WO2021114160A1 - 一种微囊泡的生产方法、基于该微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用 - Google Patents

一种微囊泡的生产方法、基于该微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用 Download PDF

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WO2021114160A1
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microvesicles
liquid
precipitate
minutes
centrifuge
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邓志婷
严飞
郑海荣
肖杨
李飞
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中国科学院深圳先进技术研究院
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to the field of biomedicine technology, in particular to a method for producing microvesicles, microvesicles obtained based on the above-mentioned microvesicle production methods, and applications thereof.
  • Exosomes a kind of small lipid microvesicles, with a size of 50-150nm, play a vital role in physiology and pathology.
  • exosomes mediate cell-to-cell communication by transferring proteins and genetic information between cells.
  • Cell-derived exosomes/microvesicles can not only avoid immune rejection, but are also convenient to store, which has great application value in regenerative medicine.
  • exosomes/microvesicles The current method of collecting exosomes/microvesicles is by culturing cells, collecting a large amount of cell supernatant, separating and extracting, which is expensive.
  • the output of exosomes severely limits its application in the field of biomedicine.
  • the low yield of exosomes/microvesicles severely limits its application and further clinical promotion. How to non-invasively promote the production of exosomes/microvesicles has important scientific research and application value.
  • shock wave therapy is used to promote the secretion of exosomes
  • the literature is published in Cardiovascular research.
  • shock wave therapy is used to stimulate endothelial cells, and the resulting exosomes carry miR-19a-3p, which can improve part of the function of myocardial ischemia.
  • microvesicles that are non-damaging to cells and suitable for a variety of cells, microvesicles obtained based on the above-mentioned microvesicle production methods, and applications thereof.
  • a method for producing microvesicles includes the following steps:
  • the following steps are further included before sonicating the cells:
  • the cells When the concentration of the cells is greater than or equal to 70%, the cells are placed on a serum-free medium.
  • the ultrasonic energy interval is 0.2W/cm2-4W/cm2, and the ultrasonic treatment time is 1s-10min.
  • the ultrasonic device used in ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier, and an ultrasonic probe
  • the power amplifier is connected to the signal generator
  • the ultrasonic probe is connected to the power amplifier
  • the ultrasonic probe It is a focused probe or a non-focused probe or an array probe, and the frequency is 200KHz-5MHz.
  • the step of purifying the cell supernatant to obtain the microvesicles is:
  • microvesicle extraction reagent is then added to perform a precipitation reaction, and after centrifugation again, the microvesicles are obtained.
  • the operation of centrifuging the cell supernatant for multiple times to obtain the microvesicles is:
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge for 3-10 minutes at a rotation speed of 300 g-500 g, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained;
  • the operation to obtain the microvesicles is:
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge for 3-10 minutes at a rotation speed of 300 g-500 g, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained;
  • a microvesicle extraction reagent is then added to perform a precipitation reaction, and after centrifugation again, the operation of obtaining the microvesicles is:
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge for 3-10 minutes at a rotation speed of 300 g-500 g, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained;
  • the PBS solution was added to the fifth precipitate, centrifuged at a rotation speed of 9000 g-12000 g for 60 minutes, and after the sixth precipitate was removed, the microvesicles were obtained.
  • a microvesicle which is obtained by the above-mentioned production method of microvesicles.
  • the above-mentioned production method of microvesicles uses an ultrasound device to stimulate cells, which can greatly promote the generation of microvesicles, thereby increasing the production of cell-derived microvesicles, and is helpful for further clinical promotion and biological applications of microvesicles.
  • the above-mentioned microvesicle production method adopts the ultrasonic cell stimulation method that does not damage the cells, and is suitable for a variety of cells, including astrocytes, stem cells and the like.
