단계 및 단리된 MSC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 일 실시형태에서, 상기 방법은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 생물학적 샘플 내로 도입하는 단계 및 상기 생물학적 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래한다. 일 실시형태에서, 돌연변이는 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시킨다. 또 다른 측면에 따르면, MSC는 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직을 포함하는 생물학적 샘플로부터 수득된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시켜 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하는 단계 및 단리된 MSC를 대상체에게 투여하는 단게를 포함한다. 또한, 일 측면에 따르면, 상기 방법은 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 생물학적 샘플 내로 도입하는 단계 및 샘플을 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, MSC는 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직을 포함하는 생물학적 샘플로부터 수득된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법은 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 MSC 집단을 대상체에게 투여함을 포함한다. 실시형태에 따르면, 샘플은 자가 또는 동종이계 공급원으로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에 따르면, 샘플은 자가 공급원으로부터 유래된다.
본 발명에서, "치료적 유효량"은 유익하거나 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 포유동물의 치료와 관련하여, 조정제 및/또는 증대된 세포의 "치료 적 유효량"은 포유동물에서 골수 질환과 같은 병태를 치료, 관리, 완화, 개선 또는 안정화시키기에 충분한 양이다. 치료적 유효량은 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다.
치료적 유효량은 일반적으로 의사에 의해 개개의 사례에 따라 결정되며 당업자의 기술 범위 내에 있다. 적절한 투여량을 결정할 때 전형적으로 몇 가지 요인이 고려된다. 이들 요인은 대상체의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 병태, 병태의 중증도 및 투여되는 약물의 형태를 포함한다.
유효한 투여 형태, 투여 방식 및 투여량은 실험에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 결정은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 당업자는 투여량이 투여 경로, 배설 속도, 치료 기간, 투여되는 임의의 다른 약물의 종류, 동물의 연령, 크기 및 종, 및 의약 및 수의학 분야에 익히 공지된 유사 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해하고 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조정제의 적합한 용량은 원하는 효과를 생성하기에 유효한 최저 용량인 조정제의 양일 것이다. 조정제의 유효 용량은 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 하위용량으로서 투여될 수 있으며, 하루 종일 적절한 간격으로 개별적으로 투여될 수 있다.
조정제는 경구 섭취를 위한 또는 복강내, 피하, 국소, 피내, 흡입, 폐내, 직장, 질, 설하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 척수강내 또는 림프내 투여와 같은 임의의 적절한 방식의 비경구 또는 다른 투여를 위한 약제학적 조성물로서 임의의 원하는 유효한 방식으로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조정제는 다른 치료와 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조정제는 원하는 경우 캡슐화되거나 또는 위 또는 다른 분비로부터 달리 보호될 수 있다.
본 발명의 조정제는 단독 투여될 수 있지만, 조정제를 약제학적 제형(조성물)으로서 투여되는 것이 바람직하다. 이러한 약제학적 제형은 전형적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의로 하나 이상의 기타 화합물, 약물, 성분 및/또는 물질과 혼합된 활성 성분으로서 하나 이상의 조정제를 포함한다. 선택된 투여 경로와 관계 없이, 본 발명의 조정제는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴)를 참조한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 당업계에 익히 공지되어 있으며(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴) 및 The National Formulary(American Pharmaceutical Association, 워싱턴 D.C.)를 참조) 당(예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨), 전분, 셀룰로오스 제제, 인산칼슘(예를 들어, 인산이칼슘, 인산삼칼슘 및 인산수소칼슘), 나트륨 시트레이트, 물, 수용액(예를 들어, 염수, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트화 링거 주사), 알코올(예를 들어, 에틸 알코올, 프로필 알코올 및 벤질 알코올), 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜), 유기 에스테르(예를 들어, 에틸 올레에이트 및 트리글리세라이드), 생분해성 중합체(예를 들어, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드, 폴리(오르토에스테르) 및 다가(무수물)), 엘라스토머성 매트릭스, 리포좀, 미세구, 오일(예를 들어, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 참기름, 면실유 및 땅콩유), 코코아 버터, 왁스(예를 들어, 좌제 왁스), 파라핀, 실리콘, 탈크, 실리실레이트 등을 포함한다. 본 발명의 조정제를 포함하는 약제학적 조성물에 사용되는 각각의 약제학적으로 허용되는 담체는 다른 성분과 상용성이고 대상체에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 선택된 투여 형태 및 의도된 투여 경로에 적합한 담체는 당업계에 익히 공지되어 있고, 선택된 투여 형태 및 투여 방법을 위해 허용되는 담체는 당업계의 일반적인 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 조정제를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물에서 통상적으로 사용되는 추가 성분 및/또는 물질을 임의로 함유할 수 있다. 이들 성분 및 물질은 당업계에 익히 공지되어 있으며, (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산; (2) 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 수크로스 및 아카시아; (3) 보습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정의 실리케이트, 나트륨 전분 글리콜레이트, 가교결합된 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜 및 나트륨 라우릴 설페이트; (10) 현탁화제, 예컨대 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트; (11) 완충제; (12) 부형제, 예컨대 락토스, 유당, 폴리에틸렌 글리콜, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 코코아 버터, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석, 살리실레이트, 산화아연, 수산화알루미늄, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 분말; (13) 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 기타 용매; (14) 방부제; (15) 계면활성제; (16) 분산제; (17) 제어-방출제 또는 흡수-지연제, 예컨대 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 기타 중합체 매트릭스, 생분해성 중합체, 리포좀, 미세구, 알루미늄 모노스테레이트, 젤라틴 및 왁스; (18) 불투명화제; (19) 보조제; (20) 습윤제; (21) 유화제 및 현탁화제; (22) 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸 렌 글리콜, 오일(특히 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르 비탄의 지방산 에스테르; (23) 추진제, 예컨대 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예컨대 부탄 및 프로판; (24) 항산화제; (25) 제형을 의도된 수령자의 혈액과 등장성이 되게 하는 제제, 예컨대 당 및 염화나트륨; (26) 증점제; (27) 코팅 물질, 예컨대 레시틴; 및 (28) 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제를 포함한다. 각각의 이러한 성분 또는 물질은 제형의 다른 성분과 상용성이고 대상체에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 선택된 투여 형태 및 의도된 투여 경로에 적합한 성분 및 물질은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 선택된 투여 형태 및 투여 방법을 위한 허용되는 성분 및 물질은 당업계의 일반적인 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 캡슐, 샤쉐, 환제, 정제, 산제, 과립제, 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액, 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 엘릭서제 또는 시럽, 파스틸, 볼루스(bolus), 연질약(electuary) 또는 페이스트의 형태일 수 있다. 이들 제형은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 팬-코팅, 혼합, 과립화 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태(캡슐, 정제, 환제, 당의정, 산제, 과립제 등)는 활성 성분(들)을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의로, 하나 이상의 충전제, 증량제, 결합제, 보습제, 붕해제, 용해 지연제, 흡수 촉진제, 습윤제, 흡수제, 윤활제 및/또는 착색제와 혼합하여 제조할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물을 적합한 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐 중의 충전제로서 사용될 수 있다. 정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형하여 제조될 수 있다. 압축 정제는 적합한 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제, 표면활성제 또는 분산제를 사용하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 적합한 기계에서 성형함으로써 제조할 수 있다. 정제, 및 당의정, 캡슐, 환제 및 과립제와 같은 다른 고체 투여 형태는 임의로 약제학적-제형화 업계에 익히 공지되어 있는 장용 코팅 및 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 스코어링(scored) 또는 제조할 수 있다. 이들은 또한 그 안의 활성 성분의 서방출 또는 제어 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 이들은 예를 들어 세균-보유 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다. 이들 조성물은 또한 임의로 불투명화제를 함유할 수 있고, 활성 성분을 위장관의 특정 부분에서만 또는 우선적으로, 임의로 지연된 방식으로 방출하도록 하는 조성물일 수 있다. 활성 성분은 또한 미세캡슐화 형태일 수 있다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서제를 포함한다. 액체 투여 형태는 당업계에서 통상 사용되는 적합한 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 보존제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 현탁액은 현탁화제를 함유할 수 있다.
직장 또는 질 투여를 위한 약제학적 조성물은 좌제로서 존재할 수 있으며, 이는 하나 이상의 활성 성분(들)을 실온에서 고체이지만 체온에서 액체이고 따라서 직장 또는 질강 내에서 용융되어 활성 화합물을 방출할 수 있는 하나 이상의 적합한 비자극 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 질 투여에 적합한 약제학적 조성물은 또한 당업계에 적합한 것으로 공지된 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형을 포함한다.
국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 산제, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 점적제 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합될 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 젤은 부형제를 함유할 수 있다. 산제 및 스프레이는 부형제 및 추진제를 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 조정제를, 사용 직전에 멸균 주사가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼 또는 멸균 분말과 함께 포함하며, 이는 적합한 항산화제, 완충제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질 또는 현탁화제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 적합한 보조제를 함유할 수 있다. 등장성 제제를 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 성취될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 조정제를 함유하는 약물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터의 이의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 수용해도가 불량한 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다.
그 다음, 약물의 흡수 속도는 약물의 용해 속도에 의존하며, 이는 결국 결정 크기 및 결정형에 의존할 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여 약물의 흡수 지연은 약물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성될 수 있다. 주사가능한 데포 형태는 생분해성 중합체 중에 활성 성분의 미세캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조될 수 있다. 활성 성분 대 중합체의 비, 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 활성 성분 방출 속도가 제어될 수 있다. 주사가능한 데포 제형은 또한 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼 중에 약물을 포획함으로써 제조된다. 주사가능한 물질은 예를 들어 세균-보유 필터를 통한 여과에 의해 멸균될 수 있다.
제형은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기, 예를 들어 앰풀 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결건조된 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 상기 설명한 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 추가로 설명하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 단지 예시적인 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
본원의 실시예는, 적어도 부분적으로 HSC 유지의 맥락에서 표적화된 mRNA 붕괴를 촉진하는 잘 인지된 m6A 판독인자인 Ythdf2(Wang et al. Blood, 505: 17-120, 2014)의 역할을 조사할 목적으로 Ythdf2를 조사한다. 어떠한 특정 이론으로 제한되지 않으면서, Ythdf2의 조정이 다수의 m6A-마크된 mRNA의 수명에 잠재적으로 영향을 미쳐서, 성체 HSC 자가-재생 대 분화에 영향을 미치고 HSC 증대를 촉진할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기 실시예에 나타난 바와 같이, Ythdf2 고갈은 계통 운명을 왜곡시키지 않으면서 마우스 및 인간 HSC를 특이적으로 증대시킨다. 따라서, Ythdf2는 HSC 자가-재생을 조절하는 데 있어 필수적인 역할을 할 수 있고, 임상 적용을 포함하는 hUCB HSC 생체외 증대를 향상시키는 새로운 접근법을 제공할 것으로 여겨진다.
본 실시예는 또한 약물-내성 rHSC 집단의 기능적 정의 및 rHSC가 항상성 동안 및 화학요법 스트레스 하에 주로 N-cad+ 세포에 의해 골내막 니치에서 유지된다는 조사결과를 보여준다. 또한, 골내막 영역의 N-cad+ 세포는 중간엽 줄기세포이고 rHSC 유지에 기여하는 것으로 나타났다.
실시예 A
하기 프로토콜을 하기 "A" 실시예에서 사용하였다.
마우스. Ythdf2 조건부 KO 마우스는 Chuan He 및 Bin Shen 그룹에 의해 생성되었다. 마우스는 스토워스의학연구소(Stowers Institute for Medical Research: SIMR)의 동물 시설에서 사육되었으며 연구소 및 NIH 지침에 따라 취급되었다. 모든 절차는 SIMR의 IACUC에 의해 승인되었다.
유세포계측 및 HSPC 분류. 마우스 HSPC, 선조세포 및 계통 세포를 BM(대퇴골 및 경골) 및 비장으로부터 수거하였다. 0.16 M 염화 암모늄 용액을 사용하여 적혈구를 용해시키고, 세포를 70㎛ 스트레이너(strainer)로 여과하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 마우스 HSC 동정을 위해, 세포를 CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), Mac-1 (M1/70), Gr1 (RB6-8C5), CD45R (B220, RA3-6B2)), IgM (I1-41) 및 Ter119 (TER-119)을 포함한 리니지 칵테일과 함께 Sca-1 (D7), c-Kit (2B8), CD34 (RAM34), Flk2 (A2F10), CD48 (HM48-1), CD150 (TC15-12F12.2)에 대한 항체로 염색하였다. 선조세포 및 계통 세포의 경우, 세포를 이전에 설명된 바와 같이 항체로 염색하였다(Qian, P. et al. Cell Stem Cell, 18:214-228, 2016, doi:10.1016/j.stem.2015.11.001). 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)(A1310, Life technologies)를 사용하여 사멸된 세포를 배제시켰다. 인간 제대혈 샘플은 St. Louis Cord Blood Bank에서 획득하였다. 단핵 세포를 Lymphoprep™(StemCell technologies)로 단리한 후, 인간 CD34 MicroBead Kit UltraPure(Miltenyi Biotec)에 의해 인간 CD34+ 제대혈 세포를 단리하였다. 인간 HSPC를 정량하기 위해, 세포를 CD34 (581), CD38 (HIT2), CD45RA (HI100), CD90 (5E10), CD49f (GoH3), EPCR/CD201 (RCR-401)에 대한 항체로 염색하였다. 세포 분류 및 분석은 MoFlo (Dako), InFlux 세포 분류기(BD Biosciences) 및/또는 MACSQuant (Miltenyi Biotec)에서 수행하였다. 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
귀소 검정(homing assay). 생체내 귀소 검정은 이미 설명된 바와 같이 수행하였다(He et al. Methods in Molecular Biology, 1185 : 279-284, 2014). 기본적으로, CD45.2 마우스로부터의 전체 골수(WBM) 세포를 37℃에서 10분 동안 5μM 5-(및 -6)-카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFDA SE)(Molecular Probes)로 표지하고, 3회 세척하고, 1x106 WBM을 치사량의 방사선 조사된 ptprc 마우스에 이식하였다. 18시간 후, 대퇴골 및 경골을 플러싱하고 CFDA SE+ 세포를 측정하였다.
경쟁적 재구성 검정. wt 또는 Ythdf2 KO 마우스(CD45.2)로부터 2×105, 7.5×104 또는 2.5×104 공여자 유래의 WBM 세포를 2×105 구제 세포(CD45.1)와 함께 치사량의 방사선 조사된(10 Gy) ptprc 수용체 마우스 10마리의 그룹에 정맥내 이식하여 경쟁적 재구성 검정을 수행하였다. 2차 이식을 위해, 1차 이식 수용자를 희생시켰다. BM 세포를 대퇴골 및 경골로부터 절제한 다음, 방사선 조사된 2차 수용자 마우스에 1×106 세포의 용량으로 마우스-대-마우스 이식하였다. 바이트릴(Baytril) 물을 방사선 조사 3일 전에 수용자 마우스에게 공급하였고 방사선 조사 후 2주 동안 다시 지속하였다. 1차 및 2차 CRU 빈도는 ELDA 소프트웨어(Hu et al. Journal of Immunological Methods, 347: 70-78, 2009)를 사용하여 측정하였으며, 여기서 성공적인 생착은 각각 말초혈 중 총 조혈 세포의 5% 이상 및 1% 이상인 뚜렷한 CD45.2+ CD45.1- 집단의 존재로서 정의되었다(Purton et al. Cell Stem Cell, 1: 263-270, 2007). 또한, 이식 후 16주 전에 사망한 2차 이식 수용자 마우스는 생착 실패로 계수하였다.
세포주기 및 아폽토시스 검정. 제조사의 지시에 따라 FITC 마우스 항-인간 Ki67 세트(BD Pharmingen)를 이용하여 세포주기 분석을 수행하였다. 간략하게 언급하면, 5×106 BM 세포를 상기 설명한 바와 같이 단리하고 HSC 항체로 염색하였다. 세포를 4℃에서 밤새 또는 실온(RT)에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, 얼음 위에서 15분 동안 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화시켰다. 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 세척한 다음, 암실에서 1시간 동안 RT에서 Ki-67 항체와 함께 항온배양한 다음, RT에서 추가 5분 동안 SYTOX Red(Invitrogen)와 함께 항온배양한 후, InFlux Cell Sorter(BD Biosciences)로 유세포계측 분석을 수행하였다. 아폽토시스 분석을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 5×106 BM 세포의 아넥신 V(Invitrogen) 및 SYTOX Red 염색을 수행하였다.
m 6 A RNA-IP-seq. C57BL/6J 마우스로부터 105 LT-HSC, ST-HSC(LSK CD34+ FLK2-) 및 MPP(LSK CD34+ FLK2+)의 2개의 복제물을 TRIzol(Invitrogen) 내로 분류하고, 제조사의 지시에 따라 전체 RNA를 단리하였다. RNA를 Ambion 단편화 시약을 이용하여 약 100개의 뉴클레오타이드 단편으로 단편화하였다(70℃에서 2분 항온배양). 이어서, 샘플을 터보 DNase 처리(Ambion)한 후, 이어서 페놀-클로로포름 추출하고, 85㎕의 뉴클레아-비함유 물에 재현탁시키고, 5㎕를 투입물로서 저장하였다. 이어서, 나머지 80㎕ RNA 단편을 IPP 완충액(150mM NaCl, 0.1% NP-40, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 희석시켰다. RNA를 IPP 완충액 중에서 4℃에서 3시간 동안, 3㎍의 항-m6A 폴리클로날 항체(Synaptic Systems)에 미리 결합된 25㎕의 단백질-G 자기 비드와 함께 항온배양하였다. 비드를 200㎕ IPP 완충액으로 2회, 200㎕ 저염 완충액(50mM NaCl, 0.1% NP-40, 10mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 2회 및 200㎕ 고염 완충액(500mM NaCl, 0.1% NP-40, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5)으로 2회 세척하였다. 이어서, 비드를 50℃에서 1.5시간 동안 300㎕ 용리 완충액(5mM Tris-HCL pH 7.5, 1mM EDTA pH 8.0, 0.05% SDS, 4.2㎕ 프로테이나제 K(20mg/ml))로 처리하고, RNA를 페놀:클로로포름 추출에 이어서 에탄올 침전으로 회수하였다. 3가지 인간 CD34+ 제대혈 세포를 상기 설명한 바와 같이 단리하고 TRIzol로 총 RNA를 단리하였다. RNA를 암 비온 단편화 시약(70℃에서 2분 50초 항온배양)을 이용하여 약 100개의 뉴클레오타이드 단편으로 단편화하였다. 이어서, 샘플을 터보 DNase 처리(Ambion)하고, 이어서 페놀:클로로포름 추출하고, 18㎕의 뉴클레아제-비함유 물에 재현탁시키고, 1㎕를 투입물로서 저장하였다. m6A RNA IP는 제조사의 지시에 따라 EpiMark® N6-메틸아데노신 풍부화 키트로 수행되었다.
RNA의 m6A 생성 후, Agilent 2100 생물분석기에서 품질을 평가하고, 16사이클(마우스) 또는 13사이클(인간) PCR2 증폭을 사용하여 SMARTer Stranded Total RNA-Seq 키트-Pico Input Mammalian (Takara Bio Inc)에 대한 제조사의 지시에 따라 RNAseq 라이브러리를 생성하기 위해 1ng(마우스) 또는 10ng(인간) RNA를 사용하였다. 상기 방법은 무작위 프라이밍 및 주형 전환 올리고를 사용하여 상보적 DNA를 생성하고, 이어서 바코드화 어댑터의 라이게이션(ligation)을 수행한다; 이어서, 리보솜 유래의 cDNA를 프로브-지향된 효소 절단 및 후속적인 비절단 단편의 풍부화를 통해 제거한다.
PCR1 정화를 위해 1.2×SPRI 비드 농도를 사용하여 저분자량 샘플 단편을 보유하도록 프로토콜을 수정하였다. 이량체화된 어댑터를 제거하기 위해, 라이브러리를 Pippin Prep(Sage Science) 2% 겔을 사용하여 160 내지 600 bp 크기 선택하였다. 생성된 라이브러리를 생물분석기 및 Qubit 형광계(Life Technologies)를 사용하여 품질과 양에 대해 점검하였다. 이어서, 동일한 몰의 라이브러리를 풀링하고 재정량하였다. 마우스 m6A-seq를 위해, 라이브러리를 HiSeq 제어 소프트웨어 2.2.58을 사용하여 Illumina HiSeq 2500 기기에서 50 bp 단일 판독으로서 시퀀싱(sequencing)하였다. 시퀀싱 후, Illumina 1차 분석 버전 RTA 1.18.64 및 2차 분석 버전 bcl2fastq2 v2.18을 실행하여 모든 라이브러리에 대한 판독을 역다중화(demultiplex)하고 FASTQ 파일을 생성하였다. 인간 m6A-seq의 경우, 라이브러리를 NextSeq 제어 소프트웨어 2.1.2를 사용하여 Illumina NextSeq 기기에서 75 bp 단일 판독으로서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 후, Illumina 1차 분석 버전 NextSeq RTA 2.4.11 및 2차 분석 버전 bcl2fastq2 v2.18을 실행하여 모든 라이브러리에 대한 판독을 역다중화하고 FASTQ 파일을 생성하였다.
