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Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der diagnostischen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung der Qualität einer biologischen Probe, umfassend die Schritte der Bestimmung der Menge von mindestens einem Biomarker aus den Tabellen 1, 1', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8 in einer Probe und Vergleichen der Menge des mindestens einen Biomarkers mit einer Referenz, wodurch die Qualität der Probe überprüft wird. Die Erfindung betrifft ebenfalls Werkzeuge zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens wie Geräte und Kits.
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Der Wert von biologischem Material, das in Biobanken für jegliche biomedizinische Forschung gelagert wird, die mit Metabolitenprofiling in Zusammenhang steht, z. B. der Möglichkeit der Biomarker-Identifizierung und Validierung, wird durch präanalytische Störfaktoren vermindert, die das Metabolom der Probe beeinträchtigen und zu einem unausgewogenen Studiendesign, erhöhter Variabilität, unberechenbaren Effekten und nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen. Es ist ausschlaggebend, die Qualität von biologischem Material zu überprüfen, um Qualität und Eignung für Metabolitenprofiling oder andere analytische oder diagnostische Verfahren zu gewährleisten. Relevante Störfaktoren sind insbesondere längere Zeit und erhöhte Temperatur bei der Aufbereitung und Lagerung von Blut-, Plasma- oder Serumproben, Auswirkungen des Zentrifugationsprotokolls, Hämolyse, Kontamination mit Blutzellen, beispielsweise durch Dispergieren des Buffy-Coat oder des Blutpfropfens nach der Zentrifugation, Gefrierprotokoll, Mikrogerinnselbildung von Blutproben, die für die Plasmapräparation bestimmt sind, aufgrund z. B. verspäteter oder unzureichender Mischung von Blut mit dem Gerinnungshemmer und andere präanalytische Schritte.
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Es gibt verschiedene Standards für die Qualitätssicherung und Qualitätskontrolle für Biobanken, z. B. ISO 9001, ISO Guide 34, ISO 17025 und andere (siehe z. B. Carter 2011, Biopreservation and Bio-banking 9 (2): 157–163; Elliott 2008, Int. J. Epidemiology 37: 234–244). Um die Qualität des biologischen Materials zu beurteilen, werden derzeit biochemische Standardparameter, wie etwa Nukleinsäuregehalt und -integrität, die Anwesenheit von Gerinnungsaktivität oder Zellzusammensetzung, die Zellintegrität und die Anzahl der Zellen in der Probe bestimmt. Die Evaluierung derartiger Standard-Parameter wird allerdings für eine definiertere Qualitätsbeurteilung für die Metabolom-Analyse nicht geeignet sein.
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Es gibt Dokumente über Protein-Biomarker, welche die Qualität von Proben für die Proteomanalyse sicherstellen (siehe z. B.
WO2012/170669 ). Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Inkubation eine Auswirkung auf die Metabolom-Zusammensetzung von Plasma- und Serumproben aufweist (Liu et al., 2010 Anal. Biochem 406: 105–115; Fliniaux et al., 2011, Journal of Biomolecular NMR 51 (4): 457–465; Boyanton 2002 Clinical Chemistry 48 (12): 2242–2247; Bernini et al., 2011, Journal of Biomolecular NMR 49: 231–243).
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Standards für die Beurteilung der Metabolom-Qualität von biologischem Material sind jedoch noch nicht verfügbar, aber nichtsdestoweniger sehr erwünscht.
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Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, kann als Bereitstellung von Mitteln und Verfahren zur Erfüllung der oben genannten Anforderungen gesehen werden. Das technische Problem wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen und nachfolgend gekennzeichnet sind.
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Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Beurteilung der Qualität einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:
- (a) Bestimmen der Menge von mindestens einem Biomarker aus den Tabellen 1, 1', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8 in der Probe; und
- (b) Vergleichen der Menge des mindestens einen Biomarkers mit einer Referenz, wodurch die Qualität der Probe beurteilt wird.
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Vorzugsweise bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Beurteilung der Qualität einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:
- (a) Bestimmen der Menge von mindestens einem Biomarker aus den Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 8 in der Probe; und
- (b) Vergleichen der Menge des mindestens einen Biomarkers mit einer Referenz, wodurch die Qualität der Probe beurteilt wird.
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Das Verfahren, auf das sich gemäß der vorliegenden Erfindung bezogen wird, umfasst ein Verfahren, das im Wesentlichen aus den vorangehend genannten Schritten oder einem Verfahren besteht, das weitere Schritte umfasst. Es ist jedoch zu verstehen, dass das Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren ist, das ex vivo durchgeführt wird, also nicht am menschlichen oder tierischen Körper praktiziert wird. Das Verfahren kann vorzugsweise durch Automatisierung unterstützt werden.
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In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere der folgenden Schritte: i) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Mittel, das mit mindestens einem Biomarker der vorliegenden Erfindung spezifisch interagiert und Bestimmen der Menge eines Komplexes, der zwischen dem Biomarker und dem Mittel, das spezifisch mit dem Biomarker interagiert, gebildet wird; ii) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Enzym, das spezifisch mit dem mindestens einen Biomarker der vorliegenden Erfindung reagiert, und Bestimmen der Menge des Produkts, das aus dem Biomarker durch das Enzym gebildet wird; iii) Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einem Mittel, das die chemische Struktur des mindestens einen Biomarkers modifiziert, vorzugsweise, um ein nicht-natürlich vorkommendes Derivat des Biomarkers zu bilden, und Nachweisen des Derivats; iv) Verwerfen der Probe im Falle, dass unzureichende Qualität beurteilt wird, und v) Ausschließen der Probe von der weiteren Analyse im Falle, dass unzureichende Qualität beurteilt wird.
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Der Begriff ”Beurteilen”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Unterscheidung zwischen unzureichender und ausreichender Qualität einer Probe für die metabolische Analyse. Unzureichende Qualität einer Probe, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Zusammensetzung einer Probe, die eine ordnungsgemäße Analyse der metabolomischen Zusammensetzung nicht zulässt, während Proben von ausreichender Qualität eine korrekte Analyse der metabolomischen Zusammensetzung ermöglichen. Eine Probe, die von unzureichender Qualität ist, kann eine untaugliche Analyse zur Folge haben, da die metabolische Zusammensetzung in Bezug auf die Mengen an Metaboliten sowie die chemische Natur der Metaboliten verändert ist. Eine unzureichende Qualität kann, vorzugsweise, durch Abbau der Metaboliten und/oder chemische Veränderungen der genannten Metaboliten bewirkt werden. Mehr bevorzugt ist die Qualität der Probe unzureichend wegen der negativen Auswirkungen von präanalytischen Störfaktoren und vorzugsweise wegen einer verlängerten Verarbeitung, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, zellulären Kontamination, unsachgemäßen Lagerungsbedingungen und/oder unsachgemäßem Einfrieren, vorzugsweise langsamem Einfrieren.
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Wie vom Fachmann auf dem Gebiet verstanden wird, kann eine solche Beurteilung, obwohl es bevorzugt ist, gewöhnlicherweise nicht für 100% der untersuchten Proben korrekt sein. Der Begriff erfordert jedoch, dass ein statistisch signifikanter Anteil der Proben korrekt beurteilt werden kann. Ob ein Anteil statistisch signifikant ist, kann ohne weiteres vom Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung verschiedener allgemein bekannter statistischer Auswertungsmittel, z. B. Bestimmung von Konfidenzintervallen, p-Wert-Bestimmung, t-Test nach Student, Mann-Whitney-Test, usw. bestimmt werden. Einzelheiten sind in Dowdy und Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983 beschrieben. Bevorzugte Konfidenzintervalle betragen mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95%. Die p-Werte betragen vorzugsweise 0,2, 0,1 oder 0,05.
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Der Begriff ”Biomarker”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine molekulare Spezies, die als ein Indikator für eine Qualitätsbeeinträchtigung oder Status dient, auf den in dieser Beschreibung Bezug genommen wird. Die molekulare Spezies kann selbst ein Metabolit sein, der in einer Probe von einem Subjekt gefunden wird. Darüber hinaus kann der Biomarker ebenfalls eine molekulare Spezies sein, die sich von dem Metabolit ableitet. In einem solchen Fall wird der tatsächliche Metabolit in der Probe oder während des Bestimmungsprozesses chemisch modifiziert werden und als Ergebnis der Modifikation wird eine chemisch unterschiedliche molekulare Spezies, d. h., der Analyt, die bestimmte molekulare Spezies sein. Es versteht sich, dass in einem solchen Fall der Analyt den tatsächlichen Metaboliten repräsentiert und das gleiche Potential als ein Indikator für die jeweilige Qualitätsbeeinträchtigung aufweist.
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Überdies entspricht ein Biomarker gemäß der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise einer molekularen Spezies. Vielmehr kann der Biomarker Stereoisomere oder Enantiomere einer Verbindung umfassen. Ferner kann ein Biomarker ebenfalls die Summe der Isomeren einer biologischen Klasse isomerer Moleküle repräsentieren. Diese Isomere sollen in einigen Fällen identische analytische Eigenschaften aufweisen und sind daher durch verschiedene analytische Verfahren, einschließlich den in den nachstehend beschriebenen beigefügten Beispielen angewandten, nicht unterscheidbar. Jedoch werden die Isomere mindestens gleiche Summenformel-Parameter und somit in dem Fall von beispielsweise Lipiden eine identische Kettenlänge und identische Anzahl von Doppelbindungen in den Fettsäure- und/oder Sphingobasen-Resten miteinander teilen.
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Polare Biomarker können vorzugsweise durch Techniken erhalten werden, auf die sich in dieser Beschreibung an anderer Stelle bezogen wird und wie in den Beispielen unten beschrieben. Lipid-Biomarker können gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wie in dieser Beschreibung an anderer Stelle beschrieben, und insbesondere entweder als Lipid-Fraktion durch Auftrennung einer Probe nach der Proteinfällung in eine wässrige polare und eine organische Lipidphase, beispielsweise durch eine Mischung aus Ethanol und Dichlormethan, wie in den Beispielen unten beschrieben, erhalten werden. Diese Biomarker können hierin durch ”Lipidfraktion” gekennzeichnet sein. Alternativ oder zusätzlich können Biomarker aus der Probe unter Verwendung von Festphasenextraktion (SPE) angereichert werden.
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Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Metabolit der in den Tabellen 1, 1 ', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8 aufgezeigten Biomarker zu bestimmen. Mehr bevorzugt ist mindestens ein Metabolit der Biomarker, die in den Tabellen 1a, 1b, 1c, 1d, 1a', 1c', 1d', 2a, 2b, 2c, 2d, 2a', 2b', 2c', 2d', 3a, 3c, 3a', 3c', 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 5', 6a, 6b, 6c, 6d, 7a, 7c, 8a, 8b, 8c und/oder 8d angegeben sind, zu bestimmen. Sogar noch mehr bevorzugt ist mindestens ein Metabolit der Biomarker, die in den Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 und/oder 8 aufgezeigt sind, zu bestimmen. Am meisten bevorzugt ist mindestens ein Metabolit der Biomarker, die in den Tabellen 1a, 1b, 1c, 1d, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 5a, 5b, 5c, 5d, 6a, 6b, 6c, 6d, 7a, 7c, 8a, 8b, 8c und/oder 8d angegeben sind, zu bestimmen.
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Vorzugsweise wird in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine Gruppe von Biomarkern bestimmt werden, um die Spezifität und/oder Sensitivität der Beurteilung zu festigen. Eine solche Gruppe umfasst vorzugsweise mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 10 oder bis zu allen Biomarkern, die in den besagten Tabellen aufgezeigt sind. Vorzugsweise ist in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mindestens ein Biomarker pro Tabellennummer zu bestimmen, d. h., mindestens ein Biomarker pro Tabelle X oder X', wobei X = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ist. Noch bevorzugter ist in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mindestens ein Biomarker pro Tabelle X zu bestimmen, d. h., mindestens ein Biomarker von jeder der Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 und/oder 8.
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Ein Metabolit, wie hierin verwendet, bezieht sich auf mindestens ein Molekül eines spezifischen Metaboliten bis zu einer Vielzahl von Molekülen des genannten spezifischen Metaboliten. Es versteht sich weiter, dass eine Gruppe von Metaboliten mehrere chemisch unterschiedliche Moleküle bedeutet, wobei für jeden Metaboliten mindestens ein Molekül bis zu einer Vielzahl von Molekülen vorhanden sein kann. Ein Metabolit gemäß der vorliegenden Erfindung schließt alle Klassen von organischen oder anorganischen chemischen Verbindungen ein, einschließlich solcher, die in biologischem Material, wie Organismen, enthalten sind. Vorzugsweise ist der Metabolit gemäß der vorliegenden Erfindung eine niedermolekulare Verbindung. Noch bevorzugter repräsentiert, falls eine Vielzahl von Metaboliten betrachtet wird, die Vielzahl von Metaboliten ein Metabolom, d. h., die Sammlung von Metaboliten, die in einem Organismus, einem Organ, einem Gewebe, einer Körperflüssigkeit oder einer Zelle zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter spezifischen Bedingungen enthalten ist.
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Zusätzlich zu den spezifischen Biomarkern, die in der Beschreibung angegeben sind, können andere Biomarker und/oder Indikatoren vorzugsweise ebenfalls in den Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Derartige Biomarker können Peptid- oder Polypeptid-Biomarker umfassen, zum Beispiel diejenigen, auf die in
WO2012/170669 , Liu 2010 a. a. O. oder Fliniaux 2011 a. a. O. Bezug genommen wird.
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Der Begriff ”Probe”, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Proben, die biologisches Material und insbesondere metabolische Biomarker umfassen, einschließlich derjenigen, auf die sich hierin bezogen wird. Vorzugsweise ist eine Probe gemäß der vorliegenden Erfindung eine Probe aus Körperflüssigkeiten, vorzugsweise Blut, Plasma, Serum, Speichel oder Urin, oder eine Probe, die beispielsweise durch Biopsie aus Zellen, Geweben oder Organen abgeleitet wird. Noch bevorzugter ist die Probe eine Blut-, Plasma- oder Serumprobe, am meisten bevorzugt eine Plasmaprobe. Die vorangehend genannten Proben können von einem Subjekt gewonnen werden, wie hier an anderer Stelle spezifiziert. Techniken zur Gewinnung der vorangehend genannten verschiedenen Arten von biologischen Proben sind im Stand der Technik wohlbekannt. Zum Beispiel können Blutproben durch Blutentnahme erhalten werden, während Gewebe- oder Organproben beispielsweise durch Biopsie erhalten werden.
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Die vorangehend genannten Proben werden vorzugsweise vorbehandelt, bevor sie für das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, kann die Vorbehandlung Behandlungen umfassen, die erforderlich sind, um die Verbindungen freizusetzen oder abzutrennen oder um überschüssiges Material oder Abfall zu entfernen. Ferner können Vorbehandlungen auf die Sterilisation von Proben und/oder die Entfernung von Verunreinigungen, wie beispielsweise unerwünschte Zellen, Bakterien oder Viren abzielen. Geeignete Techniken umfassen Zentrifugation, Extraktion, Fraktionierung, Ultrafiltration, Proteinpräzipitation mit anschließender Filtration und Aufreinigung und/oder Anreicherung von Verbindungen. Darüber hinaus werden weitere Vorbehandlungen durchgeführt, um die Verbindungen in einer Form oder Konzentration bereitzustellen, die für die Verbindungsanalyse geeignet ist. Wenn beispielsweise Gaschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird es erforderlich sein, die Verbindungen vor der Gaschromatographie zu derivatisieren. Eine andere Art der Vorbehandlung kann die Lagerung der Proben unter geeigneten Lagerbedingungen sein. Lagerbedingungen, wie hierin genannt, umfassen Lagertemperatur, Druck, Feuchte, Zeit sowie die Behandlung der gelagerten Proben mit Konservierungsmitteln. Geeignete und notwendige Vorbehandlungen hängen ebenfalls von den für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mitteln ab und sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt. Vorbehandelte Proben, wie zuvor beschrieben, sind ebenfalls unter dem Begriff ”Probe” eingeschlossen, wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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Die Probe, die gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnet wird, kann vorzugsweise von einem Subjekt stammen. Ein Subjekt, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Tiere und vorzugsweise auf Säugetiere. Mehr bevorzugt ist das Subjekt ein Nagetier und am meisten bevorzugt eine Maus oder eine Ratte oder ein Primat und am meisten bevorzugt ein Mensch. Von dem Subjekt wird vorzugsweise vermutet, dass es an einer Erkrankung oder einem medizinischen Zustand leidet, oder nicht, oder gefährdet ist, eine Erkrankung oder einen medizinischen Zustand zu entwickeln, oder nicht.
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Der Ausdruck ”Bestimmung der Menge”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Bestimmung mindestens eines charakteristischen Merkmals eines Biomarkers, der durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung in der Probe bestimmt werden soll. Charakteristische Merkmale gemäß der vorliegenden Erfindung sind Merkmale, welche die physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften, einschließlich der biochemischen Eigenschaften eines Biomarkers kennzeichnen. Solche Eigenschaften umfassen beispielsweise Molekülmasse, Viskosität, Dichte, elektrische Ladung, Spin, optische Aktivität, Farbe, Fluoreszenz, Chemolumineszenz, elementare Zusammensetzung, chemische Struktur, Fähigkeit, mit anderen Verbindungen zu reagieren, die Fähigkeit, eine Reaktion in einem biologischen Auslesesystem (beispielsweise die Induktion eines Reportergens) und dergleichen hervorzurufen. Werte für diese Eigenschaften können als charakteristische Merkmale dienen und können durch Techniken bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Darüber hinaus kann das charakteristische Merkmal ein beliebiges Merkmal sein, das von den Werten der physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften eines Biomarkers durch Standardoperationen, z. B. mathematische Berechnungen wie Multiplikation, Division oder logarithmisches Rechnen abgeleitet wird. Am meisten bevorzugt gestattet das mindestens eine charakteristische Merkmal die Bestimmung und/oder chemische Identifizierung des mindestens einen Biomarkers und seiner Menge. Dementsprechend umfasst der charakteristische Wert ebenfalls vorzugsweise Informationen, welche mit der Häufigkeit des Biomarkers, von dem der charakteristische Wert abgeleitet ist, in Zusammenhang stehen. Beispielsweise kann ein charakteristischer Wert eines Biomarkers ein Peak in einem Massenspektrum sein. Ein derartiger Peak enthält charakteristische Informationen des Biomarkers, d. h., die m/z-Information, sowie einen Intensitätswert, der mit der Häufigkeit des Biomarkers (d. h., seiner Menge) in der Probe in Zusammenhang steht.