  • Fig. 1 is a schematic flow chart of a method for producing microvesicles according to an embodiment
  • Figure 2 is a schematic diagram of an embodiment of the process of centrifuging the cell supernatant for multiple times to obtain microvesicles
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an embodiment of the operation flow of the cell supernatant is subjected to multiple centrifugation treatments, followed by ultrafiltration treatment, to obtain microvesicles;
  • FIG. 4 is a schematic diagram of an embodiment of the operation flow diagram of microvesicles obtained by centrifuging the cell supernatant for multiple times, then adding a microvesicle extraction reagent to perform a precipitation reaction, and centrifuging again;
  • Figure 5 is a characterization diagram of the number of exosomal particles
  • Figure 6 shows the total number of microvesicles in Example 1 and Comparative Example 1;
  • Figure 7 shows the cell proliferation after ultrasound stimulation.
  • the method for producing microvesicles includes the following steps:
  • the cells are sonicated.
  • the following steps are further included before sonicating the cells:
  • the cells are placed on a serum-free medium for sonication.
  • the cells can be cultured in petri dishes or flasks.
  • the cells may be suspension cells or adherent cells.
  • the types of cells can be nerve cells, glial cells, stem cells, fat cells, tumor cells or immune cells.
  • the temperature at which the cells are cultured in a carbon dioxide incubator is 37°C.
  • the ultrasonic device used in the ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier, and an ultrasonic probe
  • the power amplifier is connected to the signal generator
  • the ultrasonic probe is connected to the power amplifier.
  • the ultrasound probe can be a focused probe or a non-focused probe or an array probe.
  • the frequency of the ultrasonic probe may be 200KHz-5MHz.
  • the ultrasonic energy interval may be 0.2W/cm2-4W/cm2, and the ultrasonic treatment time may be 10s-10min.
  • the ultrasonic waves may be continuous waves or pulse waves.
  • S20 Place the ultrasonically processed cells in an incubator for 24 to 72 hours, and collect the cell supernatant.
  • the incubator is a carbon dioxide incubator.
  • the culture time can be 24 hours, 48 hours or 72 hours.
  • microvesicles refer to exosomes.
  • the step of purifying the cell supernatant to obtain microvesicles can be:
  • SB20 Centrifuge the first liquid at a rotation speed of 1500-4000g for 25-60 minutes to remove the third precipitate to obtain the second liquid.
  • SB30 Centrifuge the second liquid at a rotation speed of 9000 g-12000 g for 45-90 minutes to remove the fourth precipitate to obtain the third liquid.
  • SB40 Centrifuge the third liquid in a 100KDa ultrafiltration tube for 50-120 minutes to remove the fifth precipitate to obtain microvesicles.
  • microvesicle extraction reagent is added for precipitation reaction, and after centrifugation again, the operation to obtain microvesicles is:
  • SC10 After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge for 3-10 minutes at a rotating speed of 300g-500g, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained.
  • SC20 Centrifuge the first liquid at a rotation speed of 1500g-4000g for 25-60 minutes to remove the third precipitate to obtain the second liquid.
  • SC30 Centrifuge the second liquid for 60 minutes at a rotation speed of 9000 g-12000 g to remove the fourth precipitate to obtain the third liquid.
  • SC40 According to the volume ratio of the third liquid and the microvesicle extraction reagent at a ratio of 1:5, add the microvesicle extraction reagent to the third liquid and react for 12-24 hours.
  • the microvesicle extraction reagent is Exoquick-TC.
  • SC60 Add PBS solution to the fifth precipitate, centrifuge at 9000g-12000g for 60 minutes, and remove the sixth precipitate to obtain microvesicles.
  • Ultrasound is a mechanical wave that can propagate in solids and liquids (elastic media) and has a variety of biological effects (mainly including thermal effects, mechanical effects, cavitation effects, etc.).
  • the above-mentioned production method of microvesicles uses an ultrasound device to stimulate cells, which can greatly promote the generation of microvesicles, thereby increasing the production of cell-derived microvesicles, and is helpful for further clinical promotion and biological applications of microvesicles.
  • the ultrasonic stimulation cell method used does not damage the cells. After ultrasonic stimulation, there is no change in the cell morphology under the microscope.
  • the cell proliferation can be detected by cck-8, and the proliferation activity can be seen.
  • ctrl represents the control group without ultrasound treatment
  • us represents the experimental group after ultrasound treatment. Applicable to a variety of cells, including astrocytes, stem cells, etc.