플라스미드 작제 및 안정한 세포주 생성. 마우스 Ythdf2(mYthdf2)를 하기 기재된 프라이머를 사용하여 상업적 cDNA 클론(ORIGENE # MC200730)으로부터 벡터 pcDNA5/FRT/Flag 플라스미드로 클로닝하였다: mYthdf2 ORF 클론 BamhI F: 5'-CGC GGA TCC TCG GCC AGC AGC CTC TTG GA-3' 및 mYthdf2 ORF 클론 NotI R: 5'-ATA AGA ATG CGG CCG CCT ATT TCC CAC GAC CTT GAC GT-3'. 이어서, Flag-mYthdf2를 EF1a 프로모터 하에 pSicoR-EF1a-IRES-EGFP 렌티바이러스 작제물에 서브클로닝하였다(Gibson Assembly®, 정방향 프라이머: 5'-GTC GAC GGT ACC GCG GGC CCA TGG ATT ACA AGG ATG ACG ACG-3' 및 역방향 프라이머: 5'-GAG GGA GAG GGG CGG ATC CCC TAT TTC CCA CGA CCT TGA CGT-3'). 인간 Ythdf2(hYthdf2)를 하기 나타낸 프라이머를 사용하여 추안 헤(Chuan He) 실험실에 의해 제공된 플라스미드로부터 클로닝하였다: 정방향 5'-CGT TCG AAA TGT CGG CCA GCA GCC TCT-3'; 역방향 5'-TCC CCC GGG TTA TTT CCC ACG ACC TT-3'. 이어서, hYthdf2를 BstBI 및 XmaI 제한 분해 및 라이게이션에 의해 EF1a 프로모터 하에 pSicoR-EF1a-IRES-EGFP 작제물로 클로닝하였다. Flag-mYthdf2 HPC7 안정한 세포주를 생성하기 위해, 인산칼슘 형질감염을 사용하여 pSicoR-EF1a-Flag-mYthdf2-IRES-EGFP 작제물을 10:7.5:2.5의 비에서 psPAX2 및 pMD2.G 플라스미드와 함께 293T 세포로 형질감염시켜 렌티바이러스를 생성하였다. 형질감염 후 48시간, 72시간 및 96시간차에 바이러스 입자를 수거하고 0.45㎛ 필터 유닛(Millipore)에 의해 여과한 다음, 18,000 RPM, 4℃에서 2시간 동안 원심분리하였다. HPC7 세포를 4㎍/mL 폴리브렌(Sigma)의 존재 하에 재조합 렌티바이러스-형질도입 단위로 감염시켰다. 감염 48시간 후, GFP+ 세포를 분류하고 실험을 위해 배양하였다.
irCLIP-seq 및 데이터 분석. irCLIP-seq의 경우, 절차는 이전에 보고된 방법(Zarneger et al. Nature Methods, 13: 489-492, 2016); Simsek et al. Cell, 169: 1051-1065 e1018, 2017)으로부터 변형시켰다. 요약하면, irCLIP는 0.4J/cm2에서 3배 동안 UV 가교결합 세포에 의해 약 3×108 Flag-Ythdf2 HPC7 세포에서 수행하였다. 전세포 용해물은 용해 완충액(150mM KCl, 10mM HEPES pH 7.6, 2mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.5mM DTT, 1:100 프로테아제 억제제 칵테일, 400U/ml RNase 억제제; 1ml 세포 펠릿 및 2ml 용해 완충액)에서 생성하였다. 수차례 위아래로 피펫팅한 다음, mRNP 용해물을 얼음 위에서 5분 동안 항온배양하고 -80℃에서 액체 질소를 이용하여 충격-동결시켰다. mRNP 용해물을 얼음 위에서 해동하고 15분 동안 15,000g에서 원심분리하여 용해물을 제거하였다. Flag-Ythdf2를 회전 하에 4℃에서 2시간 동안 1ml 용해물당, 2㎍의 항-Flag 모노클로날 항체(Sigma)에 미리 결합시킨 30㎕의 단백질-G 자성 비드를 이용하여 단리하였다. 비드를 모으고, 1ml 빙냉 NT2 완충액(200mM NaCl, 50mM HEPES pH 7.6, 2mM EDTA, 0.05% NP-40, 0.5mM DTT, 200U/ml RNase 억제제)으로 8회 세척하고 200㎕ irCLIP NT2 완충액(50mM Tris, pH 7.5; 150mM NaCl; 1mM MgCl2; 0.0005% NP-40)으로 1회 세척하였다. mRNP 복합체를 irCLIP NT2 완충액(30㎕의 수성 용적 및 6㎕의 PEG400이 보충됨(16.7% 최종)) 중의 4U/㎕의 RNase 1(Thermo Fisher #AM2294)을 이용하여 분해시켰다. 뉴클레아제 반응을 에펜도르프 써모믹서에서, 15 s 1,400 r.p.m., 90초 휴식으로 30℃에서 15분 동안 항온배양하였다. 0.5mL의 빙냉 고-엄격성 완충액(20mM Tris, pH 7.5; 120mM NaCl; 25mM KCl; 5mM EDTA; 1% Triton-X100; 1% Na-데옥시콜레이트)을 첨가하여 뉴클레아제 분해를 중단시켰다. 이어서, 면역침전물을 0.25mL에 이어서 0.05mL의 빙냉 irCLIP NT2 완충액으로 신속하게 헹구었다. irCLIP 어댑터 라이게이션 및 라이브러리 작제는 이전에 보고된 프로토콜을 따랐다(Zarneger et al. Nature Methods, 13: 489-492, 2016).
FAST-iCLIP 버전 0.9.3을 사용하여 데이터를 역다중화하고, 파라미터 "--outFilterScoreMinOverLread 0 --outFilterMatchNminOverLread 0 --outFilterMatchNmin 0"을 갖는 STAR(2.4.2a)를 사용하여 UCSC로부터의 마우스 게놈 mm10에 대해 정렬시켰다. RPM-정규화된 게놈 브라우저 트랙을 R(3.4.1)에서 생성하고 Gviz 패키지(1.20.0)를 사용하여 플롯팅하였다. 풍부화된 모티프는, 3개의 모든 복제물에서 발견된 각각의 결합 부위의 중간점을 취하고 20개 염기를 상류 및 하류에 추가하고 파라미터 "-dna -mod zoops -revcomp -minw 5 -maxw 10 -nmotifs 10 -maxsize 1000000"를 갖는 MEME (4.11.1)를 실행하여 동정하였다. 모티프가 동정된 후, 본 발명자들은 기지의 결합 부위를 동정하기 위해 transfac(1-2017)에 대해 tomtom(4.11.1)을 실행하였다. GO 풍부화 분석을 R에서 초기하(hypergeometric) 시험을 사용하여 수행하였다. GO 용어는 0.05 미만의 BH-조정된 p-값을 갖는 경우 풍부한 것으로 간주하였다. 선택된 관심대상의 용어는 막대 그래프로 나타낸다. 막 그래프의 막대는 용어를 갖는 시험되는 목록 내의 유전자의 백분율을 용어를 갖는 게놈 내의 유전자의 백분율로 나눈 것을 나타낸다. 모든 3개의 복제물에서 FAST-iCLIP에 의해 발견된 피크는 게놈의 다양한 특징으로 할당되었다. 프로모터는 TSS로부터 상류 150개 염기로서 정의되었다. "trans_stop"은 전사 개시 부위로부터 상류 및 하류 200개 염기로서 정의되었다.
제대혈 형질도입. 제대혈 형질도입은 이미 설명된 바와 같이 수행하였다(Rentas, S. et al. Nature, 532:508-511, 2016, doi:10.1038/nature17665). 간략하게 언급하면, 신선한 CD34+ 제대혈 세포 또는 유동-분류된 CD34+ CD38- 세포를 성장 인자 인터루킨 6 (IL-6; 20ng/ml, Peprotech), 줄기세포 인자(SCF; 100ng/ml, Peprotech), Flt3 리간드(FLT3-L; 100ng/ml, Peprotech) 및 트롬보포이에틴(TPO; 20ng/ml, Peprotech)이 보충된 StemSpan 배지(StemCell Technologies)에서 12 내지 18시간 동안 사전자극시켰다. 이어서, 렌티바이러스를 24시간 동안 50 내지 200의 감염다중도(MOI)에서 동일한 배지에 첨가하였다. 이어서, 시험관내 또는 생체내 검정 전, 형질도입 후 2일차에 세포를 제공하였다. 인간 YTHDF2는, 이전 보고서에서 사용된 바와 같이, CDS의 N 말단 근처의 5'-AAGGACGTTCCCAATAGCCAA-3'을 표적으로 하는 shRNA에 의해 넉다운의 표적이 되도록 하였다(Wang, X. et al. Nature 505:117-120, 2014, doi:10.1038/nature12730). 스크램블 shRNA(시드 서열(seed sequence) 5'-GCGCGATAGCGCTAATAAT-3')를 대조군으로서 사용하였다.
클론원성 선조세포 검정. 10일차의 배양된 형질도입된 세포(ml당 12,000)로부터의 유동-분류된 GFP+ 제대혈 세포를 반고체 메틸 셀룰로스 배지(Methocult H4034; StemCell Technologies)에 재현탁시켰다. 14일의 항온배양 후 콜로니 계수를 수행하였다.
인간 제대혈 HSPC 배양. 형질도입 2일 후, 인간 제대혈 CD34+ 또는 CD34+ CD38- 세포를 수집하고, GFP+ 백분율을 유세포계측에 의해 결정하였다. 증대 전에 반드시 동일한 수의 GFP+ 세포가 배양되도록 하기 위해, 동일하게 배양된 GFP- 세포를 더 높은 GFP+ 백분율을 갖는 세포에 첨가하여 대조군과 hYthdf2 KD 사이의 % GFP+와 일치시켰다. 이어서, 성장 인자 IL-6(20ng/ml), SCF(100ng/ml), FLT3-L(100ng/ml), TPO(20ng/ml) 및 CHIR99021(250 nM)(Stemgent)가 보충된 StemSpan 배지(StemCell Technologies)에 ml당 105의 밀도로 세포를 시딩하였다(Perry et al. Genes and Development, 25: 1928-1942, 2011).
인간 HSC 이종이식. 인간 제대혈 HSC 생체외 증대 분석을 위해, 105개의 분류된 CD34+ CD38- 세포를 인간 YTHDF2 shRNA 또는 대조군 shRNA로 3일 동안 형질도입하고 이어서 형질도입 효율(% GFP-/+) 및 줄기세포 마커에 대해 분석하였다. 10일차에, 줄기세포 마커 분석을 위해 배양된 세포를 수집하였다. hUBC HSC 1차 LDA 검정을 위해, CD34+ 세포를 상기 설명한 바와 같이 풍부화하고 50 MOI에서 인간 YTHDF2 shRNA 또는 대조군 shRNA로 형질도입하였다. 감염 후 24시간차에 배지를 교체하였다. 감염 후 3일차에 대조군 또는 YTHDF2 KD 세포로부터 동일한 수의 GFP+ 세포를 분류하고 밤새 배양하였다. 분류된 GFP+ 세포의 3회 용량, 50K, 20K 및 10K를 각각 아치사량의 방사선 조사된(3.25Gy) NSG 마우스에 이식하였다. HSC 생착에 대한 컷오프는 1차 이식 수용자의 BM 내의 총 CD45+ 세포 중 1% 초과의 인간 CD45+ GFP+ 세포를 나타내는 것이었다. hUCB HSC 2차 LDA 분석을 위해, 가장 높은 2가지 용량 1차 수용자로부터의 BM 세포를 수집하고 이식 후 10주차에 함께 혼합하였다. 1.2×107, 8×106, 4×106의 3가지 용량의 BM 세포를 각각 아치사량의 방사선 조사된(3.25Gy) NSG 마우스에 이식하였다. HSC 생착에 대한 컷오프는 2차 이식 수용자의 BM 내의 총 CD45+ 세포 중 0.2% 이상의 인간 CD45+ GFP+ 세포를 나타내는 것이었다. HSC 빈도는 ELDA 소프트웨어를 사용하여 평가하였다(Hu et al. Journal of Immunological Methods, 347: 70-78, 2009). 모든 인간 제대혈 이종이식 실험에는 6 내지 8주령의 암컷 NSG 마우스를 사용하였다.
m 6 A-seq 데이터 분석. 인간 및 마우스 m6A-seq 데이터를 hg19 및 mm10의 전사체에 대해 정렬시켰다. m6A 피크를 동정하기 위해, hg19 및 mm10 전사체를 25개 뉴클레오타이드-폭의 타일로 나누었다. m6A IP 및 비-IP(대조군) 샘플 중의 판독(read)의 수를 각 타일에서 계수하고, p 값을 피셔 정확 검정(Fisher exact test)을 사용하여 계산하고 다수의 시험에 맞게 조정하였다. 현저한 m6A 신호 강화를 갖는 타일(조정된 P값 <= 0.05 조정)이 더 큰 영역으로 병합하였다. 100bp 미만의 영역을 버리고 200bp 이상의 영역을 100 내지 200bp 하위영역으로 나누었다; 각 영역에서 대조군 대비 m6A 신호를 계산하였고; 모든 복제물에서 적어도 2배 강화를 갖는 영역은 m6A 피크로서 동정되었다. 모든 m6A 피크를 hg19 및 mm10 RefGene 주석(annotation)과 중첩시켜 m6A 피크 분포 및 m6A 마크된 유전자를 결정하였다. mgA 피크를 hg19 RefGene과 중첩시켜 m6A 마크된 유전자를 동정하였다. 전사 인자를 필터링하기 위해, 3가지 샘플 모두에서 m6A에 의해 마크된 유전자를 인간 전사 인자 데이터베이스 http://fantom.gsc.riken.jp/5/sstar/Browse_Transcription_Factors_hg19와 비교하였다. 이어서, R 패키지 풍부화 GO를 사용하여 GO 용어 분석을 수행하였다. m6A 마크된 인간 전사 인자를 검색 목록으로서 사용하였고, 모든 발현된 유전자를 배경으로서 사용하였다. 현저한 풍부화를 갖는 조혈 관련 BP 용어를 사용하여 도 3c를 생성 하였다.
RNA-seq. 인간 제대혈 CD34+ 세포를 대조군 또는 인간 YTHDF2 KD 렌티바이러스로 형질도입하고 10일 후 GFP+ CD34+에 대해 분류하였다. 12,000개의 GFP+ CD34+ 세포의 3개 복제물을 각 그룹별로 분류하고 총 RNA를 추출하는 데 사용하였다. cDNA 합성 및 라이브러리 제조를 위해 4㎍의 고품질 총 RNA를 시퀀싱용 SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA 키트(Takara, 634891) 및 Nextera XT(Illumina, FC-131-1096)와 함께 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 생성된 짧은 단편 라이브러리를 Agilent 2100 생물분석기 및 Invitrogen Qubit 형광계를 사용하여 품질과 양을 점검하였다. 동일한 몰의 라이브러리를 풀링하고, 재정량하고, Illumina NextSeq 500 기기의 High Output 플로우셀에서 75염기쌍 단일 판독으로서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 후 Illumina 1차 분석 버전 NextSeq RTA 2.4.11 및 2차 분석 버전 bcl2fastq2 2.18을 실행하여 모든 라이브러리에 대한 판독을 역다중화하고 FASTQ 파일을 생성하였다.
RNA-seq 분석을 위해, 판독을 Ensembl 87 유전자 모델을 사용하여 데폴트 파라미터를 갖는 Tophat 버전 2.0.13으로 UCSC 게놈 hg38에 대해 정렬시켰다. -m intersection-nonempty와 함께 HTSeq-계수를 사용하여 판독 계수가 생성되었다. 판독을 또한 ERCC 제어 서열에 대해 정렬하고 계수를 표로 작성하였다. 각 샘플에 대한 ERCC 계수의 중앙값을 기초로 하여 축척 계수를 계산하고 정규화를 위해 사용하였다. R(3.4.1)에서 edgeR 패키지(3.18.1)를 사용하여 차등 발현된 유전자를 발견하였다. 차등 발현된 유전자는 BH-조정된 p-값 <.05 및 발현의 2배 변화를 갖도록 요구되었다.
RNA 안정성 분석. 15,000개의 분류된 LT-, ST-HSC 및 MPP를 10㎍/mL 헤파린(Sigma), 0.5× 페니실린/스트렙토마이신(Sigma), 10ng/mL 재조합 마우스(rm) SCF(Biovision, Inc.) 및 20ng/mL Tpo(Cell Sciences, Inc.)가 보충된 StemSpan SFEM 배지(Stem Cell Technologies)에서 37℃ 5% CO2 5% O2에서 배양하였다(Perry et al. Genes and Development, 25: 1928-1942 (2011)). mRNA 전사 억제를 위해, 분류된 세포를 5㎛ 악티노마이신 D(Sigma)로 처리하였다. 처리 후 0시간 또는 4시간차에 세포를 수거하고, 총 RNA를 추출하고 RNA-seq를 위해 사용하였다.
m 6 A RNA 메틸화 정량.
wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 마우스 BM 계통 음성 세포를 마우스 계통 세포 고갈 키트(Miltenyi Biotec)로 풍부화한 후, TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA 추출을 수행하였다. Lin- 세포에서 m6A RNA 메틸화의 정량은 제조사의 프로토콜에 따라 m6A RNA 메틸화 정량 키트(Abcam ab185912)를 이용하여 수행하였다. 어느 그룹이든 복제물당 200ng의 총 RNA를 사용하였다.
qPCR 분석.
105개의 LSK 세포를 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터 분류하였다. 총 RNA를 TRIzol(Invitrogen)로 추출하였다. cDNA 합성을 제조사의 프로토콜에 따라 High-Capacity RNA-to-cDNA™ 키트(Thermo)를 이용하여 수행하였다. 사용된 qPCR 프라이머는 표 S5에 열거되어 있으며, qPCR 프라이머는 wt 및 Ythdf2 KO HSPC에서 전사 인자의 발현 수준을 확인하기 위해 사용되었다.
웨스턴 블롯 및 세포내 염색. Ythdf2 KO 마우스 모델 또는 hUCB에서 KO 또는 KD 효율을 검증하기 위해, 33,000개의 cKit+ 세포 또는 120,000개의 GFP+ 세포를 각각 BM 또는 형질감염된 hUCB 샘플로부터 분류하였다. 인간 YTHDF2를 과발현시키기 위해 형질도입된 Hela 세포를 도 14b에 도시된 바와 같이 과발현 효율을 검증하는데 사용하였다. 면역블롯팅을 항-YTHDF2 토끼 폴리클로날 항체(MBL, RN123PW) 및 β-액틴 마우스 모노클로날 항체(NOVUS, NB600-501)로 수행하였다. 사용된 2차 항체는 IRDye 800CW 염소 항-마우스 IgG 및 IRDye 800CW 염소 항-토끼 IgG 항체(LI-COR)였다. 세포내 염색을 위해, wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 BM 세포를 상기와 같이 HSC 마커로 염색한 다음, 제조사의 지시에 따라 Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences)를 이용하여 고정시켰다. 고정 및 투과화된 세포를 항 YTHDF2 항체(MBL RN123PW), 항 TAL1 항체(Santacruz sc-393287), 항 GATA2 항체(Santacruz sc-267), 항 RUNX1 항체(Santacruz sc-365644), 항 STAT5 항체(Santacruz sc-74442))로 면역염색하고 Alexa-488 당나귀 항-토끼 IgG 항체(Invitrogen)에 의해 검출하였다.
단일 세포 면역염색. wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 10,000개의 LSK를 폴리-L-라이신 코팅 슬라이드 상으로 분류하고, 이를 수분 챔버에 놓고 40℃에서 30분 동안 항온배양하여 세포가 슬라이드 상에 침전되도록 하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 냉각된 메탄올을 이용하여 고정시키고, 실온에서 범용 차단 시약 (BioGenex)으로 30분 동안 차단하고, 4℃에서 마우스 TAL1 항체(Santa Cruz, SC393287) 또는 마우스 IgG 대조군(Abcam)으로 밤새 염색하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 30분 동안 Alexa Fluor 488 당나귀 항-마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. Yokagawa CS-X1 디스크가 장착된 PerkinElmer Ultraview 회전 디스크 시스템에서 이미지를 촬영하였다. 모든 방출을 Velocity 소프트웨어(PerkinElmer)를 사용하여 C9100-23 Hamamatsu EM-CCD로 수집하였다. Z-스택의 경우, 단계 크기를 400nm로 설정하였다. 이미지당 염색 강도는 ImageJ 프로그램에 의해 정량하였다.
형광성 면역염색과 병용된 FISH. 분류된 LSK를 중간 가속도로 800rpm에서 1분 동안 Cytospin™ 4 세포원심분리기(Thermo Scientific, 카탈로그 번호 A78300003)를 사용하여 현미경 유리 슬라이드(Fisher Scientific 카탈로그 번호 12-544-4)로 스피닝시킨 후, 즉시 4% PFA(16%(wt/vol) 수용액으로부터 희석됨, Electron Microscopy Sciences, 카탈로그 번호 15710)에 침지시켰다. 세포를 RT(25±2℃)에서 30분 동안 고정시켰다. RNA 인 시츄 하이브리드화를 몇 가지 수정된 제조사의 지침(Advanced Cell Diagnostics)에 따라 RNAscope 다중 형광 검출 키트를 사용하여 수행하였다: 항원 복원(antigen retrieval)은 불필요하였고 분해는 RT에서 10분 동안 1:15 희석된 프로테이나제 III 용액을 이용하여 수행하였다. 마우스 Tal1 및 Gata2를 표적으로 하는 RNAscope 프로브는 ACDbio에 의해 설계되고 제조디었다. 인 시츄 하이브리드화가 완료된 후, 슬라이드를 PBST로 2회 헹구고 배경 차단(배경 부스터 용액, Innovex, 카탈로그 번호 NB306) 및 1차 항체 배양으로 직접 가공하였다. 항-YTHDF2(MBL, 1: 500) 및 항-Dcp1α(Santa Cruz, SC100706, 1:200) 항체를 항체 희석제 시약 완충액(Life Technologies, 카탈로그 번호 003118)으로 희석하고 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor 488(Invitrogen, 1:500) 및 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor 633(Invitrogen, 1:500)을 단백질 표적 다중화를 위해 사용하였다.
실시예 A-1
Ythdf2 KO는 1차 마우스에서 표현형 HSC의 증가를 야기한다.
표현형 HSC에 미치는 Ythdf2의 효과를 조사하기 위해, Crispr-Cas9 기술을 사용하여 Ythdf2 f/f 조건부 넉아웃 마우스를 생성한 다음, Mx1-Cre 마우스와 교배시켜 조혈 세포에서의 Ythdf2 발현을 특이적으로 감소시켰다(이하, Ythdf2 KO 마우스)(도 1a 및 도 1b). BM HSPC는 pI:pC의 부재 하에 인식가능한 차이를 보이지 않았다(도 7a). pI:pC 주사한지 4주 후에, 장기적 HSC (Lin- Sca1+ cKit+ (LSK) CD34- Flk2-; LT-HSC) 및 단기적 HSC(LSK CD34+ Flk2-; ST-HSC)의 빈도와 절대 수 둘 다에서 유의적인 증가가 관찰되었지만, 동복자 야생형(wt) 마우스와 비교하여 Ythdf2 KO 마우스의 다분화능 선조세포(LSK CD34+ Flk2+; MPP)는 그렇지 않았다(도 1c 내지 도 1e). 장기적 HSC(LT-HSC) 및 ST-HSC의 빈도 및 절대 세포 수는 2배 이상 증가한 반면, MPP는 보다 약한 반응을 나타낸 것으로 밝혀졌다(도 1c 및 도 1e). Ythdf2 KO는 BM 세포충실성을 증가시켰지만, 공통 골수 선조세포(CMP), 과립구-대식세포 선조세포(GMP), 거핵구-적혈구 선조세포(MEP) 및 공통 림프구 선조세포(CLP)를 포함하는 수임 선조세포뿐만 아니라, 성숙한 계통 세포, 적혈구, 골수 세포, B 세포 및 T 세포의 절대 수는 Ythdf2 KO와 wt 마우스 사이에 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 1f 내지 도 1h). 세포주기 분석은 Ythdf2 KO 후에 HSC 또는 MPP에서 휴지의 인식가능한 변화가 없음을 밝혔다(도 7b). 특히, Ythdf2 KO LT-, ST-HSC 및 MPP에서 아폽토시스 세포의 백분율은 wt 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하였다(도 7c). Ythdf2 KO 마우스에서 임의의 잠재적인 HSC 결함을 추가로 동정하기 위해, 비장 내의 HSC, 수임 선조세포 및 성숙한 계통의 수를 조사하였고, wt 및 Ythdf2 KO 마우스 간에 유의차는 발견되지 않았다(도 7d 내지 도 7h). 요약하면, 1차 마우스의 Ythdf2 KO는 선조세포 또는 계통 세포에서의 편향 또는 결함 없이 HSC 수를 특이적으로 증가시킨다.