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Wie zuvor besprochen, kann jeder Biomarker, der in einer Probe enthalten ist, vorzugsweise gemäß der vorliegenden Erfindung quantitativ oder halbquantitativ bestimmt werden. Zur quantitativen Bestimmung wird entweder die absolute oder genaue Menge des Biomarkers bestimmt werden, oder die relative Menge des Biomarkers wird auf der Grundlage des für das/die charakteristische(n) Merkmal(e) bestimmten Wertes, auf den sich vorangehend bezogen wurde, bestimmt werden. Die relative Menge kann in einem Fall festgestellt werden, in welchem die genaue Menge eines Biomarkers nicht ermittelt werden kann oder soll. In dem Fall kann bestimmt werden, ob die Menge, in welcher der Biomarker vorliegt, bezüglich einer zweiten Probe, welche den Biomarker in einer zweiten Menge umfasst, vergrößert oder verringert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform soll die zweite Probe, die den Biomarker umfasst, eine berechnete Referenz sein, wie hier an anderer Stelle spezifiziert ist. Quantitativ einen Biomarker zu analysieren umfasst somit ebenfalls, was manchmal als halbquantitative Analyse eines Biomarkers bezeichnet wird.
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Darüber hinaus umfasst das Bestimmen, wie in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, vorzugsweise die Verwendung eines Verbindungs-Trennungsschrittes vor dem Analyseschritt, der zuvor genannt wurde. Vorzugsweise ergibt der Verbindungs-Trennungsschritt eine zeitlich aufgelöste Trennung der Metaboliten, die in der Probe enthalten sind. Die für die Trennung geeigneten Techniken, die vorzugsweise gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen folglich alle chromatographischen Trennverfahren, wie beispielsweise Flüssigkeitschromatographie (LC), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC), Dünnschichtchromatographie, Größenausschluss- oder Affinitätschromatographie. Diese Techniken sind im Stand der Technik gut bekannt und können vom Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteren Aufwand angewendet werden. Am meisten bevorzugt sind LC und/oder GC die chromatographischen Techniken, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden. Geeignete Vorrichtungen für eine derartige Bestimmung von Biomarkern sind im Stand der Technik wohlbekannt. Vorzugsweise wird Massenspektrometrie verwendet, insbesondere Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), direkte Infusions-Massenspektrometrie oder Fourier-Transformations-Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometrie (FT-ICR-MS), Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie (HPLC-MS), Quadrupol-Massenspektrometrie, jede Art von sequenziell gekoppelter Massenspektrometrie, wie beispielsweise MS-MS oder MS-MS-MS, induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS), Pyrolyse-Massenspektrometrie (Py-MS), Ionenbeweglichkeits-Massenspektrometrie oder Flugzeit-Massenspektrometrie (TOF). Am meisten bevorzugt werden LC-MS und/oder GC-MS verwendet, wie ausführlich nachfolgend beschrieben. Die Techniken sind beispielsweise in Nissen 1995, Journal of Chromatography A, 703: 37–57,
US 4.540.884 oder
US 5.397.894 offenbart, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Als eine Alternative oder zusätzlich zu Massenspektrometrietechniken können die folgenden Techniken zur Verbindungsbestimmung verwendet werden: Kernmagnetresonanz (NMR), Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), Fouriertransformations-Infrarotanalyse (FT-IR), Ultraviolett-(UV-)Spektroskopie, Brechungsindex (RI), Fluoreszenznachweis, radiochemischer Nachweis, elektrochemischer Nachweis, Lichtstreuung (LS), dispersive Raman-Spektroskopie oder Flammenionisations-Detektion (FID). Diese Techniken sind dem Fachmann allgemein bekannt und können ohne weiteres angewendet werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung soll vorzugsweise durch Automatisierung unterstützt werden. Beispielsweise können Probenverarbeitung oder Vorbehandlung mit Hilfe der Robotik automatisch durchgeführt werden. Datenverarbeitung und Vergleich werden vorzugsweise durch geeignete Computerprogramme und Datenbanken unterstützt. Die Automatisierung, wie hierin vorangehend beschrieben, ermöglicht unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung Vorgehensweisen mit hohem Probendurchsatz.
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Darüber hinaus kann der mindestens eine Biomarker ebenfalls durch einen spezifischen chemischen oder biologischen Assay bestimmt werden. Der Assay soll Mittel umfassen, welche es gestatten, den mindestens einen Biomarker in der Probe spezifisch zu detektieren. Vorzugsweise sind die Mittel zur spezifischen Erkennung der chemischen Struktur des Biomarkers in der Lage oder sie sind zur spezifischen Identifizierung des Biomarker auf der Grundlage seiner Fähigkeit, mit anderen Verbindungen zu reagieren, oder seiner Fähigkeit, eine Reaktion in einem biologischen Ablesungssystem auszulösen (z. B. Induktion eines Reporter-Gens) in der Lage. Mittel, welche zum spezifischen Erkennen der chemischen Struktur eines Metaboliten in der Lage sind, sind vorzugsweise Antikörper oder andere Proteine, die spezifisch mit chemischen Strukturen, wie Rezeptoren oder Enzymen Wechselwirken. Spezifische Antikörper können, zum Beispiel, unter Verwendung des Biomarkers als Antigen mit im Stand der Technik gut bekannten Verfahren erhalten werden. Antikörper, wie hierin verwendet, umfassen sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sowie Fragmente davon, wie beispielsweise Fv-, Fab- und F(ab)2-Fragmente, die zur Bindung des Antigens oder Haptens in der Lage sind. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls humanisierte Hybridantikörper ein, wobei die Aminosäuresequenzen von einem nicht-menschlichen Donor-Antikörper, welcher eine gewünschte Antigen-Spezifität aufweist, mit Sequenzen eines menschlichen Akzeptor-Antikörpers kombiniert werden. Darüber hinaus sind Einzelketten-Antikörper eingeschlossen. Die Donor-Sequenzen werden gewöhnlicherweise mindestens die Antigen-bindenden Aminosäurereste des Donors umfassen, sie können allerdings ebenfalls andere strukturell und/oder funktionell relevante Aminosäurereste des Donorantikörpers umfassen. Derartige Hybride können durch verschiedene im Stand der Technik allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden. Geeignete Proteine, die zum spezifischen Erkennen des Biomarkers in der Lage sind, sind vorzugsweise Enzyme, die an der metabolischen Umwandlung des genannten Biomarker beteiligt sind. Die Enzyme können entweder den Biomarker als ein Substrat verwenden oder sie können ein Substrat in den Biomarker umwandeln. Überdies können die Antikörper als eine Grundlage verwendet werden, um Oligopeptide zu erzeugen, die spezifisch den Biomarker erkennen. Diese Oligopeptide sollen beispielsweise die Bindungsdomänen oder -taschen des Enzyms für den Biomarker umfassen. Geeignete Antikörper und/oder Enzym-basierte Assays können RIA (Radioimmunoassay), ELISA (Enzym-Linked Immunosorbent Assay), Sandwich-Enzym-Immuntests, Elektrochemilumineszenz-Sandwich-Immunoassays (ECLIA), durch Dissoziation verstärkten Lanthanidfluor-Immunoassay (DELFIA) oder Festphasen-Immuntests sein. Darüber hinaus kann der Biomarker auch auf der Grundlage seiner Fähigkeit, mit anderen Verbindungen zu reagieren, d. h., durch eine spezifische chemische Reaktion, bestimmt werden. Ferner kann der Biomarker in einer Probe aufgrund seiner Fähigkeit, eine Reaktion in einem biologischen Ablesungssystem auszulösen, bestimmt werden. Die biologische Reaktion soll als Ablesung nachgewiesen werden, was das Vorhandensein und/oder die Menge des Biomarkers, der in Probe enthalten ist, anzeigt. Die biologische Reaktion kann beispielsweise die Induktion der Genexpression oder eine phänotypische Antwort einer Zelle oder eines Organismus sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bestimmung des mindestens einen Biomarkers ein quantitatives Verfahren, was beispielsweise ebenfalls die Bestimmung der Menge des mindestens einen Biomarkers in der Probe ermöglicht.
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Wie oben beschrieben, kann die Bestimmung des mindestens einen Biomarkers vorzugsweise Massenspektrometrie (MS) umfassen. Massenspektrometrie, wie hierin verwendet, umfasst alle Verfahren, welche die Bestimmung des Molekulargewichts (d. h. der Masse) oder einer Massenvariablen erlauben, die einer Verbindung, also einem Biomarker, entspricht, die gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden soll. Vorzugsweise, wie hier verwendet, bezieht sich Massenspektrometrie auf GC-MS, LC-MS, Direktinfusions-Massenspektrometrie, FT-ICR-MS, CE-MS, HPLC-MS, Quadrupol-Massenspektrometrie, jede sequenziell gekoppelte Massenspektrometrie, wie beispielsweise MS-MS oder MS-MS-MS, ICP-MS, Py-MS, TOF oder irgendwelche kombinierten Ansätze unter Verwendung der vorangehend genannten Techniken. Wie diese Techniken anzuwenden sind, ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Außerdem sind geeignete Geräte im Handel erhältlich. Weiter bevorzug bezieht sich Massenspektrometrie, wie hierin verwendet, auf IC-MS und/oder GC-MS, d. h., Massenspektrometrie, die funktionell mit einem vorausgehenden chromatographischen Trennungsschritt verbunden ist. Noch bevorzugter, wie hier verwendet, umfasst Massenspektrometrie Quadrupol-MS. Am meisten bevorzugt wird die Quadrupol-MS wie folgt durchgeführt: a) Auswahl eines Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) von einem Ion, das durch Ionisation in einem ersten analytischen Quadrupol des Massenspektrometers erzeugt worden ist, b) Fragmentierung des Ions, das in Schritt a) ausgewählt ist, durch Anlegen einer Beschleunigungsspannung in einem weiteren nachfolgenden Quadrupol, der mit einem Kollisionsgas gefüllt ist und als Kollisionskammer wirkt, c) Auswahl eines Masse/Ladungs-Quotienten von einem Ion, das durch das Fragmentierungsverfahren in Schritt b) in einem zusätzlichen nachfolgenden Quadrupol erzeugt worden ist, wobei die Schritte a) bis c) des Verfahrens mindestens einmal durchgeführt werden, und Analyse des Masse/Ladungs-Quotienten aller in der Mischung von Substanzen vorhandenen Ionen als Ergebnis des Ionisationsprozesses, wobei der Quadrupol während der Analyse mit Kollisionsgas gefüllt ist, aber keine Beschleunigungsspannung angewendet wird. Einzelheiten zu der am meisten bevorzugten Massenspektrometrie, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, können in
WO2003/073464 gefunden werden.
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Noch mehr bevorzugt ist die Massenspektrometrie-Flüssigkeitschromatographie-(IC-), MS und/oder Gaschromatographie-(GO-)MS. Flüssigkeitschromatographie, wie hierin verwendet, bezieht sich auf alle Verfahren, welche die Trennung von Verbindungen (d. h., Metaboliten) in flüssiger oder überkritischer Phase ermöglichen. Flüssigkeitschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen in einer mobilen Phase durch die stationäre Phase geleitet werden. Wenn Verbindungen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die stationäre Phase hindurchgehen, werden sie mit der Zeit getrennt, da jede einzelne Verbindung ihre spezifische Retentionszeit besitzt (d. h., die Zeit, die von der Verbindung benötigt wird, um durch das System hindurchzugehen). Flüssigkeitschromatographie, wie hierin verwendet, schließt ebenfalls HPLC ein. Geräte für die Flüssigkeitschromatographie sind im Handel erhältlich, z. B. von Agilent Technologies, USA. Gaschromatographie, die gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet wird, arbeitet im Prinzip vergleichbar zur Flüssigkeitschromatographie. Anstatt jedoch die Verbindungen (d. h., die Metabolite) in einer flüssigen mobilen Phase aufzuweisen, die durch die stationäre Phase hindurchgeleitet wird, sind die Verbindungen in einem gasförmigen Volumen vorhanden. Die Verbindungen passieren die Säule, die feste Trägermaterialien als stationäre Phase enthalten kann, oder deren Wände, die als stationäre Phase dienen können oder mit dieser beschichtet sind. Wiederum weist jede Verbindung eine spezifische Zeit auf, die benötigt wird, um durch die Säule hindurchzulaufen. Darüber hinaus ist in dem Fall der Gaschromatographie es vorzugsweise in Betracht gezogen, dass die Verbindungen vor der Gaschromatographie derivatisiert werden. Geeignete Verfahren zur Derivatisierung sind im Stand der Technik gut bekannt. Vorzugsweise bezieht sich Derivatisierung gemäß der vorliegenden Erfindung auf Methoximierung und Trimethylsilylierung von vorzugsweise polaren Verbindungen und Transmethylierung, Methoximierung und Trimethylsilylierung von vorzugsweise nicht-polaren (d. h., lipophilen) Verbindungen.
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Der Begriff ”Referenz” bezieht sich auf Werte von charakteristischen Merkmalen eines jeden der Biomarker, die mit einer unzureichende Qualität der Probe korreliert werden können. Vorzugsweise ist eine Referenz ein Schwellenwert (beispielsweise eine Menge oder ein Mengenverhältnis) für einen Biomarker, wodurch der Schwellenwert den Bereich möglicher Werte für die charakteristischen Merkmale in einen ersten und einen zweiten Teil unterteilt. Einer dieser Anteile ist mit unzureichender Qualität verbunden, während der andere mit ausreichender Qualität verbunden ist. Der Schwellenwert selbst kann ebenfalls entweder mit ausreichender oder unzureichender Qualität verbunden sein. Im Falle, dass der Schwellenwert mit unzureichender Qualität verbunden ist, zeigen Werte, die in einer zu untersuchenden Probe festgestellt werden, die dementsprechend im Wesentlichen mit dem Schwellenwert identisch sind oder die in den mit unzureichender Qualität assoziierten Bereich fallen, eine unzureichende Qualität der Probe an. Im Falle, dass der Schwellenwert mit ausreichender Qualität verbunden ist, zeigen Werte, die in einer zu untersuchenden Probe festgestellt werden, die im Wesentlichen mit dem Schwellenwert identisch sind oder die in den mit ausreichender Qualität assoziierten Bereich fallen, eine ausreichende Qualität der Probe an.
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Gemäß dem oben erwähnten Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine Referenz vorzugsweise eine Referenz, die aus einer Probe oder mehreren Proben erhalten wurde (d. h., vorzugsweise mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 10, 50 oder 100 Proben) von denen bekannt ist, dass sie von unzureichender Qualität sind. In einem solchen Fall kann ein Wert für den mindestens einen Biomarker, der in der Testprobe gefunden wird, der im Wesentlichen identisch ist, indikativ für eine unzureichende Qualität sein, während ein Wert für den mindestens einen Biomarker, der in der Testprobe gefunden wird, welcher verschieden ist, indikativ für eine ausreichende Qualität sein.
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Vorzugsweise ist gemäß dem oben erwähnten Verfahren der vorliegenden Erfindung die Referenz von einer Probe oder mehreren Proben abgeleitet, von denen bekannt ist, dass sie von unzureichender Qualität sind. Noch mehr bevorzugt ist in einem derartigen Fall eine Menge des mindestens einen Biomarkers in der Probe, die im Wesentlichen identisch mit der Referenz ist, für eine unzureichende Qualität indikativ, während eine Menge, die sich davon unterscheidet, für eine ausreichende Qualität indikativ ist.
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Ebenfalls bevorzugt ist die Referenz aus einer Probe oder mehreren Proben abgeleitet, von denen bekannt ist, dass sie von ausreichender Qualität sind. Noch mehr bevorzugt ist in einem derartigen Fall eine Menge des mindestens einen Biomarkers in der Probe, die im Wesentlichen identisch mit der Referenz ist, für eine auszureichende Qualität indikativ, während eine Menge, die sich davon unterscheidet, für eine unzureichende Qualität indikativ ist.
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Die relativen Werte oder Grade der Veränderungen des mindestens einen Biomarkers der Individuen der Population kann bestimmt werden, wie hierin an anderer Stelle spezifiziert ist. Wie ein geeigneter Referenzwert zu berechnen ist, vorzugsweise der Mittelwert oder Medianwert, ist im Stand der Technik gut bekannt.
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Der Wert für den mindestens einen Biomarker der Testprobe und die Referenzwerte sind im Wesentlichen identisch, wenn die Werte für die charakteristischen Merkmale und, im Fall der quantitativen Bestimmung, die Intensitätswerte im Wesentlichen identisch sind. Im Wesentlichen identisch bedeutet, dass die Differenz zwischen beiden Werten vorzugsweise nicht signifikant ist und sie soll dadurch gekennzeichnet sein, dass die Werte für die Intensität innerhalb von mindestens dem Intervall zwischen 1. und 99. Perzentil, 5. und 95. Perzentil, 10. und 90. Perzentil, 20. und 80. Perzentil, 30. und 70. Perzentil, 40. und 60. Perzentil des Referenzwertes, vorzugsweise dem 50., 60., 70., 80., 90. und 95. Perzentil des Referenzwerts liegen. Ein statistischer Test zur Bestimmung, ob zwei Mengen im Wesentlichen identisch sind, sind im Stand der Technik gut bekannt und werden ebenfalls an anderer Stelle beschrieben.
