CN115463155B - 间充质干细胞的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了间充质干细胞，例如胎盘源性间充质干细胞，在增强和/或联合CAR‑T细胞治疗肿瘤的方法，以及相应的用途和组合物，其中所述间充质干细胞增强CAR‑T细胞体内增殖能力和持久性；并且调控CAR‑T细胞的分化，使其保持低分化状态并增加向记忆性细胞亚型的分化。

Description

间充质干细胞的用途

技术领域

本发明涉及细胞治疗领域。具体地，本发明涉及间充质干细胞用于增强免疫疗法的用途和相应的药物组合物。

背景技术

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）是一种人工合成的分子，其通过特异性识别肿瘤细胞表面表达的抗原来引导经基因工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)清除肿瘤(参见Sampson JH等，EGFRvIII mCAR-modified T-celltherapy cures mice with established intracerebralglioma and generates hostimmunity against tumor-antigen loss. Clinical cancer research: an officialjournal of the American Association for Cancer Research. 2014; 20(4):972-984)。例如，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是通过T细胞上的嵌合抗原受体(CAR)分子直接靶向肿瘤细胞的表面抗原，从而达到识别和杀伤肿瘤的目的，其中所述嵌合抗原受体的N端包含识别抗原的胞外域。当所述CAR-T细胞针对的抗原阳性细胞存在时，CAR-T细胞能识别并杀伤这些抗原阳性细胞。CAR-T细胞在治疗恶性肿瘤方面具有明显的优势。越来越多的报道证明，CAR-T细胞在治疗难治性血液病肿瘤方面非常有效（参见Sadelain M等，TherapeuticT cell engineering. Nature. 2017 May 24;545(7655):423-431.；June CH和SadelainM. Chimeric Antigen Receptor Therapy. N Engl J Med. 2018 Jul 5;379(1):64-73.；Brudno JN和Kochenderfer JN. Chimeric antigen receptor T-cell therapies forlymphoma. Nat Rev Clin Oncol. 2018 Jan;15(1):31-46.；Brudno JN等，T CellsGenetically Modified to Express an Anti-B-Cell Maturation Antigen ChimericAntigen Receptor Cause Remissions of Poor-Prognosis Relapsed MultipleMyeloma. J Clin Oncol. 2018 Aug 1;36(22):2267-2280.）。虽然完全缓解率很高，但大多数病人仍会复发；其中有些病人是抗原阴性，有些是抗原低下（参见：Sadelain M等，Therapeutic T cell engineering. Nature. 2017 May 24;545(7655):423-431.；JuneCH和Sadelain M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. N Engl J Med. 2018 Jul 5;379(1):64-73.；Brudno JN等，T Cells Genetically Modified to Express an Anti-B-Cell Maturation Antigen Chimeric Antigen Receptor Cause Remissions of Poor-Prognosis Relapsed Multiple Myeloma. J Clin Oncol. 2018 Aug 1;36(22):2267-2280.；Orlando EJ等，Genetic mechanisms of target antigen loss in CAR19 therapyof acute lymphoblastic leukemia. Nat Med. 2018 Oct;24(10):1504-1506.；SotilloE等，Convergence of Acquired Mutations and Alternative Splicing of CD19Enables Resistance to CART-19 Immunotherapy. Cancer Discov. 2015 Dec;5(12):1282-95.；Gardner R等，Acquisition of a CD19-negative myeloid phenotype allowsimmune escape of MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T-cell therapy. Blood.2016 May 19;127(20):2406-10.；Orlando EJ等，Genetic mechanisms of targetantigen loss in CAR19 therapy of acute lymphoblastic leukemia. Nat Med. 2018Oct;24(10):1504-1506.）。特别是在治疗实体瘤方面，疗效甚微（参见: An Z等，Antitumoractivity of the third generation EphA2 CAR-T cells against glioblastoma isassociated with interferon gamma induced PD-L1. Oncoimmunology. 2021 Aug 16;10(1):1960728.；Xu C等，IL-13Rα2 humanized scFv-based CAR-T cells exhibittherapeutic activity against glioblastoma. Mol Ther Oncolytics. 2022 Jan 10;24:443-451.），仍需很长的路要走。

如果CAR-T疗法的结果不达预期，可能有一个最重要的原因是相关CAR-T细胞的扩增性差，且持久性有限。CAR-T细胞的体内扩增能力和持久性与CAR分子信号强度、细胞因子选择、刺激域和T细胞的表型等等都有关。

此外，临床前和临床研究表明，CAR-T细胞的功能也受到CAR-T细胞的分化的影响。灌注具有天真样（TN）和中央记忆（TCM）表型的CAR-T细胞与T细胞在体内的持久性和优越的抗肿瘤效果有关（参见: Wilkie S等，Selective expansion of chimeric antigenreceptor-targeted T-cells with potent effector function using interleukin-4.J Biol Chem. 2010 Aug 13;285(33):25538-44.；Shum T等，Constitutive Signalingfrom an Engineered IL7 Receptor Promotes Durable Tumor Elimination by Tumor-Redirected T Cells. Cancer Discov. 2017 Nov;7(11):1238-1247.； Sukumaran S等，Enhancing the Potency and Specificity of Engineered T Cells for CancerTreatment. Cancer Discov. 2018 Aug;8(8):972-987.；Liu X等，A Chimeric Switch-Receptor Targeting PD1 Augments the Efficacy of Second-Generation CAR T Cellsin Advanced Solid Tumors. Cancer Res. 2016 Mar 15;76(6):1578-90.；TorresChavez A等，Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cellswith in vivo longevity. J Immunother Cancer. 2019 Nov 28;7(1):330.）。因此，调控CAR-T细胞的分化，使其保持在低分化状态，将大大增强其抗肿瘤效果。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种具有多潜能的基质细胞，在多种组织例如骨髓、脂肪、外周血、脐带、胎盘和其他组织中都有发现。它是临床上最有希望的异体细胞治疗方法。目前，来自骨髓和胎盘的间充质干细胞是本领域最感兴趣的。胎盘中的干细胞相对原始，免疫排斥性低，增殖和分化能力强，易于收集和分离，更重要的是它并不伴随伦理障碍。

间充质干细胞在体外具有固有的免疫调节特性、营养能力、高自我更新能力和强分化潜力。间充质干细胞通过与免疫细胞的直接接触和旁分泌活动影响大多数免疫效应细胞的功能，并且可以很容易地被设计来增强其免疫调节功能（参见：Song N等，MesenchymalStem Cell Immunomodulation: Mechanisms and Therapeutic Potential. TrendsPharmacol Sci. 2020 Sep;41(9):653-664.）。有报道称，MSC通过抑制T细胞的激活和增殖来抑制T细胞的功能（参见：Ghannam S等，Mesenchymal stem cells inhibit human Th17cell differentiation and function and induce a T regulatory cell phenotype. JImmunol. 2010 Jul 1;185(1):302-12.），并发现MSC抑制naive CD4+ T细胞分化为Th17细胞，并抑制IL-17、IL22、IFN-γ和TNF-α的产生（参见：Ghannam S等，Mesenchymal stemcells inhibit human Th17 cell differentiation and function and induce a Tregulatory cell phenotype. J Immunol. 2010 Jul 1;185(1):302-12.），诱导T调节细胞表型或T细胞过敏（参见：Glennie S等，Bone marrow mesenchymal stem cells inducedivision arrest anergy of activated T cells. Blood. 2005 Apr 1;105(7):2821-7.）。关于间充质干细胞对CAR-T功能的影响的报告很少。有报道称骨髓间充质干细胞抑制T细胞反应，但不影响CD19 CAR-T细胞的活性 （参见：Zanetti SR等，Bone marrow MSC frompediatric patients with B-ALL highly immunosuppress T-cell responses but donot compromise CD19-CAR T-cell activity. J Immunother Cancer. 2020 Aug;8(2):e001419.），另一项研究发现IL7-IL12工程间充质干细胞改善CAR-T细胞对结直肠癌细胞的攻击（参见：Hombach AA等，IL7-IL12 Engineered Mesenchymal Stem Cells (MSCs)Improve A CAR T Cell Attack Against Colorectal Cancer Cells. Cells. 2020 Apr3;9(4):873.）。目前，MSC对CAR-T功能的影响仍有争议。间充质干细胞是促进CAR-T功能还是抑制CAR-T功能需要更多的研究。

如何提高CAR-T细胞治疗肿瘤的效果是本领域研究人员的首要目标。

发明内容

本发明首次发现了间充质干细胞对CAR-T功能的影响模式，并且首次提供了间充质干细胞作为CAR-T功能增强剂的用途。具体地，本发明通过将从健康捐赠者和孕妇的胎盘中诱导和培养的间充质干细胞与不同靶标的CAR-T细胞共同培养，从而确认了间充质干细胞对CAR-T细胞杀伤功能的影响，进一步地，本发明首次确认了这种影响通过CAR-T细胞的持久性和分化而体现。

在一个方面，本发明涉及间充质干细胞用于增强免疫疗法疗效的用途，其中所述间充质干细胞表面不表达或实质上不表达被所述免疫疗法所针对的抗原。在一些实施方案中，免疫疗法是细胞疗法，即，施用治疗性细胞的疗法，优选地，治疗性细胞是免疫效应细胞。在一些更具体的实施方案中，治疗性细胞是非特异性免疫效应细胞。在一些更具体的实施方案中，治疗性细胞是特异性免疫效应细胞，优选地，免疫效应细胞是T细胞；优选地，免疫效应细胞是经修饰的免疫效应细胞；更优选地，免疫效应细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，人T细胞是CD8⁺ T细胞。在另一些具体的实施方案中，治疗性细胞是TIL、CAR-NK，TCR-T、CAR-DC、已负载抗原的DC、B细胞等等细胞。

在一些实施方案中，所述免疫疗法针对的疾病是肿瘤。在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤是血液系统肿瘤。在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在一些更具体的实施方案中，所述免疫疗法针对肿瘤所表达的一种或多种肿瘤相关抗原（Tumorassociated antigen，TAA），其中MSC表面不表达或实质上不表达所述肿瘤相关抗原分子。在一个优选的实施方案中，所述肿瘤相关抗原是IL-13Rα2、EphA2、CD19和/或EGFRvIII。