실시예 A-2
Ythdf2 KO는 마우스에서 기능적 HSC를 증대시킨다.
Ythdf2 KO가 기능적 HSC를 증대시키는지 여부를 결정하기 위해, KO 마우스 또는 이의 동복자 대조군 마우스로부터의 1×106개 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFDA SE)-표지된 BM 세포를 치사량의 방사선 조사된 수용자 마우스에게 이식함으로써 단기적 귀소 검정을 먼저 수행하였고, 귀소 능력에 있어 돌연변이체와 wt 대조군 간에 유의차가 발견되지 않았다(도 7i). 이어서, ptprc 돌연변이 스트레인(CD45.1)으로부터 유래된 2×105 수용자 BM 세포와 함께 2×105, 7.5×104 또는 2.5×104 공여자 BM 세포(CD45.2)를 치사량의 방사선 조사된 수용자 마우스에게 이식함으로써 제한 희석, 경쟁적 재증식 단위 검정(LDA)을 수행하였다(도 2a). Ythdf2 KO 마우스에서 표현형 HSC의 수가 증가된 것과 일치하여, 경쟁적 재증식 단위(CRU)는 대조군과 비교하여 Ythdf2 KO HSC에서 2.2배 증가한 것으로 밝혀졌다(도 2b). 2×105 그룹에서는, 대조군과 비교하여, 이식 후 16주차에 Ythdf2 KO 공여자 세포로부터 전체 재증식율의 유의적인 증가가 관찰되었다(도 2c). 게다가, 대조군의 수용자와 비교하여 Ythdf2 KO BM 세포의 수용자는 공여자 유래의 LT-HSC 및 ST-HSC의 현저히 더 높은 빈도 및 절대 수를 나타내었지만, BM에서 MPP는 그렇지 않았다(도 2d 및 도 2e). 또한, 돌연변이체 및 wt 세포의 이식 수용자로부터의 BM에서 공여자 유래의 수임 선조세포 및 성숙한 계통은 유의적인 변화를 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다(도 2f 및 2g). Ythdf2 KO 마우스로부터의 HSC의 장기적 재증식 능력을 결정하기 위해, 1차 수용자로부터 유래된 BM 세포로의 2차 이식을 수행하였다. 특히, 대조군과 비교하여, Ythdf2 KO 세포로부터의 CRU는 3.5배 증가를 나타냈고(도 2h), 2차 이식 후 16주차에 BM과 비장 둘 다에서 백혈병의 징후를 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다(도 9a 내지 도 9f). 또한, 도 2i 및 도 2j에서, 제한 희석 검정을 WT 또는 Ythdf2 KO 마우스로부터 총 골수(BM)를 3가지 상이한 용량으로 이식함으로써 수행하였다. 이식한지 4주 후에, WT BM 세포가 이식된 마우스와 비교하여 200,000개의 Ythdf2 KO BM 세포가 이식된 마우스에서 공여자 세포의 생착이 증가한 것으로 관찰되었다. 또한, 이러한 증가는 이식 수용자에서 계통 편향을 생성하지 않았다.
본 발명자들은 또한 pI:pC 주사 후 5개월 이상에서 BM 및 비장 둘 다에서 줄기세포, 선조세포 및 계통을 조사함으로써 항상성 조건 하의 조혈에 미치는 Ythdf2 KO의 장기적 효과를 조사하였다(도 9a). 본 발명자들이 대조군으로부터의 BM과 비교하여 Ythdf2 KO 마우스로부터의 BM에서 LT-HSC의 완만한 증가를 관찰하였지만(도 9c), BM 또는 비장으로부터의 선조세포 및 계통 세포에 있어 YMdf2 KO와 대조군 마우스 간에 인식가능한 차이는 없었다(도 9d 내지 도 9j). 이러한 관찰은 생체 내에서 Ythdf2 KO의 장기적 효과가 계통 분화를 왜곡시키지도 않고 비정상적인 증식을 촉진하지도 않음을 나타내며, 이는 Ythdf2가 백혈병유발에 요구되지 않는다는 이전의 보고와 일치한다. pI:pC 유도 후 5개월차에 BM 내의 기능적 HSC의 빈도를 확인하기 위해, 본 발명자들은 적격 세포와 함께 wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 7.5×104 BM 세포를 치사량의 방사선 조사된 수용자에게 이식하였다. 본 발명자들은 Ythdf2 KO가 wt 대조군과 비교하여 수용자에서 유의적으로 높은 생착을 유도하였다는 것을 발견하였으며, 이는 Ythdf2 KO가 생체내 마우스 HSC 증대에 있어 장기적 능력을 가지고 있음을 시사한다(도 9k). 종합하면, 이들 데이터는 Ythdf2 KO가 계통 수임에 영향을 미치지 않으면서 생체내에서 특이적이고 유의적인 마우스 HSC 증대를 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 A-3
Ythdf2는 m 6 A-매개 mRNA 붕괴에 의해 HSC 자가-재생 유전자 발현을 조절한다.
Ythdf2 KO가 HSC를 증대시키는 기본적인 메커니즘을 조사하기 위해, 성체 C57BL/6J 마우스로부터 분류된 LT-HSC, ST-HSC 및 MPP에서 고처리량 시퀀싱 (MeRIP-seq 또는 m6A-seq)과 결합된 메틸화 RNA 면역침전에 의해 m6A 메틸놈(methylome)의 맵핑을 수행하였다(Meyer et al. Cell, 149: 1635-1646, 2012; Schwartz et al. Cell, 155: 1409-1421, 2013; Dominissini et al. Nature, 485: 201-206, 2012). 2개의 독립적인 복제물로부터 유의적으로 풍부화된 중첩 피크를 동정하여 m6A 피크를 선택하였다. 이전의 연구(Meyer et al. Cell, 149: 1635-1646, 2012); Dominissini et al. Nature, 485: 201-206, 2012)와 일치하여, m6A 피크는 mRNA 오픈 리딩 프레임(ORF) 내, 3' 비번역 영역(UTR) 내 및 모든 3가지 HSPC 집단의 정지 코돈 주변에서 풍부한 것으로 밝혀졌다. 적당하게 발현된 유전자의 전사체는 메틸화될 가능성이 더 높았다(도 10a 내지 도 10c). 흥미롭게도, m6A 변형은 HSC 자가-재생 및 줄기세포 상태 유지에 중요한 것으로 입증된 Gata2, Etv6, Stat5 및 Tal1과 같은 전사 인자의 mRNA에서 풍부하였다(Wang et al. Blood, 113: 4856-5865, 2009; Ebina et al. The EMBO Journal, 34: 694-709, 2015; Orkin et al. Cell, 132: 631-644, 2008: de Pater et al. The Journal of Experimental Medicine, 210: 2843-2850, 2013; Hock et al. Genes and Development, 18: 2336-2341, 2004; Lim et al. The Journal of Clinical Investigation 122: 3705-3717, 2012; Reynaud et al. Blood, 106: 2318-2328, 2005; and Kato et al. The Journal of Experimental Medicine, 202: 169-179, 2005), 이는 m6A 변형이 HSC의 조절에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다(표 S1, HSC 자가-재생 및 유지에 중요한 주요 전사 인자는 HSPC에서 m6A로 표지된다). m6A mRNA 메틸화가 자가-재생 및 분화에 관여하는 주요 신호전달 경로의 전사 인자 및 유전자를 암호화하는 mRNA의 붕괴를 촉진함으로써 줄기세포 운명 결정을 조절한다는 축적된 증거를 고려하여(Batista et al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014; (Geula et al. Science 347: 1001-1006, 2015; Yoon et al. Cell, 2017; Zhang et al. Nature, 549: 273-276, 2017; Zhao et al. Nature, 542: 475-478, 2017; Li et al. Cancer Cell, 31: 127-141, 2017; Li et al. Nature, 548: 338-342, 2017), 그 다음에 악티노마이신 D에 의한 전사 억제 후 mRNA 수준을 모니터링함으로써 mRNA 분해 속도를 LT-, ST-HSC 및 MPP에서 측정하였다. 메틸화된 mRNA의 분해 속도가 ST-HSC 및 MPP에서 메틸화되지 않은 mRNA보다 유의적으로 빠르다는 것이 밝혀졌다(도 10d). Ythdf2는 mRNA 붕괴를 매개하는 잘 인지된 m6A "판독인자"이므로(Wang et al. Nature, 505: 117-120, 2014), Ythdf2의 표적을 마우스 다분화능 조혈 전구세포주에서 적외선 U-가교결합 면역침전 시퀀싱(irCLIP-seq)을 수행하여 추가로 결정하였다(Pinto do et al. The EMBO Journal, 17: 5744-5756, 1998; Zarnegar et al. Nature Methods, 13: 489-492, 2016)(도 3a;도 11a 내지 도 11c). 그 결과는 Ythdf2 표적 mRNA의 57.8%가 m6A 피크를 함유하였음을 보여주었다(도 11d). Ythdf2 결합 부위는 보존된 m6A 모티프가 풍부하였고 m6A 분포 특징의 특성을 나타냈다(도 3b 및 도 3c). Ythdf2 표적 전사체의 유전자 온톨로지(gene ontology: GO) 분석은 조혈 또는 림프 기관 발달과 관련된 유전자의 풍부함을 밝혀냈고, 이는 조혈의 조절에 Ythdf2가 관여함을 시사한다(도 3d). 특히, Ythdf2가 m6A 피크와 크게 중첩되는 부위에서 Tal1 및 Gata2의 것과 같은 전사 인자 mRNA에 결합하였다는 것이 밝혀졌다(도 3e; 도 5e 및 표 S2, Ythdf2는 3개의 irCLIP-seq 복제물로부터의 mRNA를 표적으로 하였다). wt 및 Ythdf2 KO 마우스로부터의 LSK Flk2- 세포 내의 총 RNA 질량의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. m6A 변형이 포유동물 세포에서 아데노신 뉴클레오타이드의 0.1 내지 0.4%만을 구성하지만, Ythdf2 KO가 BM Lin- 세포로부터의 총 RNA 중 m6A 함량의 수준 증가를 야기하였다는 것이 밝혀졌으며, 이는 Ythdf2가 m6A-마크된 mRNA의 안정성을 특이적으로 조절함을 시사한다(도 12a 및 도 12b). 일관되게, 총 mRNA의 qPCR 분석은 Tal1, Gata2, Runx1 및 Stat5a의 수준 증가를 밝혀냈고, 이들의 mRNA는 wt 대조군과 비교하여 Ythdf2 KO LSK 세포에서 m6A에 의해 변형된 것으로 나타났다(도 3f). 단일 세포 면역형광 염색 및 세포내 유세포 분석은 Ythdf2 KO HSPC가 HSC 자가-재생에서 Ythdf2의 억제 역할을 가리키는 TAL1, GATA2, RUNX1 및 STAT5와 같은 줄기세포 자가-재생에 관여하는 m6A-표지된 전사 인자의 강도의 유의적인 증가를 나타냈다는 것을 추가로 밝혔다(도 3g; 도 12c). 이전의 연구는 Ythdf2가 결합된 mRNA를 mRNA 붕괴 부위로 국소화함으로써 RNA 대사를 조절한다는 것을 보여주었다(Wang et al. Nature, 505: 117-120, 2014). HSC 자가-재생을 조절하는 데 있어 Ythdf2의 메커니즘을 추가로 조사하기 위해, Tal1 mRNA의 형광 인 시츄 하이브리드화(FISH) 및 mRNA 붕괴 부위의 마커인 Dcp1a 및 Ythdf2의 형광 면역염색을 수행하였고(Sheth et al. Science, 30:805-808, 2003; Kedersha et al. Methods in Enzymology, 431: 61-81, 2007), 이들의 상대적 공간 분포를 분류된 wt 및 Ythdf2 KO HSPC에서 분석하였다. Tal1 mRNA, Dcp1a 및 Ythdf2의 공동국소화가 wt 세포에서 관찰된 반면, Ythdf2 KO 대조군에서는 실질적으로 감소되었다(도 3h 및 3i). 또한, wt 또는 Ythdf2 KO HSPC에서 Gata2 mRNA FISH를 Ythdf2 및 Dcp1a로 공동염색함으로써 유사한 관찰이 확인되었다(도 12d 및 도 12e). Tal1과 같은 증가된 전사 인자 발현이 Ythdf2 KO 마우스에서 HSC 증대의 이유가 되는지 여부를 결정하기 위해, wt 및 Ythdf2 KO LSK 세포에서 짧은 헤어핀(sh) RNA-매개 Tal1 넉다운(KD)을 사용하고 이어서 치사량의 방사선 조사된 수용자에게 이식하여 구제 실험을 수행하였다. HSPC 내의 Tal1의 고갈은 이전에 보고된 바와 같이 wt 세포의 재구성 능력을 유의적으로 손상시켰고 또한 Ythdf2 KO 세포의 증가된 생착을 구제하였다(도 12f). 전체적으로, 이들 데이터는 Ythdf2가 줄기세포 재생에 필수적인 전사 인자를 암호화하는 mRNA의 분해를 가능하게 함으로써 HSC 자기 재생을 조절한다는 것을 나타낸다.
실시예 A-4
m 6 A-seq 및 RNA-seq에 의해 인간 UCB HSPC에서의 Ythdf2의 역할을 상세히 분석하기.
단일 인간 제대혈 단위에서의 제한된 수의 HSC는 HSC 이식과 같은 임상 적용의 장애였다(Walasek et al. Annals of the New York Academy of Sciences, 1266: 138-150, 2012). Ythdf2 KO가 표현형 및 기능적 마우스 HSC의 증가를 초래하였다는 관찰은 Ythdf2 넉다운(KD)이 인간 UCB HSC 증대를 촉진할 수 있는지 여부에 대한 시험을 촉발하였다. 먼저, 3가지의 개별적 hUCB 샘플로부터 단리된 CD34+ 세포를 이용한 m6A-seq를 수행하였다(도 13a). m6A 변형은 주로 mRNA에서 발생하였고(약 95%), 우선적으로는 예상대로(약 90%) mRNA ORF 영역 내의 및 3'UTR 및 정지 코돈 근처에서 발생하였다(도 4a 및 도 4b; 도 13b). 마우스 및 hUCB HSPC에서 m6A 랜드 스케이프를 비교하였고, 2,239개의 유전자는 공통적으로 m6A 태그된 것으로 밝혀졌다(도 4c). 이러한 공통적으로 m6A-태그된 전사체는 조혈 및 줄기세포 유지와 관련된 유전자에 대해 풍부하였다(도 4d). 마우스 HSC 자가-재생을 담당하는 전사 인자의 mRNA 내 m6A 표지의 풍부화로 인해, 그 다음에 GO 용어 분석을 수행함으로써 hUCB CD34+ 세포의 m6A-마크된 전사 인자 전사체를 특성규명하였다. 722개의 동정된 m6A-표지된 전사 인자 mRNA 중에서, 주요 GO 용어는 세포 운명 수임 및 줄기세포 유지와 관련되었다(도 13c). 예를 들어, 생체외에서 과발현되면 인간 및 마우스 HSC를 증대시키는 것으로 보고된 HOXB4(Amsellem et al. Nature Medicine, 9: 1423-1427, 2003; Antonchuck et al. Cell, 109: 39-45, 2002)는 hUCB CD34+ 세포에서 m6A로 마크되었다(도 4e). HSC 자가-재생에 필요하고 다른 세포 유형으로부터 HSC를 유도하는데 중요한 다른 전사 인자(Ebina et al. The EMBO Journal, 34: 694-709, 2015; Galan-Caridad et al. Cell, 129: 345-357, 2007), 예컨대 Zfx, RUNX1 및 FOSB도 또한 hUCB CD34+ 세포에서 m6A-태그되었다(도 13f 및 도 13g 및 또한 리(Li) 등에 의한 논문["Supression of m6A Reader Ythdf2 Prmotd Hematopoeitic Stem Cell Expansion", Cell Research 28, 904-917 (2018)]의 보충 표 S3(상기 논문(및 이의 보충 표를 포함)은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다)를 참조, 개별 샘플로부터의 인간 UCB CD34+ HSPC에서 m6A로 마크된 유전자). 추가로 hUCB HSPC에서의 Ythdf2의 역할을 상세히 분석하기 위해, 대조군 또는 Ythdf2 KD hUCB CD34+ 세포를 이용하여 RNA-seq를 수행하였다(도 4f; 도 13d 및 도 13e). 놀랍게도, HOXB4 및 다른 HSC 자가-재생 관련 전사 인자를 포함하여 m6A로 마크된 전사체는, m6A 표지되지 않은 유전자에 대한 현저한 변화 없이, 대조군과 비교하여 YTHDF2 KD 세포에서 투입 mRNA 판독의 유의적인 증가를 보여주었다(도 4g 내지 도 4i; 도 13f 및 13g). 이러한 결과들은 RNA 분해를 통해 hUCB HSC 자가-재생을 조절하는 데 있어 Ythdf2의 역할을 뒷받침한다.
실시예 A-5
Ythdf2 KD에 의한 hUCB HSC의 증대.
Ythdf2의 억제가 인간 HSC를 증대시킬 수 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해, hUCB HSPC에서 짧은 헤어핀(sh) RNA-유도된 Ythdf2 KD를 상기와 같이 수행하였다(도 4f). 7일간의 생체외 배양 후, Ythdf2의 렌티바이러스 넉다운은 대조군 세포에 비해 각각 CD34+ CD38-CD45RA-EPCR+ 표현형 HSC의 빈도 및 절대 수의 평균 14.3배 및 13.6배 증가 및 CFU, 특히 가장 원시적인 CFU-과립구 적혈구 단핵구 거핵구(GEMM) 콜로니 유형 및 적혈구 돌발형성단위(BFU-E)의 5.1배 증가를 초래하였으며, 이는 YTHDF2 KD hUCB 세포에서 TAL1과 같은 조혈을 위한 주요 전사 인자의 높은 발현 수준을 반영한다(도 5a 내지 도 5d; 도 14a). 흥미롭게도, 아폽토시스율은, Ythdf2 KO 마우스에서의 HSC 경향과 유사하게, 대조군 세포에 비해 Ythdf2 KD hUCB HSPC에서 유의적으로 감소되었다(도 5e). 또한, 도 5f는 형질도입 10일 후 Ythdf2 넉다운(KD) HSC가 대조군 HSC와 비교하여 최대 10배 증가를 나타냈음을 도시한다. 그 다음, HSPC 기능에 미치는 과발현(OE) Ythdf2의 효과를 조사하였다. Ythdf2의 과발현은 hUCB HSPC의 클론원성 잠재성을 2.2배 감소시켰으며, 이는 Ythdf2가 생체외에서 HSC 유지를 음성적으로 조절함을 시사한다(도 14b 및 도 14c).
Ythdf2 KD가 생체내에서 인간 HSC를 증대시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 감염 후 4일차에 대조군 및 Ythdf2 shRNA로 감염된 hUCB CD34+ 세포로부터 분류된 GFP+ 세포를 이식함으로써 LDA를 수행하였다(도 6a). 이식 후 10주차에, 본 발명자들은 수용자 NOD/SCID Il2rg null(NSG) 마우스로부터의 BM 세포를 분석하고 생체내 증대 후 기능적 HSC 빈도를 측정하였다. 특히, 대조군과 비교하여, Ythdf2 KD 세포의 수용자는 각 계통의 비율의 변화 없이 BM에서 인간 조혈 세포(hCD45+ GFP+) 생착의 9배 증가를 나타냈다(도 6b 및 6ch; 도 15a 및 도 15b). Ythdf2 KD는 1차 수용자의 BM 내의 골수, 거핵구 및 적혈구의 백분율을 유의적으로 증가시켰다(도 15c). 따라서, Ythdf2 KD 세포에서의 HSC 빈도는 대조군 세포에서의 HSC 빈도에 비해 4.4배 증가한 것으로 밝혀졌다(도 6d). 재구성되고 자가-재생될 수 있는 Ythdf2 KD hUCB 세포의 장기적 능력이 확인되었다; 1차 수용자로부터의 BM을 아치사량의 방사선 조사된 2차 NSG 수용자 마우스로 이식한지 12주 후에, BM 내의 인간 조혈 세포 키메리즘(chimerism)은 대조군과 비교하여 Ythdf2 KD 그룹에서 더 높았다(도 6e, 도 6f; 도 15d). Ythdf2 KD 세포의 CRU는 대조군 세포의 CRU에 비해 8배 증가를 나타냈다(도 6g). 이들 데이터는 Ythdf2 KD가 생체외에서 표현형 hUCB HSC와 기능적 hUCB HSC 둘 다의 증대를 현저하게 촉진한다는 것을 입증한다.
실시예 A-6
본원의 실시예는 m6A 판독인자인 Ythdf2의 조건부 결실이 계통 편향 없이 표현형 HSC 및 기능적 HSC의 증대를 야기한다는 것을 입증한다. 생체내 중간엽 줄기세포에서 수반된 증가가 있는지를 조사하기 위해, Ytdhf2f/f 마우스를 Mx1-Cre 마우스와 교배시켜 중간엽 세포로부터의 Ythdf2 발현을 조건부로 결실시켰다. pI:pC 주사 9개월 후에 골수 세포를 Ythdf2KO 및 이의 야생형 동복자로부터 단리하였다. 총 골수 세포의 단일-세포 현탁액을 유동 항체로 면역염색하였다. 조혈(CD45, Ter119) 및 내피 세포(CD31)는 특이적 마커를 사용하여 배제시켰다. 총 골수 간질세포 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 N-카데린 및 CD105 항체를 포함시켜 추가 정제하였다. N-카데린+ 및 CD105+ 둘 다를 마크하는 중간엽 줄기세포를 정량하였다. Ythdf2의 조건부 결실은 중간엽 줄기세포의 빈도의 3.6배 증대를 야기하였다(도 16). 본 발명자들의 연구는 Ythdf2의 손실이 생체내에서 골수 중간엽 줄기세포를 증대시킬 수 있음을 입증한다.