  • microvesicles prepared by the above-mentioned microvesicle production method are quantitatively analyzed by the following method.
  • Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) technology
  • NTA Nanoparticle Tracking Analysis
  • direct imaging and observation of specific microvesicles in the suspension in the diameter range of 50nm-1000nm in real time can be accurately obtained in different sizes.
  • HA-EXO is microvesicles derived from astrocytes without ultrasound stimulation
  • US-HA-EXO is after ultrasound stimulation. Microvesicles derived from astrocytes.
  • microvesicles obtained by the above-mentioned microvesicle production method can be used in medicines, and can also be used in scientific research and clinical applications.
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell density reached 80%, the culture medium was replaced with a serum-free medium, and the culture flask or dish was placed on the ultrasonic rack. Use degassed water as a coupling to transfer sound wave energy.
  • the ultrasonic device used in the ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier and an ultrasonic probe, the power amplifier is connected with the signal generator, the ultrasonic probe is connected with the power amplifier, and the ultrasonic probe is a focusing probe.
  • the frequency of the ultrasound probe is 200KHz.
  • the ultrasonic energy is 2.5W/cm2.
  • the ultrasonic treatment time is 5 min. Ultrasound is continuous wave.
  • the sonicated cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 24 hours, and the cell supernatant was collected.
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge at 400 g for 5 minutes, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell density reached 60%, the culture medium was replaced with a serum-free medium, and the culture flask or dish was placed on the ultrasonic rack. Use degassed water as a coupling to transfer sound wave energy.
  • the ultrasonic device used in the ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier and an ultrasonic probe, the power amplifier is connected with the signal generator, the ultrasonic probe is connected with the power amplifier, and the ultrasonic probe is a focusing probe.
  • the frequency of the ultrasound probe is 1MHz.
  • the ultrasonic energy is 4.0W/cm2.
  • the ultrasonic treatment time is 10s.
  • Ultrasound is continuous wave.
  • the sonicated cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours, and the cell supernatant was collected.
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge at 400 g for 5 minutes, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell concentration reached 70%, the culture medium was replaced with a serum-free medium, and the culture flask or dish was placed on the ultrasonic rack. Use degassed water as a coupling to transfer sound wave energy.
  • the ultrasonic device used in ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier and an ultrasonic probe, the power amplifier is connected to the signal generator, the ultrasonic probe is connected to the power amplifier, and the ultrasonic probe is a focusing probe.
  • the frequency of the ultrasound probe is 5MHz.
  • the ultrasonic energy is 0.2W/cm2.
  • the ultrasonic treatment time is 10 min.
  • Ultrasound is a pulse wave.
  • the sonicated cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 48 hours, and the cell supernatant was collected.
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge at 400 g for 5 minutes, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained.
  • the PBS solution was added to the fifth precipitate and centrifuged at 12000 g for 60 minutes to remove the sixth precipitate to obtain microvesicles.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell density reached 80%, the culture medium was replaced with a serum-free medium, and the culture flask or dish was placed on the ultrasonic rack. Use degassed water as a coupling to transfer sound wave energy.
  • the ultrasonic device used in ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier and an ultrasonic probe, the power amplifier is connected to the signal generator, the ultrasonic probe is connected to the power amplifier, and the ultrasonic probe is a focusing probe.
  • the frequency of the ultrasound probe is 200KHz.
  • the ultrasonic energy is 2.5W/cm2.
  • the ultrasonic treatment time is 5 min. Ultrasound is continuous wave.
  • the sonicated cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 24 hours, and the cell supernatant was collected.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell density reached 60%, the culture medium was replaced with a serum-free medium, and the culture flask or dish was placed on the ultrasonic rack. Use degassed water as a coupling to transfer sound wave energy.
  • the ultrasonic device used in ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier and an ultrasonic probe, the power amplifier is connected to the signal generator, the ultrasonic probe is connected to the power amplifier, and the ultrasonic probe is a focusing probe.
  • the frequency of the ultrasound probe is 1MHz.
  • the ultrasonic energy is 4.0W/cm2.
  • the ultrasonic treatment time is 10s. Ultrasound is continuous wave.