在一些实施方案中，间充质干细胞是骨髓、脂肪、外周血、脐带和/或胎盘来源的。在一些实施方案中，间充质干细胞是脐带和/或胎盘来源的。在一些实施方案中，间充质干细胞是骨髓、脂肪和/或胎盘来源的。在一些实施方案中，间充质干细胞是骨髓和/或胎盘来源的。在一些实施方案中，间充质干细胞是胎盘来源的。

在一些实施方案中，间充质干细胞表达CD105。在一些实施方案中，间充质干细胞不表达CD45。在一些优选的实施方案中，间充质干细胞是CD105⁺CD45^-。在一些优选的实施方案中，间充质干细胞具有被诱导分化为成骨细胞的能力。在一些优选的实施方案中，间充质干细胞具有被诱导分化为成脂细胞的能力。在一些优选的实施方案中，间充质干细胞具有被诱导分化为成软骨细胞的能力。

在一些实施方案中，将所述间充质干细胞与所述免疫效应细胞在体外共培养。在一些实施方案中，将所述间充质干细胞与所述免疫效应细胞共同施用于受试者体内，其中间充质干细胞先于免疫效应细胞施用，或与其同时施用，或在施用免疫效应细胞之后施用。

在一些实施方案中，所述免疫效应细胞与所述间充质干细胞的数量比例为100:1，或90:1，或80:1，或70:1，或60:1，或50:1，或40:1，或30:1，或20:1，或10:1，或5:1，或4:1，或2:1，或1:1，或1:2，或1:4，或1:5，或1:10，或介于其之间的比例。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进所述免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞。在另一些优选的实施方案中，间充质干细胞增强免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）对靶细胞的直接杀伤作用。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）增殖扩增，即，数量增加。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）持久性增加，即，在体内存活/存在的时间延长。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）到达肿瘤区域的能力。在一些具体的实施方案中，所述疗效增强剂促进免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）透过体内屏障（例如，血脑屏障）而使得更多免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）到达肿瘤（例如，胶质细胞瘤）区域，即，增加透过体内屏障（例如，血脑屏障）的免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）的数量。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞调节免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）的分化，使其保持低分化状态。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）更多分化为记忆性细胞亚型。在一些优选的实施方案中，所述增强是通过免疫效应细胞的持久性增加和/或保持在低分化状态和/或更多分化为记忆性效应细胞亚型而实现的。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强细胞疗法至少体现在如以下所述的一项或多项：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力；

(2)增加单个免疫效应细胞体内持久性；

(3)提升由免疫效应细胞分泌的治疗性细胞因子（例如，干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-4、IL-6、IL-10和/或IL-17A）的量；

(4)增强携带靶抗原的细胞的杀伤；

(5)抑制免疫效应细胞（例如，CAR-T细胞）的分化，使其保持低分化状态；

(6)增加记忆性T细胞形成；

(7)增加靶抗原中和/抑制；

(8)延缓病灶进展/缩小病灶体积；

(9)逆转接受治疗的受试者体内对免疫疗法的抑制因素/环境/情形；

(10)提高接受治疗的受试者生存率和/或延长其生存期（即，寿命延长）。

优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强细胞疗法至少体现在如以下所述的一项或多项：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力；

(2)增加单个免疫效应细胞体内持久性；

(3)增强携带靶抗原的细胞的杀伤；

(4)抑制免疫效应细胞（例如，CAR-T细胞）的分化，使其保持低分化状态；

(5)增加记忆性T细胞形成；

(6)延缓病灶进展/缩小病灶体积；

(7)提高接受治疗的受试者生存率和/或延长其生存期（即，寿命延长）。

优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强细胞疗法至少体现在如以下所述的一项或多项：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力或增加单个免疫效应细胞体内持久性；

(2)抑制CAR-T细胞的分化，使其保持低分化状态；

(3)增加记忆性T细胞形成；和

(4)提高接受治疗的受试者生存率和/或延长其生存期。

优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

因而，在另一个方面，本发明提供了间充质干细胞用于增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的用途。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

本发明还提供了间充质干细胞用于调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的用途。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

本发明还提供了间充质干细胞用于促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的用途。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在一个方面，本发明涉及间充质干细胞在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述药物还含有其他细胞。在一个具体的实施方案中，所述其他细胞是免疫效应细胞，且所述间充质干细胞表面不表达或实质上不表达被所述CAR-T细胞所特异性靶向的抗原。

在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤是血液系统肿瘤。在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。

在一些具体的实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些具体的实施方案中，免疫效应细胞是经修饰的，优选地，转导并表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞，即，CAR-T细胞。

在一些具体的实施方案中，特异性免疫效应细胞针对肿瘤所表达的一种或多种肿瘤相关抗原。在一个优选的实施方案中，特异性免疫效应细胞针对的靶TAA是IL-13Rα2、EphA2、CD19或EGFRvIII。

在一些实施方案中，间充质干细胞是胎盘来源的。在一些具体的实施方案中，胎盘来源的间充质干细胞表达CD105且不表达CD45。

在一些实施方案中，将所述间充质干细胞与细胞疗法中所用的治疗性细胞在体外共培养。在一些实施方案中，将所述间充质干细胞与细胞疗法中所用的治疗性细胞共同施用于受试者体内，其中间充质干细胞先于治疗性细胞施用，或与其同时施用，或在施用治疗性细胞之后施用。

在一些实施方案中，所述治疗性细胞与所述间充质干细胞的数量比例为100:1，或90:1，或80:1，或70:1，或60:1，或50:1，或40:1，或30:1，或20:1，或10:1，或5:1，或4:1，或2:1，或1:1，或1:2，或1:4，或1:5，或1:10，或介于其之间的比例。

在一个方面，本发明涉及间充质干细胞与其他细胞联合用于制备抗肿瘤药物的用途，其中所述间充质干细胞表面实质上不表达被其他细胞所特异性靶向的抗原，且所述癌症的细胞表达被其他细胞所特异性靶向的抗原。

在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤是血液系统肿瘤。在一些更具体的实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。

在一些实施方案中，其他细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些具体的实施方案中，免疫效应细胞是经修饰的，优选地，转导并表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞，即，CAR-T细胞。

在一些具体的实施方案中，特异性免疫效应细胞针对肿瘤所表达的一种或多种肿瘤相关抗原。在一个优选的实施方案中，特异性免疫效应细胞针对的靶TAA是IL-13Rα2、EphA2、CD19或EGFRvIII。

在一些实施方案中，间充质干细胞是胎盘来源的。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞表达CD105且不表达CD45。

在一些实施方案中，将所述间充质干细胞与细胞疗法中所用的治疗性细胞在体外共培养。在一些实施方案中，将所述间充质干细胞与细胞疗法中所用的治疗性细胞共同施用于受试者体内，其中间充质干细胞先于治疗性细胞施用，或与其同时施用，或在施用治疗性细胞之后施用。

在一些实施方案中，所述治疗性细胞与所述间充质干细胞的数量比例为100:1，或90:1，或80:1，或70:1，或60:1，或50:1，或40:1，或30:1，或20:1，或10:1，或5:1，或4:1，或2:1，或1:1，或1:2，或1:4，或1:5，或1:10，或介于其之间的比例。

在又一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含间充质干细胞，优选地，胎盘源性间充质干细胞。所述组合物用作免疫疗法的疗效增强剂。在一个具体的实施方案中，所述免疫疗法针对血液系统肿瘤。在另一个具体的实施方案中，所述免疫疗法针对实体瘤。在一个优选的实施方案中，所述免疫疗法的靶分子是IL-13Rα2、EphA2、 CD19或EGFRvIII。

在一些具体的实施方案中，组合物促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞。在另一些具体的实施方案中，组合物增强治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）对靶细胞的直接杀伤作用。在一些具体的实施方案中，组合物促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）增殖，即，数量增加。在一些优选的实施方案中，组合物增强治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）到达肿瘤区域的能力。在一些具体的实施方案中，所述疗效增强剂促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）透过体内屏障（例如，血脑屏障）而使得更多治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）到达肿瘤（例如，胶质细胞瘤）区域，即，增加透过体内屏障（例如，血脑屏障）的治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）的数量。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞调节免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）的分化，使其保持低分化状态。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进免疫效应细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）更多分化为记忆性细胞亚型。在一些优选的实施方案中，所述增强是通过免疫效应细胞的持久性增加和/或保持在低分化状态和/或更多分化为记忆性效应细胞亚型而实现的。

在又一个方面，本发明提供了间充质干细胞的用途，用于制备以下一种或多种：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力和/或单个免疫效应细胞体内持久性的试剂；

(2)使得免疫效应细胞保持低分化状态的免疫效应细胞分化抑制剂；

(3)使得记忆性免疫效应细胞亚型形成增加的试剂；

(4)细胞（优选免疫效应细胞）疗法的疗效增强剂；

其中，优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在又一个方面，本发明提供了间充质干细胞与免疫效应细胞联合用于制备治疗癌症的药物的用途，其中，优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明前述的间充质干细胞（例如，胎盘源性间充质干细胞）或组合物，另外还包含适当的可药用载体。所述可药用载体使得所述药物组合物适合于通过预期的途径给药，例如，但不限于，静脉注射或肿瘤局部注射等等。在一些实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含其他细胞（例如，优选地，治疗性细胞，更优选地，CAR-T细胞）。

在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括向有需要的受试者施用免疫效应细胞，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。在一个实施方案中，受试者具有本文所描述的病症，例如，受试者患有癌症，例如，受试者具有表达本文所述的靶抗原的癌症。在一个实施方案中，受试者是人。

在另一个方面，本发明涉及治疗患有与如本文所述的癌症相关抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，包括向有需要的受试者施用免疫效应细胞，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在又一个方面中，本发明提供了治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用免疫效应细胞，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在又一个方面，本发明提供了增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了体外/离体增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞在体外/离体与间充质干细胞共培养。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了体内增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

本发明还提供了调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了体外/离体调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞在体外/离体与间充质干细胞共培养。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了体内调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

本发明还提供了促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了体外/离体促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞在体外/离体与间充质干细胞共培养。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了体内促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

