CN113029728B - 一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法，属于组织切片制备与外泌体提取技术领域，本发明通过包埋组织样本，采用冰冻切片机将组织样本切片，收集样本切片后、酶解、超离、排阻和超滤等步骤，使提取的外泌体产量明显高于现有技术的其他组织外泌体提取方法，相同用量的组织样品，外泌体的得率提高约2~10倍，极大的减少了组织的用量，可以解决各种稀缺组织样本较难获取足够外泌体的问题，0.1~0.2g组织即可满足后续NTA、WB、电镜和转录组等检测分析，实用性好，应用前景广阔。

Description

一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法
技术领域
本发明涉及组织切片制备与外泌体提取技术领域，具体涉及一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法。
背景技术
外泌体是由不同细胞释放的30~150nm大小的脂质双层膜包被的颗粒。它们可以包裹和传递RNA、DNA、蛋白质等分子，作为细胞间通信的信使参与多种生理和病理途径。目前从血液、尿液和唾液等体液中分离外泌体的方法已经非常成熟，但是有效的从各种组织细胞间隙中分离到外泌体的相关研究和方法还比较有限。组织外泌体富集过程中的关键环节机械剪切获得细胞悬液的过程，会一定程度造成细胞结构的破坏，破裂的细胞释放大量的脂质体、蛋白复合体等内含物，以及DNA，RNA，细胞器或细胞碎片等，与体液相比极大的增加了外泌体分离纯化难度。
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一种方法，被广泛应用于临床快速病理诊断以及对于疾病的科学研究上。冰冻切片一般使用水、OCT和普通胶水等作为包埋剂，极大缩短了制片时间；同时冰冻切片机械力切割更稳定，不同操作者实验可重复性高，对不同样本处理程度一致性较高，易控制；且切片可一直保持冷冻状态，在冰冻条件下快速切片，切片平整，厚度均一，能比较完好的保存细胞，避免组织细胞损伤、外泌体的降解等，更利于细胞间隙的EVs释放。冰冻切片的优点可以在很大程度上弥补提取组织外泌体时械剪切方法造成的组织样本厚度不均、大小不一、组织样本融化、细胞结构破损等缺点，减少组织细胞的破碎，且使得酶解时间更短，反应更彻底。现有的提取组织外泌体的方法一般都是通过剪切、酶解、离心、超离、超滤等步骤，例如中国专利CN107523536A公开了一种组织来源外泌体的提取方法及应用，核心基于机械剪切、酶裂解组织后使用PEG过夜沉降、离心等步骤提取组织外泌体，耗时较长，而且提取的外泌体中可能存在大量蛋白杂质；中国专利CN111621471A公开了一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用，通过剪切、离心、超滤等步骤提取软组织外泌体，同样是过程繁琐且耗时较长；中国专利2020115224931.3公开了一种快速提取组织胞外囊泡的分离富集方法，通过酶解、差速离心、超离、分子排阻、超滤的方法实现了组织外泌体的快速提取。现有的专利和文献多对组织外泌体提取的酶解、离心、超滤等方法进行优化以提高组织外泌体提取的纯度和产量，但少有方法对组织外泌体提取的剪切方法进行优化，使得组织外泌体既实现快速提取又实现提取产量的增加。
因此，现有组织外泌体提取技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法，旨在简化操作流程的同时，减少组织样本用量，以进一步提高提取组织外泌体的产量。
为了实现本发明目的，本发明提供一种提高组织外泌体产量的方法，其为使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片，收集组织样品切片提取外泌体。
所述使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片包括以下步骤：
（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷；包埋剂1~8℃预冷；
（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；
（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，直到包埋样品切完。
本发明方法中所述的包埋剂为磷酸盐缓冲溶液（PBS）。
本发明方法的步骤（1）中，冰冻切片机开机预冷2~4 h，设置切片机和样品头温度为-15~-30℃，组织样本、包埋盒和样品托盘在干冰中预冷20~40min，包埋剂在1~8℃预冷不低于2 h。
本发明方法的步骤（2）中，所述包埋好的组织转移到样品托盘中之前，在样品托盘上浅涂一层PBS,厚度为1~4 mm。
本发明方法的步骤（2）中，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷10~30min。
步骤（3）中，将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。组织样品切片的厚度为100~300 µm。
另一方面，本发明提供了一种获取组织外泌体的方法，包括以下步骤：
（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷，包埋剂1~8℃预冷；
（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；
（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，直到包埋样品切完；
（4）收集组织样品切片，进行酶解、差速离心、超离、排阻和超滤，完成组织外泌体的富集纯化。