  • the sonicated cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 72 hours, and the cell supernatant was collected.
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge for 100 minutes at a rotation speed of 300 g, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell concentration reached 70%, the culture medium was replaced with a serum-free medium, and the culture flask or dish was placed on the ultrasonic rack. Use degassed water as a coupling to transfer sound wave energy.
  • the ultrasonic device used in ultrasonic processing includes a signal generator, a power amplifier and an ultrasonic probe, the power amplifier is connected to the signal generator, the ultrasonic probe is connected to the power amplifier, and the ultrasonic probe is a focusing probe.
  • the frequency of the ultrasound probe is 5MHz.
  • the ultrasonic energy is 0.2W/cm2.
  • the ultrasonic treatment time is 10 min.
  • Ultrasound is a pulse wave.
  • the sonicated cells were cultured in a carbon dioxide incubator for 48 hours, and the cell supernatant was collected.
  • the PBS solution was added to the fifth precipitate and centrifuged at 9000 g for 60 minutes to remove the sixth precipitate to obtain microvesicles.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Glial cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37°C. After the cell density reached 60%-80%, the culture medium was replaced with a serum-free medium and cultured for 5 minutes.
  • the cells were then placed in a carbon dioxide incubator for continuous cultivation for 24 hours, and the cell supernatant was collected.
  • the first liquid After removing the first precipitate from the cell supernatant, centrifuge at 400 g for 5 minutes, and after removing the second precipitate, the first liquid is obtained.
  • NTA nanoparticle tracking analysis

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Abstract

一种微囊泡的生产方法，涉及生物医药技术领域，包括以下步骤：将细胞进行超声处理；将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。上述微囊泡的生产方法，利用超声装置刺激细胞，可以大量促进微囊泡的生成，从而提高了细胞来源的微囊泡的产量，有助于微囊泡的进一步临床推广及生物学应用。且，上述微囊泡的生产方法，采用的超声刺激细胞方法对细胞无损伤，适用于多种细胞，包括星型胶质细胞，干细胞等。此外，还提供采用上述微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其在药物中应用。

Description

一种微囊泡的生产方法、基于该微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用 技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种微囊泡的生产方法、基于上述微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用。
背景技术
细胞治疗具有广泛的应用价值，包括干细胞疗法，免疫细胞疗法等。外泌体(exosomes)，一种小的脂质微囊泡(microvesicles),尺寸在50-150nm，在生理和病理中起着至关重要的作用。作为一种活跃的生物容器，外泌体通过在细胞之间转移蛋白质和遗传信息来介导细胞间的通讯。细胞来源的外泌体/微囊泡不仅可以避免免疫排斥反应，还方便储存，在再生医学中具有极大的应用价值。
目前收集外泌体/微囊泡的方法是通过培养细胞，大量收集细胞上清，分离提取，成本昂贵。外泌体的产量严重限制其在生物医药领域的应用。然而细胞外泌体/微囊泡的产量较低严重限制了其应用及进一步的临床推广。如何无创促进外泌体/微囊泡的产量具有重要的科研和应用价值。
目前已有的技术中有报道利用冲击波疗法促进外泌体的分泌，文献发表在Cardiovascular research。在该方案中，利用冲击波疗法刺激内皮细胞，产生的外泌体携带miR-19a-3p，可以改善心肌缺血的部分功能。
传统的技术的缺点是冲击波的机械作用可能对细胞有损伤，且文献中显示结果仅对内皮细胞有效。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种对细胞无损伤，适用于多种细胞的微囊泡的生产方法、基于上述微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用。
一种微囊泡的生产方法，包括以下步骤：
将细胞进行超声处理；
将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；
将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。
在一个实施例中，将细胞进行超声处理前还包括以下步骤：
将细胞培养在二氧化碳培养箱中，培养的温度为37℃；