附图说明

图1-4：健康自然分娩孕妇的胎盘间充质干细胞的表征。图1所示为胎盘源性间充质干细胞的显微镜下形态。图2所示为间充质干细胞体外增殖计数的流程图（上图），以及按照体外六次传代的群体倍增计算间充质干细胞的增殖（下图）。图3所示为通过流式细胞术分析扩增的MSC第3代的免疫表型，纵轴反映细胞数量，横轴代表染色强度。左图显示细胞群体CD45特异性染色（通过抗CD45 mAb）基本为阴性；右图显示细胞群体CD105特异性染色（通过抗CD105 mAb），深色曲线代表同型匹配的阴性对照mAb染色，浅色代表mAb特异性染色的细胞，可见绝大多数细胞可明显被CD105抗体所染色。图4所示为通过茜素红染色显示胎盘源性间充质干细胞的成骨分化能力，诱导成骨分化后可见明显团块、结节样钙沉积被染色。MSC，间充质干细胞，N = 3。

图5：通过流式细胞术检测MSC中肿瘤表面抗原的表达。(A) 阴性对照；(B, C, D)分别检测MSC表面的uPAR、IL13Rα2和CD19的表达。MSC，间充质干细胞。

图6-10：CAR-T细胞的制备和间充质干细胞对体外CAR-T功能的影响。图6所示为特异性靶向CD19、IL13Rα2和uPAR的三种CAR分子的结构示意图。图7所示为CAR-T细胞的制备连同体外功能研究按时间节点的流程图。图8所示为流式细胞仪检测MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞增殖的影响。CAR-T细胞首先与间充质干细胞以10:1的比例共培养24小时，随后收集并以1:1的比例与/不与NALM-6细胞共培养3天，进行流式细胞术分析。相同条件下（包括与/不与NALM-6细胞共培养）未经与MSC共培养的CAR-T细胞作为对照组。图9所示为流式细胞仪检测MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞活化的影响。CAR-T细胞提前与MSC共培养，并与/不与NALM-6共培养6小时。图10所示用CBA方法检测MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞的细胞因子释放的影响。CAR-T细胞与MSC共培养24小时，随后与NALM-6(A)和Raji(B)细胞共培养过夜，E :T比例为1:1，收集共培养的上清液进行细胞因子检测。对于每种细胞因子，5个条形从左向右分别代表单独靶肿瘤细胞组、单独CD19-IL15 CAR-T细胞组、CD19-IL15 CAR-T细胞+靶肿瘤细胞组、经过MSC共培养的CD19-IL15 CAR-T细胞+靶肿瘤细胞组和经过MSC共培养的CD19-IL15 CAR-T细胞组。数据显示为平均值±SEM。"*"代表p < 0.05; "**"代表p < 0.01;"***"代表p < 0.001; MSC: 间充质干细胞，N = 3。CAR-T细胞N = 3。

图11-13：MSC对体外CD19-IL15 CAR-T细胞抗肿瘤功能的影响。图11所示为通过流式细胞术分析MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞抗NALM-6-GL细胞系的影响。CAR-T细胞首先与MSC以10:1的比例共培养，然后与NALM-6-GL共培养，比例为1:1。提供了流式细胞术结果分析图和统计柱状图。图12所示为通过流式细胞术分析MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞抗Raji-GL细胞系的影响。CAR-T细胞事先与间充质干细胞以10:1的比例共同培养，然后与Raji-GL以1:1的比例共同培养，提供了流式细胞术结果分析图和统计柱状图。图13所示为通过检测荧光素酶活性，分析MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞抗NALM-6-GL细胞(A)和抗Raji-GL细胞(B)的影响。其中，CAR-T细胞首先与MSC以10:1的比例共培养，然后收集，并以1:1，2:1，和5:1三个比例与NALM- GL或Raji-GL共培养。"*"代表p＜0.05；"**"代表p＜0.01；"***"代表p＜0.001；GL：eGFP-Luc；MSC：间充质干细胞，N=3；E:T比例为效靶比；CAR-T细胞N = 3。

图14-16：MSC对IL13Rα2 CAR-T细胞抗U87细胞的功能的影响。图14所示为通过流式细胞术分析CD107a的激活情况。CAR-T细胞首先以10:1的比例与间充质干细胞共培养，然后与/不与U87-GL细胞系共培养6小时。图15所示为通过ELISA检测细胞因子的释放。CAR-T细胞与MSC共培养24小时，然后收集并与U87-GL细胞共培养过夜，E:T比例为1:1，获取上清液进行细胞因子检测。对于每种细胞因子，5个条形从左向右分别代表单独U87细胞组、单独IL13Rα2 CAR-T细胞组、IL13Rα2 CAR-T细胞+ U87细胞组、经过MSC共培养的IL13Rα2 CAR-T细胞+ U87细胞组和经过MSC共培养的IL13Rα2 CAR-T细胞组。图16所示为流式细胞术分析抗肿瘤的效果。CAR-T细胞与MSC共培养24小时，然后收集与U87-GL细胞共培养过夜，E:T比例为1:1。提供了流式细胞术结果分析图和统计柱状图。"*"代表p < 0.05；"**"代表p <0.01；"***"代表p < 0.001。GL：eGFP-Luc；MSC：间充质干细胞，N = 3；CAR-T细胞N = 3。

图17-21：MSC对uPAR CAR-T细胞抗H460-GL细胞的功能的影响。图17所示为CAR-T细胞CD107a的激活情况。图18所示为细胞因子释放的检测。图19所示为E:T比例为1:1的体外抗肿瘤效果，提供了流式细胞术结果分析图和统计柱状图。图20所示为通过检测荧光素酶的活性，反映在不同的E: T比例下，uPAR CAR-T细胞的抗肿瘤效果。图21所示为uPARCAR-T细胞对MSC表现出杀伤功能。GL：eGFP-Luc；MSC：间充质干细胞，N = 3；E:T比例为效靶比；CAR-T细胞N = 3。

图22-25：MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞分化的影响。图22所示为流式细胞仪检测TCM表型的分化情况的流式细胞术分析图。CAR-T细胞首先与间充质干细胞共培养24小时，然后收集，并与/不与NALM-6细胞共培养。图23所示为同一测定的统计结果柱状图。图24所示为通过qRT-PCR检测转录因子TCF-7的表达。图25所示为通过ELISA检测细胞因子IL2的释放。CAR-T细胞在不含IL2的培养基中培养3天，与MSC共培养24小时，然后与NALM-6(A)或Raji细胞(B)在不含IL2的相同培养基中培养过夜，获取共培养的上清液进行IL2检测。"*"代表p＜0.05；"**"代表p＜0.01；"***"代表p＜0.001。MSC：间充质干细胞，N = 3；CAR-T细胞N = 3。

图26-29：MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞在NALM-6-GL异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果的影响。图26所示为体内实验的流程图，注明了时间节点。1 × 10⁶个NALM-6-GL细胞经尾静脉注射于NOD-SCID小鼠（N = 12）体内，24小时后通过尾静脉注射1×10⁷个CAR-T细胞，其中包含与/不与MSC共同培养的CAR-T细胞。小鼠的分组方式为随机的3组，每组4只小鼠。图27所示为小鼠的肿瘤荧光成像，图28所示为每只小鼠的荧光相对定量结果，其中CAR-T细胞的对照组成瘤小鼠生存期极短，仅获取前两周的相关数据，这也反映在图29所示的小鼠的生存曲线中。"*"代表p < 0.05; "**"代表p < 0.01; "***"代表p < 0.001。

具体实施方式

如在本文中所用的，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”可以包括多于一个或一种的被指代物，除非上下文另外明确规定。如本文所用，“约”应理解为是指处在该所提及数字的-5％至+5％的范围内。此外，本文中的所有数值范围都应理解为包含该范围内的所有整数或分数。本文所公开的组合物可以不含本文未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包括”或“包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的组分组成”和“由所指明的组分组成”的实施方案的公开内容。

如本文所用，术语“间充质干细胞”，本领域也称为“间质干细胞（mesenchymalstem cell，MSC）”，是指一类源自中胚层的，具有一定分化潜能、可以分化成多种细胞类型的多能基质细胞群。其主要源自和存在于骨髓，此外也包括广泛源自其他“非骨髓”组织的多能细胞，例如：胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质、乳牙牙髓等等组织。

适合于本发明的间充质干细胞

可以通过以下方法产生本文所述的分离的间充质干细胞群体：用组织破坏酶消化包含间充质干细胞的组织（例如，但不限于，骨髓、胎盘、脂肪、脐带、外周血等）以获得包含间充质干细胞的间充质干细胞群体，和从剩余物中分离或基本分离多个间充质干细胞。可以将全部或任何部分的组织消化以获得本文所述的分离的间充质干细胞。

当在原代培养或在细胞培养中培养时，如本文所述使用的间充质干细胞贴壁到组织培养基底上，例如，组织培养容器表面(例如，组织培养塑料制品)。培养中的间充质干细胞呈现出一般成纤维样星形外观，其中多个胞质突从中央细胞体中伸出。然而，由于间充质干细胞显示出比成纤维细胞数目更多的这些过程，因此间充质干细胞在形态上与相同条件下培养的成纤维细胞是可区分的。在形态上，间充质干细胞还与造血干细胞是可区分的，造血干细胞在培养时一般呈现出更圆的或卵石形态。

在本文所公开的技术方案中有用的分离的间充质干细胞(例如，分离的多能间充质干细胞或分离的间充质干细胞群体)是贴壁细胞（例如在组织培养塑料上贴壁），其具有多能细胞或干细胞的特征并且表达可用于鉴别和/或分离所述细胞或包含所述干细胞的细胞群体的多种标志物。

在一些实施方案中，所述分离的间充质干细胞是CD45^-和CD105⁺，如通过流式细胞术所检测的。在一些实施方案中，所述间充质干细胞是CD73⁺、CD90⁺和CD105⁺，并且CD14、CD34和CD45表达水平极低/不表达。在某些实施方案中，分离的间充质干细胞具有分化为神经表型细胞、成骨表型细胞和/或软骨形成表型细胞的潜能。在一个具体的实施方案中，所述间充质干细胞表面表达约95％的CD105，基本上不表达CD45，并在暴露于成骨诱导培养基3-4周后可分化为成骨细胞。