논의
최근의 연구들이 mRNA m6A 변형의 생물학적 기능을 조사하고 있지만(Zheng et al. Molecular Cell, 49: 18-29, 2013; Zhou et al. Nature, 526: 591-594, 2015; Alarcon et al. Cell, 162: 1299-1308, 2015; Zhang et al. Cancer Cell, 31: 591-606 e596, 2017; Lence et al. Nature, 540: 242-247, 2016; Haussmann et al. Nature, 540: 301-302, 2016; Chen et al. Cell Stem Cell, 16: 289-301, 2015; Alarcon et al. Nature, 519: 482-485, 2015; Xiao et al. Molecular Cell, 61: 507-519, 2016; Wojtas et al. Molecular Cell, 68: 374-387 e312, 2017; Ivanovna et al. Molecular Cell, 67: 1059-1067 e1054, 2017; Fustin et al. Cell, 155: 793-806, 2013; Slobodin et al. Cell, 169: 326-337 e312, 2017; Schwartz et al. Cell, 159: 148-162, 2014; Pendleton et al. Cell, 169: 824-835 e814, 2017; Shi et al. Cell Research, 27: 315-328, 2017; Huang et al. Nature Cell Biology, 20: 285-295, 2018; Bertero et al. Nature, 2018; Liu et al. Nature, 518: 560-564, 2015), 본원의 실시형태는 전사 후 m6A 변형을 자가-재생을 위한 주요 전사 인자를 암호화하는 mRNA의 분해에 커플링시킴으로써 Ythdf2가 인간 및 마우스 HSC 자가-재생의 중요한 조절인자라고 밝히고 있다. 마우스 HSPC 및 hUCB HSC에서 Ythdf2의 억제는 자가-재생에 중요한 다수의 주요 TF의 증가된 발현을 야기할 수 있으며, 이를 통해 현저한 계통 편향 및 백혈병 잠재성 없이 표현형 HSC와 기능적 HSC 둘 다의 생체외 증대를 촉진할 수 있다. 또한, Mx1-cre가 중간엽 간질세포에서 활성화될 수 있기 때문에, 줄기세포 니치는 어느 정도까지 Ythdf2 억제-매개 마우스 HSC 증대에 기여할 수 있다. 중간엽 줄기세포(MSC)에 대한 Ythdf2의 기능 및 HSC와 MSC 둘 다에서의 Ythdf2의 억제가 생체내에서 어떻게 HSC를 상승적으로 증대시킬 수 있는지를 연구하는 것은 매우 흥미로울 것이다.
mRNA 스플라이싱, 번역 및 pri-miRNA 프로세싱에 미치는 m6A 기록인자 복합체 Mettl3 및 Mettl14의 광범위하고 복잡한 영향을 고려하면(Barbieri et al. Nature,, 2017; Alarcon et al. Nature, 519: 482-485, 2015; Liu et al. Nature, 518: 560-564, 2015), Mettl3 또는 Mettl14 고갈은 정상 줄기세포 및 백혈병에서 확실한 결과를 초래한다. 최근의 연구들은 Mettl3 및 Mettl14가 백혈병 발병 및 백혈병 줄기세포 유지에 필수적인 역할을 한다는 것을 입증하였다(Vu et al. Nature Medicine, 2017; Barbieri et al. Nature, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199, 2018). 대조적으로, Ythdf2는 주로 m6A-매개 mRNA 붕괴에 관여하는 것으로 여겨진다(Batista et al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014; Yoon et al. Cell, 2017; Zhang et al. Nature, 549: 273-276, 2017; Wang et al. Nature, 505: 117-120, 2014). 본원의 특정의 실시형태에 따르면, Ythdf2의 조정은 mRNA 프로세싱의 다른 측면에 영향을 미치지 않으면서 줄기세포 자가-재생에 중요한 TF를 암호화하는 특이적 m6A-마크된 mRNA의 반감기를 연장시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 본원의 실시예는 HSC 내의 Ythdf2 고갈이 계통 수임을 왜곡시키지도 않고 혈액 악성 종양을 유도하지도 않음으로써 증대된 HSC로 인한 백혈병유발 위험을 감소시킨다는 것을 보여준다. 게다가, 줄기세포 자가-재생은 세포 분열, 생존, 분화 방지 및 줄기세포능(stemness) 유지로 구성된 복잡한 과정이다. Ythdf2-결함 HSC가 더 낮은 아폽토시스율을 나타냈다는 관찰은 본원의 방법의 실시형태들이 줄기세포 자가-재생의 다른 특징에도 이롭다는 것을 나타낸다.
hUCB HSC 이식을 사용하는 데 있어 주요 제한은 하나의 hUCB 단위 내의 불충분한 HSC 수이다. 비록 이전 연구들은 Dlk1, SR1, Musashi2 및 UM171이 Notch, AHR 신호 전달 또는 다른 미지의 경로를 표적화함으로써 hUCB HSC를 증대시킬 수 있음을 밝혔다(Boitano et al. Science, 329: 1345-1348, 2010; Fares et al. Science, 345: 1509-1512, 2014; Rentas et al. Nature, 532: 508-511, 2016; Chou et al. Experimental HematologyI, 41: 479-490 e474, 2013). 따라서, 본원의 실시형태는 HSC 자가-재생에 중요한 다수의 주요 TF를 표적화하고 HSC의 증대를 향상시키는 신규한 강력한 방식을 제공한다. 예를 들어, 소형 화학물질 또는 AAV-매개 KD를 통해 시험관내 배양 동안의 Ythdf2 수준 및 기능을 감소시키는 것은 생체내 이식 후 Ythdf2 수준 및 기능이 복구될 수 있게 하고, 따라서 인간 환자의 정상적인 HSC 유지 및 기능에 영향을 미치지 않는다. 또한, 특정의 실시형태에서, 본원에 설명된 방법은 인간 HSC뿐만 아니라 다른 줄기세포의 증대를 촉진하기 위해 다른 방법과 조합되어 줄기세포-기반 요법을 위한 접근법을 제공할 수 있다.
실시예 B
하기 프로토콜은 하기 "B" 실시예에서 사용되었다.
동물. C57BL/6-Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/J(iDTR), B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-td토마토)Hze/J(R26RtdT), Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J, Cxcl12tm2.1Sjm/J, Kitltm2.1Sjm/J (SCFf/f), Cxcl12tm1.1Sjm/J(CXCL12f/f) 마우스는 잭슨 래보러터리(Jackson Laboratory)로부터 입수하였다. N-cad-CreER T 및 N-cad-TdT 마우스는 어플라이드 스템셀사(Applied StemCell, Inc.)에 의해 생성되었다. N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스를 유도하기 위해, 타목시펜(Sigma)을 3일 동안 주사당 2mg으로 복강내 주사하였다. N-cad-CreER T ; R26-tdT를 배아 단계에서 유도하기 위해, 단일 용량의 1.5mg TMX를 E12.5 임신한 어미에게 복강내로(IP) 주사하였다. 제왕절개를 E19.5에서 수행하고 신생아 마우스를 위탁 마우스에게 옮겨주었다. N-cad-CreER T ;iDTR 마우스에서 N-Cad+ 세포 제거를 유도하기 위해, DT(Sigma)를 지시된 바와 같이 체중 1g당 50ng의 용량으로 격일로 복강내 주사하였다. 5FU(Sigma-Aldrich)를 체중 1g당 150㎍로 꼬리 정맥에 1회 주사하였다. 5FU 주사 후, 마우스를 본문에 설명된 바와 같이 분석하였다. 본 연구에 사용된 모든 마우스 스트레인은 C57BL/6J 유전자 배경을 가졌다. 동물을 유전자형 분석 결과에 따라 실험에 무작위로 포함시켰다. 동물 실험은 연구자에 대해 맹검 방식으로 수행하였다. 실험당 사용된 동물의 수는 도면 범례에 명시되어 있다. 본 연구에 사용된 모든 마우스는 스토워스의학연구소(SIMR)의 동물 시설에서 사육되었으며 SIMR 및 미국국립보건원(National Institutes of Health: NIH) 지침에 따라 취급되었다. 모든 절차는 SIMR의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인되었다.
유세포계측. 표현형 분석을 위해, 조혈 세포를 골수(대퇴골 및 경골)로부터 수거하였다. 적혈구를 0.16M 염화암모늄 용액을 사용하여 용해시켰다. 세포 표면 표현형 분석을 위해, 항-CD3(145-2C11), 항-CD4(RM4-5), 항-CD8(53-6.7), 항-Mac-1 (M1/70), 항-Gr1(RB6-8C5), 항-B220(RA3-6B2), 항-IgM(II/41) 및 항-TER119(TER-119)(백만 골수 세포당 100ng 항체 칵테일, eBioscience)를 포함하는 계통 칵테일(Lin, 피코에리트린(PE)-Cy5)을 사용하였다. 지시된 경우에 SCA1(D7, eBioscience), c-KIT(2B8, eBioscience), FLK2(A2F10, eBioscience), CD34(RAM34, eBioscience), CD48(HM48-1, eBioscience), CD150(TC15-12F12.2, BioLegend) 및 CD49b(HMα2, Biolegend)에 대한 모노클로날 항체(모두 백만 골수 세포당 50ng로서 사용됨)를 또한 사용하였다. 말초혈의 계통 분석을 위해, CD45.1(A20, eBioscience), CD45.2(104, eBioscience), CD3, B220, Mac-1 및 Gr1에 대한 모노클로날 항체를 사용하였다. 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD) (A1310, Life technologies)를 사용하여 사멸된 세포를 배제시켰다. 간질 니치 세포 분석을 위해, CD45(30-F11, eBioscience), CD31(390, eBioscience), PDGFRα-바이오틴(APB5, eBioscience), LepR-Bio(R & D), CD51(클론 RM7-V, Biolegend). 바이오틴 접합된 항체로 염색된 샘플을 염색 배지로 세척한 다음, 스트렙타비딘 브릴리언트 바이올렛 421TM(Biolegend, 1:500)과 함께 항온배양하였다. 세포 분류 및 분석은 MoFlo(Dako), InFlux Cell Sorter(BD Biosciences), MACSQuant(Miltenyi Biotec) 또는 CyAn ADP(Dako) 기기를 사용하여 수행하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
홀마운트 흉골 HSC 면역염색. 흉골을 수집하고 수술용 칼을 이용하여 3 내지 4개의 단편으로 횡절단하였다. 단편을 시상 2등분하여 골수 강을 노출시키고 4% PFA에 고정시키고, 20% 정상 염소 혈청 및 0.5% Triton X-100을 함유하는 PBS에서 차단/투과화시키고 3일 동안 1차 항체로 염색하였다. 조직을 2차 항체와 함께 2시간 동안 항온배양하였다(Bruns et al., 2014; Kunisaki et al., 2013). 회전-디스크 공초점 시스템(CSU-X1; Yokogawa Corporation)에 부착된 도립현미경(Axiovert 200 M; Carl Zeiss Microimaging, 독일 예나)을 포함하는 회전-디스크 공초점 현미경(UltraVIEW; PerkinElmer) 및 속도 획득 소프트웨어(PerkinElmer) 및 20x/0.8 Plan-Apochromat 대물렌즈(Carl Zeiss)를 갖춘 Orca-R2 카메라(Hamamatsu)에서 형광 이미지화를 수행하였다. 이미지는 단계 크기가 4㎛인 일련의 광학 섹션으로서 수집되었다. 이미지를 전체 샘플을 덮기에 충분한 타일 패턴(오버랩 10%)에서 수집하였다. 채널을 순차적으로 수집하였다. (청색 염료)는 405nm 광(50mW 다이오드 레이저, OEM)을 사용하여 여기시켰고, (적색 염료)는 561nm 광 (50mW 고체 상태 레이저, OEM)을 사용하여 여기시켰으며, 각각 415nm 내지 775nm 580nm 내지 650nm 대역의 다중 대역 통과 방출 필터를 사용하여 수집하였다. (녹색 염료)는 488nm 광(50mW 고체 레이저, OEM)을 사용하여 여기시키고 500nm 내지 550nm의 다중 대역 통과 방출 필터를 사용하여 수집하였으며, (원 적색(far red) 염료)는 640nm 광 (50mW 고체 상태 레이저, OEM)을 사용하여 여기시켰고 455nm 내지 515nm 및 660nm 내지 750nm의 다중 대역 통과 방출 필터를 사용하여 수집하였다. 염색의 변동을 보상하기 위해 노출 시간과 레이저 출력을 조정하였다.
제2 고조파 발생(SHG) 이미지화는 형광 이미지화 직후에 수행하였다. SHG 이미지를 QUASAR 검출 유닛, 10× 0.45 Plan-Apochromat 대물렌즈(Carl Zeiss) 및 Zen 2012 획득 소프트웨어(v8.1.3, Carl Zeiss)가 장착된 LSM-780 레이저 주사 공초점 현미경(Carl Zeiss)에서 수집하였다. 이미지는 단계 크기가 4㎛이고 픽셀 크기가 형광 픽셀 크기의 4배 정수배인 일련의 광학 섹션으로서 수집하였다. SHG 이미지는 900 nm의 레이저 광 파장으로 촬영하였고 375 내지 420 nm에서 수집하였다. 이미지 정렬에 대한 참조로서, Cd150-PE의 이미지를 DPSS 레이저(Melles Griot)의 561nm 라인을 사용하여 촬영하였으며 SHG 이미지과 동시에 566 내지 735nm에서 수집하였다. 이미지를 전체 샘플을 덮기에 충분한 타일 패턴(중첩 없음)에서 수집하였다. 타일은 Zen 소프트웨어를 사용하여 완전한 3D 이미지로 스티칭(stitching)하였다.
Fiji 소프트웨어(1.51g National Institutes of Health)를 사용하여 이미지를 분석하였다. SHG와 형광 이미지를 정렬하기 위해, 형광 이미지에서 먼저 배경을 공제하고 이미지 타일을 Grid/Collection 스티칭 플러그인(참조 http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/25/11/1463.abstract)을 사용하여 완전한 3D 이미지로 스티칭하였다. 형광 현미경으로부터 SHG 현미경으로의 샘플 이동이 소량의 샘플 회전을 수반한다는 것을 고려하면, SHG 및 형광 이미지를 3차원으로 재정렬할 필요가 있었다. SHG 및 형광 이미지 세트의 정렬은 http://research.stowers.org/imagejplugins에서 이용가능한 사용자 정의 플러그인을 사용하여 수행하였다. 먼저, SHG 및 형광 데이터 세트 둘 다의 육안 검사에 의해 최소 8개의 공통 랜드마크를 동정하였다. 그 다음, Kabsch 알고리즘을 사용하여 형광 좌표를 SHG 이미지 좌표로 변환하기 위한 최상의 스케일링된 회전을 찾아내었다. 마지막으로, 형광 이미지의 각 3D 복셀을 해당 SHG 위치로 변환하고 삼선형 보간법을 사용하여 해당 위치에서 SHG 강도를 찾아내어 재정렬된 합성 이미지를 생성하였다.
본 연구의 가설에 익숙하지 않은 연구자들에 의해 이미지 분석이 수행되었다. HSC는 육안으로 동정되었다. 세포의 형상을 육안으로 식별할 수 없는 경우 또는 세포의 형상이 양성 신호의 필드 내에서 어두운 영역을 형성한 경우, 세포는 염색에 대해 음성인 것으로 간주되었다. 니치 구성성분까지의 거리 측정을 Fiji 및 Microsoft Excel 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. HSC의 위치 및 3가지 니치 구성성분 각각의 최근접 점은 Fiji에서 점 ROI를 사용하여 표시하였고, 위치는 엑셀로 전송되었으며, 이어서 3D 거리가 3D 피타고라스 정리를 사용하여 계산되었다. 무작위로 분포된 HSC의 거리를 계산하기 위해, 관찰된 HSC에 대해 분석된 동일한 이미지에서 FIJI의 사용자 정의 플러그인을 사용하여 무작위 포인트 ROI를 생성하였다. 무작위로 생성된 포인트는 이것이 합리적인 HSC 위치에 나타난 경우(주변 영역 내의 Lin+ 세포의 존재에 의해 평가됨) 모의(simulated) HSC로 간주된다. 모의 HSC에 대한 니치 거리 측정은 관찰된 HSC에 대한 것과 동일한 방식으로 이루어졌다.
거리 분포의 차이의 통계적 유의성은 Origin 소프트웨어를 사용하여 콜모고로프-스미르노프(Kolmogorov-Smirnov) 분석에 의해 평가하였다. 5㎛에서 HSC 백분율의 변화의 통계적 유의성은 Microsoft Excel에서 스튜던트 T검정(Student's T test)을 사용하여 평가하였다. P <0.05이면 변화가 유의적인 것으로 간주하였다.
도면에 도시된 최종 이미지는 명료성을 위해 배경 공제되고 대비가 조정된 최대 투영이다.
이식 및 재증식 검정. 1.0×105 CD45.1 구제 골수 세포와 함께 100개의 분류된 pHSC 또는 rHSC 세포를 치사량의 방사선 조사된(10 Gy) CD45.1 수용자에게 이식하였다. N-cad-CreER T ;iDTR 및 대조군 마우스로부터의 2.0×105 CD45.2 BM 세포를 2.0×105 CD45.1 구제 골수 세포와 함께 치사량의 방사선 조사된(10 Gy) CD45.1 수용자에게 이식하였다. 이식 후 4주마다, 하악하 정맥으로부터 말초혈을 수집하였다. 공여자-유래 혈액 세포(CD45.2)로부터 조혈 재증식을 측정하였다.
RNA 시퀀싱 및 분석. SMARTer Ultra Low Input RNA 키트(Clonetech)를 사용하여 1000개의 정제된 세포로부터 cDNA를 생성하고, Nextera XT DNA 라이브러리 제조 키트(Illumina)에 의해 라이브러리를 생성한 후, Illumina HiSeq2500에서 50bp 단일 판독에 대한 시퀀싱을 수행하였다. 미가공 판독을 Illumina bcl2fastq2 v2.18을 사용하여 Fastq 포맷으로 역다중화하여 최대 하나의 미스매치가 허용될 수 있게 하였다. 판독을 TopHat v2.0.13 데폴트 파라미터를 이용하여 UCSC 게놈 mm10에 대해 정렬하였다. FPKM 값은 "-u max-bundle-frags 100000000"과 함께 Cufflinks v2.2.1을 사용하여 생성하였다. 판독 계수는 "-m cross-nonempty"와 함께 HTSeq-count를 사용하여 생성하였다. 각 집단마다 3개 또는 4개의 복제물을 시퀀싱하였다. 데이터는 NCBI GEO:GSE104887에서 액세스 가능하다.
CFU-F 검정 및 시험관내 분화. 세포를 96웰 플레이트에서 배양물 내로 직접 분류하였다. 배양물을 7 내지 10일 동안 5% O2 및 10% CO2를 함유한 가습된 대기에서 37℃에서 항온배양하였다. 콜로니를 CellTracker™ Green CMFDA(Life technologies)에 의해 염색하고 Celigo Imaging Cytometer(Nexcelom)에 의해 영상을 획득하였다. 시험관내 분화를 위해, 클론적으로 증대된 Ncad-CreERT 구동 토마토+ BM/골 간질세포를 0.25% 트립신/EDTA로 분해하여 CFU-F 배양물로부터 단리하고, 3개의 분취액으로 나누고, 분화를 허용하는 별도의 배양물에 시딩하였다: StemPro 골형성 키트 Gibco A10072-01, 지방형성 키트 A10070-01 및 연골형성 분화 키트 A10071-01. 골모세포 분화는 VECTOR 레드 알칼리 포스파타제에 의해 평가하였다; 지방형성 분화는 오일 레드 O(Sigma)에 의해 검출하였다; 연골형성 분화는 톨루이딘 블루(Sigma, 0.1g T 블루/100mL 증류수)에 의해 검출하였다.
골 절편, 면역염색 및 이미지화.
새로 단리된 대퇴골을 4% 파라포름알데히드에 밤새 고정시킨 후, 10% EDTA에서 1 내지 3일간 탈석회화를 수행하였다. 파라핀 절편의 경우, 골 샘플을 Sakura Tissue Tek VIP 5 조직 프로세서(Sakura America, 캘리포니아주 토런스)로 가공하고, 파라핀 절편을 5 um 두께로 절단하였다. 절편을 자일렌으로 탈파라핀화한 후, 알시안 블루/헤마톡실린/오렌지 G 염색을 수행하였다. 동결된 절편의 경우, 골 샘플을 CryoJane 테이프-전달 시스템으로 가공하였다. 절편을 Power Block™ 범용 차단 시약으로 30분 내지 1시간 동안 차단한 다음, 토끼-항-아그레칸(Millipore, 1:300), 토끼-항-페릴리핀(Cell Signaling, 1:300) 및 염소-항-오스테오폰틴(R&D, 1:300)으로 밤새 염색하였다. 당나귀-항-염소 Alexa Fluor 488 및 당나귀-항-염소 Alexa Fluor 647을 2차 항체로서 사용하였다(모두 제조원: Invitrogen, 1:300). 항체를 항체 희석 용액(Invitrogen 00-3218)으로 희석시켰다. 슬라이드를 FLUORO-GEL(Electron Microscopy Science 1798510)로 봉입하였고, Olympus 슬라이드 스캐너로 이미지를 획득하였다.
대퇴 고랑 수술. 마우스를 2.5% 이소플루란으로 마취시키고, 진통을 위해 부프레노르핀을 투여하였다. 우측 다리의 피부를 면도하고 알코올과 요오드로 문질렀다. 무릎 관절 측면의 피부에 작은 절개부를 만들었다. 가시화를 위해 피부를 내측으로 미끄러져 들어가게 한 후, 내부 절개부를 내측에서 슬개골쪽으로 만들어서 슬개건을 따라서 대퇴근까지 연장시킴으로써 조직을 방출시켰다. 슬개골을 측면에서 부분이탈시키고, 원위 대퇴골을 노출시켰다. 미세 톱날(microsaw)을 사용하여 연골하 골을 천공시켜 무릎 관절에서 관절연골을 관통하도록 하였다. 신전근 메커니즘(사두근, 슬개건 및 슬개골)을 이의 본래의 해부학적 위치로 되돌렸다. 내부 절개부는 흡수성 봉합사로 봉합하고, 피부는 비흡수성 봉합사로 봉합하였다.
통계.
값은 평균±s.e.m으로서 나타낸다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 5(GraphPad 소프트웨어)를 사용하여 생성하였다. 두 그룹을 비교하기 위해 스튜던트 t검정을 사용하였다. 통계적 유의성은 p <0.05로서 정의되었다.