当所述细胞的浓度大于等于70％后，将细胞置于无血清培养基上。
在一个实施例中，超声能量区间为0.2W/cm2-4W/cm2，超声处理时间为1s-10min。
在一个实施例中，超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，所述功率放大器和所述信号发生器连接，所述超声探头和所述功率放大器连接，所述超声探头为聚焦探头或非聚焦探头或阵列探头，频率为200KHz-5MHz。
在一个实施例中，将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡的步骤为：
将所述细胞上清进行多次离心处理，得到所述微囊泡；或
将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到所述微囊泡；或
将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡。
在一个实施例中，将所述细胞上清进行多次离心，得到所述微囊泡的操作为：
将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
将所述第二液体在转速为9000g-15000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
将所述第三液体在转速为90000g-120000g的条件下离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到所述微囊泡。
在一个实施例中，将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处 理，得到所述微囊泡的操作为：
将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
将所述第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
将所述第三液体在100KDa超滤管中离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到所述微囊泡。
在一个实施例中，将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡的操作为：
将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
将所述第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
按照所述第三液体和微囊泡提取试剂的体积比为1:5的比例，往第三液体中加入微囊泡提取试剂，反应12-24h小时；
在转速为3000g-12000g的条件下离心60分钟，保留第五沉淀；
往所述第五沉淀中加入PBS溶液，在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第六沉淀后，得到所述微囊泡。
一种微囊泡，所述微囊泡采用上述的微囊泡的生产方法得到。
一种采用上述的微囊泡的生产方法得到的微囊泡在药物中的应用。
上述微囊泡的生产方法，利用超声装置刺激细胞，可以大量促进微囊泡的生成，从而提高了细胞来源的微囊泡的产量，有助于微囊泡的进一步临床推广及生物学应用。且，上述微囊泡的生产方法，采用的超声刺激细胞方法对细胞无损伤，适用于多种细胞，包括星型胶质细胞，干细胞等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为一实施方式的微囊泡的生产方法的流程示意图；
图2为一实施方式的将细胞上清进行多次离心，得到微囊泡的操作流程示意图；
图3为一实施方式的将细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到微囊泡的操作流程示意图；
图4为一实施方式的将细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到微囊泡的操作流程示意图；
图5为外泌体颗粒数目表征图；
图6为实施例1和对比例1的微囊泡总数量；
图7为超声刺激后的细胞增殖情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。
如图1所示，一实施方式的微囊泡的生产方法，包括以下步骤：
S10、将细胞进行超声处理。
在一个实施例中，将细胞进行超声处理前还包括以下步骤：
S1、将细胞培养在二氧化碳培养箱中。
S2、当细胞的浓度大于等于70％后，将细胞置于无血清培养基上。
在一个实施例中，S10中，将细胞置于无血清培养基上进行超声处理。
在一个实施例中，细胞可以培养在培养皿或培养瓶中。
可以理解，细胞可以为悬浮细胞或贴壁细胞。细胞的种类可以为神经细胞，胶质细胞，干细胞，脂肪细胞，肿瘤细胞或免疫细胞等。
进一步的，S1中，细胞在二氧化碳培养箱中培养的温度为37℃。
在一个实施例中，超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接。超声探头可以为聚焦探头或非聚焦探头或阵列探头。
进一步的，超声探头的频率可以为200KHz-5MHz。
在一个实施例中，超声能量区间可以为0.2W/cm2-4W/cm2，超声处理时间可以为10s-10min。
在一个实施例中，超声波可以为连续波或脉冲波。
S20、将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞 上清。
在一个实施例中，培养箱为二氧化碳培养箱。
优选的，培养时间可以为24小时、48小时或72小时。
S30、将细胞上清进行纯化得到微囊泡。
在一个实施例中，微囊泡指的是外泌体。
可以理解，S30中，将细胞上清进行纯化得到微囊泡的步骤可以为：
A、将细胞上清进行多次离心处理，得到微囊泡；或
B、将细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到微囊泡；或
C、将细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到微囊泡。
进一步的，请参考图2，A、将细胞上清进行多次离心，得到微囊泡的操作为：
SA10、将细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
SA20、将第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
SA30、将第二液体在转速为9000g-15000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
SA40、将第三液体在转速为90000g-120000g的条件下离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
进一步的，请参考图3，B、将细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到微囊泡的操作为：
SB10、将细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
SB20、将第一液体在转速为1500-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