如上所述的分离的间充质干细胞群体一般可以包含约、至少或不超过1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多个分离的间充质干细胞。在本文所述的治疗方法中有用的分离的间充质干细胞群体包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的活的分离的间充质干细胞，例如，如通过(例如)台盼蓝拒染法所确定的。

对于任何上述间充质干细胞或间充质干细胞群体，所述细胞或间充质干细胞群体是或者可以包含已传代了至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20代或更多代，或者扩增了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群体倍增或更多次群体倍增的细胞。

在优选的实施方案中，本发明的间充质干细胞不表达或实质上不表达被细胞疗法所特异性针对的抗原分子。如无另外说明，当本文提及间充质干细胞“不表达”和“实质上不表达”某种抗原时，其具有相同的含义，意指在某个指定的间充质干细胞群体中，只有极少数的细胞，例如，少于20%的细胞，少于19%的细胞，少于18%的细胞，少于17%的细胞，少于16%的细胞，少于15%的细胞，少于14%的细胞，少于13%的细胞，少于12%的细胞，少于11%的细胞，少于10%的细胞，少于9%的细胞，少于8%的细胞，少于7%的细胞，少于6%的细胞，少于5%的细胞，少于4%的细胞，少于3%的细胞，少于2%的细胞或少于1%的细胞表达该抗原至可被检测到的程度；或者，虽然该抗原在多于少数的细胞上表达，但表达量极低，以至于与被细胞正常表达的分子相比，或者与正常表达该抗原分子的细胞上的表达量相比，该表达量可忽略不计，甚至低于常规方法的检测下限。例如，在某些实施方案中，分离的间充质干细胞不表达或实质上不表达被免疫效应细胞（例如，CAR-T细胞）所特异性靶向的抗原。在一些实施方案中，分离的间充质干细胞不表达或实质上不表达CD19。

适合于本发明的胎盘间充质干细胞

可以通过以下方法产生本文所述的分离的胎盘干细胞群体：用组织破坏酶消化胎盘组织以获得包含胎盘干细胞的胎盘细胞群体，和从所述胎盘细胞的剩余物中分离或基本分离多个胎盘干细胞。可以将全部或任何部分的胎盘消化以获得本文所述的分离的胎盘干细胞。在具体的实施方式中，例如，所述胎盘组织可以是整个胎盘(例如，包括脐带)、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合，或任何上述的组合。在其他具体的实施方式中，所述组织破坏酶是胰蛋白酶或胶原酶。在多种实施方式中，包含在得自胎盘消化的细胞群体内的所述分离的胎盘干细胞是所述胎盘细胞群体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。

其中，源自胎盘的间充质干细胞（也可称为胎盘源性间充质干细胞、胎盘衍生间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、胎盘干细胞，上述术语在本文可互换地使用）在来源上可以是胎儿的或母体的(即，可以具有母体或胎儿的基因型)。胎盘干细胞群体或包含胎盘干细胞的细胞群体可以包含仅是胎儿或母体来源的胎盘干细胞，或者可以包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合群体。

本文所述的分离的间充质干细胞和/或胎盘细胞群体(例如，两种或更多种分离的胎盘干细胞)包括直接获自胎盘或其任何部分(例如，绒毛膜、胎盘绒毛叶等)的胎盘干细胞和含有胎盘细胞的细胞群体。分离的胎盘细胞群体还包括培养物中的(即两种或更多种)分离的胎盘干细胞群体和容器(例如，袋)中的细胞群体。

适合于本发明的免疫效应细胞

术语“免疫效应细胞”是来自人体的已分化成（即，不是造血干细胞）能够调节或影响免疫反应的形式或实现的细胞，例如B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞和T细胞。本领域已知收集体内天然存在的免疫效应细胞，任选地并且是优选地在体外经过一定程序的处理之后，转化为治疗产品并施用于患者的治疗方法，即免疫效应细胞疗法。这些细胞疗法产品是癌症治疗新支柱——免疫疗法的重要部分，有效地利用患者自身的免疫系统来攻击肿瘤。免疫效应细胞疗法也可以被设计为促进免疫系统停止攻击自身（在存在自身免疫性疾病的情况下）。

CAR-T细胞疗法是近年来被研究最多的免疫效应细胞疗法。术语“CAR-T”或“CART”是指转导并表达了嵌合抗原受体（CAR）的T淋巴细胞。所述嵌合抗原受体是指一组或多组多肽，当其在免疫效应细胞上表达时，给所述的细胞提供针对靶抗原的特异性，并且具有细胞内信号产生。所述靶抗原被靶细胞（通常是癌细胞）表达。通常，CAR包括至少一个胞外结合区、跨膜区和胞内信号区。示例性的CAR构建方法和/或CAR-T细胞的转导方法记载于例如中国专利公开号CN114014941A之中。在一些具体的实施方案中，所述CAR-T细胞是根据第一代CAR-T技术构建的。在一些具体的实施方案中，所述CAR-T细胞是根据第二代CAR-T技术构建的。在一些具体的实施方案中，所述CAR-T细胞是根据第三代CAR-T技术构建的。在一些具体的实施方案中，所述CAR-T细胞是根据第四代CAR-T技术构建的。在一些具体的实施方案中，所述CAR分子包含胞外特异性靶抗原结合域，优选地，所述靶抗原结合域是scFv。优选地，所述靶抗原结合域是靶抗原的天然相互作用分子，例如但不限于，其配体（当靶抗原是受体时）或其可溶性受体片段（当靶抗原是配体时）。在一些实施方案中，靶抗原选自以下一种或多种:CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1(也被称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319、和19A24)、C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白介素13受体亚基α-2(IL-13Rα2或CD213A2)、间皮素、白介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、路易斯(Y)抗原、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2 / neu)、细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、Prostase、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变的延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(Prosome、Macropain)亚基、β型、9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断点簇区(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(AB1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤血管内皮标记1(TEM1 / CD248)、肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)、Claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组、成员D(GPRC5D)、X染色体开放阅读框61(CXORF61)、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、globoHglycoceramide的己糖部分(GloboH)、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、uroplakin 2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、pannexin 3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K9(LY6K)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)、肾母细胞瘤蛋白(WT1)、癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)、黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)、精子蛋白17(SPA17)、X抗原家族，成员1A(XAGE1)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)、黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)、黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、FOS相关抗原1、肿瘤蛋白质p53(p53)、p53突变体、prostein、存活蛋白、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)、由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)、大鼠肉瘤(Ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、肉瘤易位断点、细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)、ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)、Ras同源物家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)、高级糖化终产物受体(RAGE-1)、肾uibiguitous 1(RU1)、肾uibiguitous 2(RU2)、legumain、人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)、肠羧基酯酶、突变的热休克蛋白70-2(mut hosp 70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)、与免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

在一些实施方案中，被编码的CAR分子结合的肿瘤抗原选自以下一种或多种:TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD44v6、B7H3、KIT、IL-13Rα2、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β，SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1，SLE、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸，PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、ETV6-AML、精子蛋白17，XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17，PAX3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、和IGLL1。

在某些实施方案中，被编码的CAR分子结合的肿瘤抗原选自以下一种或多种：TSHR、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、和 OR51E2。

在一些具体的实施方案中，所述CAR-T细胞的靶抗原选自CD19、IL-13Rα2、EphA2和EGFRvIII。

在一个具体的实施方案中，所述CAR-T细胞的靶抗原是CD19，此类CAR-T细胞的实例如Ying Zhang等，Co-expression IL-15 receptor alpha with IL-15 reducestoxicity via limiting IL-15 systemic exposure during CAR-T immunotherapy. JTransl Med. 2022 Sep 27;20(1):432.中所描述。

在一个具体的实施方案中，所述CAR-T细胞的靶抗原是IL-13Rα2，此类CAR-T细胞的实例如中国专利申请号202210019437.4中所描述。

在一个具体的实施方案中，所述CAR-T细胞的靶抗原是EphA2，此类CAR-T细胞的实例如中国专利申请号202110919075.X和An Z等，Antitumor activity of the thirdgeneration EphA2 CAR-T cells against glioblastoma is associated withinterferon gamma induced PD-L1. Oncoimmunology. 2021 Aug 16;10(1):1960728.中所描述。

在一个具体的实施方案中，所述CAR-T细胞的靶抗原是EGFRvIII，此类CAR-T细胞的实例如中国专利申请号202211140506.3中所描述。

在一些具体的实施方案中，所述CAR分子包含选自以下的跨膜结构域:T细胞受体的α、β、或ζ的跨膜结构域、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和/或NKG2C的跨膜结构域。优选地，所述跨膜结构域是CD28跨膜结构域或CD8跨膜结构域或CD4跨膜结构域。

在一些实施方案中，CAR分子的所述胞外靶抗原结合域由铰链区连接到所述跨膜结构域。在一个实施方案中，铰链区包含CD8铰链的氨基酸序列。在另一个实施方案中，铰链区包含IgG4铰链的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，所述CAR分子包含胞内段。在一些具体的实施方案中，所述胞内段包含共刺激信号结构域，所述共刺激信号传导结构域包含选自如下一种或多种的蛋白质的功能信号传导结构域:CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、或NKG2D，优选地，所述共刺激信号结构域是CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域。

在一些具体的实施方案中，所述胞内段包含选自CD3 ζ、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、常见 FcR γ (FCER1G)、FcR β (Fc ε R1b)、CD79a、CD79b、Fcγ RIIa、DAP10和 DAP12的信号传导结构域的刺激信号结构域，优选地，所述刺激信号结构域是CD3ζ信号传导结构域。在一些具体的实施方案中，所述胞内段进一步包含IL15序列。

在一些实施方案中，所述CAR-T细胞除了外源引入的CAR分子之外，还任选地包含至少另一种修饰，例如通过与CAR分子相同/不同载体引入的其他外源基因，和/或对基因组原有序列的修饰，例如通过基因编辑技术等。