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Ein beobachteter Unterschied für zwei Werte soll andererseits statistisch signifikant sein. Ein Unterschied in dem relativen oder absoluten Wert ist vorzugsweise signifikant außerhalb des Intervalls zwischen dem 45. und 55. Perzentil, 40. und 60. Perzentil, 30. und 70. Perzentil, 20. und 80. Perzentil, 10. und 90. Perzentil, 5. und 95. Perzentil, 1. und 99. Perzentil des Referenzwertes. Bevorzugte relative Änderungen der Mediane oder der Grade von Veränderungen sind in den beigefügten Tabellen sowie in den Beispielen beschrieben. In den folgenden Tabellen ist eine bevorzugte relative Änderung der Biomarker als ”hoch” für eine Erhöhung und ”runter” für eine Verminderung in der Spalte ”Richtung der Veränderung” angezeigt. Die Werte für die bevorzugten Grade der Veränderungen werden in der Spalte ”geschätzte x-fache Änderung” angezeigt. Die bevorzugten Referenzen für die vorangehend genannten relativen Veränderungen oder Grade der Veränderungen werden in den nachstehenden Tabellen ebenfalls angegeben. Es versteht sich, dass diese Änderungen vorzugsweise im Vergleich zu den in den jeweiligen nachfolgenden Tabellen angegeben Referenzen beobachtet werden.
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Vorzugsweise wird die Referenz, d. h. Werte für mindestens ein charakteristisches Merkmal des mindestens einen Biomarkers oder Verhältnisse davon, in einem geeigneten Datenspeichermedium gespeichert, wie beispielsweise einer Datenbank, und sind somit ebenfalls für zukünftige Beurteilungen verfügbar.
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Der Begriff ”Vergleichen” bezieht sich auf die Bestimmung, ob der ermittelte Wert eines Biomarkers im Wesentlichen zu einer Referenz identisch oder davon verschieden ist. Vorzugsweise wird ein Wert für einen Biomarker als von einer Referenz abweichend erachtet, wenn die beobachtete Differenz statistisch signifikant ist, was durch statistische Methoden bestimmt werden kann, auf die an anderer Stelle in dieser Beschreibung Bezug genommen wird. Wenn der Unterschied statistisch nicht signifikant ist, sind der Biomarker-Wert und die Referenz im Wesentlichen identisch. Basierend auf dem Vergleich, wie vorangehend angeführt, kann die Qualität einer Probe beurteilt werden, d. h., es kann überprüft werden, ob die Probe von ausreichender Qualität ist oder nicht.
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Für die spezifischen Biomarker, auf die sich in dieser Beschreibung bezogen wird, sind bevorzugte Werte für die Veränderungen in den relativen Mengen oder Verhältnissen (d. h., nur die Änderungen, die als Verhältnisse der Mediane ausgedrückt sind) in den Tabellen unten angegeben. Basierend auf den Verhältnissen der Biomarker und der berechneten p-Werte, wie in den Tabellen 1, 1 ', 2, 2', 3, 3 ', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8 nachfolgend, vorzugsweise Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 8 nachfolgend angegeben, kann abgeleitet werden, ob eine Zunahme oder eine Abnahme eines gegebenen Biomarkers indikativ für eine Probe von unzureichender Qualität ist.
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Der Vergleich wird vorzugsweise durch Automatisierung unterstützt. Beispielsweise kann ein geeignetes Computerprogramm, das Algorithmen für den Vergleich von zwei verschiedenen Datensätzen aufweist (zum Beispiel Datensätze, welche die Werte von dem/den charakteristischen Merkmal(en) umfassen), verwendet werden. Derartige Computerprogramme und Algorithmen sind im Stand der Technik gut bekannt. Ungeachtet der obigen Ausführungen kann ein Vergleich ebenfalls manuell durchgeführt werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Biomarker oder die Biomarker nach dem Kriterium der ”Testfähigkeit” ausgewählt (Tabellen 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 1a', 2a', 3a' und 5'). Wie in dem Kontext von Biomarkern der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff ”Testfähigkeit” auf die Eigenschaft eines Biomarkers, dass er durch mindestens einen im Handel erhältlichen klinischen Labortestanalysierbar ist, wie etwa vorzugsweise enzymatische, kolorimetrische oder immunologische Assays.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist/sind der Biomarker oder die Biomarker nach dem Kriterium der ”Performance” ausgewählt (Tabellen 1b, 2b, 4b, 5b, 6b, 8b und 2b'). Wie im Rahmen der Biomarker der vorliegenden Erfindung verwendet bezieht sich der Begriff ”Performance” auf die Eigenschaft eines Biomarkers, dass er einen möglichst niedrigen p-Wert aufweist.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist/sind der Biomarker oder die Biomarker nach dem Kriterium ”GC-polar” ausgewählt (Tabellen 1c, 2c, 3c, 4c, 5c, 6c, 7c, 8c, 1c', 2c', 3c' und 5'). Wie im Rahmen der Biomarker der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff ”GC-polar” auf die Eigenschaft eines Biomarkers, dass er aus der polaren Fraktion, die vorzugsweise wie in den Beispielen hierin nachfolgend beschrieben erhalten wurde, durch ein Gaschromatographie-Verfahren analysierbar ist.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist/sind der Biomarker oder die Biomarker nach dem Kriterium der ”Einzigartigkeit” ausgewählt (Tabelle 9). Wie im Rahmen der Biomarker der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich der Begriff ”Einzigartigkeit” auf die Eigenschaft eines Biomarkers, spezifisch einen spezifischen präanalytischen Störfaktor anzuzeigen (Qualitätsaspekt). Folglich kann vorzugsweise durch Bestimmung eines Biomarkers aus Tabelle 9 in einer Probe bestimmt werden, ob die Probe durch den Qualitätsaspekt, der in der Tabelle angegeben ist, geschädigt worden war. Es wird durch den Fachmann verstanden, dass die Richtung der Veränderung eines spezifischen Biomarker aus der Tabelle, auf die in Tabelle 9 verwiesen wird, abgelesen werden kann.
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Vorteilhafterweise ist in der Studie, welcher der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, gefunden worden, dass die Mengen der spezifischen Biomarker, die vorangehend als Indikatoren für die Qualität einer Probe biologischen Materials in Bezug auf verschiedene präanalytische Störfaktoren von Relevanz bezeichnet worden sind, wie beispielsweise unsachgemäße Verarbeitung und Lagerung, Hämolyse, Kontamination mit Blutzellen, Mikrogerinnselbildung von Blutproben, die für die Plasmapräparat und andere präanalytische Schritte bestimmt sind. Dementsprechend kann der mindestens eine Biomarker, wie er oben festgelegt ist, in einer Probe im Prinzip für die Beurteilung verwendet werden, ob eine Probe von ausreichender Qualität für die Metabolomics-Analyse ist oder nicht. Dies ist besonders hilfreich für eine effiziente metabolomische Diagnose von Erkrankungen oder medizinischen Zuständen, bei denen die richtige Probenqualität entscheidend für eine zuverlässige Diagnose ist.
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Die Definitionen und Erläuterungen der Begriffe, die vorangehend ausgeführt wurde, gelten sinngemäß für die folgenden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, außer, etwas anderes ist hierin nachfolgend angegeben.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die biologische Probe auf längere Verarbeitung von Plasma überprüft oder weiter überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 1 bzw. 1', vorzugsweise Tabelle 1. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 1a, 1b, 1c, 1a', und/oder 1c'.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die biologische Probe auf längere Verarbeitung von Blut überprüft oder weiter überprüft und wobei der mindestens eine Biomarker aus Tabelle 2 bzw. 2', vorzugsweise Tabelle 2 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 2a, 2b, 2c, 2a', 2b', und/oder 2c'.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird die biologische Probe auf Hämolyse überprüft oder weiter überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 3 bzw. 3', vorzugsweise Tabelle 3. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 3a, 3c, 3a' und/oder 3c'.
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In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die biologische Probe auf Mikrogerinnselbildung überprüft oder weiter überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 4 bzw. 4', vorzugsweise Tabelle 4. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 4a, 4b und/oder 4c.
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In einer darüber hinaus bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die biologische Probe auf Kontamination mit Blutzellen überprüft oder weiter überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 5 bzw. 5', vorzugsweise Tabelle 5. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 5a, 5b und/oder 5c. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die vorstehend genannten Blutzellen weiße Blutzellen.
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Darüber hinaus wird in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die biologische Probe auf unsachgemäße Lagerung überprüft oder weiter überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 6 bzw. 6', vorzugsweise Tabelle 6. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 6a, 6b und/oder 6c.
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Darüber hinaus wird in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die biologische Probe auf unsachgemäßes Einfrieren überprüft oder weiter überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 7 bzw. 7', vorzugsweise Tabelle 7. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 7a und/oder 7c.
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Darüber hinaus wird in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die biologische Probe auf verlängerte Blutgerinnung überprüft und der mindestens eine Biomarker ist aus Tabelle 8 bzw. 8', vorzugsweise Tabelle 8. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker aus Tabelle 8a, 8b und/oder 8c.
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Somit kann in bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung das biologische Material überprüft werden auf einen der vorangehend erwähnten Störfaktoren einzeln oder auf eine Kombination von Störfaktoren, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: längerer Verarbeitung von Plasma, längerer Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung, unsachgemäßes Einfrieren und verlängerte Blutgerinnung. Bevorzugte Kombinationen können beispielsweise sein:
- – längere Verarbeitung von Plasma und längere Verarbeitung von Blut;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut und Hämolyse;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse und Mikrogerinnselbildung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung und Kontamination mit Blutzellen;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung und unsachgemäßes Einfrieren;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung, unsachgemäßes Einfrieren und verlängerte Blutgerinnung.
- – längere Verarbeitung von Blut und Hämolyse;
- – längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse und Mikrogerinnselbildung;
- – längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung und Kontamination mit Blutzellen;
- – längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung und unsachgemäßes Einfrieren;
- – längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung, unsachgemäßes Einfrieren und verlängerte Blutgerinnung;
- – längere Verarbeitung von Plasma und Hämolyse;
- – längere Verarbeitung von Plasma, Hämolyse und Mikrogerinnselbildung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung und Kontamination mit Blutzellen;
- – längere Verarbeitung von Plasma, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung und verlängerte Blutgerinnung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut und Mikrogerinnselbildung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Mikrogerinnselbildung und Kontamination mit Blutzellen;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung und unsachgemäßes Einfrieren;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung, unsachgemäßes Einfrieren und verlängerte Blutgerinnung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse und Kontamination mit Blutzellen;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Kontamination mit Blutzellen und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung und unsachgemäßes Einfrieren;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäße Lagerung, unsachgemäßes Einfrieren und verlängerte Blutgerinnung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, unsachgemäße Lagerung und unsachgemäßes Einfrieren;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, unsachgemäße Lagerung, unsachgemäßes Einfrieren und verlängerte Blutgerinnung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut und Hämolyse;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut und unsachgemäße Lagerung;
- – längere Verarbeitung von Plasma, längere Verarbeitung von Blut, unsachgemäße Lagerung und verlängerte Blutgerinnung.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Vorrichtung oder ein System zur Beurteilung der Qualität einer biologischen Probe, umfassend:
- a) eine Analyseeinheit für die Probe, die einen Detektor für mindestens einen Biomarker aus den Tabellen 1, 1', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7, und/oder 8 aufweist, vorzugsweise für mindestens einen Biomarker der Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 8, wobei der Detektor die Bestimmung der Menge des mindestens einen Biomarkers in der Probe gestattet; und funktionell damit verbunden,
- (b) eine Auswertungseinheit, die eine Datenverarbeitungseinheit und eine Datenbank aufweist, wobei die Datenbank eine gespeicherte Referenz aufweist und die Datenverarbeitungseinheit einen greifbar eingebetteten Algorithmus zur Durchführung eines Vergleichs der Menge des mindestens einen durch die Analyseeinheit bestimmten Biomarkers und der gespeicherten Referenz und zur Erzeugung einer Ausgangsinformation, auf deren Grundlage die Beurteilung der Qualität erstellt wird, aufweist.
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Eine Vorrichtung, wie hierin verwendet, soll mindestens die oben genannten Einheiten umfassen. Die Einheiten der Vorrichtung sind funktionell miteinander verbunden. Wie die Mittel in einer fuktionellen Weise verbunden werden, wird von der Art der Einheiten abhängen, die in der Vorrichtung enthalten sind. Zum Beispiel, wenn der Detektor die automatische qualitative oder quantitative Bestimmung des Biomarkers ermöglicht, können die durch die automatisch arbeitende Analyseeinheit erhaltenen Daten beispielsweise durch ein Computerprogramm verarbeitet werden, um die Beurteilung in der Auswertungseinheit zu erleichtern. Vorzugsweise sind die Einheiten durch eine einzige Vorrichtung in einem solchen Fall umfasst. Die Vorrichtung kann dementsprechend eine Analyseeinheit für den Biomarker und einen Computer oder eine Datenverarbeitungseinrichtung als Auswertungseinheit zur Verarbeitung der erhaltenen Daten für die Beurteilung und für das Abstellen der Ausgangsinformationen umfassen. Bevorzugte Vorrichtungen sind solche, die ohne die besonderen Kenntnisse eines spezialisierten Klinikers angewendet werden können, beispielsweise elektronische Geräte, die lediglich das Beladen mit einer Probe erfordern. Die Ausgabeinformation des Gerätes ist vorzugsweise ein Zahlenwert, der Rückschlüsse auf die Qualität der Probe ermöglicht, und dementsprechend ein Hilfsmittel für die Zuverlässigkeit einer Diagnose oder zur Fehlersuche ist.
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Eine bevorzugte Referenz, die als eine gespeicherte Referenz gemäß der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist eine Menge für den mindestens einen zu analysierenden Biomarker oder davon abgeleitete Werte, die aus einer Probe oder mehreren Proben von unzureichender Qualität abgeleitet wurde. In einem solchen Fall vergleicht der Algorithmus, der greifbar eingebettet ist, vorzugsweise die ermittelte Menge für den mindestens einen Biomarker mit der Referenz, wobei eine identische oder im Wesentlichen identische Menge oder Wert für eine Probe von unzureichender Qualität indikativ ist, während eine Menge, die sich unterscheidet, für eine Probe von ausreichender Qualität indikativ ist.
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Alternativ ist eine weitere bevorzugte Referenz, die als eine gespeicherte Referenz gemäß der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, eine Menge für den mindestens einen zu analysierenden Biomarker oder davon abgeleitete Werte, die aus einer Probe oder mehreren Proben von ausreichender Qualität abgeleitet wurde. In einem solchen Fall vergleicht der Algorithmus, der begreifbar eingebettet ist, vorzugsweise die ermittelte Menge für den mindestens einen Biomarker mit der Referenz, wobei eine identische oder im Wesentlichen identische Menge oder Wert für eine Probe von ausreichender Qualität indikativ ist, während eine Menge, die sich unterscheidet, für eine Probe von unzureichender Qualität indikativ ist.
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Bevorzugte Differenzen sind solche, die als relative Änderungen oder Grade der Veränderungen für die einzelnen Biomarkern in den nachfolgenden Tabellen angegeben sind. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 1 zur Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Plasma verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 2 zur Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Blut verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 3 zur Überprüfung einer Hämolyse verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 4 zur Überprüfung einer Mikrogerinnselbildung verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 5 zur Überprüfung einer Kontamination mit Blutzellen verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 6 zur Überprüfung einer unsachgemäßen Lagerung verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 7 zur Überprüfung eines unsachgemäßen Einfrierens verwendet werden. Vorzugsweise kann in der Vorrichtung der Erfindung mindestens ein Biomarker von der Tabelle 8 zur Überprüfung einer verlängerten Blutgerinnungszeit verwendet werden.
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Die Einheiten der Vorrichtung können, ebenfalls bevorzugt, in ein System implementiert werden, das mehrere Vorrichtungen aufweist, die funktionell miteinander verbunden sind. Abhängig von den Einheiten, die für das System der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, können die Mittel funktionell durch Verbinden jedes Mittels mit anderen Mitteln vernetzt werden, die den Datentransport zwischen den Mitteln ermöglichen, beispielsweise Glasfaserkabel und andere Kabel für Hochdurchsatz-Datentransport. Nichtsdestotrotz ist die drahtlose Datenübertragung zwischen den Mitteln ebenfalls durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen, beispielsweise via LAN (Wireless LAN, W-LAN). Ein bevorzugtes System umfasst Mittel zur Bestimmung von Biomarkern. Mittel zum Bestimmen von Biomarkern, wie hierin verwendet, umfassen Mittel zum Auftrennen von Biomarkern, wie chromatographische Vorrichtungen, sowie Mittel zur Metabolitenbestimmung, wie beispielsweise Massenspektrometrie-Geräte. Geeignete Vorrichtungen sind im Detail vorangehend beschrieben worden. Bevorzugte Mittel zur Verbindungstrennung, die in dem System der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, umfassen chromatographische Vorrichtungen, insbesondere Vorrichtungen für die Flüssigkeitschromatographie, HPLC und/oder Gaschromatographie. Bevorzugte Vorrichtungen zur Verbindungsbestimmung umfassen Massenspektrometrievorrichtungen, noch bevorzugter, GC-MS, LC-MS, Direktinfusions-Massenspektrometrie, FT-ICR-MS, CE-MS, HPLC-MS, Quadrupol-Massenspektrometrie, sequentiell-gekoppelte Massenspektrometrie (einschließlich MS-MS oder MS-MS-MS), ICP-MS, Py-MS oder TOF. Die Trennungs- und Bestimmungsmittel sind vorzugsweise miteinander gekoppelt. Am meisten bevorzugt werden IC-MS und/oder GC-MS in dem System der vorliegenden Erfindung verwendet, wie ausführlich an anderer Stelle in der Beschreibung beschrieben wird. Ferner umfasst werden sollen Mittel zum Vergleichen und/oder Analysieren der von den Mitteln zur Bestimmung von Biomarkern erhaltenen Ergebnisse. Die Mittel zum Vergleichen und/oder Analysieren der Ergebnisse können mindestens eine Datenbank und ein implementiertes Computerprogramm zum Vergleich der Ergebnisse umfassen. Bevorzugte Ausführungsformen der vorstehend genannten Systeme und Vorrichtungen sind ebenfalls im Detail nachfolgend beschrieben.