실시예 B-1
마우스 골수에서 기능적으로 구별되는 예비 HSC 및 프라이밍된 HSC(primed HSC). 예비 HSC(이하, rHSC(들)) 하위집단을 조사하기 위해, 중기적 HSC를 영구 장기적 HSC(LT-HSC)와 구별할 수 있는 세포 표면 마커 CD49b(인테그린 α2)를 개조하였다(Benveniste et al., 2010; Qian et al., 2015; Wagers and Weissman, 2005; Yang et al., 2005). 흥미롭게도, 통상적인 LT-HSC(CD34-Flk2-계통- Sca-1+c-Kit+ (LSK) 세포)에만 존재하고 단기적 HSC(ST-HSC) 또는 다분화능 선조세포(MPP; CD34+ FLK2+ LSK)에는 존재하지 않는 CD48-CD49b- 하위집단이 발견되었다. CD48- CD49b- LT-HSC 하위집단은 rHSC를 풍부하게 하고 CD48-CD49b+ LT-HSC 하위집단은 프라이밍된 HSC(이하 pHSC(들))를 풍부하게 한다는 것이 제안되었고(도 17a) 재증식 검정으로 시험되었다. rHSCs와 pHSCs 둘 다는, 이전의 보고서(Benveniste et al., 2010)와 일치하여, 유의적인 차이 없이 이식 후 최대 40주 동안 치사량의 방사선 조사된 마우스에서 조혈을 지지하는 것으로 밝혀졌다(도 17b) . 그러나, 이식된 pHSC는 이식된 rHSC에 비해 수용자에서 rHSC(95.4% 감소)뿐만 아니라 ST-HSC 및 MPP(두 집단 모두의 경우 약 78% 감소)를 생성시키는 데 있어 효율이 매우 낮았으며, 이는 rHSC가 pHSC보다 계층적으로 우선한다는 것을 시사한다(도 17c). Scl-tTA-유도된 H2B-GFP 표지-보유 모델을 사용하여, rHSC가 pHSC와 비교하여 더 많은 H2B-GFP고 세포를 유의적으로 풍부하게 한다는 것이 밝혀졌으며(P=0.0039), 이는 rHSC가 pHSC에 비해 더 느린 세포주기를 갖는다는 것을 나타낸다(도 17d). 분자적으로, rHSC는 모두 HSC의 G0기 유지에 관여하는 Gadd45g, Cdkn1c(p57을 암호화함) 및 Foxo1의 발현은 더 높고 Myc, Pcna, Ccng2 및 Cdk4와 같은 세포주기 활성화인자의 발현은 더 낮은 것으로 밝혀졌다. rHSC와 pHSC 간에 Ki67 발현의 차이는 없었으며, 이는 Ki67 발현만으로는 2가지 HSC 하위집단을 구별하기에 불충분하다는 것을 나타낸다(도 17e).
rHSC에 대한 기능적 정의는 약물-내성이기 때문에, rHSC 또는 pHSC를 수용자 마우스에게 이식하고, 이식 후 4주차에 마우스에게 5FU를 시험투여(challenge)하였다. 도 17f에 도시된 바와 같이, rHSC는 5FU 처리에 민감하지 않았다; 그러나, pHSC는 이들의 재구성 능력을 크게 감소시켰다(이식 후 20주차에 44% 감소). 종합하면, 데이터는 CD48-CD49b- LT-HSC가 화학요법 치료에 내성인 rHSC를 실제로 풍부하게 하는 반면, CD48-CD49b+ LT-HSC는 화학요법에 민감한 pHSC를 풍부하게 하였다는 것을 나타냈다; 또한, 전자는 이식 검정에서 후자를 발생시켰지만 그 반대는 아니었다.
rHSC 및 pHSC에 대한 급성 5FU 시험투여의 직접적인 결과를 추가로 분석하였다. 17g에 도시된 바와 같이, 5FU 후 3일차에 약 92%의 pHSC가 제거되었고 rHSC만이 생존하였으며, 이는 rHSC가 화학요법 스트레스를 극복하기 위해 이의 DNA 복구 시스템을 특이적으로 작동시켰음이 틀림없다는 것을 시사한다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 5FU 처리 후 rHSC, pHSC 및 rHSC 내의 DNA 손상 반응 유전자의 전사체 프로파일링을 분석하였다. rHSC는 항상성 동안 pHSC와 비교하여 DNA 손상 복구 시스템에 관여하는 유전자의 더 낮은 발현을 유지하였지만(도 17h) DNA 미스매치 복구(MMR), 뉴클레오타이드 절제 복구(NER), 염기 절제 복구(BER) 및 상동 재조합(HR)과 같은 대부분의 DNA 복구 경로는 5FU 시험투여 하에 rHSC에서 유의적으로 활성화된 것으로 관찰되었다(도 17i). 게다가, 주로 Hsp90 및 Hsp70 패밀리에 속하는 수많은 스트레스 반응 유전자(Rodina et al., 2016)도 동시에 상향조절되었고(각각 1.8±0.17배 및 1.4±0.1배)(도 17j), 이것은 rHSC가 어떻게 화학요법 스트레스 하에 생존하였고 조혈 시스템을 재구성하였는지를 부분적으로 설명하였다.
종합하면, pHSC와 rHSC의 공존이 BM에서 기능적으로 입증되었다. 휴지 상태 및 활성 DNA-복구 경로에 의해서도 pHSC는 화학요법에 여전히 민감한 반면, rHSC는 이의 DNA 손상 복구 및 스트레스 반응 유전자를 활성화시켜 화학요법 스트레스에서 생존하고 pHSC를 발생시켰다; 따라서, rHSC는 극심한 스트레스 하에 조혈 재생을 지지하는 데 있어 중요한 역할을 한다.
실시예 B-2
약물-내성 rHSC는 주로 골수의 골내막 영역에 위치한다
BM 니치로부터의 외인성 메커니즘이 지혈 동안 및 화학요법 스트레스 하에서 rHSC 유지에 기여하였는지 여부를 추가로 조사하였다. 이를 위해, 홀마운트 HSC 염색을 수행하였으며, 이는 약 75㎛ 두께의 골 공동 내에서 골, 거핵구(MK) 또는 혈관에 대한 rHSC 및 pHSC의 상대적 분포를 동시에 검출하였다(제2 고조파 생성, SHG에 의해 달성됨)(도 18a 내지 도 18b). 본 발명자들의 정량 데이터는 대량의 HSC 집단이 혈관주위 및 굴모양 구역에 있다는 이전의 보고(Acar et al., 2015; Bruns et al., 2014; Chen et al., 2016; Zhao et al., 2014)와 일치하여, 43.4% rHSC 및 31.0% pHSC가 혈관으로부터 10㎛ 거리 이내에 위치하고 22.6% rHSC 및 24.6% pHSC가 MK로부터 10㎛ 이내에 위치하였음을 보여주었다(도 18c 내지 도 18d). 흥미롭게도,단지 3.69%의 pHSC에 비해 16.4% rHSC가 골 표면으로부터 10㎛ 이내에 위치하였다는 것이 주지되었다(도 2e). 이들 데이터는 rHSC 및 pHSC 둘 다가 혈관 및 MK에 편향 없이 분포되었지만 rHSC가 pHSC와 비교하여 골내막 골 표면에 유의적으로 더 가깝게 위치하였음을 보여주었다(P=0.00182).
화학요법 스트레스 동안 골내막 영역이 rHSC를 보존하였는지 여부를 시험하기 위해, pHSC가 제거될 때 5FU 처리 후 3일차에 rHSC의 분포를 조사하였다(도 18b). 흥미롭게도, 본 발명자들은 생존 rHSC의 약 55%가 급성 5FU 스트레스시 골내막 니치에 의해 보존되었으며, 이는 항상성과 비교하여 약 3.5배 풍부한 것임을 발견하였다(도 18e). 그러나, 혈관 또는 MK 근처에서 관찰된 생존 rHSC의 빈도에서는 유의차가 없었다(도 18c 내지 도 18d). 일관되게, 도 17g에 도시된 바와 같이, pHSC의 4.24%만이 급성 5FU 스트레스에서 생존한 것으로 관찰되었다. 그 다음, BrdU-표지된 생존 및 증식 세포를 조사하여 BM 손상의 동적 과정 및 5FU 스트레스 후의 후속적인 회복을 연구하였다. 5FU 처리 후 2일차에 BrdU-표지된 세포의 대량 손실이 있음이 주지되었고, 이는 5FU에 의해 유도된 활발한 아폽토시스를 나타낸다. 5FU 처리 후 3일차에, 생존 BrdU+ 세포(주로 단일 세포)가 골내막 영역의 골 내층 세포에 인접하여 주로 검출된 것으로 관찰되었다(도 24a 내지 도 24d). 3.5일차에, BrdU+ 세포의 쌍이 골내막 표면에 출현하였다는 것이 관찰되었으며, 이는 생존 세포의 활성화 및 분열을 나타낸다. 4일차 및 5일차에 시작하여 계속해서, 증식하는 세포의 수가 점진적으로 증가하였으며, 이들 세포는 혈관 또는 잠재적 지방세포 구조 가까이에서 군집으로서 매우 빈번히 검출되었다(4일차에 약 55% 및 6일차에 약 65%)(도 24e 내지 도 24i). 이러한 관찰은 골 표면이 5FU 후에 세포가 처음으로 생존한 니치였음을 시사한다. 이어서, 이들 세포는 활성화되어 딸 세포를 생성하였으며, 후자는 주로 혈관에서 또는 거핵구에 인접하여 증대되었다(Zhao et al., 2014). 생존 5FU-rHSC가 골 표면에 인접하여 단일 세포로서 실제로 검출되었고 증식 HSC가 종종 MK와 연관되거나 혈관 근처에 있다는 것이 추가로 확인되었다. 5FU 처리 후 3일차에 생존 rHSC(녹색, CD150+ Lin-CD49b-)는 종종 골 표면(흰색, SHG)에 인접하여 단일 세포로서 검출되었으며, 증식하는 HSC는 종종 MK(CD150+ Lin+)와 연관되거나 혈관(적색, CD31+) 근처에 있었다(도 29).
골 표면의 N-cad+ 전-골모세포는 내성이 있는 것으로 밝혀진 반면, Osx+ 골모세포는 5FU 처리에 민감한 것으로 밝혀졌고 N-cad+ 간질세포는 5FU 처리 후 회복 동안 Osx+ 골모세포를 생성하는 것으로 밝혀졌다(Sugimura et al., 2012). 최근의 연구는 방사선 조사 1일 후 세포 사멸로 인해 중심 골수의 LepR+ 간질세포가 극적으로 고갈되었음을 보여주었다(Zhou et al., 2017). 혈관 및 골내막 니치에서의 초기 변화를 추적하기 위해, 5FU 처리 후 1일차에 아폽토시스 검정을 수행하였다. 아폽토시스성 CD31+VE-카데린+ 세포는, 5FU 후 파괴된 혈관 구조에 대한 이전의 보고(Dominici et al., 2009; Sugimura et al., 2012)와 일치하여, 5FU 후 1일차에 크게 증가한 것으로 밝혀졌다(도 18f). 골내막 니치를 연구하기 위해, 토마토+ 세포가 중심 골수와 골 표면 둘 다에서의 N-cad 발현을 보고하는 N-cad-td토마토(N-cad-TdT) 마우스 주를 확립하였다(도 24j). 중심 골수 내의 아폽토시스성 N-Cad 구동 토마토+ 세포의 현저한 증가가 관찰된 반면, 골내막 구역 내의 토마토+ 세포는 5FU 후 1일차에 안정하게 유지되었다(도 18g). 5FU 처리 후 3일차에 조혈 재생이 시작되었을 때, 중심 골수 내의 N-Cad 구동 토마토+ 세포뿐만 아니라 골 표면 내의 N-Cad 구동 토마토+ 세포는 각각 2.2배 및 1.7배 증가하였다(도 18h, 도 24k). CD31+ 혈관 세포의 수 또한 증가하였지만, 팽창되고 손상된 구조를 나타냈다(도 18i). 종합하면, 이전의 보고서와 본 데이터는 혈관, 및 LepR+ 및 N-cad+ 세포를 포함하는 혈관주위 니치의 연관된 간질세포가 즉각적인 손상을 입었고 5FU 스트레스에 민감한 반면, N-cad+ 골내막 간질세포는 안정적으로 유지되었다는 것을 보여주었다.
본 데이터는 대부분의 HSC가 혈관주위 및 굴모양 구역에 주로 분포되어 있다는 이전의 조사결과를 부분적으로 설명한다(Acar et al., 2015; Chen et al., 2016; Kunisaki et al., 2013). 휴지 HSC 집단의 51.3%를 차지하는 pHSC는 항상성 하에 혈관주위 및 굴모양 구역 근처에 있다. 그러나, 스트레스 하에, 골 표면에 더 가까이 있는 rHSC가 화학요법 스트레스에서 생존한다. 종합적으로, 본 데이터는 골내막 니치가 화학요법으로부터 rHSC를 보호하는 데 있어 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
실시예 B-3
N-Cad + 니치 세포는 골수에서 rHSC를 포함하는 기능적 HSC를 유지시킨다
N-cad+ 간질세포가 최초로 동정된 HSC 니치 세포였고, 골내막 니치에서의 N-cad+ 간질세포는 화학요법에 내성이 있는 한편 Osx+ 골모세포는 화학요법에 민감하였지만, N-cad+가 HSC를 기능적으로 지지한다는 직접적인 증거는 적절한 유전자 마우스 주의 결여로 인해 여전히 찾지 못하였다. 본원의 측면에 따라, N-cad-CreER T 주가 생성되었고(도 25a), N-cad+ 간질세포가 Col2.3-GFP+ 골모세포와 혈관주위 세포 둘 다를 생성하였음을 보여주었다(도 25b). 이전의 연구는 성숙한 Col2.3-GFP+ 골모세포를 고갈시키는 것이 BM 세포의 전체적 생착에 영향을 미치지는 않았고(Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013), LT-HSC의 서브세트의 손상된 재생 능력을 유발하기만 하였음을 보여주었다(Bowers et al., 2015). N-cad+ 간질세포가 발달적으로 Osx+ 골선조세포(osteoprogenitor cell)를 진행시키고, 이것이 성숙한 Col2.3+ 골모세포를 추가로 생성하지만, N-cad+ 간질세포에 의한 HSC 유지에 대한 기능적 기여는 알려져 있지 않다. N-cad+ 세포의 HSC 니치 역할을 조사하기 위해, N-cad- 니치 세포가 디프테리아 독소(DT)에 민감하게 된 N-cad-CreER T 유도 DTR(디프테리아 독소 수용체를 암호화함) 주(N-cad-CreER T ;iDTR)를 생성하였다. N-cad-CreER T ;iDTR 마우스에 타목시펜(TMX) 주사를 3회 투여한 후, DT(2일마다 1회 주사)를 복강내 주사하고, 마지막 주사 후 첫날에 이들을 분석하였다(도 19a). DT와 동시에 처리된 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스와 비교하여 N-cad-CreER T ;iDTR; R26-tdT에서 N-cad+ 간질세포의 효율적인 제거가 관찰되었다(도 19b). N-cad+ 세포 제거가 생체내 HSC에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 추가로 조사하였다. N-cad+ 세포를 제거한 후, 대조군과 비교하여 BM에서 세포충실성의 유의적인 변화는 관찰되지 않았다(도 19c). 그러나, HSC의 수는 급격히 감소하였다: rHSC(65.0% 감소), pHSC(60.0% 감소), ST-HSC(59.6% 감소) 및 MPP(29.3% 감소)(도 19d). 이는 N-cad+ 니치 세포가 예비 HSC를 포함하는 가장 원시적인 HSC 유지에 기여하였음을 나타냈다.
이식 검정을 또한 수행하여 N-cad+ 간질세포 제거된 마우스에서 기능적 HSC 수를 시험하였다. N-cad+ 간질세포 제거된 마우스로부터의 골수 세포는 유의적으로 더 낮은 수준의 공여자 세포 재구성(20주차에 28.3% 감소)(도 19e)과 감소된 골수 세포 생산(24.5% 내지 17.1%)(도 19f)을 제공하였다. N-cad+ 니치 세포가 HSC의 장기적 자가-재생을 유지하는데 기여하였는지 여부를 추가로 조사하기 위해, 1차 이식 후 20주차에 2차 이식을 수행하였다. N-cad+ 간질세포 제거된 마우스로부터의 BM 세포는 다계통 재구성을 할 수 있었지만(도 19h), 2차 이식에서 공여자 세포 재구성 능력이 상당히 감소된 것으로 관찰되었다(16주차에 40.5% 감소)(도 19g).
또한, 본 발명자들은 N-cad+ 간질세포로부터의 Cxcl12의 조건부 넉아웃이 pHSC(48% 감소) 및 ST-HSC(28.8% 감소)를 유의적으로 감소시켰다는 것을 관찰하였지만, rHSC에서 유의적인 감소는 관찰되지 않았다. 비유의적이지만 약간의 MPP 증가가 있었다(도 19i). N-cad+ 간질세포로부터 SCF의 조건부 결실은 rHSC(60% 감소), pHSC(38.6% 감소) 및 ST-HSC(53.7% 감소)를 유의적으로 감소시켰지만 MPP는 약간 증가하였다(도 19j). 전체적으로, 본 발명자들은 N-cad+ 니치 세포가 유지 인자를 생성하는 것을 통해 rHSC를 포함하는 HSC 유지에 기여한다는 첫 번째 기능적 증거를 제공하였다.
실시예 B-4
조혈 세포 및 이의 BM 니치 세포에 대한 전사체 분석
상이한 니치 세포가 HSC 하위집단 조절에 기여하는 방식을 통제하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 전사체 프로파일링 분석을 항상성 동안 4가지 유형의 조혈 줄기 및 선조세포에 대해 그리고 5FU 후 3일차에 rHSC뿐만 아니라 10가지 유형의 BM 니치 세포에 대해 수행하였다. BM 니치 세포를 골내막(B) 및 중심 골수(M)의 상이한 니치 구역으로부터 수거하였다(도 26a 내지 도 26b). 피어슨 거리 트리(pearson distance tree) 및 주성분 분석(PCA) 데이터는 rHSC 및 pHSC가 ST-HSC 및 MPP와 비교하여 독특한 전사체 프로파일링을 공유함을 보여주었다(도 20a). 흥미롭게도, 5FU 처리 후의 rHSC는 pHSC와 가까이 있는 것으로 나타났으며(도 20b), 이는 생존 rHSC가 활성화되어 후속적인 조혈 재생을 지지하기 위해 프라이밍되었다는 것을 시사한다.
rHSC는 Slamf1(CD150), H19, Ctnnal1(α-카툴린), Fgd5, vWF, Tek(Tie2), Procr(Epcr), Hoxb5 및 Meg3(또는 Gtl2)와 같은 공개된 HSC 특이적 마커의 대부분을 풍부하게 한 것으로 밝혀졌다(Acar et al., 2015; Chen et al., 2016; Qian et al., 2015; Sanjuan-Pla et al., 2013; Venkatraman et al., 2013). 특히, rHSC의 vWF는 pHSC의 vWF보다 6.1배 높았으며, 이는 rHSC가 HSC 계층의 정점에 있는 vWF+ HSC의 대부분을 풍부하게 하였다는 것을 시사한다(Sanjuan-Pla et al., 2013). 일관되게, CD34, CD48 및 Flt3(Flk2) 및 Itga2(CD49b)와 같은 선조세포 시그너처 유전자(signature gene)는 rHSC에서 발현이 낮았다(Acar et al., 2015; Chen et al., 2016; Gazit et al., 2014). 흥미롭게도, 5FU 후의 rHSC는 CXCR4, Ctnnal1(α-카 툴린)(Park et al., 2002), Esam(내피세포-선택적 접착 분자) 및 CD150(신호전달 림프구성 활성화 분자인 Slamf1을 암호화함)의 발현 수준이 높았으며, 이것은 전환된 프라이밍 상태와 연관된 이들의 기능과 일치한다(도 20e).
니치 세포 분석에서, N-cad 구동 td토마토(N-cad-TdT)(M)는 피어슨 거리 트리(도 20c)와 PCA 분석(도 20d) 둘 다에서 LepR, Cxcl12-RFP 및 네스틴-GFP 세포와 같은 중간엽 줄기세포(MSC) 잠재성을 갖는 다른 니치 세포와 비교하여 매우 유사한 전사체 프로파일을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 N-cad+ 세포가 MSC 잠재성을 갖고 HSC 조절에서 유사한 기능을 가질 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, NG2-RFP 세포는 Col2.3-GFP+ 골모세포와 매우 유사한 전사체 프로파일을 가졌다(도 20c 내지 도 20d). 또한 NG2-RFP 세포가 동맥주위 영역에서도 검출되었지만, 주로 골단 또는 골간의 골내막으로 제한되어 있다는 것이 밝혀졌다(도 26c).
Pecam (CD31), CDH5 (VE-카데린)은 Pecam-GFP+ 내피 세포에 풍부하다는 것이 밝혀졌다. PF4 및 Adgre1은 MK 및 대식세포(Mac)에 풍부하였다. Cspg4(NG2)는 NG2-RFP 세포에 풍부하였다. 네스틴-GFP 세포는 이전의 보고(Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013)와 일치하여 내인성 네스틴(Nes) 발현을 갖지 않았다. 흥미롭게도, Kitl (SCF), LepR, Cdh2 (N-카데린, N-CAD), Cxcl12, Pdgfrα와 같은 몇몇 마커 유전자는 혈관주위 니치 세포에서 광범위하게 발현되는 것으로 밝혀졌다(도 20f). 골내막 구역으로부터 단리된 N-cad-TdT(B) 세포도 Col2.3-GFP 및 NG2-RFP 세포와 같은 골내막 구역으로부터의 다른 세포와 비교하여 SCF, Cxcl12, LepR 및 Pdgfrα 발현 수준이 높았다(도 20f). 본 발명자들의 GO 용어 분석은 Col2.3-GFP, Pecam-GFP, MK 및 Mac 세포가 RNA 대사작용, 단백질 대사작용, 기타 대사작용 경로 및 번역 활성을 매우 강화시켰음을 보여주었고, 이는 이들 세포가 비교적 낮은 대사 상태에 있는 N-cad-TdT 세포 및 다른 혈관주위 구역 세포에 비해 상대적으로 활성인 기능적 상태에 있었음을 나타낸다. 내피 세포 및 혈관주위 세포는 면역계 과정 및 스트레스 반응 활성을 가졌다(도 20g). N-cad+ 세포는 LepR+, Cxcl12-RFP 및 네스틴-GFP 세포와 같은 다른 MSC와 유사한 전사체 프로파일을 갖기 때문에, 본 발명자들은 그 다음에 상이한 니치 세포로부터 간질 발달 관련 유전자들을 분석하고 비교하였다(도 20h). Col2.3-GFP 세포는 골모세포 유전자 Col1a 및 선조세포 유전자 Ly6a (SCA1)를 강화시키는 것으로 밝혀졌다(Yang et al., 2014). 골내막 영역으로부터의 N-Cad-TdT(B) 세포는 연골세포 유전자 Spock1, Col2a1 및 Col1a2, 및 Tnc와 같은 골 발달 유전자를 강화시켰다. 흥미롭게도, N-Cad-TdT(B)와 N-Cad-TdT(M) 둘 다는 Prrx1, Pdgfrβ, Pdgfrα, Sp7, Sox9 및 Grem1과 같은 대부분의 중간엽 줄기 및 선조세포(MSPC) 유전자를 강화시켰다. 골수 수거된 NG2-RFP 세포도 Alcam, Sp7, Mcam, Sox9 및 Gli1과 같은 MSPC 유전자의 발현 수준도 높았지만, Col1a1, Col2a1 및 Col1a2와 같은 골모세포 및 연골세포 관련 유전자의 수준이 더 높았다. 또한, 모든 혈관주위 니치 세포 중에서, LepR+ 세포가 Gla뿐만 아니라 Atf4 및 Tnc와 같은 몇몇 골모세포 및 연골세포 마커를 독점적으로 강화시킨 것으로 밝혀졌다. Cxcl12-RFP 세포는 MSPC 유전자 Itgav를 유의적으로 강화시켰다. 추가로, Grem1은 N-Cad-TdT(B) 및 모든 혈관주위 니치 세포에서 강화되었지만, NG2-RFP 세포에서는 그렇지 않았다.