在一些实施方案中，本发明的胎盘间充质干细胞增强了CD19-IL15 CAR-T细胞和IL13 CAR-T细胞的抗肿瘤功能，但抑制了uPAR CAR-T细胞的抗肿瘤功能。在一些实施方案中，间充质干细胞促进CD19-IL15 CAR-T细胞的增殖和激活，并促进细胞因子IL2和IL4的释放。IL-2参与塑造决定T细胞命运的转录和代谢过程。它是T细胞激活和增殖的重要细胞因子，被认为是治疗癌症的一种手段。而IL-4通常被认为是一种典型的Th2细胞因子，但有报道称它能促进人类胸腺和脐带血中的CD4⁺ T细胞转化为CD8⁺ T细胞，并促进记忆性CD8+T细胞的频率和功能，从而促进而不是削弱Th1细胞免疫反应。在一些实施方案中，间充质干细胞促进了CD3⁺ T细胞中TCM表型细胞的比例增加，包括CD4⁺和CD8⁺T细胞。在一个实施方案中，间充质干细胞显著地上调了与T细胞分化有关、参与TCM表型细胞分化和发展的转录因子TCF-7的表达。本领域公知的是，具有较少分化表型的CAR-T细胞，如TN和TCM表型，与自我更新、增殖和存活的特性增加有关。因此此类细胞增多/CAR-T细胞倾向于分化为此类细胞，将使得CAR-T细胞或细胞群的体内活性增强。

术语“肿瘤”和“癌症”在本文中并不互相排斥且可互换地使用，涵盖实体瘤和血液肿瘤，指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。在某些实施方案中，适合于通过本发明的方法来治疗的癌症包括血液癌症，例如，选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性白血病，急性淋巴性白血病(ALL)，B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)，T-细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)，慢性骨髓性白血病(CML)，B细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥散性大B细胞淋巴瘤，滤泡型淋巴瘤，多毛细胞白血病，小细胞或大细胞-滤泡型淋巴瘤，恶性淋巴组织增生状况，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤如Burkitt淋巴瘤等，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞性淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，或白血病前期的一种或多种的癌症。癌症也可以包括实体瘤，例如选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统瘤(CNS)，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性形式。

术语“药物组合物”是指，本发明中的间充质干细胞作为有效成分与可药用载体(根据情况而定)的混合物。药物组合物有助于有效成分向患者的施用。

如本文所用，术语“可药用载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂，稳定剂，分散剂，悬浮剂，稀释剂，赋形剂，增稠剂，溶剂或包封材料，涉及在患者体内或向患者体内携带或运输本发明有用的化合物，使其可以发挥其预期的功能。通常，这种构建物可以被携带至、或从一个器官或身体的一部分运输至另一个器官或身体的一部分。在与制剂的其他成分(包括本发明所述的麝香提取物)相容且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和药物制剂中使用的其他无毒相容物质。如本文所用，“可药用载体”还包括与本发明化合物的活性相容的且对于患者是生理学上可接受的任何和所有包衣、抗细菌和抗真菌剂、和吸收延迟剂等。增补性活性化合物也可以掺入组合物中。“可药用载体”可以进一步包括可用于本发明的化合物的药学上可接受盐。可以包括在本发明的药物组合物中的其他成分是本领域已知的并且描述于例如Remington''s Pharmaceutical Sciences(Genaro，Ed。，Mack Publishing Co.，1985，Easton，PA)，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，配制药物组合物用于静脉内注射。在一些实施方案中，药物组合物包含配制用于静脉内注射的间充质干细胞。在一些实施方案中，药物组合物包含配制用于静脉内注射的间充质干细胞和CAR-T细胞。适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散体、和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水，抑菌水，或达到易于注射程度的流体。可注射组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及它们的合适混合物。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层、在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸、和通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等，可以防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇，山梨糖醇，氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

在一些实施方案中，配制药物组合物适用于在将其中的治疗性细胞用于静脉内注射之前，与本发明的间充质干细胞（例如，优选，胎盘干细胞）共培养，使其治疗效应在体外即得到增强，并将此状态延续至施用于体内后。因此，所述药物组合物中包含间充质干细胞，治疗性细胞（例如，CAR-T细胞），以及适用于两者共培养的培养基，以及可选地，适用于两者共培养的培养容器。

在一些实施方案中，配制药物组合物适用于对来自受试者自身的细胞进行修饰（例如，转基因修饰），并在修饰之后，进行必要的扩增培养和与本发明的间充质干细胞（例如，优选，胎盘干细胞）的共培养，使其治疗效应在体外即得到增强，并将此状态延续至施用于体内后。因此，所述药物组合物中包含间充质干细胞，对来自受试者自身的细胞进行修饰的必需的试剂（例如，转染试剂，转基因构建体，优选地，病毒载体构建体），以及合适的培养基，以及可选地，适用于两者共培养的培养容器。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。对癌症/肿瘤的治疗效果通常包括但不限于例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低或与癌性病症有关的各种生理学症状的改善。

用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方案中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。

用于本文时，疗法的“增强”或“促进”意指能够提升已有免疫疗法（例如，细胞疗法，优选地，CAR-T细胞疗法）的治疗效果，其中已有免疫疗法可以指任何本领域已经使用或知晓的疗法，优选针对癌症的疗法，更优选CAR-T细胞疗法。疗效得到增强，是指相比于没有被本发明的间充质干细胞所增强的已有疗法治疗的患者，在接受了被本发明的间充质干细胞所增强的已有疗法的患者中更加减缓、更加中断、更加阻滞、更加缓解、更加停止、更加降低、或更加逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性，或者副作用更少、治疗体验更好、生存质量更高，或者简而言之，取得了或者基本上取得了比接受没有被本发明的间充质干细胞所增强的已有疗法治疗的患者更好的治疗过程或结局。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进所述治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞。在另一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）对靶细胞的直接杀伤作用。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）增殖扩增，即，数量增加。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）持久性增加，即，在体内存活/存在的时间延长。在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）到达肿瘤区域的能力。在一些具体的实施方案中，所述疗效增强剂促进治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）透过体内屏障（例如，血脑屏障）而使得更多治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）到达肿瘤（例如，胶质细胞瘤）区域，即，增加透过体内屏障（例如，血脑屏障）的治疗性细胞（例如，优选地，CAR-T细胞）的数量。在一些优选的实施方案中，所述增强是通过免疫效应细胞的持久性增加和/或保持在低分化状态和/或更多分化为记忆性效应细胞亚型而实现的。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强细胞疗法至少体现在如以下所述的一项或多项：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力；

(2)增加单个免疫效应细胞体内持久性；

(3)提升由免疫效应细胞分泌的治疗性细胞因子（例如，干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-4、IL-6、IL-10和/或IL-17A）的量；

(4)增强携带靶抗原的细胞的杀伤；

(5)抑制免疫效应细胞（例如，CAR-T细胞）的分化，使其保持低分化状态；

(6)增加记忆性T细胞形成；

(7)增加靶抗原中和/抑制；

(8)延缓病灶进展/缩小病灶体积；

(9)逆转接受治疗的受试者体内对免疫疗法的抑制因素/环境/情形；

(10)提高接受治疗的受试者生存率和/或延长其生存期（即，寿命延长）。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强细胞疗法至少体现在如以下所述的一项或多项：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力；

(2)增加单个免疫效应细胞体内持久性；

(3)增强携带靶抗原的细胞的杀伤；

(4)抑制免疫效应细胞（例如，CAR-T细胞）的分化，使其保持低分化状态；

(5)增加记忆性T细胞形成；

(6)延缓病灶进展/缩小病灶体积；

(7)提高接受治疗的受试者生存率和/或延长其生存期（即，寿命延长）。

在一些具体的实施方案中，间充质干细胞增强细胞疗法至少体现在如以下所述的一项或多项：

(1)增强免疫效应细胞体内增殖能力或增加单个免疫效应细胞体内持久性；

(2)抑制CAR-T细胞的分化，使其保持低分化状态；

(3)增加记忆性T细胞形成；和

(4)提高接受治疗的受试者生存率和/或延长其生存期。

在一些实施方案中，细胞疗法所用的治疗性细胞与间充质干细胞的数量比例为100:1，或90:1，或80:1，或70:1，或60:1，或50:1，或40:1，或30:1，或20:1，或10:1，或5:1，或4:1，或2:1，或1:1，或1:2，或1:4，或1:5，或1:10，或介于其之间的比例。

治疗方法/组合疗法

在一个方面，本发明涉及间充质干细胞用于增强免疫疗法疗效的用途。在一些实施方案中，免疫疗法是细胞疗法，即，施用治疗性细胞的疗法。在一些更具体的实施方案中，治疗性细胞是非特异性免疫效应细胞。在一些更具体的实施方案中，治疗性细胞是特异性免疫效应细胞，优选地，治疗性细胞是T细胞，更优选地，治疗性细胞是经修饰的T细胞，最优选地，治疗性细胞是CAR-T细胞。在一些实施方案中，人T细胞是CD8+ T细胞。在另一些具体的实施方案中，治疗性细胞是CAR-NK，TCR-T、TIL、CAR-DC等等细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括向有需要的受试者施用免疫效应细胞，所述免疫效应细胞任选地是经修饰的，优选地包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。在一个实施方案中，受试者具有本文所描述的病症，例如，受试者患有癌症，例如，受试者具有表达本文所述的靶抗原的癌症。在一个实施方案中，受试者是人。

在另一个方面，本发明涉及治疗患有与如本文所述的癌症相关抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，包括向有需要的受试者施用免疫效应细胞，所述免疫效应细胞任选地是经修饰的，优选地包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在又一个方面中，本发明提供了治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用免疫效应细胞，所述免疫效应细胞任选地是经修饰的，优选地包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在又一个方面，本发明提供了增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了体外/离体增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞在体外/离体与间充质干细胞共培养。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了体内增强免疫效应细胞在施用后的体内增殖能力和/或增加单个免疫效应细胞在施用后的体内持久性的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。优选地，上述方法使得免疫效应细胞在施用于受试者体内后持久性增加。

本发明还提供了调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了体外/离体调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞在体外/离体与间充质干细胞共培养。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了体内调节免疫效应细胞在施用后的体内分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。优选地，上述方法使得免疫效应细胞在施用于受试者体内后保持在低分化状态。