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Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Datensammlung, welche charakteristische Werte von mindestens einem Biomarker umfasst, der für eine ausreichende oder unzureichende Qualität einer Probe des biologischen Materials indikativ ist.
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Der Begriff ”Datensammlung” bezieht sich auf eine Sammlung von Daten, die physikalisch und/oder logisch miteinander gruppiert werden können. Dementsprechend kann die Datensammlung in einem einzelnen Datenspeichermedium implementiert werden, oder in physikalisch getrennten Datenspeichermedien, die operativ miteinander verbunden sind. Vorzugsweise wird die Datensammlung mittels einer Datenbank verwirklicht. Demzufolge umfasst eine Datenbank, wie hier verwendet, die Datensammlung auf einem geeigneten Speichermedium. Außerdem umfasst die Datenbank vorzugsweise ferner ein Datenbankverwaltungssystem. Das Datenbankverwaltungssystem ist vorzugsweise ein netzwerkbasiertes, hierarchisches oder objektorientiertes Datenbankverwaltungssystem. Darüber hinaus kann die Datenbank eine förderierte oder integrierte Datenbank sein. Noch bevorzugter wird die Datenbank als ein verteiltes (förderiertes) System, z. B. als Client-Server-System implementiert werden. Noch bevorzugter ist die Datenbank so strukturiert, das sie einem Suchalgorithmus ermöglicht, ein Testdatenset mit den Datensätzen zu vergleichen, die in der Datensammlung enthalten sind. Insbesondere kann durch Verwendung eines solchen Algorithmus die Datenbank nach ähnlichen oder identischen Datensätzen durchsucht werden, die indikativ für eine Qualität der Proben, wie oben dargelegt, sind (z. B. eine Suchanfrage). Folglich wird, wenn ein identischer oder ähnlicher Datensatz in der Datensammlung identifiziert werden kann, der Testdatensatz mit der bewussten Qualität assoziiert werden. Folglich kann die aus der Datensammlung erhaltene Information verwendet werden, beispielsweise als eine Referenz für die vorangehend beschriebenen Verfahren der vorliegenden Erfindung. Besonders bevorzugt umfasst die Datensammlung charakteristische Werte aller Biomarker, die in irgendeiner der oben genannten Gruppen enthalten sind.
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In Anbetracht des vorangehend Gesagten weist die vorliegende Erfindung ein Datenspeichermedium auf, das die vorangehend erwähnte Datensammlung umfasst.
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Der Begriff ”Datenspeichermedium”, wie hierin verwendet, umfasst Datenspeichermedien, die auf einzelnen physikalischen Einheiten, wie beispielsweise einer CD, einer CD-ROM, einer Festplatte, optischen Speichermedien oder einer Diskette basieren. Außerdem umfasst der Begriff ferner Datenspeichermedien, die aus physikalisch getrennten Einheiten bestehen, die betriebsmäßig miteinander in einer Weise verbunden sind, dass die vorangehend erwähnte Datensammlung, vorzugsweise in einer geeigneten Weise für eine Suchanfrage, bereitgestellt wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein System, umfassend:
- (a) Mittel zum Vergleichen der charakteristischen Werte des mindestens einen Biomarkers einer Probe, welche operativ vernetzt sind mit
- (b) einem wie oben beschriebenen Datenspeichermedium.
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Der Begriff ”System”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf unterschiedliche Mittel, die operativ miteinander vernetzt sind. Die Mittel können in einer einzigen Vorrichtung eingebaut sein oder sie können physikalisch getrennte Vorrichtungen sein, die funktionell miteinander vernetzt sind. Die Mittel zum Vergleichen von charakteristischen Werten von Biomarkern basieren vorzugsweise auf einem Vergleichs-Algorithmus wie zuvor erwähnt. Das Datenspeichermedium umfasst vorzugsweise die vorstehend erwähnte Datensammlung oder Datenbank, wobei jeder der gespeicherten Datensätze für eine vorstehend genannte Probenqualität indikativ ist. Demzufolge ermöglicht das System der vorliegenden Erfindung zu identifizieren, ob ein Testdatensatz in der Datensammlung vorhanden ist, die auf dem Datenspeichermedium gespeichert ist. Folglich können die Verfahren der vorliegenden Erfindung durch das System der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des Systems sind Mittel zum Bestimmen von charakteristischen Werten von Biomarkern einer Probe eingeschlossen. Der Ausdruck ”Mittel zur Bestimmung charakteristischer Werte von Biomarkern” bezieht sich vorzugsweise auf die vorangehend genannten Vorrichtungen zur Bestimmung von Metaboliten, wie beispielsweise Massenspektrometrie-Vorrichtungen, NMR-Vorrichtungen oder Vorrichtungen zur Durchführung chemischer oder biologischer Assays für die Biomarker.
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Im Allgemeinen zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von mindestens einem Biomarker aus den Tabellen 1, 1', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8; vorzugsweise aus den Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 8 oder eines Nachweismittels dafür zur Beurteilung der Qualität einer Probe in Betracht.
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Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 1 und/oder 1' für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Plasma verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 2 und/oder 2' für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Blut verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 3 und/oder 3' für die Überprüfung einer Hämolyse verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 4 für die Überprüfung einer Mikrogerinnselbildung verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 5 und/oder 5' für die Überprüfung einer Kontamination mit Blutzellen verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 6 für die Überprüfung einer unsachgemäßen Lagerung verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 7 für die Überprüfung eines unsachgemäßen Einfrierens verwendet werden. Vorzugsweise kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 8 für die Überprüfung einer verlängerten Blutgerinnung verwendet werden.
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Noch bevorzugter kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 1 für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Plasma verwendet werden. Noch bevorzugter kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 2 für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Blut verwendet werden. Noch bevorzugter kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 3 für die Überprüfung einer Hämolyse verwendet werden. Noch bevorzugter kann mindestens ein Biomarker der Tabelle 5 für die Überprüfung einer Kontamination mit Blutzellen verwendet werden.
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Wie Nachweismittel auf der Grundlage des mindestens einen Biomarkers hergestellt werden können, ist den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Beispielsweise können Antikörper oder Aptamere, die spezifisch an den mindestens einen Biomarker binden, hergestellt werden. Ähnlich können die Biomarker selbst als solche Zusammensetzungen verwendet werden, z. B. innerhalb von Komplexen oder in modifizierter oder derivatisierter Form, beispielsweise wenn sie durch GC-MS analysiert werden.
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Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Kit zur Beurteilung der Qualität einer biologischen Probe zu Verfügung, umfassend ein Nachweismittel für mindestens einen Biomarker aus den Tabellen 1, 1', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8; vorzugsweise für die Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 8 und vorzugsweise eine Referenz für den mindestens einen Biomarker.
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Der Begriff ”Kit”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Sammlung der oben genannten Komponenten, die vorzugsweise getrennt oder in einem einzigen Behälter bereitgestellt werden. Der Behälter umfasst ebenfalls Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Diese Anweisungen können in der Form eines Handbuchs sein oder sie können von einem Computerprogramm-Code bereitgestellt werden, der in der Lage ist, die Vergleiche, auf die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung hingewiesen wird, auszuführen und eine Qualitätsbeurteilung einer Probe festzustellen, wenn er auf einem Computer oder einer Datenverarbeitungseinrichtung eingerichtet ist. Der Computerprogrammcode kann auf einem Datenspeichermedium oder einer Vorrichtung, wie beispielsweise einem optischen Speichermedium (beispielsweise eine Compact-Disc) oder direkt auf einem Computer oder einer Datenverarbeitungsvorrichtung bereitgestellt werden. Außerdem soll das Kit mindestens einen Standard für eine Referenz umfassen, wie hierin oben definiert, d. h., eine Lösung mit einer vorgegebenen Menge für den mindestens einen Biomarker, die eine Referenzmenge repräsentiert. Ein solcher Standard kann beispielsweise die Menge des mindestens einen Biomarkers von einer Probe oder mehreren Proben von ausreichender oder unzureichender Qualität repräsentieren.
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Vorzugsweise umfasst der Kit der vorliegenden Erfindung umfasst ein Nachweismittel für mindestens einen Biomarker von jeder der Tabellen 1, 1', 2, 2', 3, 3', 4, 5, 5', 6, 7 und/oder 8, vorzugsweise den Tabellen 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 und/oder 8, und vorzugsweise eine Referenz für jeden der mindestens einen Biomarker, um eine Beurteilung einer Probe auf unzureichende Qualität zu ermöglichen, die mit irgendeinem von einer längeren Verarbeitung von Plasma, längeren Verarbeitung von Blut, Hämolyse, Mikrogerinnselbildung, Kontamination mit Blutzellen, unsachgemäßer Lagerung und unsachgemäßes Einfrieren verknüpft ist.
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In einigen Ausführungsformen kann das Kit weitere Komponenten wie beispielsweise Puffer, Reagenzien (zum Beispiel ein Konjugat und/oder Substrat), und dergleichen umfassen, wie hierin offenbart.
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Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung des Kits der Erfindung für die oben genannten Zwecke der Beurteilung einer ausreichenden oder unzureichenden Qualität einer Probe betrifft.
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Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 1 und/oder 1' umfasst, für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Plasma verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 2 und/oder 2' umfasst, für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Blut verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 3 und/oder 3' umfasst, für die Überprüfung einer Hämolyse verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 4 umfasst, für die Überprüfung einer Mikrogerinnselbildung verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 5 und/oder 5' umfasst, für die Überprüfung einer Kontamination mit Blutzellen verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 6 umfasst, für die Überprüfung einer unsachgemäßen Lagerung verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 7 umfasst, für die Überprüfung eines unsachgemäßen Einfrierens verwendet werden. Vorzugsweise kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 8 umfasst, für die Überprüfung einer verlängerten Blutgerinnungszeit verwendet werden.
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Noch bevorzugter kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 1 umfasst, für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Plasma verwendet werden. Noch bevorzugter kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 2 umfasst, für die Überprüfung einer längeren Verarbeitung von Blut verwendet werden. Noch bevorzugter kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 3 umfasst, für die Überprüfung einer Hämolyse verwendet werden. Noch bevorzugter kann ein Kit, das mindestens einen Biomarker der Tabelle 5 umfasst, für die Überprüfung einer Kontamination mit Blutzellen verwendet werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Durchführen einer Metabolomanalyse, umfassend die Beurteilung der Qualität von mindestens einer biologischen Probe gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und das Durchführen der Metabolomanalyse, vorzugsweise nur unter Verwendung biologischer Proben, für die eine ausreichende Qualität beurteilt wurde.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Durchführen einer Metabolomanalyse, umfassend die Anforderung einer Beurteilung der Qualität von mindestens einer biologischen Probe gemäß einem der Verfahren der vorliegenden Erfindung und das Durchführen der Metabolomanalyse, vorzugsweise nur unter Verwendung biologischer Proben, für die eine ausreichende Qualität beurteilt wurde.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Stratifizieren von biologischen Proben nach Qualität, umfassend die Beurteilung der Qualität mindestens einer biologischen Probe gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und das Stratifizieren der mindestens einen Probe gemäß der Qualität.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Stratifizieren von biologischen Proben nach Qualität, umfassend die Anforderung einer Beurteilung der Qualität von mindestens einer biologischen Probe gemäß einem der Verfahren der vorliegenden Erfindung und das Stratifizieren der mindestens einen Probe gemäß der Qualität.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Entfernung von biologischen Proben, die nicht den Qualitätskriterien von einem Pool biologischer Proben entsprechen, umfassend die Beurteilung der Qualität der mindestens einen biologischen Probe von diesem Pool gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und Entfernung der Probe aus dem Pool im Falle, dass eine unzureichende Qualität beurteilt wurde.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Entfernung von biologischen Proben, die nicht den Qualitätskriterien von einem Pool biologischer Proben entsprechen, umfassend die Anforderung einer Beurteilung der Qualität der mindestens einen biologischen Probe von diesem Pool gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und Entfernung der Probe aus dem Pool im Falle, dass eine unzureichende Qualität beurteilt wurde.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren der Einbeziehung einer biologischen Probe in eine Studie, vorzugsweise eine klinische Studie, umfassend die Beurteilung der Qualität der mindestens einen biologischen Probe gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und das Einbeziehen der biologischen Probe in die Studie, wenn ausreichende Qualität beurteilt wird.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren der Einbeziehung einer biologischen Probe in eine Studie, vorzugsweise eine klinische Studie, umfassend die Anforderung einer Beurteilung der Qualität der mindestens einen biologischen Probe gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung und das Einbeziehen der biologischen Probe in die Studie, wenn eine ausreichende Qualität beurteilt wird.
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Alle hierin zitierten Referenzen werden hiermit durch Bezugnahme hinsichtlich ihres Offenbarungsgehaltes im Allgemeinen oder in Bezug auf die spezifischen Offenbarungsgehalte, die oben angegeben sind, eingebracht.
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Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht dazu bestimmt sind, den Umfang dieser Erfindung einzuschränken oder zu begrenzen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Experimentelles Design zur Analyse metabolischer Effekte der Verarbeitungszeit und der Verarbeitungstemperatur auf menschliches Blutplasma
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Dieses Experiment wurde entworfen, um die Auswirkungen der kurzfristigen Inkubation während der präanalytischen Probenverarbeitung auf das Humanplasma-Metabolom zu analysieren, um Biomarker für die Qualitätskontrolle von Blutplasma-Biobankproben zu identifizieren. Ein EDTA-Plasmapool wurde in 1-ml-Aliquots aufgeteilt und diese wurden bei Temperaturen von 4°C, 12°C und 21°C inkubiert. Zu den Zeitpunkten 0 h, 0,5 h, 2 h, 5 h und 16 h wurden je 10 Aliquots bei –80°C eingefroren und analysiert, wie in Beispiel 4 beschrieben (Sphingolipide wurden in Beispiel 1 nicht ausgewertet). Plasmaproben wurden im randomisierten analytischen Sequenzdesign analysiert. Die rohen Peakdaten wurden auf den Median aller Proben pro analytischer Sequenz normalisiert, um die Prozessvariabilität zu berücksichtigen (sogenannte ”Verhältnisse”). Um eine Experiment-umfassende Ausrichtung semi-quantitativer Daten zu ermöglichen, wurde MxPoolTM mit 12 replizierten Proben in dem Experiment analysiert und die Verhältnisse weiter auf den Median der MxPoolTM-Proben normalisiert, d. h., die Verhältnisse von diesen Studien sind auf dem gleichen Niveau und daher vergleichbar mit Daten von anderen Projekten, die auf andere Aliquots desselben MxPoolTM normalisiert sind. Die gesamten quantifizierten Daten aus den zielgerichteten Verfahren (Eicosanoide, Catecholamine) verbleiben mit ihren absoluten Quantifizierungs-Daten. Die Daten wurden log 10 transformiert, um eine Näherung an eine Normalverteilung vorzunehmen. Die statistische Analyse wurde durch ein einfaches lineares Modell (ANOVA) mit den feststehenden Effekten ”Zeit” und ”Temperatur” durchgeführt. Der ANOVA-Faktor ”Zeit” wurde auf die Referenz ”0” als Faktor und die ”Temperatur” wurde auf die Referenz ”4°C” eingestellt. Das Signifikanzniveau wurde auf einen alpha-Fehler von 5% festgelegt. Die durch diesen Ansatz identifizierten Metaboliten sind Indikatoren für qualitätsvermindernde Effekte, die mit einer längeren Verarbeitungszeit und Verarbeitungstemperatur von Biobank-Proben zusammenhängen (Tabelle 1).
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Beispiel 2: Experimentelles Design zum Analysieren metabolischer Effekte von verschiedenen Blutverarbeitungsverfahren auf menschliches Blutplasma
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Dieses Experiment wurde entworfen, um die Auswirkungen der unterschiedlichen Blutproben-Handhabungsverfahren auf das Humanplasma-Metabolom zu analysieren, um Biomarker für die Qualitätskontrolle von Blutplasma-Biobankproben zu identifizieren. Verschiedene Gruppen der Blutbehandlung umfassten die folgenden Verfahren:
- • Beginnen der Blutgerinnung
- • längere Inkubation bei 0°C
- • längere Inkubation bei Raumtemperatur
- • Hämolyse
- • Kontamination mit weißen Blutzellen
- • Einfrierprotokoll
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Zwanzig gesunde Probanden (13 Frauen, 7 Männer) wurden rekrutiert und 64 ml Blut wurden durch Venenpunktion unter Verwendung eines 20-Gauge Safety-Fly Blutentnahmesystems Blut in 3 9-ml-K3EDTA Monovetten, gefolgt von 1 ml in eine neutrale Monovette (Probe wurde verworfen), gefolgt von einer 9-ml neutralen Monovette, gefolgt von 3 9-ml K3EDTA-Monovetten entnommen. Die Monovetten wurden vorsichtig durch Umdrehen gemischt, um eine Hämolyse zu verhindern. The K3EDTA-Monovetten wurden geöffnet und für jeden Probanden separat vereinigt.