SB30、将第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
SB40、将第三液体在100KDa超滤管中离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
进一步的，请参考图4，C、将细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到微囊泡的操作为：
SC10、将细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
SC20、将第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
SC30、将第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
SC40、按照第三液体和微囊泡提取试剂的体积比为1:5的比例，往第三液体中加入微囊泡提取试剂，反应12-24h小时。
在一个实施例中，微囊泡提取试剂为Exoquick-TC。
SC50、在转速为3000g-12000g的条件下离心60分钟，保留第五沉淀。
SC60、往第五沉淀中加入PBS溶液，在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第六沉淀后，得到微囊泡。
超声波是一种机械波，其能够在固体与液体(弹性介质)中传播，并具有 多种生物效应(主要包括热效应、机械效应、空化效应等)。上述微囊泡的生产方法，利用超声装置刺激细胞，可以大量促进微囊泡的生成，从而提高了细胞来源的微囊泡的产量，有助于微囊泡的进一步临床推广及生物学应用。且，上述微囊泡的生产方法，采用的超声刺激细胞方法对细胞无损伤，超声刺激后，显微镜下可见细胞形态无变化，继续培养后，利用cck-8检测细胞增殖情况，可见增殖活力与对照未处理组无变化，如图7所示，其中，ctrl表示没有进行超声处理的对照组，us表示超声处理后的实验组。适用于多种细胞，包括星型胶质细胞，干细胞等。
采用上述微囊泡的生产方法制备得到的微囊泡，采用下述方法进行定量分析。
利用马尔文的NanoSight仪器，根据纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术实时地对悬浮液中50nm-1000nm直径范围内特定的微囊泡进行逐个的直接成像和观察，可以精确获得微囊泡在不同尺寸下的颗粒数量。超声刺激后细胞微囊泡分泌增多，NTA测定数量增多，如图五显示，其中，HA-EXO为不采用超声刺激星形胶质细胞来源的微囊泡，US-HA-EXO为超声刺激后的星形胶质细胞来源的微囊泡。
采用上述的微囊泡的生产方法得到的微囊泡可以应用于药物，也可以在科学研究，临床上进行应用。
下面为具体实施例部分。
实施例1
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞密度达到80％以后，将培养基替换为无血清培养基，将培养瓶或者培养皿放在超声架上。利用已脱气的水作为耦合，传递声波能量。
超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接，超声探头为聚焦探头。超声探头的频率为200KHz。超声能量为2.5W/cm2。超声处理时间为5min。超声波为连续波。
将超声处理后的细胞置于二氧化碳培养箱中培养24小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为400g的条件下离心5分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为2000g的条件下离心30分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
将第二液体在转速为10000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
将第三液体在转速为100000g的条件下离心60分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检测，请参考图六，超声处理组的微囊泡分泌平均总数目约为6.067×1010/mL。
实施例2
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞密度达到60％以后，将培养基替换为无血清培养基，将培养瓶或者培养皿放在超声架上。利用已脱气的水作为耦合，传递声波能量。
超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接，超声探头为聚焦探头。超声探头的频率为1MHz。超声能量为4.0W/cm2。超声处理时间为10s。超声波为连续波。
将超声处理后的细胞置于二氧化碳培养箱中培养72小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为400g的条件下离心5分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为2000g的条件下离心30分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
将第二液体在转速为10000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
将第三液体在100KDa超滤管中离心60分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检测，超声处理组的微囊泡分泌平均总数目约为5.8×1010/mL。
实施例3
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞浓度达到70％以后，将培养基替换为无血清培养基，将培养瓶或者培养皿放在超声架上。利用已脱气的水作为耦合，传递声波能量。
超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接，超声探头为聚焦探头。超声探头的频率为5MHz。超声能量为0.2W/cm2。超声处理时间为10min。超声波为脉冲波。
将超声处理后的细胞置于二氧化碳培养箱中培养48小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为400g的条件下离心5分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为2000g的条件下离心30分钟，去除第三沉淀后，得 到第二液体。
将第二液体在转速为10000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
按照第三液体和Exoquick-TC的体积比为1:5的比例，往第三液体中加入Exoquick-TC，反应12小时。
在转速为12000g的条件下离心60分钟，保留第五沉淀。
往第五沉淀中加入PBS溶液，在转速为12000g的条件下离心60分钟，去除第六沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检测，超声处理组的微囊泡分泌平均总数目约为6.2×1010/mL。
实施例4