초기 데이터와 일치하여, Col2.3-GFP 세포는 보다 성숙한 골-계통 유전자(Dmp1, Col1a1, Spp1, Bglap)가 강화되었다. 네스틴-GFP, Cxcl12-RFP 및 LepR은 MSC 유전자(Prrx1, Pdgfrα, Itgb1, Grem1)을 강화시키는 데 있어 이들의 공지된 역할과 일치하였다(도 20h). 흥미롭게도, MSC 유전자의 발현과는 별도로, N-Cad-TdT(M) 및 N-Cad-TdT(B)는 연골형성(Sox9, Col2a1 및 Tnc), 지방형성(Cebpα, Pparγ, Adipoq) 및 골형성((Col1a1, Runx2) 유전자가 강화되었고, 이는 N-Cad+ 간질세포의 삼중분화능(tripotential) 성질을 시사한다. 놀랍게도, NG2-RFP는 골 발달 유전자(Dmp1, Bglap, Sp7, Runx2, Col1a1)와 연골형성 유전자(Sox9, Col2a1 및 Tnc) 두가지 모두가 강화되었고, 이는 골-연골형성 역할을 시사한다(도 26d 내지 도 26e). 이들 데이터는 BM 내의 MSPC의 이질성을 강력하게 나타냈다.
실시예 B-5
N-cad-CreER T 유도된 리포터 세포는 LepR + 및 Cxcl12 + 줄기/간질세포와 대체로 중첩된다
전사 분석을 확인하기 위해, TdT 또는 ZsG 리포터를 사용하여 N-cad 생체내 계통 추적을 수행하였고, 유도 후 3일차에 N-cad-CreER T 계통 추적된 세포가 Cxcl12-RFP 및 네스틴-GFP 세포와 부분적으로 중첩?榮募? 것이 밝혀졌다(도 20i). 또한, 98.3% 및 97.9% N-cad-CreERT 유래의 세포는 각각 LepR 및 Pdgfrα 발현에 대해 양성이었다(도 20j). 이러한 결과는 N-cad+ 간질세포가 전사체 분석에 의해 시사된 바와 같이 MSC 잠재성을 갖는다는 것을 추가로 뒷받침하였다. N-cad+ 간질세포의 계통 잠재성을 분석하기 위해, 콜로니-형성 단위-섬유아세포(CFU-F) 검정을 수행하여 이들의 증식 능력을 시험하였다. 보고된 니치 세포의 대다수는, 골내막 구역으로부터의 것이든 혈관주위 구역으로부터의 것이든, 네스틴-GFP+ 세포를 제외하고는 CFU-F 활성을 갖는 10개 미만의 세포 중 하나를 갖고, 상기 네스틴-GFP+ 세포는 CFU-F 활성을 갖는 17.6개 세포중 하나만을 가진 것으로 밝혀졌다. 골로부터의 N-cad+ 세포는 8.79개 세포 중에서 CFU-F 활성을 갖는 하나의 세포를 가졌다. N-cad-CreER T 유래의 골 세포는 CFU-F 활성을 갖는 10.7개 세포 중 1개를 가졌고, N-cad-CreER T 유래의 골수 세포는 7.37개 세포 중 1개를 가졌다(도 20k). 대부분의 CFU-F 콜로니는 td토마토 신호를 유지하였고(도 21a 내지 도 21b), 이는 N-cad+ 세포가 CFU-F 활성을 갖는 MSPC의 주요 공급원임을 시사한다.
실시예 B-6
N-cad + 간질세포는 시험관내 및 생체내에서 골모세포, 연골세포 및 지방세포를 생성한다
N-cad+ 세포의 MSC 잠재성을 시험하기 위해, N-cad+ 세포에 의해 형성된 개별 CFU-F 콜로니로부터 수득된 세포들을 3개의 분취액으로 분할하고 이들을 골, 지방 또는 연골 세포 분화를 허용하는 배양물로 서브클로닝하여 시험관내 분화 검정을 수행하였다. 토마토+ 세포는 다계통 분화를 거쳐 알칼리 포스페이트-양성 골모세포, 오일-레드-O-양성 지방세포 및 아그레칸-염색된 연골세포 및 톨루이딘-블루-양성 연골세포를 생성한 것으로 밝혀졌다(도 21c 내지 도 21e).
N-cad+ 간질세포의 생체내 기능을 특성규명하기 위해, 1회 용량의 TMX 처리 후 N-cad 유래의 세포의 동적 해부학적 분포를 분석하였다(도 21f, 도 21g). 흥미롭게도, 검출된 N-cad 유래의 세포는 TMX 후 6시간 정도로 조기에 소주의 골간단에서 검출되었지만, 중심 골수에서는 매우 적은 세포만이 관찰되었고, 이는 N-cad+ 세포의 대부분이 골내막 영역으로부터 기원한다는 것을 시사한다(도 21h). 또한, N-cad-유래의 세포의 수는 TMX 처리 후 1주 내지 2주부터 소주골에서 2.2±0.2배 증가하였고 이후에 안정적으로 유지된 것으로 관찰되었다; 피질골 영역에서 세포 수는 TMX 후 2주차에 2.95±0.2배 증가였지만, 이후 TMX 후 6주차에는 감소하였으며, 이는 소주골 영역의 N-cad+ 세포가 피질골 영역에 비해 더 휴지 상태였음을 시사한다. 또한, N-cad 유래의 세포는 중심 골수에서 6주까지 지속적으로 증가하였으며, 이는 N-cad 유래의 세포가 이 영역 내에서 증식하고 분화하고 있는 중일 수 있음을 시사한다(도 21i).
그 다음, 생체내 계통 추적 검정을 수행하였고, N-cad+ 세포가 시간 의존적 방식으로 Col2.3-GFP+ 골모세포(Dacic et al., 2001)를 생성한 것으로 관찰되었다(도 22a, 도 27a 내지 도 27b). N-cad 유래의 골모세포는 TMX 유도 후 6시간 정도로 조기에 혈관주위 영역에서 검출되었고(도 22b), TMX 유도 후 14시간차에 치밀골 영역에서 검출되었다(도 22c). 추가 분석은 TMX 후 6시간차에 미성숙한 N-cad+ Col2.3- 세포(1.1%±0.2%)가 피질골 영역(0.11%±0.04%)에 비해 소주골 영역에서 10배 더 풍부하였다는 것을 보여주었다(도 22d, 도 22e). 일관되게, 보다 미성숙한 N-cad+ Col2.3- 세포는 TMX 유도 후 24시간차 및 2주차에 치밀골 영역에 비해 소주골 영역에서 풍부하였다(도 22f). TMX 유도 후 4주차에, Col2.3-GFP 세포의 대부분(72%±6%)은 N-cad+ 세포로부터 유래되었다(도 22g).
TMX 주사 후 4주차에, N-cad+ 간질세포가 소주골 영역에서 지방세포, 특히 골내막 세포를 생성하였다 것이 추가로 관찰되었으며(도 22h), 이는 BODIPY 지질 프로브 염색에 의해 추가로 확인되었다(도 22i). 흥미롭게도, N-cad+ 유래 세포의 39.3%±4.5%, 77.1%±6.7% 및 17.2%±3%가 TMX 유도 후 각각 6시간, 14시간 및 24시간차에 관찰되었다는 정량으로 입증되는 바와 같이, N-cad+ 유래의 지방세포의 빈도는 초기에는 빠르게 증가하고 이후에는 감소하였으며, 이는 지방세포가 빈번한 회전율(turnover rate)을 가질 수 있음을 시사한다(도 22j 내지 도 22k, 도 27c 내지 도 27e). 종합적으로, 본 데이터는 N-cad+ 간질세포가 성체 마우스에서 항상성 동안 생체내에서 골모세포와 지방세포 계통 둘 다를 생성하였음을 입증하였다.
게다가, Ncad+ MSC는 다른 마커와 비교하여 >10배 풍부한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 도 30에 도시된 바와 같이, 단지 10K Ncad+ hMSC만이 생체내 총 hMSC보다 더 높은 인간 트롬보포이에틴(THPO 또는 TPO)을 생성하였다. 유사하게, Ncad-hMSC는 총 hMSC와 유사한 기능을 나타냈다. 따라서, MSC를 N-카데린 항체로 단리하는 것은 MSC 집단의 풍부화를 제공할 수 있다.
실시예 B-7
N-cad + 간질세포는 발달 동안 및 손상 후에 연골세포를 생성한다
연골형성은 태아 발달에서 활발하고 성인에서는 거의 활발하지 않다(Raghunath et al., 2005; Sophia Fox et al., 2009). 출생 후 2일차(P2)에 TMX 유도된 마우스에서, 토마토+ 골모세포 및 연골막 세포(perichondrocyte)가 성장판에 인접하여 있음에도 불구하고, 토마토 발현은 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스의 대퇴골의 아그레칸+ 연골세포 중에서 검출되지 않았다(도 28a). N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스를 1주 또는 2주차에 TMX로 유도한 후 성장판이 발달할 때, 대퇴골 또는 경골의 연골 내의 토마토+ 연골세포는 검출 불가능한 상태로 유지되었다(데이터는 제시하지 않음). MSC가 태아 골에서 응축 및 연골세포 분화를 겪을 때 배아기 E12.5에서 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스에 대한 TMX 유도를 시작하였다(도 23a). 미분화된 N-cad 유래 tdT+ 세포의 대다수는 말초에 위치하였고, 분화된 N-cad 유래 토마토+ 연골세포는 E14.5 배아에서 늑골의 중심 영역에 위치하는 것으로 밝혀졌다(도 23b). 중요하게도, P2에서 대퇴골의 소주 영역에서, N-cad 유래의 연골 세포는 2차 골화 중심이 형성되는 원주 구역(columnar zone)과 더 심층의 보호를 위해 반드시 전단력에 저항해야 하는 표재성 구역 둘 다에서 검출되었다(도 23c, 도 23d). 일관되게, N-cad 유래의 지방 세포는 출생 후 2개월차에서 최대 10개월차에 검출되었으며 (도 23e, 도 28b), 이는 N-cad+ 세포가 발달 동안 초기 및 장기적 지방형성에 기여하였음을 시사한다. 그러나, N-cad+ 세포 유래의 오스테오폰틴+ 골모세포 및 골세포는 출생 후 2개월차에 검출되었지만 초기 P2에는 검출되지 않았다(도 23f, 도 28c). 이들 데이터는 배아 N-cad-유래의 세포가 모든 3가지 골-지방형성-연골형성 계통을 발생시켰으며 배아기의 N-cad+만이 연골세포를 효율적으로 형성할 수 있음을 입증 하였다.
그 다음에, N-cad+ 세포가 손상 후 성체 마우스에서 연골세포를 생성할 수 있는지의 여부를 조사하였다. E12.5에서 TMX 유도를 받은 N-cad-CreER T ; R26-tdT 마우스에서 연골 천공을 수행하였다(도 23g). 연골 손상 후 2주 내지 3주차에, 본 발명자들은 N-cad 유래의 연골세포가 손상되지 않은 대조군 마우스와 비교하여 손상 부위의 가골(callus)에 2배 증가하여 군집화되었음을 발견하였다(도 23h 내지 도 23i). 대퇴경골 관절은 수술 후 마우스의 관절연골 손상으로 인해 부어올랐다(도 28d). 전형적인 연골세포 특징을 갖는 알시안 블루 양성 세포는 손상 후 영역에서 급격히 증가하였고(도 23j), 이는 N-cad+ MSC가 손상에 반응하여 연골세포를 빠르게 재생시켰다는 것을 나타낸다.
종합하면, 본 데이터는 태아기(E12.5)에 유도된 N-cad-유래 세포가 성체에서 연골세포 선조세포를 생성할 수 있고 손상에 반응하여 연골세포 재생을 지지할 수 있음을 입증하였다.
논의
rHSC 대 pHSC
HSC의 이질성은 광범위하게 연구되어 왔다. HSC는 활성, 휴지 또는 강한 휴지 상태로 유지될 수 있다. HSC의 휴지 특성규명은 이의 장기적 자가-재생 잠재성과 관련되는 것으로 익히 공지되어 있다(Foudi et al., 2008; Wilson et al., 2008). 그러나, 휴지 HSC 집단이 어떻게 생체내 골수제거의 결과를 극복하는가는 해답이 없는 질문이다. 대다수의 HSC는, 이들의 휴지에도 불구하고, 5FU와 같은 화학요법 스트레스에서 생존할 수 없다(Longley et al., 2003). 본원의 측면에 따르면, HSC 하위집단의 적은 일부만이 1차 마우스에서 5FU 처리 후에도 생존할 수 있었고 이식 모델에서 5FU 처리에 내성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 HSC 하위집단은 rHSC로서 정의되는 한편, 기타 휴지 상태이지만 화학요법에 민감한 HSC 하위집단은 pHSC로서 정의된다(Li and Clevers, 2010). 두 HSC 하위집단이 모두 이식 실험에서 장기적 조혈을 지지하였지만, pHSC는 rHSC를 거의 생성하지 않은 반면, 후자는 pHSC를 생성할 수 있었다. 기계론적으로, 항상성 동안 rHSC는 pHSC와 비교하여 약화된 DNA 복구 시스템을 갖지만, rHSC는 이의 DNA 복구 경로 및 스트레스-반응 프로그램을 신속하게 활성화시켜 화학요법 스트레스에서 생존할 수 있고 후속적 조혈을 지지하여 골수제거의 결과를 극복할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
니치는 화학요법에 대한 내성 부여의 측면에서 중요하다
rHSC의 화학-내성의 기초가 되는 외인성 메커니즘을 조사하기 위해, rHSC가 BM의 특정 미세환경에서 보존된다는 발상을 시험하였다. 홀마운트 HSC 염색 (Kunisaki et al., 2013)을 사용하였을 때, 대량의 HSC는 이전에 보고된 바와 같이 혈관 및 MK와 연관된 것으로 관찰되었다. 그러나, 놀랍게도, rHSC는 항상성 동안 및 5FU 처리 후에 pHSC와 비교하여 골내막 니치와 주로 연관된 것으로 밝혀졌다. 이는 골내막 니치가 화학요법 스트레스로부터 rHSC를 보호하기 위해 확실한 BM 미세환경을 형성할 수 있음을 나타냈다. 일관되게, 화학요법 스트레스시, 대부분의 rHSC는 화학-내성 N-cad+ 간질세포를 풍부하게 하는 골내막 니치에서 보호된 반면, 혈관 및 혈관주위 세포는 5FU 처리에 민감하였고, 이는 화학요법에 의해 유도된 pHSC의 대량 손실의 이유가 된다. 홀마운트 HSC 염색은 골수 내부에 풍부한 골 분지 및 연장부를 갖는 흉골에서 수행하였다. 이러한 특징은 이것을 대퇴골의 소주골 영역과 매우 유사하게 만든다. N-cad+ 니치 세포의 고갈이 rHSC를 포함하는 HSC 유지에 영향을 미쳤음을 보여주는 이식 검정은 이러한 개념을 뒷받침한다. HSC 휴지도 이의 낮은 대사 상태와 상관관계가 있으며, 이는 '수면'과 유사한 것으로 간주될 수 있고 HSC 휴면 또는 동면이라 명명되었다(Takubo et al., 2013; Wilson et al., 2008; Yamazaki et al., 2011). 그러나, 본원의 측면에 따르면, 휴지는 약물 내성의 기초가 되는 유일한 메커니즘이 아니고 대신에 내인성 스트레스-반응 프로그램과 외인성 니치 보호 둘 다가 약물 내성에 기여한 것으로 추가로 나타났다.
BM 니치 내의 HSC 유지에 있어 N-cad 간질세포의 정체 및 기능
N-cad+ 간질세포는 최초로 동정된 HSC 니치 세포이고(Zhang et al., 2003) 후속 연구에 의해 확인되었다(Arai et al., 2004; Sugiyama et al., 2006). N-cad+ 세포는 처음에는 이들의 골내막 위치에 기초하여 골모세포성 선조세포로서 제안되었다. 본원의 측면에 따르면, 2가지 리포터 주를 사용함으로써, N-cad+ 간질세포가 골내막 영역과 혈관주위 부위 둘 다에 분포되어 있다는 것이 밝혀졌다. 더 흥미롭게도, 대다수의 N-cad+ 세포는 LepR+ 세포 및 Pdgfrα+ 세포와 중첩된 것으로 밝혀졌다. 전사 분석은 N-cad+ 세포, LepR+ 세포, Cxcl12-RFP(CAR) 세포 및 네스틴-GFP 세포가 매우 유사한 유전자 발현 패턴을 가졌음을 보여주었다. 본 데이터는 HSC 니치 개념의 오래된 논란이 이들의 세포적 정체보다는 상이한 세포 마커가 사용되고 있기 때문일 가능성이 높다는 것을 강력하게 나타냈다.
N-Cad+ 간질세포의 정체를 결정하기 위해, 이들의 영역 분포를 상이한 니치 리포터 마우스를 사용하여 골수 내의 다른 공지된 니치 세포에 대해 가시화하였다. N-Cad+ 간질세포는 72%±6% Col2.3-GFP+ 세포를 생성하였다; 그러나, 9.3%±4.7% N-cad+ Col2.3GFP- 세포도 골내막 영역에서 검출되었다. 이러한 미성숙 세포는 HMS 니치 기능 연구에서 Col2.3-Cre 유전자 모델의 불충분한 효율을 설명할 수 있는 원시 MSC의 이유가 되었다(Ding and Morrison, 2013; Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013). N-Cad-TdT+와 네스틴-GFP+ 둘 다가 소주 영역에 풍부하였지만, N-Cad-TdT+는 이전에 보고된 바와 같이 이식된 HSC의 생착이 검출된 소주 영역에 집중되었고(Nilsson et al., 2001; Xie et al., 2009) 여기에서 관찰된 바와 같이 스트레스 후에 생존하였다. 이러한 모든 데이터는, 비록 N-cad+ 세포가 다른 MSC와 유사한 전사체 프로파일을 공유하지만 이들의 해부학적 분포가 이들의 독특한 HSC 니치 기능을 암시할 수 있음을 나타냈고; 실제로, N-cad+ 골내막 니치 세포가 rHSC를 보존하는 데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
유도가능한 DTR 시스템을 사용함으로써, N-cad+ 세포의 제거가 BM에서 pHSC와 rHSC 둘 다를 제거하였다는 것이 밝혀졌다. 이것은 골내막 구역과 혈관주위 구역 둘 다에서의 N-cad+ 니치 세포의 해부학적 분포에 의해 설명될 수 있다. 또한, N-cad 발현을 HSC의 서브세트에서 검출될 수 있다는 것으로 나타났다; 그러나, N-cad-TdT 리포터 마우스 주는 이러한 관찰을 뒷받침하지 않는다(데이터는 제시하지 않음). 이것은 이들의 단백질 수준과 전사 수준 간의 불일치에 의해 부분적으로 설명될 수 있었는데, N-cad-mcherry(단백질 수준에서의 융합)의 또 다른 마우스 주가 실제로 낮은 수준의 N-cad 발현을 나타내는 HSC의 작은 서브세트를 가졌기 때문이다(1차 관찰). 기능적 이식 데이터는 N-cad+ 니치 세포의 제거가 rHSC를 포함하는 HSC의 감소를 초래하였음을 보여주었다. N-cad+ 세포로부터 Cxcl12 및 SCF를 결실시킴으로써, N-cad+ 간질세포가 이들 두 인자를 생성함으로써 HSC 유지 및 조절에 기여한다는 것이 밝혀졌다. 전체적으로, 본원의 측면은 N-cad+ 간질세포가 MSC로서 기능하고 특히 스트레스 하에 원시적 HSC 유지를 지지한다는 것을 입증한다.
인간 제대혈(hUCB)로부터의 조혈 줄기세포(HSC)의 이식이 암을 포함하는 광범위한 혈액학적 장애를 치료할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있지만, 단일 hUCB 단위 내의 제한된 수의 HSC는 이의 광범위한 사용을 제한할 수 있다. 광범위한 노력으로 단일 분자 또는 경로의 표적화에 의한 인간 HSC의 생체외 증대를 위한 다수의 방법들이 개발되었지만, 줄기세포 자가-재생에 필수적인 다수의 표적을 동시에 조작하는 것이 달성 가능한지 여부는 알려져 있지 않다. 최근의 연구들은 N6-메틸 아데노신(m6A)이 줄기세포 운명 결정에 중요한 mRNA 그룹의 안정성에 영향을 미침으로써 이의 발현을 조정한다는 것을 밝혀냈다. 몇몇 m6A 판독인자 중에서, Ythdf2는 표적화된 mRNA 붕괴를 촉진하는 것으로 잘 인지되어 있다. 그러나, 성체 줄기세포에 대한 Ythdf2의 생리학적 기능은 여전히 규정하기 힘들다. 본원의 실시형태는 조건부 넉아웃(KO) 마우스 Ythdf2가 표현형 및 기능적 HSC 수를 증가시켰지만, 계통 분화를 왜곡시키지도 않고 조혈 악성종양을 야기하지도 않는다는 것을 입증한다. 또한, 인간 YTHDF2의 넉다운(KD)은 2회의 제한 희석 이식 검정에서 hUCB HSC의 생체외 증대의 10배 이상의 증가, 콜로니-형성 단위(CFU)의 5배 증가 및 기능적 hUCB HSC의 8배 초과의 증가를 야기하였다. 기계론적으로, 마우스 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC)뿐만 아니라 hUCB HSC로부터의 RNA의 m6A 맵핑은 줄기세포 자가-재생에 중요한 전사 인자를 암호화하는 mRNA상의 m6A 풍부화를 나타냈다. 이들 m6A-마크된 mRNA는 Ythdf2에 의해 인식되었고 mRNA 붕괴를 겪었다. Ythdf2 KO HSPC 및 YTHDF2 KD hUCB HSC에서, 이들 mRNA는 안정화되어 단백질 수준의 증가를 초래하고 HSC 증대를 촉진시켰으며, 이는 Tal1 mRNA와 같은 mRNA를 넉다운함으로써 구제될 수 있다. 따라서, 실시형태들은 성체 줄기세포 유지에서의 Ythdf2의 기능을 보여주고, HSC 자가-재생에 중요한 다수의 mRNA의 안정성을 제어하는 메커니즘을 통해 HSC 생체외 증대를 조절하는 데 있어 Ythdf2의 중요한 역할을 밝히고 있고, 이에 따라 장래의 임상 적용에 대한 강력한 잠재성을 갖는다.