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Das Blut von jedem Probanden wurde innerhalb der verschiedenen Gruppen wie folgt verarbeitet:
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Beginnen der Blutgerinnung
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Nach 5 min bei Raumtemperatur wurde das Blut aus der 9-ml neutralen Monovetten in eine 9-ml-K3EDTA-Monovette dekantiert und das Plasma durch Zentrifugation bei 1500 × g für 15 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge hergestellt. Das Plasma wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C bis zur Analyse gelagert.
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Längere Inkubation bei 0°C
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2 × 5 ml des Blutpools wurden bei 0°C für 4 h und 6 h jeweils inkubiert. Nach dieser Zeit wurde das Plasma durch Zentrifugation bei 1500 × g für 15 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge hergestellt. Das Plasma wurde bei –80°C bis zur Analyse gelagert.
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Längere Inkubation bei Raumtemperatur
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5 ml des Blutpools wurden bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurde das Plasma durch Zentrifugation bei 1500 × g für 15 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge hergestellt. Das Plasma wurde bei –80°C bis zur Analyse gelagert.
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Hämolyse
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2 × 6 ml des Blut-Pools wurden durch eine Spritze mit einer 25-Gauge (Grad 1-Hämolyse) bzw. einer 27-Gauge Nadel (Grad 2-Hämolyse) durchgedrückt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation bei 1500 × g für 15 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge hergestellt. Das Plasma wurde bei –80°C bis zur Analyse gelagert.
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Kontamination mit weißen Blutzellen/Einfrierprotokoll/Kontrolle
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Der verbliebene Blut-Pool wurde bei 1500 × g für 15 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Die obere Plasmaüberstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und gemischt. Aliquots dieser Plasmaprobe wurden eingefroren und bei –80°C bis zur Analyse gelagert, um als Kontrolle zu dienen. Weitere Aliquots dieser Plasmaprobe wurden bei –20°C eingefroren und am Ende des Tages überführt und bei –80°C bis zur Analyse gelagert (siehe Tabelle 7 – ”langsames Einfrieren”). Der untere Plasmaüberstand wurde mit Material aus dem Buffy-Coat des Zentrifugenröhrchens gemischt, was zu zwei Graden von Verunreinigungen mit weißen Blutkörperchen führte.
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Die Plasmaproben von diesem Experiment wurden wie in Beispiel 4 beschrieben im randomisierten analytischen Sequenzdesign analysiert. Das Metabolitenprofiling bietet eine semi-quantitative Analyseplattform, was in einem relativen Metabolitenniveau zu einer definierten Referenzgruppe (”Verhältnis”) führte. Um dieses Konzept zu unterstützen und ebenfalls ein Alignment der verschiedenen analytischen Chargen (”Experimente”) zu ermöglichen, wurden zwei verschiedene Referenzprobentypen parallel während des gesamten Prozesses mitlaufen lassen. Zunächst wurde ein Projekt-Pool aus Aliquots aller Proben erzeugt und mit 4 Replikaten innerhalb jeder analytischen Sequenz gemessen. Für alle semi-quantitativ analysierten Metabolite wurden die Daten gegen den Median in den Pool-Referenzproben innerhalb jeder analytischen Sequenz normalisiert, um Pool-normalisierte Verhältnisse zu ergeben (für jede Probe pro Metabolit durchgeführt). Dies kompensiert die inter- und intra-instrumentelle Variation. Dann wurde zweitens der MxPoolTM mit 12 replizierten Proben in dem Experiment analysiert und die Pool-normalisierten Verhältnisse weiter auf den Median der MxPoolTM-Proben normalisiert, d. h., die Verhältnisse von diesen Studien sind auf dem gleichen Niveau und daher vergleichbar mit Daten von anderen Projekten, die auf andere Aliquots desselben MxPoolTM normalisiert sind. Die gesamten quantifizierten Daten aus den zielgerichteten Verfahren (Eicosanoide, Catecholamine) verbleiben mit ihren absoluten Quantifizierungs-Daten.
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Daten-Analyse:
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Die Daten wurden vor der statistischen Analyse log10 transformiert, um eine Näherung an eine Normalverteilung vorzunehmen. Die Veränderungen der Metaboliten-Verhältnisse wurden durch ein gemischtes lineares Modell (ANOVA) mit dem Probanden als Random Intercept und dem Geschlecht als feststehendem Effekt berechnet. Die Verhältnisse in den Tabellen 2 – 5 sind relativ zu den Kontrollgruppen angegeben.
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Beispiel 3: Experimentelles Design zur Analyse metabolischer Effekte der Langzeitlagerung bei –20°C auf menschliches Blutplasma
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Dieses Experiment wurde entworfen, um die Auswirkungen der längeren Lagerung bei –20°C auf das Humanplasma-Metabolom zu analysieren, um Biomarker für die Qualitätskontrolle von Blutplasma-Biobankproben zu identifizieren. Aliquots eines EDTA-Plasmapools wurden bei –20°C oder entsprechend in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach 181 Tagen und 365 Tagen wurden 4 Aliquots von Proben, die bei der jeweiligen Temperatur gelagert wurden, durch Metabolitenprofiling wie in Beispiel 4 beschrieben analysiert (Sphingolipide wurden in Beispiel 3 nicht analysiert). Plasmaproben wurden im randomisierten analytischen Sequenzdesign analysiert. Aus Aliquots aller Proben wurde ein Projekt-Pool erzeugt und mit 4 Replikaten innerhalb jeder analytischen Sequenz gemessen. Die rohen Peakdaten wurde mit dem Median aller Proben pro analytischer Sequenz normalisiert, um die Prozessvariabilität zu berücksichtigen (sogenannte ”Verhältnisse”). Die Verhältnisse wurden log10 transformiert, um eine Näherung an eine Normalverteilung der Daten vorzunehmen. Die statistische Analyse der Metabolitenveränderungen nach Lagerung bei –20°C für 181 Tage und 365 Tage im Verhältnis zu der Lagerung in flüssigem Stickstoff für den gleichen Zeitraum wurde durch ein einfaches lineares Modell (ANOVA) mit dem feststehenden Effekt ”Temperatur” durchgeführt, der auf eine Referenz von ”–196°C” festgesetzt war. Das Signifikanzniveau wurde auf einen alpha-Fehler von 5% festgelegt. Metaboliten sind Biomarker, welche Qualitätsaspekte in Biobankproben anzeigen, die mit längerer Plasma-Lagerungszeit oder erhöhter -Temperatur (Tabelle 6) zusammenhängen.
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Beispiel 4 Probenvorbereitung für die MS-Analyse und MS-Analyse
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Humane Plasmaproben wurden hergestellt und einer LC-MS/MS- und GC-MS- oder SPE-IC-MS/MS-(Hormone)Analyse, wie im Folgenden beschrieben, unterzogen. Die Proteine wurden durch Fällung aus Blutplasma abgetrennt. Nach Zugabe von Wasser und einer Mischung aus Ethanol und Dichlormethan wurde die verbliebene Probe in eine wässrige polare Phase und eine organische, lipophile Phase fraktioniert.
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Für die Transmethanolyse der Lipidextrakte wurde eine Mischung aus 140 μl Chloroform, 37 μl Salzsäure (37 Gew.-% HCl in Wasser), 320 μl Methanol und 20 μl Toluol zu dem eingedampften Extrakt hinzugefügt. Das Gefäß wurde dicht verschlossen und für 2 Stunden bei 100°C unter Schütteln erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde nachfolgend zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde vollständig getrocknet.
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Die Methoximierung der Carbonylgruppen wurde durch Umsetzung mit Methoxyamin-Hydrochlorid (20 mg/ml in Pyridin, 100 l für 1,5 Stunden bei 60°C) in einem dicht verschlossenen Gefäß durchgeführt. 20 μl einer Lösung von ungeradzahligen, geradkettigen Fettsäuren (Lösung aus jeweils 0,3 mg/mL von Fettsäuren mit 7 bis 25 Kohlenstoffatomen und jeweils 0,6 mg/ml von Fettsäuren mit 27, 29 und 31 Kohlenstoffatomen in 3/7 (Vol./Vol.) Pyridin/Toluol) wurden als Zeitstandards zugesetzt. Schließlich wurde die Derivatisierung mit 100 μl N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-2,2,2-trifluoracetamid (MSTFA) für 30 Minuten bei 60°C wiederum in dem dicht verschlossenen Gefäß durchgeführt. Das Endvolumen vor der Injektion in den GC betrug 220 μl.
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Für die polare Phase wurde die Derivatisierung in der folgenden Weise durchgeführt: Die Methoximierung der Carbonylgruppen wurde durch Umsetzung mit Methoxyamin-Hydrochlorid (20 mg/ml in Pyridin, 50 l für 1,5 Stunden bei 60°C) in einem dicht verschlossenen Gefäß durchgeführt. 10 μl einer Lösung von ungeradzahligen, geradkettigen Fettsäuren (Lösung aus jeweils 0,3 mg/mL von Fettsäuren mit 7 bis 25 Kohlenstoffatomen und jeweils 0,6 mg/ml von Fettsäuren mit 27, 29 und 31 Kohlenstoffatomen in 3/7 (Vol./Vol.) Pyridin/Toluol) wurden als Zeitstandards zugesetzt. Schließlich wurde die Derivatisierung mit 50 μL N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-2,2,2-trifluoracetamid (MSTFA) für 30 Minuten bei 60°C wiederum in dem dicht verschlossenen Gefäß durchgeführt. Das Endvolumen vor der Injektion in den GC betrug 110 μl.
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Die GC-MS-Systeme bestehen aus einem Agilent 6890 GC, der mit einem Agilent 5973 MSD gekoppelt ist. Die Autosampler sind CompiPal oder GCPal von CTC.
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Für die Analyse wurden gewöhnliche Kapillar-Trennsäulen verwendet (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm) mit verschiedenen stationären Phasen aus Poly-Methylsiloxan, die 0% bis zu 35% der aromatischen Einheiten enthalten, abhängig von den analysierten Probenmaterialien und den Fraktionen aus dem Phasentrennungsschritt (zum Beispiel: DB-1 ms, HP-5 ms, DB-XLB, DB-35 ms, Agilent Technologies). Bis zu 1 μl des Endvolumens wurden ”splitlos” injiziert, und das Ofentemperaturprogramm wurde bei 70°C gestartet und endete bei 340°C mit verschiedenen Heizraten in Abhängigkeit von dem Probenmaterial und der Fraktion aus dem Phasentrennungsschritt, um eine ausreichende chromatographische Auftrennung und Anzahl von Scans innerhalb jedes Analyt-Peaks zu erzielen. Darüber hinaus wurde RTL (Retention Time Locking, Agilent Technologies) für die Analyse und die üblichen GC-MS-Standardbedingungen angewandt, zum Beispiel konstanter Fluss mit nominal 1 bis 1,7 ml/min und Helium als dem Gas der mobilen Phase, die Ionisation wurde durch Elektronenstoß bei 70 eV, Abtastung innerhalb eines m/z-Bereich von 15 bis 600 mit Scanraten von 2,5 bis 3 Scans/s und Standard-Feinabstimmungs-Bedingungen durchgeführt.
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Die HPLC-MS-Systeme bestanden aus einem Agilent 1100 LC-System (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland), gekoppelt mit einem API 4000-Massenspektrometer (Applied Biosystem/MDS SCIEX, Toronto, Kanada). Die HPLC-Analyse wurde auf kommerziell erhältlichen Umkehrphasen-Trennungs-Säulen mit stationären C18-Phasen (zum Beispiel: GROM ODS 7 pH, Thermo Betasil C18) durchgeführt. Bis zu 10 μL des letztlichen Probenvolumens von eingedampfter und rekonstituierter polarer und lipophiler Phase wurden injiziert, und die Trennung wurde mit Gradientenelution unter Verwendung von Methanol/Wasser/Ameisensäure- oder Acetonitril/Wasser/Ameisensäure-Gradienten bei einer Flussrate von 200 μL/min durchgeführt.
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Die Massenspektrometrie wurde durch Elektrospray-Ionisation im Positivmodus für die nicht-polare Fraktion und im Negativ- oder Positivmodus für die polare Fraktion unter Verwendung von Mehrfach-Reaktions-Monitoring-(MRM)-Modus und ”Fullscan” von 100–1000 amu durchgeführt.
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Analyse der Steroide und Catecholamine in Plasmaproben:
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Steroide und ihre Metabolite wurden durch Online-SPE-LC-MS (Festphasenextraktion-LC-MS) gemessen. Catecholamine und ihre Metabolite wurden durch Online-SPE-LC-MS gemessen, wie von Yamada et al. beschrieben (Yamada H, Yamahara A, Yasuda S, Abe M, Oguri K, Fukushima S, Ikeda-Wada S: Dansyl chloride derivatization of methamphetamine: a methode with advantages for screening and analysis of methamphetamine in urine. Journal of Analytical Toxicology, 26 (1): 17–22 (2002)).
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Analyse der Eicosanoide in Plasmaproben
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Eicosanoide und verwandte Substanzen wurden aus Plasma durch Offline- und Online-SPE-LC-MS/MS (Festphasenextraktion-LC-MS/MS) (Masoodi M. und Nicolaou A: Rapid Commun Mass Spectrom. 2006; 20 (20): 3023–3029), gemessen. Absolute Quantifizierung wurde mittels stabilen isotopenmarkierten Standards durchgeführt.
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Beispiel 5: Experimentelles Design zur Analyse metabolischer Effekte auf verlängerte Blutgerinnungszeit
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Dieses Experiment beschreibt die Analyse der Effekte von verlängerter Blutgerinnungszeit auf das Humanserum-Metabolom, um Biomarker für die Qualitätskontrolle von Blutserum-Biobankproben zu identifizieren. 145 Blutproben wurden bei Raumtemperatur für 1–2 h gerinnen lasen. Eine weitere Gruppe von 46 Blutproben wurden für 24 h bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Die geronnenen Proben wurden zentrifugiert und die Serumüberstände wurden entfernt und eingefroren. Serumproben wurden bei –80°C vor der Metabolitenprofiling-Analyse wie in Beispiel 4 beschrieben gelagert (Sphingolipide wurden in Beispiel 5 nicht analysiert). Die Serumproben dieses Experiments wurden in einem randomisierten analytischen Sequenzdesign analysiert. Aus den Aliquots aller Proben wurde ein Projekt-Pool erzeugt und mit 4 Replikaten innerhalb jeder analytischen Sequenz gemessen. Für alle semi-quantitativ analysierten Metabolite wurden die Daten gegen den Median in den Pool-Referenzproben innerhalb jeder analytischen Sequenz normalisiert, um Pool-normalisierte Verhältnisse zu ergeben (für jede Probe pro Metabolit durchgeführt). Dies kompensiert die inter- und intra-instrumentelle Variation.
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Daten-Analyse:
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Die Daten wurden vor der statistischen Analyse nach log10 transformiert, um sie einer Normalverteilung anzunähern. Die Veränderungen der Metaboliten-Verhältnisse wurden durch ein einfaches lineares Modell (ANOVA) mit der Verarbeitungsgruppe und dem Geschlecht als feststehende Effekte berechnet. Die Daten in Tabelle 8 sind als Verhältnisse und p-Werte der 24-h-Blutgerinnungszeit von Blut in Bezug auf die direkte Verarbeitung von Blut zu Serum ausgedrückt.
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Tabelle 1': Weitere Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Plasmaproben zusammenhängt. Es sind die relativen Verhältnisse von bei der angegebenen Temperatur (21°C) und den Zeiten (5 h, 16 h) verarbeiteten Proben im Vergleich zu Kontrollproben sowie die entsprechenden p-Werte angegeben
Temp. °C | 21 | 21 | 21 | 21 |
Zeit | 5 | 16 | 5 | 16 |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis relativ zu = 0 bei 21°C | p-Wert |
Aspartat | 0,9947 | 1,3006 | 0,95352 | 0,00486 |
Asparagin | 0,9543 | 0,9258 | 0,00386 | 3,5E–06 |
Intra-Probenverhältnis Aspartat zu Asparagin | 1,0423 | 1,4048 | 0,6399 | 0,00019 |
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Tabelle 1a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Plasmaproben zusammenhängt: Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Glutamat |
Maltose |
Cystein |
Intra-Probenverhältnis Glutamat zu Glutamin |
Glycerat |
Threonsäure |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Glutamin |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) |
Cystin |
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Tabelle 1a': Weitere bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Plasmaproben zusammenhängt. Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Aspartat |
Asparagin |
Intra-Probenverhältnis Aspartat zu Asparagin |
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Tabelle 1b: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Plasmaproben zusammenhängt: Auswahl anhand von Performance.