本发明还提供了促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了体外/离体促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞在体外/离体与间充质干细胞共培养。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了体内促进免疫效应细胞在施用后的体内向记忆性细胞亚型分化的方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是经修饰的。优选地，所述免疫效应细胞是T细胞。更优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。优选地，上述方法使得免疫效应细胞在施用于受试者体内后更多分化为记忆性效应细胞亚型。

在另一个方面，本发明提供了包含免疫效应细胞和间充质干细胞的组合物，用于治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病如本文所述的病症的受试者，其中所述免疫效应细胞包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在任何上述方法或用途的某些实施方案中，所述间充质干细胞可与所述免疫效应细胞组合递送，在所述免疫效应细胞施用之前施用，与所述免疫效应细胞同时施用，在所述免疫效应细胞施用之后施用。备选地，免疫效应细胞在施用于受试者之前，与所述间充质干细胞在体外/离体共培养，并且在共培养后，所述间充质干细胞与/不与所述免疫效应细胞组合递送。备选地，间充质干细胞可以在免疫效应细胞施用之后延长的时间后，施用。在一个实施方案中，间充质干细胞与免疫效应细胞或细胞群被同时(例如，在同一天施用)施用于受试者或免疫效应细胞或细胞群施用后(例如，施用后1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，2周，3周，4周，6周，8周，10周或以上) 施用于受试者。

在任何上述方法或用途的实施方案中，还可以进一步组合其他本领域已知的治疗剂/治疗方法，例如，但不限于，免疫检查点抑制剂、靶向药、化疗药物、手术治疗、放疗、其他CAR-T增效剂，等等。

在任何上述方法或用途的实施方案中，还可以进一步组合其他本领域已知的治疗剂/治疗方法，例如，但不限于，免疫检查点抑制剂、靶向药、化疗药物、手术治疗、放疗、其他CAR-T增效剂，等等。

在任何上述方法或用途的实施方案中，在所述共培养/组合递送时，治疗性细胞与间充质干细胞以约选自以下的比例存在：间充质干细胞:治疗性细胞=5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100，或之间的任何比例。

在任何上述方法或用途的实施方案中，经共培养/组合递送，所述免疫效应细胞对目的肿瘤的杀伤效力，相对于未与间充质干细胞共培养也未组合递送的相同免疫效应细胞，得到增强。在优选的实施方案中，杀伤效力增强了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、140%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、100倍、500倍、1000倍或更高，如利用本领域已知的任何评估疾病改善和/或肿瘤消退的指标所评价的。

在任何上述方法或用途的某些实施方案中，与肿瘤抗原，例如，本文所述的肿瘤抗原相关的疾病选自增生性疾病，诸如癌症或恶性肿瘤或癌前病变，如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或与本文所述的肿瘤抗原的表达相关联的非癌症相关的适应证。在一个实施方案中，所述疾病是本文如前所述的癌症。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是本文如前所述的肿瘤抗原。

在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括向有需要的受试者施用经修饰的免疫效应细胞，所述细胞包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，且所述细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。在一个实施方案中，受试者具有本文所描述的病症，例如，受试者患有癌症，例如，受试者具有表达本文所述的靶抗原的癌症。在一个实施方案中，受试者是人。

在一些优选的实施方案中，与所述间充质干细胞的共同培养/共同施用增加了所述免疫效应细胞的疗效。

制药用途/药物组合物

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物用于增强细胞疗法的疗效，其中所述药物组合物包含间充质干细胞。所述细胞疗法向有需要的受试者施用治疗性细胞，所述治疗性细胞是非特异性免疫效应细胞。优选地，所述免疫效应细胞包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，更优选地所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，用于治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病如本文所述的病症的受试者，其中所述药物组合物包含免疫效应细胞和间充质干细胞，且所述免疫效应细胞已经在体外/离体与间充质干细胞共培养，和/或与间充质干细胞共同施用至体内。优选地，所述免疫效应细胞包含CAR分子和/或包含所述CAR分子的编码序列的载体分子，更优选地所述免疫效应细胞是CAR-T细胞。

在任何上述实施方案中，药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其使得所述药物组合物适合于通过预期的途径给药，例如，但不限于，静脉注射或肿瘤局部注射等等。

因此，在另一个方面，本发明提供了间充质干细胞在制备细胞疗法的疗效增强剂中的用途。

本文引用或提及的所有专利，专利申请，出版物，技术文献和/或学术文章以及其他参考文献在法律允许的范围内通过引用的方式，以其全部内容并入本文。

实施例

现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅用于举例说明的目的，本发明不局限于这些实施例，而是涵盖基于本文提供的教导而显而易见的所有变化。

实施例1. 材料和方法

本研究（包括其每个部分，例如其引用或参考的部分）得到了北京世纪坛医院机构审查委员会的批准和所有参与者的知情同意。胎盘来自首都医科大学附属北京世纪坛医院的健康捐赠者。所有处理人类胎盘的方案、间充质干细胞的分离和培养、体外的细胞实验和体内的异种移植小鼠实验都得到了北京世纪坛医院伦理委员会的批准。

胎盘间充质干细胞（pMSC）的分离和培养

胎盘组织的处理方式按照Papait A等的方法（Mesenchymal Stromal Cells fromFetal and Maternal Placenta Possess Key Similarities and Differences:Potential Implications for Their Applications in Regenerative Medicine.Cells. 2020 Jan 6;9(1):127）的基础上稍作修改。首先将胎盘组织浸泡在含有10%青霉素和链霉素的预热磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中10分钟，然后再用PBS清洗两次，并用剪刀剪成1 mm³。通过100μm无菌细胞过滤器获得单个核细胞，并由密度梯度离心分离淋巴细胞。细胞在含有20%FBS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml 青/链霉素的DMEM培养基中，以1×10⁶ 细胞/cm²的密度，在37℃下含5%（v/v）CO₂的湿润空气中维持培养。大约6至8天后，许多集落已经形成。去除未贴附的细胞，补充新鲜培养基。在汇合度达到85%后，用0.25% (w/v) 胰酶/EDTA将粘附的细胞消化，并以5×10³ 细胞/cm² 的细胞密度重新铺种。胎盘细胞在相同条件下连续培养，扩增2至6代（Passage, P）。所有的实验都是用第3代至第6代（即P3和P6）之间收获的细胞在无菌环境中进行的，并尽可能在生物安全柜中进行。

胎盘间充质干细胞（pMSC）的扩增和表征

按照Lechanteur等人（Clinical-scale expansion of mesenchymal stromalcells: a large banking experience. J Transl Med. 2016 May 20;14(1):145.）的方法，通过累积的每代群体倍增数来评估pMSC的扩增情况。将第1代的间充质干细胞以5×10³cells/cm² 的细胞密度铺种在六孔板中。然后每5天收获细胞，用台盼蓝染色计数，并以相同的细胞密度5×10³ 细胞/cm²重新铺种。重复该过程，直到第6代。

pMSC的表征是根据国际细胞治疗学会（ISCT）提出的指南进行的（参见：Viswanathan S等，Mesenchymal stem versus stromal cells: International Societyfor Cell & Gene Therapy (ISCT®) Mesenchymal Stromal Cell committee positionstatement on nomenclature. Cytotherapy. 2019 Oct;21(10):1019-1024.）。培养的pMSC的免疫表型通过流式细胞仪评估。总共1×10⁶ 个第3代细胞，在室温下避光孵育15分钟。使用FACSCanto-II流式细胞仪和flowjo v.10软件（BD Biosciences）进行数据采集和分析。通过在特定的分化诱导培养基中培养3-4周来评估pMSC的分化诱导能力。对于成骨分化的诱导和检测评估参照文献进行：Jaiswal N等，Osteogenic differentiation ofpurified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J CellBiochem 1997;64:295-312.和Xu X等，Dysregulated systemic lymphocytes affect thebalance of osteogenic/adipogenic differentiation of bone mesenchymal stemcells after local irradiation. Stem Cell Res Ther 2017;8:71。间充质干细胞用茜素红染色以检测钙质沉积，并通过检测与诱导成骨细胞形成有关的特定转录因子的mRNA水平表达，以进一步定量评估。使用Trizol从分化的间充质干细胞培养物和对照中提取总mRNA，并使用SYBR Green PCR Master Mix（Fisher Scientific SL）和引物，在罗氏LightCycler 480 II上实施定量RT-PCR（qRT-PCR）分析。反应以一式三份进行，基因表达值归一化至GAPDH的表达值。

细胞系

人B型急性淋巴细胞白血病细胞系NALM-6和人Burkitt淋巴瘤细胞Raji以及逆转录病毒包装细胞系PG13和Phoenix ECO均购自ATCC。通过逆转录病毒转导而被工程化为表达GFP和萤火虫荧光素酶(Luc)的NALM-6和Raji细胞系分别命名为NALM-6-GL和Raji-GL。这些细胞系在含有10%胎牛血清（FBS，Biosera）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（EallBio Life Sciences）的1640培养基（Lonza）中进行良好培养。逆转录病毒生产者细胞系在含有10% FBS的不加青链霉素的1640培养基中培养。

嵌合抗原受体-T细胞的产生

三种特异性靶向CAR-T细胞用于本发明的实施例，包括靶向血液肿瘤抗原CD19的CAR-T细胞，和分别靶向两种实体瘤抗原uPAR和IL13Rα2的CAR-T细胞。CAR通过逆转录病毒载体转移到T细胞中。靶向血液肿瘤抗原CD19的CAR-T细胞的实例如Ying Zhang等，Co-expression IL-15 receptor alpha with IL-15 reduces toxicity via limiting IL-15 systemic exposure during CAR-T immunotherapy. J Transl Med. 2022 Sep 27;20(1):432中所描述。靶向两种实体瘤抗原uPAR和IL13Rα2的CAR-T细胞的实例分别如Amor,C.等，Senolytic CAR T cells reverse senescence-associated pathologies. Nature583, 127–132 (2020).和中国专利申请号202210019437.4中所描述。CAR-T细胞的普适性制备方法可以参照例如此前的论文（An Z等. Antitumor activity of the thirdgeneration EphA2 CAR-T cells against glioblastoma is associated withinterferon gamma induced PD-L1. Oncoimmunology. 2021 Aug 16;10(1):1960728）。