또한, 골수(BM) 니치에 의한 조혈 줄기세포(HSC)의 조절은 상당히 연구되어 왔다; 그러나, HSC 하위집단이 상이한 BM 니치에 의해 특징적으로 조절되는지 여부 및 방법은 대부분 불분명하게 남아있다. 여기서, 예비 HSC(rHSC)는 프라이밍된 HSC(pHSC)와 기능적으로 구별되었으며, 이들의 각 BM 니치는 추가로 조사되었다. pHSC와 rHSC 둘 다는 항상성 하에 장기적 조혈을 지지할 수 있는 것으로 밝혀졌다; 그러나, pHSC는 화학요법에 민감한 반면, rHSC는 화학요법에서 생존하였고 골수제거 후 후속적인 재생을 지지하였다. 홀마운트 HSC 분포 연구는 rHSC가 항상성 동안 및 화학요법 후에 N-카데린+ 골 내층 세포를 풍부하게 하는 골내막 영역에서 우선적으로 유지되었다는 것을 밝혀냈다. pHSC는 골과 비교하여 화학요법에 취약한 혈관과 주로 연관되었다. 전사체 프로파일링 및 생체내 계통 추적 결과는 N-카데린+ 간질세포가 발달 및 재생 동안 골모세포, 지방세포 및 연골세포를 생성하는 기능적 중간엽 줄기세포임을 보여주었다. 마지막으로, N-카데린+ 니치 세포의 제거 또는 N-카데린+ 니치 세포로부터 Scf 또는 Cxcl12의 결실은 HSC 수 및 유지에 영향을 미친 것으로 입증되었다.
실시예 C
shRNA를 이용한 CAR-T 세포의 증대
CAR-T 세포의 증대에 미치는 Ythdf2 조정의 효과는 렌티바이러스 구동 인간 Ythdf2 shRNA를 사용하여 평가되고 있는 중이다. CAR-T 렌티벡터에서 YTHDF2 shRNA의 성공적인 클로닝이 발생하였다. 렌티바이러스는 인간 CAR-T 세포를 감염시키는 데 사용되었으며, 인간 CAR-T 세포의 증대는 진행 중이다. 증대는 결과가 나오기까지 수일 내지 수주가 걸릴 것으로 예상된다. 유의적으로 향상된 증대는 CAR-T 대조군 집단과 비교하여 렌티바이러스-감염된 CAR-T 세포 집단에서 입증될 것으로 여겨진다.
m6A-seq, irCLIP-seq 및 RNA-seq 데이터세트를 포함하는 모든 시퀀싱 데이터는 등록번호 GSE107957 하에 Gene Expression Ombibus(GEO)을 통해 이용 가능하다.
http://www.stowers.org/research/publications/LIBPB-1248의 원본 데이터 저장소.
참조문헌
다음 참고문헌들은 본원에 제시된 것에 대한 예시적 절차 또는 보충적인 다른 세부사항을 제공하는 정도로 본원에서 구체적으로 인용된다.
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표 S1
표 S1 : HSC 자가-재생 및 유지에 중요한 주요 전사 인자는 HSPC에서 m6A로 표지되어 있다.
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표 S2
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표 S4
표 S4 . CRU 를 계산하기 위해 사용된 인간 공여자 유래의 키메리즘의 백분율
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표 S4 (계속)
Figure pct00037
표 S5
표 S5 . wt 및 Ythdf2 KO HSPC에서 전사 인자의 발현 수준을 확인하기 위해 사용된 qPCR 프라이머
Figure pct00038

Claims (361)

  1. 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 줄기세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이, 상기 줄기세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하거나, 줄기세포를 소분자, 생물제제(biologic), 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자(reader), m6A mRNA 변형 기록인자(writer) 및 m6A mRNA 변형 소거인자(erasor)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돌연변이가 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 돌연변이가 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  12. 제3항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포를 노출시킴을 포함하는, 방법.
  13. 제3항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 shRNA가 줄기세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입되는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf2를 포함하는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 하향조절이 줄기세포를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포의 증대가 적어도 2배의 배수만큼인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 줄기세포의 증대가 적어도 4배의 배수만큼인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 줄기세포의 증대가 적어도 5배의 배수만큼인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 줄기세포의 증대가 적어도 8배의 배수만큼인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 줄기세포의 증대가 적어도 10배의 배수만큼인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포가 조혈 줄기세포(HSC), 조혈 줄기 및 선조세포(hematopoietic stem and progenitor cell: HSPC), 내피 선조세포(EPC), 중간엽 줄기세포(MSC), 심장 줄기세포(CSC), 뉴런 줄기세포(NSC) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 줄기세포가 HSC인, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 증대된 세포가 총 콜로니-형성 단위(CFU)의 적어도 5배 증가를 갖는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 증대된 세포가 CFU-과립구 적혈구 단핵구 거핵구(GEMM) 콜로니의 적어도 3.8배 증가를 갖는, 방법
  28. 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 방법이, 미분화된 줄기세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 줄기세포 집단의 현저한 분화 없이 미분화된 줄기세포의 수를 증대시킴을 포함하는, 방법
  29. 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 조혈 줄기세포(HSC) 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 방법이, 상기 HSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여, HSC 집단의 다계통 분화(multilineage differentiation) 잠재성을 유지하면서 HSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  31. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하거나, 줄기세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자 및 m6A mRNA 변형 소거인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 돌연변이가 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 돌연변이가 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포를 노출시킴을 포함하는, 방법.
  42. 제31항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 shRNA가 줄기세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입되는, 방법.
  44. 제29항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf2를 포함하는, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 하향조절이 줄기세포를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  48. 제28항에 있어서, 상기 줄기세포가 조혈 줄기세포(HSC), 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC), 내피 선조세포(EPC), 중간엽 줄기세포(MSC), 심장 줄기세포(CSC), 뉴런 줄기세포(NSC) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 줄기세포가 조혈 줄기세포(HSC)인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 HSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득되는, 방법.
  51. 제31항에 있어서, 상기 줄기세포의 수의 증대가 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배 및 적어도 10배로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼인, 방법.
  52. 제28항에 따른 방법에 의해 생성된, 증대된 실질적으로 미분화된 줄기세포 집단.
  53. 제29항에 따른 방법에 의해 생성된, 증대된 HSC 집단.
  54. 조혈 줄기세포(HSC)를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이, 증대된 HSC가 이를 필요로 하는 포유동물로 이식시 HSC 계통(lineage)을 재구성할 능력이 있고, 상기 방법이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하는 단계 및 HSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법
  55. 제54항에 있어서, 상기 HSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득되는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  57. 제54항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  58. 제54항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포를 노출시킴으로써 도입되는, 방법.
  59. 제54항에 있어서, 상기 돌연변이가 shRNA를 줄기세포 내로 혼입시켜, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
  60. 제54항에 있어서, 상기 HSC의 수의 증대가 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배 및 적어도 10배로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼인, 방법.
  61. 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, 상기 키트가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  62. 제61항에 있어서, 상기 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는, 키트.
  63. 제62항에 있어서, 상기 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템을 포함하는, 키트.
  64. 제62항에 있어서, 상기 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시키는 렌티바이러스를 전달하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 시약을 포함하는, 키트.
  65. 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, 상기 키트가 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  66. 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계,
    (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 HSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 HSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시키는, 방법.
  70. 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) HSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 HSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 HSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제가 Ythfd2를 억제하는, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  74. 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 HSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 HSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 HSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  76. 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) HSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 HSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 HSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 HSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  78. 조혈 세포(HSC) 집단을 HSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하는, HSC 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이, 증대된 HSC 집단이 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적합한, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 5배인, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 10배인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 인간이 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는, 방법.
  85. 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 제78항의 방법에 의해 수득된 HSC 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는 방법.
  86. 조혈 줄기세포(HSC) 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) HSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계;
    (b) 상기 샘플로부터 HSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 HSC 집단이 적어도 2배 증대되고; (ii) 증대된 HSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 5배인, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 10배인, 방법.
  91. 제86항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 인간이 골수 이식을 필요로 하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 조직 샘플이 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  94. 조혈 줄기세포 계통의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 조혈 줄기세포 계통을 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) HSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계;
    (b) 상기 샘플로부터 HSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서,
    여기서 (i) 상기 HSC 집단이 적어도 2배 증대되고;
    (ii) 증대된 HSC 집단이 총 콜로니-형성 단위의 적어도 5배 증가를 갖는, 단계; 및
    (c) 증대된 HSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 이식하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 5배인, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 10배인, 방법.
  99. 제94항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 인간이 골수 이식을 필요로 하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 조직 샘플이 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 샘플이 자가 또는 동종이계 공급원으로부터의 것인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 샘플이 자가 공급원으로부터의 것인, 방법.
  104. 조혈 줄기세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 조혈 줄기세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이, N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을 포유동물에서 조혈 계통을 재구성하는 능력을 갖는 HSC와 함께 HSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 조정제가 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함하는, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 조정제가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 HSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함하는, 방법.
  107. 제104항에 있어서, 상기 조정제가 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자의 억제제를 포함하는, 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 조정제가 Ythdf2의 억제제를 포함하는, 방법.
  109. 제104항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  110. 실질적으로 미분화된 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법으로서, 미분화된 MSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 MSC의 현저한 분화 없이 미분화된 MSC의 수를 증대시킴을 포함하는 방법
  111. 제110항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC를 포함하는, 방법.
  113. 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 중간엽 줄기세포(MSC) 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 방법이, 상기 MSC 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여, MSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함하는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  115. 제113항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC를 포함하는, 방법.
  116. 제113항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  117. 제110항 또는 제113항에 있어서,
    상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 MSC 내로 도입하거나, 줄기세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자 및 m6A mRNA 변형 소거인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  123. 제119항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 돌연변이가 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  125. 제119항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 돌연변이가 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  127. 제119항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 MSC를 노출시킴을 포함하는, 방법.
  128. 제119항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 MSC 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 shRNA가 줄기세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입되는, 방법.
  130. 제119항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함하는, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf2를 포함하는, 방법.
  133. 제130항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 하향조절이 MSC를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  134. 제113항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득되는, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 줄기세포의 수의 증대가 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배 및 적어도 8배로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼인, 방법.
  136. 제110항에 따른 방법에 의해 생성된, 증대된 실질적으로 미분화된 중간엽 세포 집단.
  137. 제113항에 따른 방법에 의해 생성된, 증대된 MSC 집단.
  138. 중간엽 줄기세포(MSC)를 적어도 2배만큼 생체외 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이, 증대된 MSC가 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식시 MSC 계통을 재구성할 능력이 있고, 상기 방법이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하는 단계 및 HSC 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  140. 제138항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득되는, 방법.
  141. 제138항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  142. 제138항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  143. 제138항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 MSC를 노출시킴으로써 도입되는, 방법.
  144. 제138항에 있어서, 상기 돌연변이가 shRNA를 MSC 내로 혼입시켜, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
  145. 제138항에 있어서, 상기 MSC의 수의 증대가 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배 및 적어도 8배로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼인, 방법.
  146. 중간엽 줄기세포 집단(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, 상기 키트가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  147. 제146항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 키트.
  148. 제146항에 있어서, 상기 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는, 키트.
  149. 제146항에 있어서, 상기 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템을 포함하는, 키트.
  150. 제146항에 있어서, 상기 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 shRNA를 MSC 집단 내로 혼입시키는 렌티바이러스를 전달하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 시약을 포함하는, 키트.
  151. 중간엽 줄기세포 집단(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, 상기 키트가 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  152. 제151항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 키트.
  153. 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계,
    (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  154. 제153항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  155. 제153항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  156. 제153항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는, 방법.
  157. 제153항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시키는, 방법.
  158. 조혈 줄기세포(HSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및
    (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  159. 제158항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  160. 제158항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  161. 제158항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제가 Ythfd2를 억제하는, 방법.
  162. 제158항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  163. 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  164. 제163항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  165. 제163항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  166. 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) MSC 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및
    (c) MSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  167. 제166항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  168. 제166항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  169. 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 MSC 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하는, MSC 집단을 증대시키는 방법으로서, 증대된 MSC 집단이 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적합한, 방법.
  170. 제169항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  171. 제169항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 2.5배인, 방법.
  172. 제171항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 3배인, 방법.
  173. 제172항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 3.5배인, 방법.
  174. 제173항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  175. 제174항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  176. 제169항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  177. 제176항에 있어서, 상기 인간이 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는, 방법.
  178. 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 제169항의 방법에 의해 수득된 MSC 집단을 대상체에게 투여함을 포함하는 방법.
  179. 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서, 여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되는, 단계
    를 포함하는, 방법.
  180. 제179항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  181. 제179항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 2.5배인, 방법.
  182. 제181항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 3배인, 방법.
  183. 제182항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 3.5배인, 방법.
  184. 제183항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  185. 제184항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  186. 제179항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  187. 제186항에 있어서, 상기 인간이 골수 이식을 필요로 하는, 방법.
  188. 제179항에 있어서, 상기 조직 샘플이 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  189. 중간엽 줄기세포 계통의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 중간엽 줄기세포 계통을 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) MSC 집단을 포함하는 조직 샘플을 포유동물로부터 수득하는 단계;
    (b) 상기 샘플로부터 MSC 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서,
    여기서 (i) 상기 MSC 집단이 적어도 2배 증대되는, 단계; 및
    (c) 증대된 MSC 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 이식하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  190. 제189항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  191. 제189항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 2.5배인, 방법.
  192. 제191항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 3배인, 방법.
  193. 제192항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 3.5배인, 방법.
  194. 제193항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  195. 제194항에 있어서, 상기 MSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  196. 제189항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  197. 제196항에 있어서, 상기 인간이 골수 이식을 필요로 하는, 방법.
  198. 제189항에 있어서, 상기 조직 샘플이 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  199. 제198항에 있어서, 상기 샘플이 자가 또는 동종이계 공급원으로부터의 것인, 방법.
  200. 제198항에 있어서, 상기 샘플이 자가 공급원으로부터의 것인, 방법.
  201. 중간엽 줄기세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 중간엽 줄기세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이, N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을 포유동물에서 중간엽 계통을 재구성하는 능력을 갖는 HSC와 함께 MSC 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함하는, 방법.
  202. 제201항에 있어서, 상기 MSC 집단이 N-카데린+ MSC 및 CD105+ MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 MSC를 포함하는, 방법.
  203. 제201항에 있어서, 상기 조정제가 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함하는, 방법.
  204. 제201항에 있어서, 상기 조정제가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함하는, 방법.
  205. 제201항에 있어서, 상기 조정제가 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자의 억제제를 포함하는, 방법.
  206. 제201항에 있어서, 상기 조정제가 Ythdf2의 억제제를 포함하는, 방법.
  207. 제201항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  208. 생물학적 샘플로부터 중간엽 줄기세포(MSC)를 단리하는 방법으로서, 상기 방법이, MSC 집단을 갖는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  209. 제208항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직을 포함하는, 방법.
  210. 제208항에 있어서, 상기 생물학적 샘플로부터의 MSC 집단을, MSC 집단의 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 중간엽 줄기세포의 수를 증대시킴으로써 증대시킴을 추가로 포함하는 방법.
  211. 제210항에 있어서, 상기 MSC 집단이 생물학적 샘플로부터 단리된 후에 증대되는, 방법.
  212. 제210항에 있어서, 상기 생물학적 샘플 중의 MSC 집단이 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하기 전에 증대되는, 방법.
  213. 제210항에 있어서, 상기 MSC 집단이, MSC 집단의 다계통 분화 잠재성을 유지하면서 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대되는, 방법.
  214. 제213항에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
  215. 제210항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하거나, 줄기세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  216. 제215항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  217. 제216항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자 및 m6A mRNA 변형 소거인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  218. 제217항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  219. 제218항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  220. 제219항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  221. 제217항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  222. 제217항에 있어서, 상기 돌연변이가 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  223. 제217항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  224. 제223항에 있어서, 상기 돌연변이가 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  225. 제210항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 줄기세포를 노출시킴을 포함하는, 방법.
  226. 제210항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 줄기세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  227. 제226항에 있어서, 상기 shRNA가 줄기세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입되는, 방법.
  228. 제210항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함하는, 방법.
  229. 제228항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  230. 제229항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf2를 포함하는, 방법.
  231. 제228항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 하향조절이 줄기세포를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  232. 제208항에 따른 방법에 의해 생성된, 단리된 중간엽 줄기세포 집단.
  233. 제210항의 방법에 의해 생성된, 증대된 단리된 중간엽 줄기세포 집단.
  234. 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식을 위해 단리하기 위한 키트로서, 상기 키트가 MSC를 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시키기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  235. 제234항에 있어서, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입함으로써 MSC 집단을 증대시키기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 추가로 포함하는 키트.
  236. 제235항에 있어서, 상기 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는, 키트.
  237. 제236항에 있어서, 상기 돌연변이를 MSC 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템을 포함하는, 키트.
  238. 제236항에 있어서, 상기 MSC 집단 내로 돌연변이를 도입하기 위한 시스템이 shRNA를 MSC 집단 내로 혼입시키는 렌티바이러스를 전달하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 시약을 포함하는, 키트.
  239. 중간엽 줄기세포(MSC)를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) MSC 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시킴으로써 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하는 단계; 및
    (b) 단리된 MSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  240. 제239항에 있어서, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 생물학적 샘플 내로 도입하는 단계 및 상기 생물학적 샘플을 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  241. 제239항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직을 포함하는 생물학적 샘플로부터 수득되는, 방법.
  242. 제240항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는, 방법.
  243. 제240항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 HSC 집단 내로 혼입시키는, 방법.
  244. 골수의 재구성을 필요로 하는 대상체에서 골수를 재구성하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 중간엽 줄기세포(MSC) 집단을 포함하는 생물학적 샘플을 하나 이상의 N-카데린 항체와 접촉시킴으로써 생물학적 샘플로부터 MSC를 단리하는 단계; 및
    (b) 단리된 MSC를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  245. 제244항에 있어서, m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 MSC 집단을 함유하는 생물학적 샘플 내로 도입하는 단계 및 상기 샘플을 샘플 중의 MSC의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  246. 제244항에 있어서, 상기 MSC가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직을 포함하는 생물학적 샘플로부터 수득되는, 방법.
  247. 골수 이식, 말초혈 이식 및 제대혈 이식으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 이식을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제208항의 방법에 의해 수득된 단리된 MSC 집단을 상기 대상체에게 투여함을 포함하는 방법.
  248. 제247항에 있어서, 상기 샘플이 자가 또는 동종이계 공급원으로부터의 것인, 방법.
  249. 제248항에 있어서, 상기 샘플이 자가 공급원으로부터의 것인, 방법.
  250. 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시켜 생성된 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 CAR-T 세포의 수를 증대시킴을 포함하는, 방법.
  251. 제250항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이, m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 CAR-T 세포 내로 도입하거나, CAR-T 세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  252. 제251항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 돌연변이를 CAR-T 세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  253. 제252항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자 및 m6A mRNA 변형 소거인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  254. 제253항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  255. 제254항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  256. 제255항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  257. 제253항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  258. 제257항에 있어서, 상기 돌연변이가 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  259. 제253항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  260. 제259항에 있어서, 상기 돌연변이가 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  261. 제252항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 CAR-T 세포를 노출시킴을 포함하는, 방법.
  262. 제252항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 CAR-T 세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  263. 제262항에 있어서, 상기 shRNA가 CAR-T 세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입되는, 방법.
  264. 제250항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함하는, 방법.
  265. 제264항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  266. 제265항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf2를 포함하는, 방법.
  267. 제264항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 하향조절이 CAR-T 세포를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  268. 제250항에 있어서, 상기 CAR-T 세포의 증대가 적어도 2배의 배수만큼인, 방법.
  269. 제268항에 있어서, 상기 CAR-T 세포의 증대가 적어도 4배의 배수만큼인, 방법.
  270. 제269항에 있어서, 상기 CAR-T 세포의 증대가 적어도 5배의 배수만큼인, 방법.
  271. 제270항에 있어서, 상기 CAR-T 세포의 증대가 적어도 8배의 배수만큼인, 방법.
  272. 제271항에 있어서, 상기 CAR-T 세포의 증대가 적어도 10배의 배수만큼인, 방법.
  273. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 CAR T-세포의 수를 증대시킴을 포함하는, CAR T-세포 집단의 생체외 증대 방법.
  274. 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시켜 생성된 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 생체외 증대 방법으로서, 상기 방법이 CAR T-세포 집단에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여, CAR T-세포 집단을 이를 필요로 하는 대상체로의 후속 이식에 충분한 충분량까지 증대시킴을 포함하는, 방법.
  275. 제274항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  276. 제274항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있는, 방법.
  277. 제274항에 있어서, 상기 대상체가 백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈액 암을 앓고 있는, 방법.
  278. 제273항 또는 제274항에 있어서,
    상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 내로 도입하거나, CAR T-세포를 소분자, 생물제제, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 경로의 분자의 조정제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  279. 제278항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 돌연변이를 CAR T-세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  280. 제279항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자, m6A mRNA 변형 기록인자 및 m6A mRNA 변형 소거인자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 분자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  281. 제280항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  282. 제281항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  283. 제282항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  284. 제279항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  285. 제284항에 있어서, 상기 돌연변이가 FTO 및 ALKBH5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 소거인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  286. 제279항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  287. 제279항에 있어서, 상기 돌연변이가 METTL3, METTL14, WTAP 및 KIAA1429로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 기록인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  288. 제278항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 CAR T-세포를 노출시킴을 포함하는, 방법.