Biomarker (Metabolit) |
3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) |
5-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[6]cis[8,11,14]4) (5-HETE) |
12-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,10,14]4) |
Glutamat |
15-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,11,13]4) |
3,4-Dihydroxyphenylglycol (DOPEG) |
11-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,12,14]4) |
3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) |
8-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[5]cis[9,11,14]4) (8-HETE) |
Prostaglandin D2 |
Maltose |
alpha-Ketoglutarat |
Noradrenalin (Norepinephrin) |
Cystein |
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Tabelle 1c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Plasmaproben zusammenhängt: Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Glutamat |
Maltose |
alpha-Ketoglutarat |
Cystein |
Glycerat |
Threonsäure |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Pyruvat |
Glutamin |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) |
Intra-Probenverhältnis Glutamat zu Glutamin |
Cystin |
Alanin |
Glycerin, polare Fraktion |
Isocitrat |
Valin |
Leucin |
Chinasäure |
Serin |
Erythrol |
trans-4-Hydroxyprolin |
Glycin |
Arabinose |
5-Oxoprolin |
Fumarat |
Ketoleucin |
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Tabelle 1c': Weitere bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Plasmaproben zusammenhängt. Auswahl anhand des Verfahrens ”GO-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Aspartat |
Asparagin |
Intra-Probenverhältnis Aspartat zu Asparagin |
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Tabelle 2a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Blutproben zusammenhängt: Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Hypoxanthin |
Ornithin |
Taurin |
Maltose |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Glutamat |
Glycerat |
Arginin |
Cystin |
Citrat |
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Tabelle 2a': Weitere bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Blutproben zusammenhängt. Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Intra-Probenverhältnis Glutamat zu Glutamin |
Threonsäure |
Asparagin |
Intra-Probenverhältnis Aspartat zu Asparagin |
Aspartat |
Cystein |
Intra-Probenverhältnis Ornithin zu Arginin |
Ribose |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) |
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Tabelle 2b: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Blutproben zusammenhängt: Auswahl anhand von Performance
Biomarker (Metabolit) |
Hypoxanthin |
Sphingadienin-1-phosphat (d18:2) |
Ornithin |
Thromboxan B2 |
9-Hydroxyoctadecadiensäure (9-HODE) (C18:trans[10]cis[12]2) |
Sphingosin (d16:1) |
Sphingosin-1-phosphat (d16:1) |
Sphingosin-1-phosphat (d18:1) |
Taurin |
Oleoylcarnitin |
Pyrophosphat (PPi) |
Sphingosin-1-phosphat (d17:1) |
Sphingadienin (d18:2) |
Sphingosin (d18:1) |
Sphinganin-1-phosphat (d18:0) |
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Tabelle 2b': Ein weiterer bevorzugter Biomarker, der einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigt, der mit längerer Verarbeitungszeit von Blutproben zusammenhängt. Auswahl anhand von Performance.
Biomarker (Metabolit) |
Intra-Probenverhältnis Ornithin zu Arginin |
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Tabelle 2c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Blutproben zusammenhängt: Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Pyruvat |
Hypoxanthin |
Ornithin |
Taurin |
Pyrophosphat (PPi) |
Hypotaurin |
Maltose |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Glutamat |
Glycerin, polare Fraktion |
Maltotriose |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) |
myo-Inositol |
Fruktose |
3-Hydroxyindol |
Glycerat |
Mannose |
2-Hydroxybutyrat |
Tryptophan |
Fumarat |
Leucin |
Ketoleucin |
Prolin |
Malat |
Erythrol |
beta-Alanin |
Threonin |
Glukose-1-phosphat |
Alanin |
Mannosamin |
Sulfat |
Methionin |
Isocitrat |
Serin |
Tyrosin |
Cystin |
Glycin |
Indol-3-essigsäure |
Lysin |
Citrat |
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Tabelle 2c': Weitere bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit längerer Verarbeitungszeit von Blutproben zusammenhängt. Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Intra-Probenverhältnis Glutamat zu Glutamin |
Threonsäure |
Asparagin |
Intra-Probenverhältnis Aspartat zu Asparagin |
Aspartat |
Cystein |
Intra-Probenverhältnis Ornithin zu Arginin |
Ribose |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) |
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Tabelle 3: Liste der identifizierten Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Hämolyse zusammenhängt
| Hämolyse Grad 1 | Hämolyse Grad 2 | Hämolyse Grad 1 | Hämolyse Grad 2 |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis relativ zu Kontrolle | Verhältnis relativ zu Kontrolle | p-Wert | p-Wert |
Sphingadienin (d18:2) | 0,4019 | 0,4411 | 2,12E–21 | 2,6E–18 |
Sphingosin (d18:1) | 0,3429 | 0,3737 | 3,08E–21 | 3,32E–19 |
Sphingosin-1-phosphat (d18:1) | 0,6527 | 0,6737 | 1,13E–18 | 1,16E–16 |
Sphingosin (d16:1) | 0,5604 | 0,5655 | 3,36E–18 | 3,68E–18 |
Thromboxan B2 | 0,225 | 0,2155 | 1,4E–14 | 2,68E–16 |
Taurin | 0,5131 | 0,5457 | 6,47E–16 | 9,51E–14 |
Sphinganin (d18:0) | 0,5116 | 0,6261 | 1,19E–15 | 4,31E–09 |
Sphinganin-1-phosphat (d18:0) | 0,5787 | 0,6317 | 2,01E–13 | 2,79E–10 |
Pyrophosphat (PPi) | 0,3763 | 0,5027 | 6,26E–12 | 5,56E–07 |
Serotonin (5-HT) | 0,164 | 0,2015 | 7,09E–12 | 4,13E–10 |
Hypotaurin | 0,5699 | 0,5915 | 1,28E–11 | 9,76E–11 |
Sphingosin-1-phosphat (d17:1) | 0,8046 | 0,8052 | 2,24E–11 | 2,54E–11 |
Sphingadienin-1-phosphat (d18:2) | 0,838 | 0,8346 | 4,83E–10 | 2,1E–10 |
O-Phosphoethanolamin | 0,4002 | 0,3749 | 2,94E–09 | 2,76E–10 |
12-Hydroxyheptadecatriensäu re (C17:[5,8,10]3) | 0,3796 | 0,3876 | 3,73E–09 | 1,68E–09 |
Maltose | 0,3527 | 0,3748 | 3,83E–09 | 3,63E–08 |
3-Hydroxyindol | 0,8298 | 0,7002 | 0,00298768 | 2,64E–08 |
Noradrenalin (Norepinephrin) | 0,8309 | 0,8012 | 0,00000573 | 5,62E–08 |
Sphingosin-1-phosphat (d16:1) | 0,919 | 0,886 | 0,0003221 | 4,37E–07 |
11-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,12,14]4) | 0,7502 | 0,8052 | 0,00000311 | 0,00019451 |
12-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,10,14]4) | 0,4219 | 0,4584 | 0,00000811 | 0,000023 |
Oleoylcarnitin | 1,0225 | 1,1838 | 0,55456842 | 0,0000126 |
Maltotriose | 0,2636 | 0,3016 | 0,000032 | 0,0000703 |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion | 0,6787 | 0,7846 | 0,0000431 | 0,00793678 |
Glutamat | 0,7363 | 0,8231 | 0,00019055 | 0,01630403 |
Octadecanoylcarnitin | 1,0271 | 1,1462 | 0,4706113 | 0,00029742 |
myo-Inositol | 0,9156 | 0,9373 | 0,00037287 | 0,00840466 |
Ceramid (d18:1, C24:0) | 1,0635 | 1,1606 | 0,13800348 | 0,00040892 |
Glycerin, polare Fraktion | 0,854 | 0,8263 | 0,00301127 | 0,00043557 |
Nicotinamid | 0,6885 | 0,9449 | 0,00044737 | 0,58722816 |
Myristinsäure (C14:0) | 1,2134 | 1,6207 | 0,15459447 | 0,00046693 |
Indol-3-essigsäure | 0,9195 | 0,8804 | 0,02020044 | 0,00048032 |
14-Methylhexadecansäure | 1,2253 | 1,3952 | 0,03345615 | 0,00056661 |
Dopamin | 0,8012 | 0,8306 | 0,00071042 | 0,00384527 |
Heptadecansäure (C17:0) | 1,159 | 1,2272 | 0,01793189 | 0,00111644 |
Sulfat | 1,1761 | 1,3153 | 0,06549211 | 0,00128012 |
Tetradecanol | 0,7158 | 0,7436 | 0,00155293 | 0,00491137 |
Hexadecanoylcarnitin | 0,9909 | 1,1379 | 0,82185551 | 0,00167649 |
Isopalmitinsäure (C16:0) | 1,1513 | 1,3289 | 0,11604202 | 0,00170911 |
Stearinsäure (C18:0) | 1,1086 | 1,2174 | 0,09912423 | 0,00184317 |
Tricosansäure (C23:0) | 1,0906 | 1,2294 | 0,18823507 | 0,0019529 |
Fumarat | 1,07 | 1,0915 | 0,01924515 | 0,00259049 |
Glycerin, Lipidfraktion | 1,3653 | 1,4929 | 0,01960141 | 0,0028074 |
Palmitinsäure (C16:0) | 1,1503 | 1,2882 | 0,10800082 | 0,00393825 |
1-Hydroxy-2-amino-(cis.trans)-3,5-octadecadien (von Sphingolipiden) | 1,0872 | 1,2479 | 0,27273192 | 0,00458857 |
Ceramid (d18:1, C24:1) | 1,0138 | 1,1189 | 0,73842126 | 0,00686432 |
konjugierte Linolsäure (C18:trans[9,11]2) | 1,111 | 1,2712 | 0,23188405 | 0,0068945 |
erythro-Dihydrosphingosin (d18:0) | 1,1077 | 1,2274 | 0,17823928 | 0,00746165 |
beta-Alanin | 0,8878 | 0,9446 | 0,00788311 | 0,19957198 |
Lignocerinsäure (C24:0) | 1,0478 | 1,1736 | 0,43961659 | 0,00863095 |
15-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,11,13]4) | 0,8592 | 0,8842 | 0,00957951 | 0,02739644 |
Phosphat, Lipidfraktion | 1,0363 | 1,1662 | 0,57151128 | 0,01229448 |
Docosapentaensäure (C22:cis[7,10,13,16,19]5) | 1,1662 | 1,2291 | 0,05870958 | 0,01277854 |
Palmitoleinsäure (C16:cis[9]1) | 1,0239 | 1,3109 | 0,82698083 | 0,01289247 |
erythro-Sphingosin (d18:1) | 1,0567 | 1,1556 | 0,34213421 | 0,01342472 |
Harnsäure | 0,9763 | 0,9373 | 0,36033477 | 0,01425087 |
Phosphatidylcholin (C18:1, C18:2) | 0,9825 | 0,9903 | 0,01502642 | 0,17572158 |
Sphingomyelin (d18:1, C24:0) | 0,9957 | 1,0472 | 0,81826216 | 0,01563259 |
Sphingomyelin (d18:2, C18:0) | 1,0447 | 1,0504 | 0,03631959 | 0,01867204 |
erythro-Sphingosin-1-phosphat (d18:1) | 1,0761 | 1,2111 | 0,37192322 | 0,0205107 |
threo-Sphingosin (d18:1) | 1,0894 | 1,1271 | 0,09822827 | 0,02133293 |
Cholesterin, gesamt | 1,0266 | 1,1651 | 0,69207227 | 0,02232955 |
Oleinsäure (C18:cis[9]1) | 1,1678 | 1,1826 | 0,03499891 | 0,02277323 |
Phosphatidylcholin (C18:0, C22:6) | 1,0265 | 1,0367 | 0,097723 | 0,02300177 |
Eicosansäure (C20:0) | 1,0794 | 1,1178 | 0,12557461 | 0,02619107 |
Linolsäure (C18:cis[9,12]2) | 1,0981 | 1,1368 | 0,10397714 | 0,02635711 |
Glycerinphosphat, Lipidfraktion | 1,0431 | 1,2103 | 0,62589921 | 0,02841455 |
Harnstoff | 1,1414 | 1,0383 | 0,02989533 | 0,53496231 |
Cortisol | 1,1052 | 1,0942 | 0,03021237 | 0,05069531 |
Normetanephrin | 1,5755 | 1,4654 | 0,03120381 | 0,06936646 |
Behensäure (C22:0) | 1,0262 | 1,1143 | 0,60468832 | 0,03171684 |
Eicosapentaensäure (C20:cis[5,8,11,14,17]5) | 1,1364 | 1,2846 | 0,27285073 | 0,03255399 |
Lysophosphatidylcholin (C17:0) | 1,0299 | 1,0876 | 0,45122371 | 0,032632 |
erythro-Dihydrosphingosin (d16:0) | 1,0784 | 1,2411 | 0,4543911 | 0,03338574 |
TAG (C18:1, C18:2, C18:3) | 1,0782 | 1,119 | 0,15875664 | 0,03605895 |
Galaktose, Lipidfraktion | 1,06 | 1,1075 | 0,23887084 | 0,03995467 |
Fruktosamin | 1,1491 | 1,3966 | 0,42463234 | 0,04560203 |
3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) | 0,9626 | 0,953 | 0,12442433 | 0,04956619 |
5-O-Methylsphingosin (d16:1) | 1,0762 | 1,2132 | 0,45644765 | 0,05099612 |
Cholesterylester C18:1 | 1,055 | 1,0924 | 0,23648261 | 0,05144797 |
Glycolat | 1,0642 | 1,1807 | 0,4672714 | 0,05342104 |
gamma-Linolensäure (C18:cis[6,9,12]3) | 1,0068 | 1,1914 | 0,94076475 | 0,05462627 |
Coenzym Q9 | 0,943 | 1,1275 | 0,35797377 | 0,06102849 |
Linolensäure (C18:cis[9,12,15]3) | 1,1898 | 1,1695 | 0,06138493 | 0,0915892 |
Phosphatidylcholin (C16:0, C16:0) | 0,966 | 0,9908 | 0,06217669 | 0,61613526 |
Cholesta-2,4-dien | 1,0984 | 1,1445 | 0,19358928 | 0,06224262 |
Sarcosin | 0,9944 | 1,045 | 0,81212785 | 0,06572449 |
1,5-Anhydrosorbitol | 0,9612 | 0,9747 | 0,06700142 | 0,2346823 |
Hexadecenoylcarnitin | 1,0014 | 1,0937 | 0,97694551 | 0,0671034 |
Nervonsäure (C24:cis[15]1) | 1,0423 | 1,1238 | 0,51907982 | 0,07057989 |
Arachidonsäure (C20:cis[5,8,11,14]4) | 0,9927 | 1,1798 | 0,93647679 | 0,07276058 |
Alanin | 0,9748 | 0,99 | 0,07453226 | 0,48203673 |
Dihomo-gamma-Linolensäure (C20:cis[8,11,14]3) | 0,9825 | 1,1333 | 0,80140762 | 0,07605609 |
Uridin | 1,1171 | 1,0338 | 0,07615628 | 0,59274993 |
Sphingomyelin (d18:1, C23:0) | 1,0086 | 1,0556 | 0,77695655 | 0,07625166 |
Cholin-Plasmalogen (C18, C20:4) | 0,9653 | 0,9829 | 0,07748573 | 0,38752846 |
Sphingomyelin (d18:2, C16:0) | 1,0623 | 0,9888 | 0,08278466 | 0,74457271 |
Malat | 0,9073 | 0,9588 | 0,08418822 | 0,45374635 |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) | 0,9485 | 0,9467 | 0,09543672 | 0,08465536 |
2-Hydroxybutyrat | 0,9712 | 0,9796 | 0,09179728 | 0,23454674 |
Glycerat | 0,9027 | 1,0902 | 0,09508601 | 0,15855904 |
8-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[5]cis[9,11,14]4) (8-HETE) | 0,9199 | 0,9533 | 0,09979566 | 0,32281559 |
Cystin | 0,8768 | 0,8232 | 0,26539304 | 0,0999352 |
Cholesterylester C18:2 | 1,0255 | 1,0673 | 0,52349069 | 0,1005164 |
Glukose-6-phosphat | 1,3154 | 1,3046 | 0,10189345 | 0,11247861 |
Histamin | 0,7212 | 0,7335 | 0,10430583 | 0,11814385 |
Pseudouridin | 1,0375 | 1,0558 | 0,27072826 | 0,10448217 |
Threitol | 1,1419 | 0,9894 | 0,10454186 | 0,89704377 |
Lysophosphatidylcholin (C20:4) | 0,9903 | 1,0644 | 0,79911675 | 0,10530508 |
Isocitrat | 0,9367 | 0,9553 | 0,10810006 | 0,26019403 |
Docosahexaensäure (C22:cis[4,7,10,13,16,19]6) | 1,0563 | 1,2111 | 0,65170561 | 0,11562245 |
myo-Inositol, Lipidfraktion | 1,031 | 1,1088 | 0,64375586 | 0,11852959 |
3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) | 1,0732 | 1,0153 | 0,11964385 | 0,73413494 |
4-Hydroxy-3-methoxyphenylglycol (HMPG) | 1,0271 | 0,9746 | 0,12610775 | 0,13529631 |
gamma-Tocopherol | 0,9701 | 1,1195 | 0,68584079 | 0,1336499 |
5-Oxoprolin | 0,9986 | 0,9463 | 0,97039848 | 0,13967798 |
Phosphatidylcholin (C16:0, C22:6) | 1,0055 | 1,0147 | 0,57978856 | 0,1411089 |
3-Hydroxybutyrat | 0,9659 | 1,0308 | 0,15035405 | 0,20860913 |
9-Hydroxyoctadecadiensäure (9-HODE) (C18:trans[10]cis[12]2) | 1,0125 | 1,0511 | 0,73197312 | 0,15196018 |
Allantoin | 0,8448 | 0,9405 | 0,15363982 | 0,60282307 |
Cholesterylester C20:4 | 1,0626 | 1,083 | 0,27887799 | 0,15585149 |
3-Methoxytyrosin | 1,0612 | 1,0176 | 0,15809936 | 0,6734133 |
4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure | 1,0957 | 0,9915 | 0,16995783 | 0,89673187 |
Docosapentaensäure (C22:cis[4,7,10,13,16]5) | 0,9531 | 1,1762 | 0,6799843 | 0,17026722 |
Cystein | 1,1243 | 1,0049 | 0,17045624 | 0,95450467 |
Ketoleucin | 0,9457 | 1,0215 | 0,17101675 | 0,60133095 |
Glukose, Lipidfraktion | 0,9643 | 0,811 | 0,81224933 | 0,17258529 |
trans-4-Hydroxyprolin | 1,0076 | 1,0433 | 0,80738096 | 0,17429652 |
Kynureninsäure | 0,843 | 0,6885 | 0,53361578 | 0,17473073 |
Lysophosphatidylcholin (C18:1) | 0,9663 | 1,0486 | 0,32712459 | 0,17550525 |
Lysophosphatidylcholin (C16:0) | 0,9055 | 0,9254 | 0,18959921 | 0,30528294 |
Phosphatidylcholin (C16:0, C20:5) | 0,973 | 1,0164 | 0,19077749 | 0,43417496 |
Asparagin | 0,9754 | 0,9571 | 0,4576604 | 0,19218912 |
Lactaldehyd | 0,7209 | 0,5925 | 1,91E–11 | 5,13E–23 |
-
Tabelle 3': Weitere Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Hämolyse zusammenhängt
| Hämolyse Grad 1 | Hämolyse Grad 1 |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis relativ zu Kontrolle | p-Wert |
Threonsäure | 0,7313 | 5,6471E–08 |
Aspartat | 0,6737 | 3,2136E–05 |
Glucose | 0,9511 | 0,13980293 |
Hypoxanthin | 0,8022 | 0,021891904 |
Ribose | 0,8831 | 0,034991325 |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) | 0,4448 | 1,50258E–06 |
-
Tabelle 3a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Hämolyse zusammenhängt Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Taurin |
Maltose |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Glutamat |
Glycerat |
Cystin |
Cystein |
Asparagin |
-
Tabelle 3a': Weitere bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Hämolyse zusammenhängt Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Threonsäure |
Aspartat |
Glucose |
Hypoxanthin |
Ribose |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) |
-
Tabelle 3c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Hämolyse zusammenhängt Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Taurin |