具体地，CAR的详细构造和CAR-T细胞的制备过程见图6和图7。所述CAR的结构由三部分组成，即含有anti-CD19 scFV序列的胞外结构域、CD28的跨膜结构域和用P2A连接的CD28、4-1BB、CD3ζ和IL15序列的胞内结构域。我们以前的研究发现，含有CD28、4-1BB和/或CD3ζ的原代人CD8+T细胞的胞内域在促进细胞因子释放方面比只含有一个或两个结构域的要好（参见：Zhong XS等，Chimeric antigen receptors combining 4-1BB and CD28signaling domains augment PI3kinase/AKT/Bcl-XL activation and CD8+ T cell-mediated tumor eradication. Mol Ther. 2010 Feb;18(2):413-20.）。

使用淋巴细胞分离培养基（MP Biomedicals）通过梯度离心分离来自健康捐赠者的人外周血单个核细胞（PBMC）。用抗CD3/CD28 T细胞活化Dynabeads（Invitrogen）刺激PBMC中的T细胞。珠子激活48小时后，在Retronectin（Takara）-包被板上通过离心法用逆转录病毒上清液转导T细胞。在第7天对T细胞进行免疫印迹检测CAR的表达。T细胞在X-VIVO-15培养基中培养，该培养基含有5%人AB血清（SIGMA）、100U/ml IL-2、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（EallBio Life Sciences）。

流式细胞术分析

使用BD FacsCanto II Plus仪器（BD Biosciences）进行流式细胞测定，并使用FlowJo v.10软件（Tree star, Inc. Ashland, OR）进行分析。使用APC偶联的抗人CD3抗体（BD Biosciences）、V450偶联的抗人CD4（BD Biosciences）、PE-Cy7偶联的抗人CD8（BDBiosciences）、PE-Cy7偶联的抗人CCR7（BD Biosciences）检测T细胞。PE-Cy5偶联的抗人CD95（BD Biosciences），Alexa Fluor 700偶联的抗人CD27（BD Biosciences）和山羊抗小鼠IgG（Fab特异性）F(ab')2片段抗体（Sigma）。用FITC标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（Sigma）染色检测CAR。MSC细胞用PE-Cy7偶联的抗人CD105（ThermoFisher Scientific）和V450偶联的抗人CD45（BD Biosciences）染色。T细胞的脱颗粒现象通过BV421偶联的抗人CD107a-APC（ThermoFisher Scientific）检测。与抗体孵育后，用PBS清洗细胞，然后用含有1% FBS的PBS重悬，上机分析。

检测CAR-T细胞的CD107a脱颗粒

将CAR-T细胞与MSC细胞以10:1的比例共培养24小时，然后收集CAR-T并与NALM-6细胞以1:1的比例在24孔板中共培养，其中每孔都含有1µl抗人CD107a抗体（BDBioscience）和Golgi Stop^TM（BD Bioscience）。6小时后，收获细胞并与抗人CD3抗体（BDBioscience）孵化，通过流式细胞术分析检测CAR-T细胞的CD107a脱颗粒情况。以CD19-IL15CAR-T细胞为例。实验分为四组：（1）事先不与MSC共培养的CAR-T细胞作为对照；（2）事先与MSC共培养的CAR-T细胞；（3）与NALM-6细胞共培养的CAR-T细胞；（4）先与MSC共培养，再收集并与NALM-6细胞共培养的Car-T细胞。

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯稀释试验

利用来自三个健康捐赠者的细胞制备了CAR-T细胞，与NALM-6细胞系进行共培养，并使用基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料的流式细胞术分析T细胞增殖。首先将CFSE标记的CAR-T细胞与MSC细胞在圆底24孔板中以1×10⁶ : 1×10⁵ 细胞/ml的密度（即10:1的比例）共培养24小时，一式三份。然后收集CAR-T细胞并与NALM-6以10:1的配比共培养3天。使用BD FacsCanto II Plus仪器（BD Biosciences）通过CD3阳性细胞的CFSE染料稀释测定T细胞增殖。使用Flow Jo v.10软件（Tree star, Inc. Ashland, OR）分析流式细胞仪数据。本实验的组别与CD107a脱颗粒实验的组别相同。

细胞毒性试验

用两种方法来检测CAR-T细胞的细胞毒性功能。一种是通过流式细胞术检测靶细胞的GFP信号，另一种是用活体成像分析系统检测靶细胞的化学发光。CAR-T细胞首先与MSC细胞以10:1的比例共培养24小时，然后重新收集，并在24孔板中以多种E:T比例（1:1和0.5:1）与NALM-6-GL和Raji-GL细胞系共培养。24小时后，收集细胞，用BD FacsCanto II Plus仪器（BD Biosciences）检测靶细胞，数据使用Flow Jo v.10软件（Tree star, Inc.Ashland, OR）分析。对于化学发光法，将细胞（96孔板）加入底物，然后使用PerkinElmer光化学成像系统收集信号。用活体成像分析系统分析荧光信号的强度来评价CAR-T细胞的细胞毒性。实验包括三组：（1）仅有目标细胞；（2）事先未与MSC共培养的CAR-T细胞与目标细胞共培养；（3）事先与MSC共培养的CAR-T细胞，然后收集与目标细胞共培养。

细胞因子产生测定

CAR-T细胞首先与MSC细胞以10:1的比例共培养24小时，然后重新收集并与NALM-6-GL和Raji-GL细胞系以E:T=1:1的比例在24孔板上共培养。共培养24小时后，收集上清液进行细胞因子检测。根据制造商的程序，使用商业细胞计数珠阵列（CBA）试剂盒（BDBiosciences）评估共培养细胞上清液中人干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-4、IL-6、IL-10和IL-17A的表达。人IFN-γ的水平还通过使用DuoSet® ELISA试剂盒（R&D,Minnesota, USA）按照制造商的说明进行评估。

为了检测细胞因子IL2，CAR-T细胞在不含IL2的培养基中培养3天，然后与间充质干细胞和靶细胞在不含IL2的相同培养基中共同培养。收集上清液，使用DuoSet® ELISA试剂盒（R&D，Minnesota, USA）检测IL2的释放。

细胞亚群分析

CAR-T细胞与MSC细胞以10:1的比例共培养5天，然后重新收集并在24孔板中以10:1的E:T比例与NALM-6-GL和Raji-GL细胞系共培养24小时，然后收集共培养后的细胞进行流式细胞术分析T细胞亚群。

脑内注射NALM-GL细胞的异种移植小鼠模型

六至八周大的雌性NOD-SCID小鼠购自Charles River实验室，并在无病原体的条件下精心饲养。适应性喂养一周后，经尾静脉给NOD-SCID小鼠注射1×10⁶个NALM-6-GL细胞，构建肿瘤异种移植小鼠模型。共12只小鼠被随机分为3组。对照组是只注射了NALM-6-GL的模型组（N = 4）。实验组为CAR-T细胞治疗组，包括CAR-T细胞与间充质干细胞共培养（N =4）和不与间充质干细胞共培养的CAR-T细胞（N = 4）。实验组在模型构建24小时后同样经尾静脉注射1×10⁷/天CAR-T细胞，连续三天。使用活体成像分析系统（IVIS, Xenogen,Alameda, CA, USA），每周通过生物发光成像监测肿瘤的进展。根据首都医科大学附属北京世纪坛医院的实验动物管理规定，小鼠达到安乐死标准后被安乐死。

统计分析

所有数据至少包含三个生物重复，用GraphPad Prism 7软件（GraphPadSoftware, San Diego, CA）进行分析。数据以平均值±SEM表示，使用非配对t检验来评估差异。异种移植小鼠的总体存活率用Kaplan-Meier方法测量，用Cox比例风险回归分析进行分组比较。如果P < 0.05认为差异具有统计学显著性。

实施例2. 胎盘间充质干细胞的扩增和特征分析

我们从8位正常捐赠者的胎盘中分离和培养了间充质干细胞，并参照ISCT列出的标准化标准，通过识别其形态、免疫表型和分化潜能来确定细胞是否是间充质干细胞。使用间充质干细胞标准培养条件和方法，从所有样本中都成功培养出贴壁细胞。这些细胞粘附在塑料上，显示出均匀的纺锤形成纤维细胞的形态（图1）。我们通过台盼蓝染色计算从P1到P6的生长动态，发现来自不同供体胎盘的间充质干细胞的增殖情况基本相同（图2）。我们通过流式细胞术检测了P3的间充质干细胞的免疫表型。结果显示，CD105（MSC的标志之一）呈阳性（>95%），而CD45（造血细胞标记）为阴性（图3）。接下来，我们在体外评估了MSC的诱导分化潜能。来自P3的间充质干细胞被暴露在成骨诱导培养基中，并进行了3-4周的培养。然后用茜素红染色检测钙的沉积。结果显示，在成骨细胞诱导的细胞中检测到明显的钙沉积（图4）。

在探索MSC对CAR-T细胞功能的影响之前，我们首先检测了MSC表面是否表达常见的肿瘤靶抗原。流式细胞仪的结果显示，uPAR在间充质干细胞的表面表达，但CD19和IL13Rα2没有表达（图5）。

实施例3. CAR-T细胞的产生

按照如实施例1中所述的方法构建如前所述的三种CAR分子并转导到T细胞中获得CAR-T细胞，通过流式细胞术验证。

实施例4. pMSC在体外增强了CD19-IL15靶向CAR-T细胞的功能

我们从四个方面评估了MSC对CD19-IL15 CAR-T功能的影响，包括CAR-T增殖、CD107a激活、细胞因子释放和细胞毒性。

在探索MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞增殖影响的实验中，首先将CAR-T细胞与MSC以E:T=10:1的比例共培养24小时，然后收集CAR-T细胞，用CFSE标记，并与NALM-6细胞以E : T的比例共同培养。T的比例为1 : 1。三天后，收获细胞并与适量的抗人类CD3抗体孵化，进行流式细胞术分析。以CFSE标记为对照，在相同条件下将未与MSC共培养的CAR-T细胞与/不与NALM-6细胞共培养。结果显示MSC促进了CAR-T细胞的增殖（图8）。