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞密度达到80％以后，将培养基替换为无血清培养基，将培养瓶或者培养皿放在超声架上。利用已脱气的水作为耦合，传递声波能量。
超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接，超声探头为聚焦探头。超声探头的频率为200KHz。超声能量为2.5W/cm2。超声处理时间为5min。超声波为连续波。
将超声处理后的细胞置于二氧化碳培养箱中培养24小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为500g的条件下离心3分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为4000g的条件下离心25分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
将第二液体在转速为9000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
将第三液体在转速为90000g的条件下离心50分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检测，请参考图六，超声处理组的微囊泡分泌平均总数目约为6.1×1010/mL。
实施例5
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞密度达到60％以后，将培养基替换为无血清培养基，将培养瓶或者培养皿放在超声架上。利用已脱气的水作为耦合，传递声波能量。
超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接，超声探头为聚焦探头。超声探头的频率为1MHz。超声能量为4.0W/cm2。超声处理时间为10s。超声波为连续波。
将超声处理后的细胞置于二氧化碳培养箱中培养72小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g的条件下离心100分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为1500g的条件下离心60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
将第二液体在转速为12000g的条件下离心45分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
将第三液体在100KDa超滤管中离心120分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检测，超声处理组的微囊泡分泌平均总数目约为5.7×1010/mL。
实施例6
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞浓度达到70％以后，将培养基替换为无血清培养基，将培养瓶或者培养皿放在超声架上。利用已脱气的水作为耦合，传递声波能量。
超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，功率放大器和信号发生器连接，超声探头和功率放大器连接，超声探头为聚焦探头。超声探头的频率为5MHz。超声能量为0.2W/cm2。超声处理时间为10min。超声波为脉冲波。
将超声处理后的细胞置于二氧化碳培养箱中培养48小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为500g的条件下离心10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为1500g的条件下离心60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
将第二液体在转速为9000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
按照第三液体和Exoquick-TC的体积比为1:5的比例，往第三液体中加入Exoquick-TC，反应24小时。
在转速为3000g的条件下离心60分钟，保留第五沉淀。
往第五沉淀中加入PBS溶液，在转速为9000g的条件下离心60分钟，去除第六沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检 测，超声处理组的微囊泡分泌平均总数目约为5.5×1010/mL。
对比例1
胶质细胞培养在37℃二氧化碳培养箱中，细胞密度达到60％-80％以后，将培养基替换为无血清培养基继续培养5min。
接着将细胞置于二氧化碳培养箱中继续培养24小时，收集细胞上清。
将细胞上清去除第一沉淀后在转速为400g的条件下离心5分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体。
将第一液体在转速为2000g的条件下离心30分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体。
将第二液体在转速为10000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体。
将第三液体在转速为100000g的条件下离心60分钟，去除第五沉淀后，得到微囊泡。
根据上述纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术对上述得到的微囊泡进行数量检测，请参考图六，对比例1的微囊泡颗粒平均总数目约为1.467×1010/mL。
可见，实施例1至实施例6由于采用超声刺激了细胞，细胞可以促进微囊泡分泌，微囊泡的颗粒数目均远大于对比例1的微囊泡的颗粒数目。实施例1生产的微囊泡的颗粒数目总数量为对比例1产生的微囊泡的颗粒数目总数量的4.13倍。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

  1. 一种微囊泡的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
    将细胞进行超声处理；
    将超声处理后的细胞置于培养箱中培养24小时～72小时，收集细胞上清；
    将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡。
  2. 如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将细胞进行超声处理前还包括以下步骤：
    将细胞培养在二氧化碳培养箱中，培养的温度为37℃；
    当所述细胞的浓度大于等于70％后，将细胞置于无血清培养基上。
  3. 如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，超声能量区间为0.2W/cm2-4W/cm2，超声处理时间为1s-10min。
  4. 如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，超声处理采用的超声装置包括信号发生器、功率放大器和超声探头，所述功率放大器和所述信号发生器连接，所述超声探头和所述功率放大器连接，所述超声探头为聚焦探头或非聚焦探头或阵列探头，频率为200KHz-5MHz。