Pyrophosphat (PPi) |
Hypotaurin |
Maltose |
3-Hydroxyindol |
Maltotriose |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Glutamat |
myo-Inositol |
Glycerin, polare Fraktion |
Indol-3-essigsäure |
Sulfat |
Fumarat |
beta-Alanin |
Harnsäure |
Fruktosamin |
Glycolat |
Sarcosin |
1,5-Anhydrosorbitol |
Alanin |
Malat |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) |
2-Hydroxybutyrat |
Glycerat |
Cystin |
Pseudouridin |
Threitol |
Isocitrat |
5-Oxoprolin |
3-Hydroxybutyrat |
Cystein |
trans-4-Hydroxyprolin |
Asparagin |
-
Tabelle 3c': Weitere bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Hämolyse zusammenhängt Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Threonsäure |
Aspartat |
Glucose |
Hypoxanthin |
Ribose |
3-Phosphoglycerat (3-PGA) |
-
Tabelle 4: Liste der identifizierten Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Mikrogerinnselbildung zusammenhängt
| Mikrogerinnselbildung | Mikrogerinnselbildung |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis relativ zu Kontrolle | p-Wert |
Sphingosin (d16:1) | 0,7388 | 0,00000056 |
Sphingosin (d18:1) | 0,6147 | 0,00000124 |
Taurin | 0,6963 | 0,00000278 |
Hypotaurin | 0,7195 | 0,0000142 |
Sphingadienin (d18:2) | 0,6975 | 0,000025 |
Sphinganin (d18:0) | 0,7348 | 0,0000819 |
Pyrophosphat (PPi) | 0,5964 | 0,00013249 |
Sphingosin-1-phosphat (d18:1) | 0,8504 | 0,00021234 |
Sphinganin-1-phosphat (d18:0) | 0,7809 | 0,00039464 |
O-Phosphoethanolamin | 0,5917 | 0,00043076 |
Leucin | 0,952 | 0,00064465 |
Tetradecanol | 0,7024 | 0,00084462 |
Alanin | 0,9556 | 0,00165354 |
Valin | 0,9586 | 0,0020399 |
myo-Inositol | 0,9281 | 0,00244972 |
Glycerin, polare Fraktion | 0,8588 | 0,00419211 |
1,5-Anhydrosorbitol | 0,9404 | 0,0047325 |
Lysin | 0,935 | 0,00500755 |
Serin | 0,9553 | 0,00501809 |
Kynureninsäure | 0,4618 | 0,00535807 |
Prolin | 0,9621 | 0,00563453 |
Ornithin | 0,9427 | 0,00627566 |
Glycin | 0,9647 | 0,00756625 |
Sphingosin-1-phosphat (d17:1) | 0,9227 | 0,00868807 |
Cystin | 0,7395 | 0,01118095 |
9-Hydroxyoctadecadiensäure (9-HODE) (C18:trans[10]cis[12]2) | 1,0869 | 0,01722053 |
8-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[5]cis[9,11,14]4) (8-HETE) | 0,8905 | 0,01722752 |
Maltose | 0,6698 | 0,01774659 |
Glutamin | 0,8273 | 0,01897131 |
Erythrol | 0,922 | 0,02057815 |
erythro-Dihydrosphingosin (d18:0) | 1,1902 | 0,02260725 |
Tyrosin | 0,9562 | 0,02758202 |
Pantothensäure | 1,1862 | 0,03167457 |
Histidin | 0,933 | 0,03517983 |
Eicosansäure (C20:0) | 1,109 | 0,03856298 |
Phosphatidylcholin (C16:0, C22:6) | 1,0207 | 0,03894939 |
Phenylalanin | 0,9629 | 0,0391365 |
Serotonin (5-HT) | 0,6085 | 0,04015896 |
Linolensäure (C18:cis[9,12,15]3) | 1,2093 | 0,04091573 |
erythro-Sphingosin-1-phosphat (d18:1) | 1,1829 | 0,0418364 |
erythro-Sphingosin (d18:1) | 1,1242 | 0,0446753 |
Palmitinsäure (C16:0) | 1,1872 | 0,04928017 |
Isoleucin | 0,9629 | 0,04963676 |
Linolsäure (C18:cis[9,12]2) | 1,1187 | 0,05166555 |
Stearinsäure (C18:0) | 1,1279 | 0,05459397 |
Oleinsäure (C18:cis[9]1) | 1,1505 | 0,05633266 |
Lignocerinsäure (C24:0) | 1,1226 | 0,05658935 |
Cresolsulfat | 0,6572 | 0,05905597 |
Taurochenodeoxycholsäure | 0,7842 | 0,06165658 |
Noradrenalin (Norepinephrin) | 0,9296 | 0,06274978 |
Nervonsäure (C24:cis[15]1) | 1,1275 | 0,06313932 |
Threonin | 0,9723 | 0,06325183 |
Sphingomyelin (d18:2, C16:0) | 1,0667 | 0,06408695 |
Cholesta-2,4-dien | 1,1408 | 0,06875023 |
Phosphatidylcholin (C18:0, C22:6) | 1,0283 | 0,07727111 |
Cholesterylester C18:1 | 1,0832 | 0,0777002 |
Normetanephrin | 1,4479 | 0,07821874 |
Dopamin | 0,8949 | 0,08117217 |
Sphingadienin-1-phosphat (d18:2) | 0,9543 | 0,08192251 |
Fumarat | 1,0512 | 0,08314779 |
Myristinsäure (C14:0) | 1,2645 | 0,08468858 |
2-Hydroxybutyrat | 0,9706 | 0,08564891 |
Ceramid (d18:1, C24:0) | 1,0735 | 0,08780931 |
Nicotinamid | 0,8372 | 0,089989 |
Hippursäure | 0,7252 | 0,09246467 |
Allantoin | 0,8195 | 0,09260986 |
Glycerinphosphat, Lipidfraktion | 1,1553 | 0,09644572 |
Fruktosamin | 0,7552 | 0,09695137 |
Glycerin, Lipidfraktion | 1,2462 | 0,09759671 |
8,9-Dihydroxyeicosatriensäure (C20:cis[5,11,14]3) | 0,9166 | 0,10314504 |
Asparagin | 0,9466 | 0,10325858 |
Harnstoff | 1,1031 | 0,10614621 |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion | 0,8635 | 0,10719199 |
Erythronsäure | 0,9384 | 0,11049428 |
Tricosansäure (C23:0) | 1,1099 | 0,11396066 |
Lactaldehyd | 0,9305 | 0,11485541 |
4-Hydroxy-3-methoxyphenylglycol (HMPG) | 0,9728 | 0,11575759 |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) | 0,9519 | 0,1198119 |
Glukose, Lipidfraktion | 0,7883 | 0,12156488 |
threo-Sphingosin (d18:1) | 1,0814 | 0,13031816 |
Heptadecansäure (C17:0) | 1,098 | 0,13165303 |
11-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,12,14]4) | 0,9183 | 0,13569715 |
Cholin-Plasmalogen (C18, C20:4) | 0,9709 | 0,13973592 |
Behensäure (C22:0) | 1,0767 | 0,14079655 |
alpha-Ketoglutarat | 0,8867 | 0,14845843 |
13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE) (C18:cis[9]trans[11]2) | 0,9631 | 0,14885392 |
Phosphatidylcholin (C18:1, C18:2) | 0,9898 | 0,15286642 |
Glycolat | 1,1301 | 0,15389111 |
Phosphatidylcholin (C18:0, C18:2) | 0,9879 | 0,15432369 |
Cortisol | 1,066 | 0,16441871 |
14,15-Dihydroxyeicosatriensäure (C20:cis[5.8.11]3) | 0,9323 | 0,16630566 |
Indol-3-propionsäure | 0,6948 | 0,17404551 |
Lysophosphatidylcholin (C18:1) | 1,0481 | 0,18012663 |
Isopalmitinsäure (C16:0) | 1,1273 | 0,18099216 |
3-Indoxylsulfat | 1,2969 | 0,18733596 |
Docosapentaensäure (C22:cis[7,10,13,16,19]5) | 1,1129 | 0,19341371 |
Sulfat | 1,1182 | 0,19688567 |
Maltotriose | 0,6839 | 0,19842592 |
-
Tabelle 4a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Mikrogerinnselbildung zusammenhängt Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Taurin |
Ornithin |
Cystin |
Maltose |
Glutamin |
Asparagin |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
-
Tabelle 4b: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Mikrogerinnselbildung zusammenhängt Auswahl anhand von Performance.
Biomarker (Metabolit) |
Sphingosin (d16:1) |
Sphingosin (d18:1) |
Taurin |
Hypotaurin |
Sphingadienin (d18:2) |
Sphinganin (d18:0) |
Pyrophosphat (PPi) |
Sphingosin-1-phosphat (d18:1) |
Sphinganin-1-phosphat (d18:0) |
-
Tabelle 4c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Mikrogerinnselbildung zusammenhängt Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Taurin |
Hypotaurin |
Pyrophosphat (PPi) |
Leucin |
Alanin |
Valin |
myo-Inositol |
Glycerin, polare Fraktion |
1,5-Anhydrosorbitol |
Lysin |
Serin |
Prolin |
Ornithin |
Glycin |
Cystin |
Maltose |
Glutamin |
Erythrol |
Tyrosin |
Histidin |
Phenylalanin |
Isoleucin |
Threonin |
Fumarat |
2-Hydroxybutyrat |
Fruktosamin |
Asparagin |
Harnstoff |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Erythronsäure |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) |
alpha-Ketoglutarat |
Glycolat |
Sulfat |
Maltotriose |
-
Tabelle 5: Liste der identifizierten Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Kontamination mit weißen Blutzellen zusammenhängt
-
Tabelle 5': Weitere Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Kontamination mit weißen Blutzellen zusammenhängt
| Kontamination mit Blutzellen Grad 2 | Kontamination mit Blutzellen Grad 2 |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis relativ zu Kontrolle | p-Wert |
Threonsäure | 0,776 | 7,43E–06 |
-
Threonsäure ist ebenfalls ein weiterer bevorzugter Biomarker, der einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigt, der mit der Kontamination mit weißen Blutzellen zusammenhängt, bei der Auswahl anhand von Testfähigkeit und/oder anhand des Verfahrens „GC-polar”.
-
Tabelle 5a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Kontamination mit weißen Blutzellen zusammenhängt Auswahl anhand von Testfähigkeit
Biomarker (Metabolit) |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Taurin |
Hypoxanthin |
Maltose |
Glutamat |
Glycerat |
-
Tabelle 5b: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Kontamination mit weißen Blutzellen zusammenhängt Auswahl anhand von Performance.
Biomarker (Metabolit) |
Octadecanoylcarnitin |
Eicosansäure (C20:0) |
Myristinsäure (C14:0) |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Isopalmitinsäure (C16:0) |
myo-Inositol |
scyllo-Inositol |
-
Tabelle 5c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Kontamination mit weißen Blutzellen zusammenhängt Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
myo-Inositol |
scyllo-Inositol |
Glycerin, polare Fraktion |
Taurin |
Fumarat |
Hypoxanthin |
alpha-Ketoglutarat |
trans-4-Hydroxyprolin |
Glukose-1-phosphat |
Oxalat |
beta-Alanin |
Erythrol |
Pseudouridin |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) |
5-Oxoprolin |
Maltose |
Fruktosamin |
Hypotaurin |
Harnsäure |
Glutamat |
3-Hydroxybutyrat |
Glycerat |
-
Tabelle 6: Liste der identifizierten Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Lagerung zusammenhängt
| Proben, gelagert bei –20°C relativ zu Proben, gelagert bei –196°C |
| 181 Tage | 365 Tage | 181 Tage | 365 Tage |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis | Verhältnis | p-Wert | p-Wert |
Glutamat | 2,6368 | 4,9119 | 0,00033723 | 0,00017925 |
Glutamin | 0,656 | 0,6304 | 0,00291477 | 0,00348084 |
Aspartat | 2,0239 | 6,8136 | 0,008366 | 0,00197954 |
Asparagin | 0,8506 | 0,8243 | 0,08098985 | 0,01849786 |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:2-OOH) | 1,4599 | 3,1993 | 0,08455524 | 0,00010079 |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:1-OOH) | 3,4881 | 16,1379 | 0,0000657 | 0,00000104 |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C18:0, C18:2-OOH) | 1,6789 | 2,5742 | 0,00683629 | 0,00013176 |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:3-OOH) | 4,4365 | 35,6414 | 0,06669905 | 0,00000042 |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:2, C18:2-OOH) | 4,4365 | 35,6414 | 0,06669905 | 0,00000042 |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:2-OOH) | 2,3951 | 21,9135 | 0,00247007 | 0,00000004 |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C18:1, 18:2, C18:2-OOH) | | 74,6446 | | 2,86E–09 |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C20:4-OOH) | | 74,6446 | | 2,86E–09 |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C18:1, C18:1, C18:3-OOH) | | 74,6446 | | 2,86E–09 |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-9-OOH) | 17,6715 | 38,5989 | 0,0000132 | 4,62E–07 |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-13-OOH) | 17,6715 | 38,5989 | 0,0000132 | 4,62E–07 |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C20:4-OOH) | 17,6715 | 38,5989 | 0,0000132 | 4,62E–07 |
Cholesterylester-Hydroperoxid (018:2-9-OOH) | 2,2942 | 8,6105 | 0,009491 | 0,0000101 |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-13-OOH) | 2,2942 | 8,6105 | 0,009491 | 0,0000101 |
Prostaglandin E2 | 10,9228 | 127,7318 | 0,00696699 | 1,46E–07 |
3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) | 0,1155 | 0,0743 | 1,07E – 07 | 2,44E–07 |
3,4-Dihydroxyphenylglycol (DOPEG) | 0,2073 | 0,0534 | 1,48E – 08 | 2,97E–07 |
Cystein | 0,6352 | 0,48 | 0,01568556 | 3,78E–07 |
Cystin | 0,3273 | 0,272 | 0,01170524 | 6,79E–07 |
Noradrenalin (Norepinephrin) | 0,2864 | 0,0491 | 0,0000203 | 0,000002 |
Pyruvat | 0,7416 | 0,3825 | 0,00408159 | 0,00000288 |
3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) | 0,0172 | 0,0057 | 4,77E–10 | 0,00000372 |
Glycerat | 2,1608 | 3,6579 | 0,00073095 | 0,000005 |
13,14-Dihydro-15-ketoprostaglandin D2 | 1,4026 | 3,7203 | 0,77268436 | 0,0000443 |
Adrenalin (Epinephrin) | 1,0395 | 0,1335 | 0,1334819 | 0,0000651 |
delta-12-Prostaglandin J2 | 5,2127 | 124,0942 | 0,28477496 | 0,0000892 |
4-Hydroxyphenylpyruvat | 0,6479 | 0,3398 | 0,01209475 | 0,00036356 |
Prostaglandin D2 | 39,7057 | 775,1853 | 0,00085332 | 0,00042654 |
Lipoxin A4 | 85,1016 | 125,1515 | 0,00670764 | 0,00079235 |
8,9-Epoxyeicosatriensäure (C20:cis[5,11,14]3) | 2,0874 | 3,4474 | 0,02347563 | 0,00116761 |
Prostaglandin F2 alpha | 2,7009 | 6,8075 | 0,03476308 | 0,00123974 |
beta-Karotin | 0,8524 | 0,62 | 0,04723278 | 0,00135881 |
5-Oxoprolin | 1,0552 | 1,3387 | 0,67135719 | 0,00192537 |
Coenzym Q10 | 0,7681 | 0,6624 | 0,07951077 | 0,00374187 |
Prostaglandin J2 | 16,6378 | 160,2748 | 0,09776237 | 0,00598662 |
Diacylglcerid (C18:1, C18:2) | 0,9258 | 0,8026 | 0,15669889 | 0,00615809 |
6-Oxoprostaglandin F1 alpha | 1,171 | 3,1176 | 0,67692366 | 0,00665208 |
delta-12-Prostaglandin D2 | 612,6522 | 311,398 | 0,00439507 | 0,00728037 |
Thromboxan B2 | 0,2906 | 0,5613 | 0,14071353 | 0,00793485 |
12-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,10,14]4) | 1,886 | 19,3798 | 0,11477199 | 0,0088226 |
Arachidonsäure (C20:cis[5,8,11,14]4) | 0,8719 | 0,8851 | 0,00840523 | 0,01033471 |
5-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[6]cis[8,11,14]4) | 3,307 | 26,5618 | 0,12306914 | 0,01189927 |
Docosahexaensäure (C22:cis[4,7,10,13,16,19]6) | 0,8699 | 0,8436 | 0,0030645 | 0,01200993 |
Glycerin, polare Fraktion | 0,9656 | 1,3693 | 0,84358345 | 0,01379894 |
15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandin J2 | 7,6596 | 10,224 | 0,00403572 | 0,01545605 |
Leukotrien 64 | 6,6204 | 60,1663 | 0,01386475 | 0,01825921 |
17,18-Epoxyarachidonsäure (C20:cis[5,8,11,14]4) | 1,0416 | 8,1826 | 0,61483042 | 0,01827305 |
8-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[5]cis[9,11,14]4) | 1,8747 | 24,9631 | 0,20380341 | 0,01951045 |
9-Hydroxyoctadecadiensäure (9-HODE) (C18:trans[10]cis[12]2) | 1,3359 | 5,8508 | 0,42403759 | 0,02241876 |
15-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,11,13]4) | 1,7003 | 22,11 | 0,247131 | 0,02367977 |
Kortikosteron | 0,9082 | 0,8102 | 0,35104355 | 0,02405416 |
14,15-Epoxyeicosatriensäure (C20:cis[5,8,11]3) | 3,991 | 3,6061 | 0,26875533 | 0,02408394 |
13-Hydroxyoctadecadiensäure (13-HODE) (C18:cis[9]trans[11]2) | 1,2494 | 4,3411 | 0,48986081 | 0,02472036 |
11-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,12,14]4) | 1,5862 | 20,7365 | 0,1939883 | 0,02496287 |
Cholesterin, gesamt | 0,9485 | 0,9163 | 0,26956024 | 0,02684661 |
Threonsäure | 0,5485 | 1,2215 | 0,00288993 | 0,02730538 |
Triacylglycerid (C18:2, C18:3) | 0,9112 | 0,8154 | 0,52695373 | 0,02894779 |
Canthaxanthin | 1,0326 | 0,7673 | 0,65218392 | 0,0349368 |
Eicosapentaensäure (C20:cis[5,8,11,14,17]5) | 0,8784 | 0,8641 | 0,01426751 | 0,04267106 |
Cryptoxanthin | 0,9022 | 0,7149 | 0,23539907 | 0,04535175 |
Cresolsulfat | 1,0766 | 0,4362 | 0,89476965 | 0,06057201 |
11,12-Epoxyeicosatriensäure (C20:cis[5,8,14]3) | 0,8515 | 3,6099 | 0,72264104 | 0,06827723 |
Citrullin | 0,9785 | 1,1009 | 0,65160998 | 0,07227598 |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) | 0,9262 | 1,2145 | 0,2791334 | 0,0730049 |
gamma-Linolensäure (C18:cis[6,9,12]3) | 0,8138 | 0,8863 | 0,00173952 | 0,07656861 |
Linolsäure (C18:cis[9,12]2) | 0,8432 | 0,9496 | 0,00832098 | 0,11276713 |
Glukose | 0,8651 | 0,8821 | 0,02802542 | 0,13018966 |
Oleinsäure (C18:cis[9]1) | 0,8791 | 0,9548 | 0,0384577 | 0,13232617 |
Dihomo-gamma-Linolensäure (C20:cis[8,11,14]3) | 0,9057 | 0,9438 | 0,03673706 | 0,18819684 |
-
Tabelle 6a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Lagerung zusammenhängt Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Glutamat |
Glutamin |
Aspartat |
Asparagin |
Cystein |
Cystin |
Glycerat |
Threonsäure |
Glukose |
-
Tabelle 6b: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Lagerung zusammenhängt Auswahl anhand von Performance.