接下来，我们探讨了MSC对CAR-T细胞CD107a激活的影响。CAR-T细胞也提前与MSC以10 : 1的比例共同培养24小时，然后与/不与NALM-6以1:1的比例共同培养6小时。与/不与NALM-6共培养的未经MSC共培养的CAR-T细胞作为对照。与对照组相比，当CAR-T细胞事先与MSC共培养，然后再与NALM-6共培养，则CD107a阳性细胞比例呈现出明显增加（图9，22.7± 1.36 vs 30.47 ± 1.26，P = 0.0138 ）。

然后，我们收集共培养的细胞的上清液，通过细胞计数珠阵列试剂盒和ELISA检测细胞因子的释放。CAR-T细胞与MSC共培养24小时，然后重新收集并与/不与NALM-6或Raji细胞共培养过夜。如图10的A（涉及NALM-6的结果）和B（涉及Raji的结果）所示，无论是否与MSC共培养，CD19-IL15 CAR-T细胞在抗肿瘤过程中，细胞因子IL10、IL4和IL6、IFN-γ、TNF-α和IL17的释放没有明显变化。当CD19-IL15 CAR-T细胞攻击NALM-6细胞时，发现与MSC共培养的CAR-T细胞中IL4和IL10的分泌量明显增加，而IFN-γ、IL17A和TNF-α的分泌量没有明显变化。当CD19-IL15 CAR-T细胞攻击Raji细胞时，发现与间充质干细胞共培养的CAR-T细胞中IL4和IL17A的分泌量明显增加，而IFN-γ、IL17A和IL10的分泌量没有明显变化。

最后，我们评估了MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞毒性的影响。将CAR-T细胞与MSC以10:1的比例共培养24小时，然后收集CAR-T细胞，与NALM-6-GL和Raji-GL细胞以多种E:T比例共同培养。通过流式细胞仪检测GFP荧光（分别见图11和12）和IVIS成像系统检测荧光素酶活性（分别见图13的A和B）来分析肿瘤细胞的存活情况，从而评估细胞毒功能。如上述附图所表明的，CD19-IL15 CAR-T细胞与间充质干细胞共同培养后，其杀伤能力被显著增强。

实施例5. 间充质干细胞在体外增强靶向IL13Rα2的CAR-T细胞功能

我们还以IL13Rα2靶向的CAR-T细胞为例，探讨了MSC对CAR-T细胞靶向胶质瘤功能的影响。我们从CD107a活性、细胞因子释放和杀伤能力三个方面评估了间充质干细胞对CAR-T细胞靶向IL13Rα2胶质瘤功能的影响。详细的实验方法与前一实施例，即评估MSC对CD19-IL15 CAR-T细胞功能影响的研究方法一致。如图14-16所示，在1 : 1的E :T的比例下，MSC没有引起IL13Rα2 CAR-T细胞的CD107a活化增加，也不影响IFN-γ和IL6的释放（图14、15），但提高了CAR-T细胞的杀伤能力（图16）。

实施例6. 间充质干细胞在体外抑制了uPAR靶向CAR-T细胞的功能

我们发现，MSC对不同的CAR-T细胞有不同的功能。MSC导致了uPAR靶向CAR-T细胞杀伤能力的下降。我们探讨了MSC对uPAR靶向CAR-T细胞功能的影响，发现MSC增强了CD107a的激活（图17），促进了细胞因子IFN-γ的释放（图18），但严重阻碍了其细胞毒性功能（图19-20）。当E: T比例为2 : 1时，MSC使CAR-T细胞的杀伤能力减少22%。当E : T比例为2 : 1时，间充质干细胞使CAR-T细胞的杀伤能力下降22%，并严重破坏杀伤能力；在E : T比例为1: 1时，杀伤力严重受损，导致杀伤力下降高达92%。进一步的研究显示，当E :T比率为1 :1时，uPAR CAR-T细胞杀伤高达77%的间充质干细胞（图21）。

实施例7. MSC调节T细胞分化

探讨了间充质干细胞如何调节CAR-T细胞的功能，并以CD19-IL15 CAR-T细胞为研究对象，寻找间充质干细胞促进CAR-T功能的可能机制。我们发现，间充质干细胞影响了CAR-T细胞的分化。将CAR-T细胞与MSC共培养一天，并收集与/不与NALM-6细胞共培养。然后收集CAR-T细胞来检测T细胞亚群。如 图22-23所示，与CD19-IL15 CAR-T细胞相比，CD3+ 细胞中TCM表型的比例在与MSC共培养的CAR-T细胞中明显增加。进一步分析发现，其在CD4+细胞和CD8+ 细胞中的比例也明显增加。qRT-PCR的结果显示，与T细胞分化有关的转录因子TCF-7的表达明显上调（图24）。同时，我们检测了T细胞增殖和分化的必要细胞因子IL2的分泌。事先将CAR-T细胞与MSC共培养24小时，然后与NALM-6和Raji细胞在不含IL2的X-VIVO-15培养基中共培养过夜。收集上清液，用ELISA检测IL2的含量。如图25所示，与CD19-IL15CAR-T细胞组相比，MSC处理的CAR-T细胞释放的IL2没有明显变化，但当与NALM-6和Raji等肿瘤细胞共培养时，MSC处理的CAR-T细胞分泌的IL2明显增加。

实施例8. 间充质干细胞增强体内CD19-IL15 CAR-T的抗肿瘤能力

通过尾静脉注射NALM-6-eGFP-Luc（NALM-6-GL）细胞构建异种移植小鼠模型，如图26所示，提前一天注射1 × 10⁶ NALM-6-GL细胞，在第0天通过尾静脉注射1×10⁷个CD19-IL15 CAR-T细胞。实验组小鼠注射的CAR-T细胞事先与间充质干细胞体外共培养1天，而对照组小鼠注射的CAR-T细胞未与MSC共培养。另外还设置未注射CAR-T的非治疗对照组。定期对小鼠进行荧光成像。如图27和图28所示，CAR-T治疗组的肿瘤负荷明显低于对照组，但与间充质干细胞处理的CAR-T组与只用CAR-T组之间没有明显差异。观察并统计了小鼠的生存情况。结果发现，CAR-T细胞与间充质干细胞共培养后，小鼠的生存时间明显延长（图29）。

讨论

在上述实施例中，胎盘间充质干细胞增强了CD19-IL15 CAR-T细胞和IL13 CAR-T细胞的抗肿瘤功能，但抑制了uPAR CAR-T细胞的抗肿瘤功能。具体地，结果显示，间充质干细胞促进CD19-IL15 CAR-T细胞的增殖和激活，并促进细胞因子IL2和IL4的释放。IL-2参与塑造决定T细胞命运的转录和代谢过程。它是T细胞激活和增殖的重要细胞因子，并被认为是治疗癌症的一种手段。IL-4通常被认为是一种典型的Th2细胞因子，但有报道称它能促进人类胸腺和脐带血中的CD4+ T细胞转化为CD8+ T细胞，并促进记忆性CD8+ T细胞的数量和功能，从而促进而非削弱Th1细胞免疫反应。我们还发现，间充质干细胞促进了CD3+ T细胞中TCM表型细胞的比例增加，包括CD4+ 和CD8+ T细胞。TCF-7，一种参与TCM表型细胞分化和发展的转录激活剂，表达量显著增加。众所周知，具有较少分化表型的CAR-T细胞，如TN和TCM表型，与自我更新、增殖和存活的特性增加有关。

CAR-T细胞疗法的疗效与CAR-T细胞的活性和持久性密切相关，因此，上述所有结果很好地解释了为什么间充质干细胞可以增强CD19-IL15 CAR-T细胞的抗肿瘤能力。

本文还评估了间充质干细胞是否能促进CD19-IL15 CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中的抗肿瘤疗效。结果显示，体外与间充质干细胞共培养的CAR-T细胞明显延长了NALM-6-GL成瘤小鼠的生存时间。在以往报道中，BM-MSC与CD19 CAR-T和肿瘤细胞共同培养，发现MSC并不能保护肿瘤细胞，也不影响CAR-T细胞的抗肿瘤能力（Zanetti SR等人，Bonemarrow MSC from pediatric patients with B-ALL highly immunosuppress T-cellresponses but do not compromise CD19-CAR T-cell activity. J Immunother Cancer2020;8:e001419.）。然而，在本文中，CD19-IL15 CAR-T细胞首先被MSC刺激，然后收集起来与肿瘤细胞共培养，结果显示其抗肿瘤能力被明显增强。CAR-T细胞在MSC刺激下发生一系列的变化，如表型、细胞因子释放、活化和增殖能力等，导致其抗肿瘤功能的增强。

在这个实验中，我们还发现间充质干细胞抑制了uPAR CAR-T细胞的功能。之前的流式分析结果表明MSC表达uPAR而不表达CD19和IL13Rα2。因此，推测CD19-IL15 CAR-T细胞和IL13Rα2 CAR-T细胞与间充质干细胞共培养时没有杀伤间充质干细胞（数据未显示），但uPAR CAR-T细胞可以经由其靶抗原特异性而攻击间充质干细胞。从而，uPAR CAR-T细胞可能因为杀伤MSC而衰竭，并导致其抗肿瘤能力下降。这一现象表明，间充质干细胞是否对CAR-T细胞的功能有增强作用，一个关键因素在于间充质干细胞是否表达相应的靶抗原。

Claims (3)

1.胎盘间充质干细胞用于制备CAR-T细胞疗法的疗效增强剂的用途，其中所述CAR-T细胞在施用于受试者之前，与所述胎盘间充质干细胞在体外共培养，所述CAR-T细胞靶向的抗原是CD19或IL-13Rα2，所述胎盘间充质干细胞表面实质上不表达被所述CAR-T细胞所特异性靶向的抗原，并且所述疗效增强剂具有以下效果中的至少一项：

1) 增强CAR-T细胞体内增殖能力或增加单个CAR-T细胞体内持久性；和

2) 增加TCM细胞的形成。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述胎盘间充质干细胞经过体外连续培养扩增，培养至第3代至第6代之间收获。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述胎盘间充质干细胞与CAR-T细胞的数量比例为1:10。

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