  289. 제278항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 shRNA를 혼입시키는 돌연변이를 CAR T-세포 내로 도입하여 m6A mRNA 변형 경로의 분자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
  290. 제289항에 있어서, 상기 shRNA가 CAR T-세포를 렌티바이러스에 노출시켜 shRNA를 전달함으로써 도입되는, 방법.
  291. 제274항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 경로의 조정이 m6A mRNA 변형 판독인자를 하향조절함을 포함하는, 방법.
  292. 제291항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf1, Ythdf2, Ythdf3, Ythdc1, Ythdc2, HNRNPC, HNRNPA2B1 및 elF3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  293. 제292항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자가 Ythdf2를 포함하는, 방법.
  294. 제291항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 하향조절이 줄기세포를 (HNRNPC의 억제제) hsa-let-7e-5p (MIRT051596), hsa-mir-455-3p (MIRT037890), hsa-mir-30c-5p (MIRT047904), hsa-mir-186-5p (MIRT045150), hsa-mir-744-5p (MIRT037494), hsa-mir-18a-3p (MIRT040851), hsa-mir-484 (MIRT042196), hsa-mir-505-5p (MIRT037959), hsa-mir-615-3p (MIRT039991), hsa-mir-342-3p (MIRT043694), hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-30d, hsa-miR-3916, hsa-miR-3162-5p, hsa-miR-1273d, hsa-miR-3161, hsa-miR-30a, hsa-miR-629, hsa-miR-208b, hsa-miR-489, hsa-miR-3148, hsa-miR-2113, hsa-miR-877, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-186, hsa-miR-548o, hsa-miR-3139, hsa-miR-320a, hsa-miR-4311, hsa-miR-555, hsa-miR-3605-5p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-144, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-548x, hsa-miR-299-5p, hsa-miR-653, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-548p, hsa-miR-586, hsa-miR-888, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-484, hsa-miR-320b, hsa-miR-620, hsa-miR-30b, hsa-miR-548q, hsa-miR-29b-1, hsa-miR-570, hsa-miR-183, hsa-miR-1276, hsa-miR-208a, hsa-miR-186, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-548am, hsa-miR-320d, hsa-miR-3175, hsa-miR-3155, hsa-miR-548aa, hsa-miR-519e, hsa-miR-1270, hsa-miR-513b, hsa-miR-599, hsa-miR-518f, hsa-miR-4301, hsa-miR-30c, hsa-miR-3135, hsa-miR-4286, hsa-miR-202, hsa-miR-4263, hsa-miR-4299, hsa-miR-606, hsa-miR-3133, hsa-miR-583, hsa-miR-3125, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-7-1, hsa-miR-514b-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-224, hsa-miR-7-2, hsa-miR-708, hsa-miR-3199, hsa-miR-514, hsa-miR-30e; (HNRNPA2B1의 억제제) hsa-mir-92a-3p (MIRT049721), hsa-mir-30c-5p (MIRT048009), hsa-mir-191-5p (MIRT045809), hsa-let-7f-5p (MIRT051404), hsa-mir-27b-3p (MIRT046213), hsa-mir-877-3p (MIRT037116), hsa-mir-615-3p (MIRT040278), hsa-mir-1260b (MIRT052680), hsa-mir-103a-3p (MIRT027027), hsa-mir-16-5p (MIRT031508), hsa-mir-1296-5p (MIRT036075), hsa-mir-197-3p (MIRT048098), hsa-miR-548j, hsa-miR-3678-3p, hsa-miR-607, hsa-miR-188-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-3653, hsa-miR-371-5p, hsa-miR-550a, hsa-miR-3622b-3p, hsa-miR-548a-5p, hsa-miR-3170, hsa-miR-3148, hsa-miR-556-3p, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-559, hsa-miR-200c, hsa-miR-130a, hsa-miR-548y, hsa-miR-548o, hsa-miR-23c, hsa-miR-491-3p, hsa-miR-335, hsa-miR-3667-3p, hsa-miR-466, hsa-miR-23b, hsa-miR-4310, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-548b-5p, hsa-miR-616, hsa-miR-16, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-3200-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-448, hsa-miR-1306, hsa-miR-944, hsa-miR-3684, hsa-miR-373, hsa-miR-103a, hsa-miR-380, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-1323, hsa-miR-323-5p, hsa-miR-3674, hsa-miR-1252, hsa-miR-33b, hsa-miR-580, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-103a-2, hsa-miR-548w, hsa-miR-600, hsa-miR-634, hsa-miR-586, hsa-miR-497, hsa-miR-720, hsa-miR-654-3p, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-543, hsa-miR-548q, hsa-let-7f-2, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-548l, hsa-miR-570, hsa-miR-374a, hsa-miR-1184, hsa-miR-649, hsa-miR-424, hsa-miR-3658, hsa-miR-186, hsa-miR-326, hsa-miR-548d-5p, hsa-miR-23a, hsa-miR-15b, hsa-miR-190, hsa-miR-203, hsa-miR-548h, hsa-miR-3136-5p, hsa-miR-618, hsa-miR-551b, hsa-miR-211, hsa-miR-1305, hsa-miR-513b, hsa-miR-96, hsa-miR-2117, hsa-miR-548n, hsa-miR-3910, hsa-miR-217, hsa-miR-892b, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-548i, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-4299, hsa-miR-1285, hsa-miR-3133, hsa-miR-483-3p; (Ythdf1의 억제제) hsa-miR-548g, hsa-miR-204, hsa-miR-3143, hsa-miR-521, hsa-miR-195, hsa-miR-3182, hsa-miR-3941, hsa-miR-34c-3p, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-563, hsa-miR-548c-5p, hsa-miR-1911, hsa-miR-26b, hsa-miR-190b, hsa-miR-33a, hsa-miR-329, hsa-miR-221, hsa-miR-612, hsa-miR-3185, hsa-miR-3156-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-664, hsa-miR-3657; (Ythdf2의 억제제) hsa-mir-615-3p (MIRT040054), hsa-mir-106b-5p　(MIRT044257), hsa-mir-1　(MIRT023842), miR-145, hsa-miR-3607-3p, hsa-miR-200a, hsa-miR-301a, hsa-miR-519a, hsa-miR-141, hsa-miR-130b, hsa-miR-181b, hsa-miR-301b, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-519c-3p, hsa-miR-551b, hsa-miR-519e, hsa-miR-519b-3p, hsa-miR-19b, hsa-miR-1303, hsa-miR-608, hsa-miR-145, hsa-miR-130a, hsa-miR-181c, hsa-miR-323b-3p, hsa-miR-421, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-3666, hsa-miR-181d, hsa-miR-146a, hsa-miR-4295, hsa-miR-454, hsa-miR-3919, hsa-miR-19a, hsa-miR-543, hsa-miR-4262; (Ythdf3의 억제제) hsa-miR-582-3p, hsa-miR-579, hsa-miR-520e, hsa-miR-520f, hsa-miR-3152-3p, hsa-miR-106a, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-93, hsa-miR-508-5p, hsa-miR-29a, hsa-miR-3148, hsa-miR-490-5p, hsa-miR-520b, hsa-miR-20a, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-4255, hsa-let-7i, hsa-miR-373, hsa-let-7e, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-3920, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-380, hsa-miR-616, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-let-7c, hsa-miR-340, hsa-miR-373, hsa-miR-520a-3p, hsa-miR-144, hsa-miR-1265, hsa-miR-548x, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-33b, hsa-miR-26b, hsa-miR-17, hsa-miR-569, hsa-miR-3618, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-922, hsa-miR-302a, hsa-miR-106b, hsa-miR-888, hsa-miR-484, hsa-let-7b, hsa-miR-582-5p, hsa-let-7f, hsa-miR-30b, hsa-miR-524-5p, hsa-miR-302d, hsa-let-7d, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-500a, hsa-miR-570, hsa-miR-548l, hsa-miR-105, hsa-miR-374c, hsa-let-7g hsa-miR-372, hsa-miR-3658, hsa-let-7a, hsa-miR-3908, hsa-miR-302b, hsa-miR-526b, hsa-miR-190, hsa-miR-181b, hsa-miR-433, hsa-miR-98, hsa-miR-3606, hsa-miR-595, hsa-miR-548am, hsa-miR-187, hsa-miR-561, hsa-miR-181a, hsa-miR-3155, hsa-miR-655, hsa-miR-302c, hsa-miR-195, hsa-miR-26a, hsa-miR-590-3p, hsa-miR-30c, hsa-miR-502-5p, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-181c, hsa-miR-520d-5p, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-202, hsa-miR-302e, hsa-miR-513c, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-583, hsa-miR-1297, hsa-miR-7-1, hsa-miR-520d-3p, hsa-miR-3155b, hsa-miR-3182, hsa-miR-519d, hsa-miR-550a, hsa-miR-7-2, hsa-miR-181d, hsa-miR-190b, hsa-miR-1912, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-33a, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-20b, hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-30e, hsa-miR-4262, hsa-miR-636; (elF3의 억제제) hsa-mir-92b-3p　(MIRT040734), hsa-mir-16-5p　(MIRT031705), hsa-mir-18a-3p (MIRT040974), hsa-mir-155-5p (MIRT020771), hsa-mir-484 (MIRT042324), hsa-let-7c-5p (MIRT051776), hsa-miR-3910, hsa-miR-148b, hsa-miR-136, hsa-miR-15a, hsa-miR-488, hsa-miR-500a, hsa-miR-1297, hsa-miR-3159, hsa-miR-374c, hsa-miR-424, hsa-miR-7-1, hsa-miR-186, hsa-miR-195, hsa-miR-15b, hsa-miR-26b, hsa-miR-505, hsa-miR-1206, hsa-miR-653, hsa-miR-1283, hsa-miR-7-2, hsa-miR-196a, hsa-miR-497, hsa-miR-33a, hsa-miR-655, hsa-miR-26a hsa-miR-16, hsa-mir-151a-3p　(MIRT043600), hsa-mir-92a-3p (MIRT049064), hsa-mir-615-3p (MIRT039779), hsa-mir-877-3p (MIRT036964), hsa-mir-222-3p (MIRT046746), hsa-mir-423-3p　(MIRT042468), hsa-mir-324-3p (MIRT042887), hsa-mir-124-3p (MIRT022932), hsa-miR-3140-3p, hsa-miR-124, hsa-miR-198, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-506, hsa-miR-520a-5p, hsa-miR-196a* hsa-miR-3117-3p, hsa-mir-342-5p　(MIRT038210), hsa-mir-378a-5p　(MIRT043981), hsa-mir-615-3p　(MIRT040086), hsa-let-7b-5p　(MIRT052211), hsa-mir-455-3p　(MIRT037879), hsa-miR-4267, hsa-miR-590-3p, hsa-mir-106b-5p　(MIRT044355), hsa-mir-320a　(MIRT044466), hsa-mir-16-5p　(MIRT032018), hsa-mir-155-5p　(MIRT021009), hsa-miR-4302, hsa-mir-191-5p (MIRT045793), hsa-mir-1303 (MIRT035890), hsa-mir-193b-3p (MIRT016316), hsa-mir-222-3p (MIRT046640), hsa-mir-532-3p (MIRT037924), hsa-mir-18a-3p (MIRT040929), hsa-mir-92a-3p (MIRT049001), hsa-miR-582-3p, hsa-miR-4265, hsa-miR-218-2, hsa-miR-1271, hsa-miR-340, hsa-miR-221, hsa-miR-20b, hsa-miR-508-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-4325, hsa-miR-889, hsa-miR-29a, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-129, hsa-miR-96, hsa-miR-3163, hsa-miR-187, hsa-miR-196a, hsa-miR-222, hsa-miR-1179, hsa-miR-182, hsa-miR-9* hsa-miR-32, hsa-miR-143, hsa-miR-4296: (YTHDC1의 억제제) hsa-mir-20a-3p (MIRT038967), hsa-mir-103a-3p (MIRT027037), hsa-mir-1 (MIRT023492), hsa-mir-19b-3p (MIRT031105), hsa-mir-100-5p (MIRT048400), hsa-mir-93-5p (MIRT027989), hsa-mir-16-5p (MIRT031379), hsa-let-7b-5p (MIRT052150), hsa-miR-520f, hsa-miR-300, hsa-miR-15a, hsa-miR-200a, hsa-miR-605, hsa-miR-30d, hsa-miR-30a, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-509-3-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-324-3p, hsa-miR-1248, hsa-miR-152, hsa-miR-548t, hsa-miR-4310, hsa-miR-145, hsa-miR-516a-3p, hsa-miR-16, hsa-miR-3668, hsa-miR-4277, hsa-miR-448, hsa-miR-16-2, hsa-miR-148b, hsa-miR-509-5p, hsa-miR-103a, hsa-miR-1265, hsa-miR-2115, hsa-miR-548c-3p, hsa-miR-148a, hsa-miR-548p, hsa-miR-513a-3p, hsa-miR-497, hsa-miR-3647-3p, hsa-miR-382, hsa-miR-30b, hsa-miR-543, hsa-let-7f-2, hsa-miR-1269, hsa-miR-3164, hsa-miR-503, hsa-miR-500a, hsa-miR-449a, hsa-miR-141, hsa-miR-424, hsa-miR-3908, hsa-miR-889, hsa-miR-2116, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-15b, hsa-miR-181b, hsa-miR-187, hsa-miR-1237, hsa-miR-449b, hsa-miR-101, hsa-miR-381, hsa-miR-618, hsa-miR-222, hsa-miR-181a, hsa-miR-432, hsa-miR-96, hsa-miR-19b, hsa-miR-195, hsa-miR-548n, hsa-miR-485-5p, hsa-miR-217, hsa-miR-30c, hsa-miR-495, hsa-miR-137, hsa-miR-1288, hsa-miR-181c, hsa-miR-3942-5p, hsa-miR-548v, hsa-miR-487a, hsa-miR-221, hsa-miR-891b, hsa-miR-205, hsa-miR-195, hsa-miR-4271, hsa-miR-3611, hsa-miR-516b, hsa-miR-181d, hsa-miR-154, hsa-miR-646, hsa-miR-153, hsa-miR-34a, hsa-miR-19a, hsa-miR-107, hsa-miR-30e 및 hsa-miR-4262로 이루어진 그룹으로부터 선택된 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  295. 제273항에 있어서, 상기 CAR T-세포가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시킴으로써 생성되는, 방법.
  296. 제278항에 있어서, 상기 CAR T-세포의 수의 증대가 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배 및 적어도 10배로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼인, 방법.
  297. 제273항에 따른 방법에 의해 생성된, 증대된 CAR T-세포 집단.
  298. 제274항에 따른 방법에 의해 생성된, 증대된 CAR T-세포 집단.
  299. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포의 생체외 증대 방법으로서, 증대된 CAR T-세포가 이를 필요로 하는 포유동물로 이식시 암 및/또는 혈액 장애를 치료할 능력이 있고, 상기 방법이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 내로 도입하는 단계 및 CAR T-세포 집단을 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  300. 제299항에 있어서, 상기 CAR T-세포가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시킴으로써 수득되는, 방법.
  301. 제299항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  302. 제299항에 있어서, 상기 포유동물이 암을 앓고 있는, 방법.
  303. 제302항에 있어서, 상기 암이 백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈액 암을 포함하는, 방법.
  304. 제299항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는, 방법.
  305. 제299항에 있어서, 상기 돌연변이가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템에 CAR T-세포를 노출시킴으로써 도입되는, 방법.
  306. 제304항에 있어서, 상기 돌연변이가 shRNA를 줄기세포 내로 혼입시켜 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
  307. 제299항에 있어서, CAR T-세포의 수의 증대가 적어도 2배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 8배 및 적어도 10배로 이루어진 그룹으로부터 선택된 배수만큼인, 방법.
  308. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, 상기 키트가 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  309. 제308항에 있어서, 상기 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는, 키트.
  310. 제309항에 있어서, 상기 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 적어도 일부분을 불활성화 또는 결실시키는 Mx1-Cre 표적화 시스템을 포함하는, 키트.
  311. 제309항에 있어서, 상기 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템이 shRNA를 CAR T-세포 집단 내로 혼입시키는 렌티바이러스를 전달하여 m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키기 위한 시약을 포함하는, 키트.
  312. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포(HSC) 집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 후속 이식하기 위해 증대시키기 위한 키트로서, 상기 키트가 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제 및 이의 사용 지침서를 포함하는, 키트.
  313. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  314. 제313항에 있어서, 상기 CAR T-세포가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시킴으로써 수득되는, 방법.
  315. 제313항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 결실을 초래하는, 방법.
  316. 제313항에 있어서, 상기 돌연변이가 Ythdf2를 발현하는 유전자의 발현을 감소시키는 shRNA를 CAR T-세포 집단 내로 혼입시키는, 방법.
  317. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재 하에 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및
    (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  318. 제317항에 있어서, 상기 CAR T-세포가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포유동물 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시킴으로써 수득되는, 방법.
  319. 제317항에 있어서, 상기 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제가 Ythfd2를 억제하는, 방법.
  320. 제317항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  321. 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) m6A mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자의 결실, 대체 또는 감소된 발현을 초래하는 돌연변이를 CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  322. 제321항에 있어서, 상기 CAR T-세포가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시킴으로써 수득되는, 방법.
  323. 제321항에 있어서, 상기 대상체가 암을 앓고 있는, 방법.
  324. 제323항에 있어서, 상기 대상체가 백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 혈액 암을 앓고 있는, 방법.
  325. 암 및/또는 혈액 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) CAR T-세포 집단을 함유하는 샘플을, 샘플 중의 CAR T-세포의 수를 대상체에게 이식하기에 충분한 수까지 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안, m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제의 존재하에, 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 배양물로부터 m6A mRNA 변형 판독인자의 억제제를 제거하는 단계; 및
    (c) CAR T-세포를 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  326. 제325항에 있어서, 상기 CAR T-세포가 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득된 T-세포를 변형시킴으로써 수득되는, 방법.
  327. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 CAR T-세포 집단의 적어도 2배 증대를 초래하기에 충분한 조건 하에 배양함을 포함하는, CAR T-세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 증대된 HSC 집단이 이를 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적합한, 방법.
  328. 제327항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  329. 제328항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 5배인, 방법.
  330. 제329항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  331. 제330항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 10배인, 방법.
  332. 제331항에 있어서, 포유동물이 인간인, 방법.
  333. 제332항에 있어서, 상기 인간이 암 및/또는 혈액 장애를 앓고 있는, 방법.
  334. 암 및/또는 혈액 장애를 앓는 대상체의 치료 방법으로서, 제327항의 방법에 의해 수득된 CAR T-세포 집단을 상기 대상체에게 투여함을 포함하는 방법.
  335. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 포유동물로부터 T-세포 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 T-세포 집단을 키메라 항원 수용체로 변형시켜 CAR T-세포 집단을 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 샘플로부터 CAR T-세포 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서,
    여기서 (i) 상기 CAR T-세포 집단이 적어도 2배 증대되는, 단계
    를 포함하는, 방법
  336. 제335항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  337. 제336항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 5배인, 방법.
  338. 제337항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  339. 제338항에 있어서, 상기 CAR T-세포 집단의 증대가 적어도 10배인, 방법.
  340. 제335항에 있어서, 포유동물이 인간인, 방법.
  341. 제340항에 있어서, 상기 인간이 암 및/또는 혈액 장애를 앓고 있는, 방법.
  342. 제341항에 있어서, 상기 조직 샘플이 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  343. 암 및/또는 혈액 장애를 앓고 있는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 포유동물로부터 T-세포 집단을 포함하는 조직 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 상기 T-세포 집단을 키메라 항원 수용체(CAR)로 변형시켜 CAR T-세포 집단을 형성하는 단계;
    (c) 상기 샘플로부터 CAR T-세포 집단을 시험관내에서 증대시키는 단계로서,
    여기서 (i) 상기 CAR T-세포 집단은 적어도 2배 증대되는, 단계; 및
    (d) 증대된 CAR-T 세포 집단을 대상체에게 이식하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  344. 제343항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 4배인, 방법.
  345. 제344항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 5배인, 방법.
  346. 제345항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 8배인, 방법.
  347. 제346항에 있어서, 상기 HSC 집단의 증대가 적어도 10배인, 방법.
  348. 제343항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  349. 제348항에 있어서, 상기 인간이 백혈병 및 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 암을 앓고 있는, 방법.
  350. 제348항에 있어서, 상기 조직 샘플이 제대혈, 말초혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 수득되는, 방법.
  351. 제350항에 있어서, 상기 샘플이 자가 또는 동종이계 공급원으로부터의 것인, 방법.
  352. 제351항에 있어서, 상기 샘플이 자가 공급원으로부터의 것인, 방법.
  353. 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단의 증대를 필요로 하는 포유동물에서 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포 집단을 증대시키는 방법으로서, N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로의 조정제의 치료적 유효량을 포유동물에서 암 및/또는 혈액 장애를 치료하는 능력을 갖는 CAR T-세포와 함께 CAR T-세포 집단을 적어도 2배 증대시키기에 충분한 시간의 기간 동안 포유동물에게 투여함을 포함하는 방법.
  354. 제353항에 있어서, 상기 조정제가 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함하는, 방법.
  355. 제354항에 있어서, 상기 조정제가 Ythdf2를 발현하는 유전자를 결실시키거나 대체하거나 이의 발현을 감소시키는 돌연변이를 CAR T-세포 집단 내로 도입하기 위한 시스템을 포함하는, 방법.
  356. 제353항에 있어서, 상기 조정제가 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 판독인자의 억제제를 포함하는, 방법.
  357. 제356항에 있어서, 상기 조정제가 Ythdf2의 억제제를 포함하는, 방법.
  358. 제357항에 있어서, 포유동물이 인간인, 방법.
  359. 혈액 장애를 앓는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법이,
    (a) 말초혈, 제대혈 및 골수로 이루어진 그룹으로부터 선택된 조직으로부터 줄기세포 및 T-세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 집단을 수득하는 단계;
    (b) 임의로, 세포 집단이 T-세포를 포함하는 경우, T-세포를 키메라 항원 수용체(CAR)로 변형시켜 CAR T-세포를 제공하는 단계;
    (c) 상기 세포에서 N 6-메틸아데노신(m6A) mRNA 변형 경로를 조정하여 세포의 수를 증대시킴으로써 세포 집단을 증대시키는 단계; 및
    (d) 증대된 세포를 대상체에게 이식하여 혈액 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  360. 제359항에 있어서, 상기 혈액 장애가 백혈병을 포함하는, 방법.
  361. 제359항에 있어서, 상기 세포 집단이 HSC 및 MSC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포를 포함하는, 방법.
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