Biomarker (Metabolit) |
Glutamat |
Glutamin |
Aspartat |
Asparagin |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:2-OOH) |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:1-OOH) |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C18:0, C18:2-OOH) |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:3-OOH) |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:2, C18:2-OOH) |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:2-OOH) |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C18:0, C18:2, C18:2-OOH) |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C20:4-OOH) |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C18:1, C18:1, C18:3-OOH) |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-9-OOH) |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-13-OOH) |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C20:4-OOH) |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-9-OOH) |
Cholesterylester-Hydroperoxid (C18:2-13-OOH) |
-
Tabelle 6c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Plasmaproben anzeigen, der mit Lagerung zusammenhängt Auswahl anhand des Verfahrens ”GO-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Glutamat |
Glutamin |
Aspartat |
Asparagin |
Cystein |
Cystin |
Pyruvat |
Glycerat |
5-Oxoprolin |
Glycerin, polare Fraktion |
Threonsäure |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) |
Glukose |
-
Tabelle 7: Liste der identifizierten Biomarker, die einen Qualitätsaspekt aufgrund langsamen Einfrierens der Proben anzeigen
| Langsames Einfrieren | Langsames Einfrieren |
Biomarker (Metabolit) | Verhältnis relativ zu Kontrolle | p-Wert |
Tetradecanol | 0,7232 | 0,002140022 |
Harnstoff | 1,1689 | 0,010627 |
Stearinsäure (C18:0) | 1,1687 | 0,013118363 |
Eicosansäure (C20:0) | 1,1322 | 0,013354788 |
Erythrol | 0,9189 | 0,015905156 |
erythro-Dihydrosphingosin (d18:0) | 1,2011 | 0,016502956 |
Lysophosphatidylethanolamin (C22:5) | 1,1687 | 0,017126683 |
Myristinsäure (C14:0) | 1,3804 | 0,018294628 |
Linolsäure (C18:cis[9,12]2) | 1,1455 | 0,018787093 |
Lignocerinsäure (C24:0) | 1,1526 | 0,019598109 |
Linolensäure (C18:cis[9,12,15]3) | 1,2329 | 0,024482544 |
Sphingomyelin (d18:2, C16:0) | 1,0812 | 0,025463963 |
Glycerin, polare Fraktion | 0,8895 | 0,026854543 |
Phosphat, Lipidfraktion | 1,1494 | 0,028126069 |
Palmitinsäure (C16:0) | 1,2108 | 0,028599728 |
Phosphatidylcholin (C18:1, C18:2) | 0,9844 | 0,029842398 |
Behensäure (C22:0) | 1,1154 | 0,030111761 |
Normetanephrin | 1,5659 | 0,030914681 |
Glycerin, Lipidfraktion | 1,33 | 0,032321451 |
TAG (C18:1, C18:2, C18:3) | 1,1204 | 0,033967485 |
Oleoylcarnitin | 1,0784 | 0,045873499 |
Tricosansäure (C23:0) | 1,1403 | 0,047055468 |
Octadecanoylcarnitin | 1,0743 | 0,053980018 |
12-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:cis[5,8,10,14]4) | 1,4117 | 0,055602301 |
Cystin | 0,7985 | 0,057477558 |
Serin, Lipidfraktion | 1,3297 | 0,061960511 |
myo-Inositol-2-phosphat; Lipidfraktion (myo-Inositolphospholipide) | 0,8093 | 0,074002009 |
11,12-Dihydroxyeicosatriensäure (C20:cis[5,8,14]3) | 0,9289 | 0,077575628 |
alpha-Ketoglutarat | 0,8636 | 0,078577812 |
Kynureninsäure | 0,6216 | 0,084333549 |
Sphingosin-1-phosphat (d16:1) | 0,9612 | 0,087576006 |
Asparagin | 0,9443 | 0,088710231 |
gamma-Tocopherol | 0,8797 | 0,088828878 |
Glutamat | 1,1448 | 0,093928971 |
3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) | 0,9602 | 0,097117107 |
3-Methoxytyrosin | 1,0707 | 0,100262462 |
Cholesterin, freies | 1,0389 | 0,101823511 |
Oleinsäure (C18:cis[9]1) | 1,1274 | 0,102262627 |
Indol-3-essigsäure | 0,9432 | 0,103924616 |
1-Hydroxy-2-amino-(cis.trans)-3,5-octadecadien (von Sphingolipiden) | 1,1299 | 0,109874857 |
Hexadecanoylcarnitin | 1,0671 | 0,109937475 |
Indol-3-milchsäure | 1,0551 | 0,110939097 |
erythro-Sphingosin-1-phosphat (d18:1) | 1,1397 | 0,112147051 |
Methionin | 1,0293 | 0,112264262 |
erythro-Dihydrosphingosin (d16:0) | 1,171 | 0,11894756 |
Fumarat | 1,0448 | 0,127704433 |
Eicosapentaensäure (C20:cis[5,8,11,14,17]5) | 1,1927 | 0,131265492 |
Glycerat | 1,096 | 0,13481564 |
Sphingosin-1-phosphat (d17:1) | 0,9556 | 0,135505349 |
Salicylsäure | 0,7635 | 0,142392241 |
Tryptophan | 1,0369 | 0,150124043 |
Isopalmitinsäure (C16:0) | 1,1327 | 0,164361792 |
trans-4-Hydroxyprolin | 1,0442 | 0,165452043 |
Phosphatidylcholin (C18:0, C20:4) | 1,0093 | 0,170866449 |
Hypoxanthin | 1,1367 | 0,172377725 |
Glukose-6-phosphat | 1,251 | 0,174943248 |
gamma-Linolensäure (C18:cis[6,9,12]3) | 1,1292 | 0,181226918 |
Ceramid (d18:1, C24:1) | 1,0564 | 0,183183249 |
Sphingomyelin (d18:1, C23:0) | 1,0413 | 0,184103295 |
Glutamin | 0,8991 | 0,185532729 |
Pantothensäure | 1,1104 | 0,185753913 |
Hippursäure | 0,7794 | 0,191123874 |
14-Methylhexadecansäure | 1,1323 | 0,191485912 |
Sphingomyelin (d18:2, C18:0) | 1,0275 | 0,19216552 |
beta-Karotin | 1,0708 | 0,192624577 |
erythro-Sphingosin (d18:1) | 1,0777 | 0,197612672 |
Pyrophosphat (PPi) | 0,8431 | 0,198160999 |
-
Tabelle 7a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt aufgrund langsamen Einfrierens der Proben anzeigen Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Cystin |
Asparagin |
Glutamat |
Glycerat |
Hypoxanthin |
Glutamin |
-
Tabelle 7c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt aufgrund langsamen Einfrierens der Proben anzeigen Auswahl anhand des Verfahrens ”GC-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Erythrol |
Glycerin, polare Fraktion |
Cystin |
alpha-Ketoglutarat |
Asparagin |
Glutamat |
Indol-3-essigsäure |
Methionin |
Fumarat |
Glycerat |
Tryptophan |
trans-4-Hydroxyprolin |
Hypoxanthin |
Glutamin |
Pyrophosphat (PPi) |
-
Tabelle 8: Liste der identifizierten Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Serumproben anzeigen, der mit verlängerter Blutgerinnung zusammenhängt.
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-
-
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Tabelle 8a: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Serumproben anzeigen, der mit verlängerter Blutgerinnung zusammenhängt: Auswahl anhand von Testfähigkeit.
Biomarker (Metabolit) |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Arginin |
Ornithin |
Glutamat |
Cystein |
Aspartat |
Glycerat |
Asparagin |
Taurin |
Cystin |
Threonsäure |
Maltose |
Hypoxanthin |
-
Tabelle 8b: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Serumproben anzeigen, der mit verlängerter Blutgerinnung zusammenhängt: Auswahl anhand von Performance.
Biomarker (Metabolit) |
Malst |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Pyruvat |
Arginin |
Glukose-1-phosphat |
5-Oxoprolin |
Ornithin |
Mannose |
Glutamat |
Cystein |
8-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[5]cis[9,11,14]4) (8-HETE) |
alpha-Ketoglutarat |
Aspartat |
-
Tabelle 8c: Bevorzugte Biomarker, die einen Qualitätsaspekt in Serumproben anzeigen, der mit verlängerter Blutgerinnung zusammenhängt: Auswahl anhand des Verfahrens ”GO-polar”.
Biomarker (Metabolit) |
Malat |
Glycerin-3-phosphat, polare Fraktion |
Pyruvat |
Glukose-1-phosphat |
5-Oxoprolin |
Ornithin |
Mannose |
Glutamat |
Cystein |
alpha-Ketoglutarat |
Aspartat |
Serin |
Phenylalanin |
Phosphat (anorganisch und von organischen Phosphaten) |
Glycerat |
Glycin |
Alanin |
Asparagin |
Lysin |
Xanthin |
myo-Inositol |
Leucin |
Histidin |
Erythrol |
Cystin |
Mannosamin |
Threonsäure |
Glukosamin |
Maltose |
Valin |
Ketoleucin |
Isoleucin |
Methionin |
Prolin |
Tyrosin |
Threonin |
Hypoxanthin |
Erythronsäure |
-
Tabelle 9: Bevorzugte Biomarker, die einen spezifischen Qualitätsaspekt in Plasma- oder Serumproben anzeigen: Auswahl anhand des Kriteriums ”Einzigartigkeit”: Biomarker (Metabolite) mit einzigartigem Vorkommen in einer der Tabellen 1 bis 8 und dem entspechenden Qualitätsaspekt (Störfaktor), für den sie indikativ sind.
Biomarker (Metabolit) | Tabelle | Qualitätsaspekt zusammenhängend mit (Störfaktor) |
Chinasäure | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Cholesta-2,4,6-trien | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
TAG(C16:0, C18:1, C18:2) | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Sorbitol | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Arabinose | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Laurinsäure (C12:0) | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Erucasäure (C22:cis[13]1) | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Kreatinin | 1 | längere Verarbeitungszeit von Plasmaproben |
Pentosen | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Fruktose | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Metanephrin | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Dehydroepiandrosteronsulfat | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Glucuronsäure | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Glycochenodeoxycholsäure | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Citrat | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
Intra-Probenverhältnis Ornithin zu Arginin | 2 | längere Verarbeitungszeit von Blutproben |
5-O-Methylsphingosin (d16:1) | 3 | Hämolyse |
Sarcosin | 3 | Hämolyse |
Threitol | 3 | Hämolyse |
4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure | 3 | Hämolyse |
Docosapentaensäure (C22:cis[4,7,10,13,16]5) | 3 | Hämolyse |
Taurochenodeoxycholsäure | 4 | Mikrogerinnselbildung |
Indol-3-propionsäure | 4 | Mikrogerinnselbildung |
3-Indoxylsulfat | 4 | Mikrogerinnselbildung |
scyllo-Inositol | 5 | Kontamination mit weißen Blutzellen |
Hydroxyhexadecenoylcarnitin | 5 | Kontamination mit weißen Blutzellen |
Oxalat | 5 | Kontamination mit weißen Blutzellen |
TAG (C16:0, C18:1, C18:3) | 5 | Kontamination mitweißen Blutzellen |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:2-OOH) | 6 | Lagerung |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:1-OOH) | 6 | Lagerung |
Phosphatidylcholin-Hydroperoxid (C16:0, C18:2-OOH) | 6 | Lagerung |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:2-OOH) | 6 | Lagerung |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:2, C18:2-OOH) | 6 | Lagerung |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:2-OOH) | 6 | Lagerung |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:2, C18:2-OOH) | 6 | Lagerung |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C20:4-OOH) | 6 | Lagerung |
Triacylgycerid-Hydroperoxid (C16:0, C18:1, C18:3-OOH) | 6 | Lagerung |
13,14-Dihydro-15-ketoprostaglandin D2 | 6 | Lagerung |
delta-12-Prostaglandin J2 | 6 | Lagerung |
4-Hydroxyphenylpyruvat | 6 | Lagerung |
Lipoxin A4 | 6 | Lagerung |
8,9-Epoxyeicosatriensäure (C20:cis[5,11,14]3) | 6 | Lagerung |
Prostaglandin J2 | 6 | Lagerung |
Diacylglcerid (C18:1,C18:2) | 6 | Lagerung |
6-Oxoprostaglandin F1 alpha | 6 | Lagerung |
5-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[6]cis[8,11,14]4) | 6 | Lagerung |
15-Deoxy-delta(12,14)-prostaglandin J2 | 6 | Lagerung |
Leukotrien B4 | 6 | Lagerung |
17,18-Epoxyarachidonsäure (C20:cis[5,8,11,14]4) | 6 | Lagerung |
8-Hydroxyeicosatetraensäure (C20:trans[5]cis[9,11,14]4) | 6 | Lagerung |
Kortikosteron | 6 | Lagerung |
14,15-Epoxyeicosatriensäure (C20:cis[5,8,11]3) | 6 | Lagerung |
Triacylglycerid (C18:2, C18:3) | 6 | Lagerung |
Canthaxanthin | 6 | Lagerung |
Cryptoxanthin | 6 | Lagerung |
11,12-Epoxyeicosatriensäure (C20:cis[5,8,14]3) | 6 | Lagerung |
Salicylsäure | 7 | lansames Einfrieren der Proben |
Phosphatidylcholin (C18:0, C20:4) | 7 | lansames Einfrieren der Proben |
Xanthin | 8 | verlängerte Blutgerinnung |
Glukosamin | 8 | verlängerte Blutgerinnung |
5-Hydroxy-3-indolessigsäure (5-HIAA) | 8 | verlängerte Blutgerinnung |
DAG (C18:1, C18:2) | 8 | verlängerte Blutgerinnung |