  5. 如权利要求1所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将所述细胞上清进行纯化得到所述微囊泡的步骤为：
    将所述细胞上清进行多次离心处理，得到所述微囊泡；或
    将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到所述微囊泡；或
    将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡。
  6. 如权利要求5所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将所述细胞上清进行多次离心，得到所述微囊泡的操作为：
    将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
    将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
    将所述第二液体在转速为9000g-15000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
    将所述第三液体在转速为90000g-120000g的条件下离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到所述微囊泡。
  7. 如权利要求5所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着进行超滤处理，得到所述微囊泡的操作为：
    将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
    将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
    将所述第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心45-90分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
    将所述第三液体在100KDa超滤管中离心50-120分钟，去除第五沉淀后，得到所述微囊泡。
  8. 如权利要求5所述的微囊泡的生产方法，其特征在于，将所述细胞上清进行多次离心处理后，接着加入微囊泡提取试剂进行沉淀反应，再次离心后，得到所述微囊泡的操作为：
    将所述细胞上清去除第一沉淀后在转速为300g-500g的条件下离心3-10分钟，去除第二沉淀后，得到第一液体；
    将所述第一液体在转速为1500g-4000g的条件下离心25-60分钟，去除第三沉淀后，得到第二液体；
    将所述第二液体在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第四沉淀后，得到第三液体；
    按照所述第三液体和微囊泡提取试剂的体积比为1:5的比例，往第三液体中加入微囊泡提取试剂，反应12-24h小时；
    在转速为3000g-12000g的条件下离心60分钟，保留第五沉淀；
    往所述第五沉淀中加入PBS溶液，在转速为9000g-12000g的条件下离心60分钟，去除第六沉淀后，得到所述微囊泡。
  9. 一种微囊泡，其特征在于，所述微囊泡采用如权利要求1-8任一项所述的微囊泡的生产方法得到。
  10. 一种采用如权利要求1-8任一项所述的微囊泡的生产方法得到的微囊泡在药物中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012054975A1 (en) * 2010-10-28 2012-05-03 Clinical Genomics Pty. Ltd. Method of microvesicle enrichment
CN109554341A (zh) * 2018-12-18 2019-04-02 深圳先进技术研究院 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用
CN110411816A (zh) * 2018-04-28 2019-11-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种外泌体的富集方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012054975A1 (en) * 2010-10-28 2012-05-03 Clinical Genomics Pty. Ltd. Method of microvesicle enrichment
CN110411816A (zh) * 2018-04-28 2019-11-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种外泌体的富集方法
CN109554341A (zh) * 2018-12-18 2019-04-02 深圳先进技术研究院 无创超声处理细胞在制备外泌体中的应用、外泌体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGMAN YE, TAO YU: "Extraction and Identification of Tumor Exosomes", JOURNAL OF MODERN ONCOLOGY, vol. 26, no. 20, 1 October 2018 (2018-10-01), pages 3341 - 3344, XP055820982, ISSN: 1672-4992, DOI: 10.3969/j.issn.1672-4992.2018.20.042 *
LEE KYUNGHEON, SHAO HUILIN, WEISSLEDER RALPH, LEE HAKHO: "Acoustic Purification of Extracellular Microvesicles", ACS NANO, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 9, no. 3, 24 March 2015 (2015-03-24), US, pages 2321 - 2327, XP055820979, ISSN: 1936-0851, DOI: 10.1021/nn506538f *
ZENG QINGYU; HONG SHIBIN; WANG XUE; CHENG YIRUI; SUN JUNFENG; XIA WEILIANG: "Regulation of exosomes secretion by low-intensity pulsed ultrasound in lung cancer cells", EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 383, no. 1, 29 May 2019 (2019-05-29), AMSTERDAM, NL, XP085801663, ISSN: 0014-4827, DOI: 10.1016/j.yexcr.2019.05.029 *

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