本发明的实施例中，将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。对目标组织切片依次进行酶解、差速离心、超离、SEC排阻和超滤，进行组织外泌体的富集纯化。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，步骤（1）中实验前预处理的具体方法为：冰冻切片机提前2~4h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-15~-30℃，组织样本、包埋盒和样品托盘提前20~40min干冰中预冷，包埋剂可一直4~8℃预冷或提前3h 4~8℃预冷。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，步骤（1）中所述包埋剂为磷酸缓冲盐溶液（PBS）。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，步骤（2）中组织样本包埋的具体方法为：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液进行包埋，使PBS完全没过组织即可，等1×PBS缓冲液包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为1~4mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，上述操作均在干冰中操作，以保证组织的快速包埋，之后将固定好组织的样品托盘转移到冰冻切片机中预冷10~30min，等待切片。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，步骤（3）中组织样本切片的厚度为100~300um。
步骤（4）中，所述差速离心为：1~8℃条件下： 300~600g 10min；2000~3000g10min；10000~12000g 10min；
所述超离为：1~8℃条件下， 100000~150000g 2 h；
所述超滤为： 1~8℃条件下， 3000~5000g 1~5min。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，步骤（4）中组织样本切片外泌体提取的反应体系和实验条件为： 组织消化酶2.5mL、酶解温度37℃，差速离心（4℃ 300~600g 10min，2000~3000g 10min，10000~12000g10min）、超离（4℃ 100000~150000g 2 h）、SEC排阻、超滤（4℃ 3000~5000g 1~5min）。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，步骤（4）中组织样本切片的酶解时间为10~20min。
作为本发明所述的一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法的一种优选方案，所述的组织样本可为人和各种动物的胃、肝、脑、肾、乳腺、肺、脾脏、淋巴、腹膜、心脏组织等正常组织及其癌变组织，但不只限于这些组织。
本发明的有益效果：
（1）本发明使用冰冻切片机提取组织外泌体的方法中，采用1×PBS缓冲液作为包埋剂，相比于普通胶水和OCT作为包埋剂，1×PBS缓冲液可直接用于后续组织外泌体的提取，不需要额外的纯化工作，且1×PBS缓冲液相较于通胶水和OCT价格优廉，因此优于其他包埋剂。
（2）本发明使用冰冻切片机提取组织外泌体的方法中，采用冰冻切片机对组织进行切片，相比其他对组织进行机械剪切的方法，组织可一直保持冷冻状态，切片平整，厚度均一，能比较完好的保存细胞，避免组织细胞破损，同时冰冻切片可以很大限度的提高组织表面积，利于细胞间隙的外泌体的释放，使得提取的外泌体产量明显高于其他组织外泌体提取方法，产量可提高约2~10倍。
（3）本发明使用冰冻切片机提取组织外泌体的方法极大的减少了提取外泌体时组织的用量，只需要0.1~0.2 g的组织即可富集满足后续NTA、WB、电镜和转录组等分析的外泌体量，可以解决各种稀缺组织样本较难获取足够外泌体的问题。
附图说明
图1为本发明通过冰冻切片或者手术刀切片方法富集各种组织来源的外泌体粒度分析图。a为小鼠脑组织冰冻切片外泌体的NTA结果，粒径主峰88.0nm；b为小鼠脑组织手术刀外泌体的NTA结果，粒径主峰86.6nm；c为小鼠脾脏组织冰冻切片外泌体的NTA结果，粒径主峰77.9nm；d为小鼠脾脏组织手术刀外泌体的NTA结果，粒径主峰78.7nm；e为小鼠胃组织冰冻切片外泌体的NTA结果，粒径主峰76.7nm；f为小鼠胃组织手术刀外泌体的NTA结果，粒径主峰78.7nm（通常外泌体粒径介于30~150nm之间），与外泌体粒径范围吻合。
图2为本发明通过冰冻切片或者手术刀切片方法富集各种组织来源的外泌体透射电镜图。a为小鼠脑组织冰冻切片外泌体TEM电镜结果；b为小鼠脑组织手术刀外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合；c为小鼠脾脏组织冰冻切片外泌体TEM电镜结果；d为小鼠脾脏组织手术刀外泌体TEM电镜结果；e为小鼠胃组织冰冻切片外泌体TEM电镜结果；f为小鼠胃组织手术刀外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合；g为人胃癌外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合；h为人乳腺癌组织外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图3为本发明通过冰冻切片或者手术刀切片方法富集各种组织来源的外泌体WB结果图。a为小鼠脑组织冰冻切片和小鼠脑组织手术刀外泌体的Western Blot（WB）检测结果；b为小鼠脾脏组织冰冻切片和手术刀外泌体的Western Blot（WB）检测结果。c为小鼠胃组织冰冻切片和手术刀外泌体的Western Blot（WB）检测结果。
图4为本发明通过冰冻切片或者手术刀切片方法富集各种组织来源的外泌体得率的比较图。
图5为本发明通过冰冻切片或者手术刀切片方法富集人胃癌和乳腺癌的外泌体得率的箱型比较图。a为冰冻切片和手术刀方法提取人胃癌组织外泌体的得率的箱型图；b为冰冻切片和手术刀方法提取人乳腺癌组织外泌体的得率的箱型图。a和b图中，左侧图示均为本发明的冰冻切片机方法获得的外泌体得率，右侧图示均为手术刀方法获得的外泌体得率。
图6为本发明通过PBS和OCT包埋样本后使用冰冻切片机富集小鼠肝脏外泌体得率的比较图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别说明，本发明实施例作用试剂耗材均为常规市售可得。
以下实施例中使用的组织消化酶购自美天旎生物技术有限公司，蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自赛默飞生物科技有限公司，1×PBS缓冲液(pH7.2- 7.4)购自北京索莱宝科技有限公司，货号：P1020，包埋盒购自南通美韦德实验器材有限公司。
实施例1一种使用冰冻切片机提高小鼠脑组织外泌体产量的方法
一种使用冰冻切片机提取小鼠脑组织外泌体的方法，具体步骤如下：
（1）实验前预处理：冰冻切片机提前3h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-25℃，组织样本0.2g、包埋盒（南通美韦德实验器材有限公司，货号为EM05-0707）和样品托盘提前30min干冰中预冷，包埋剂为1×PBS缓冲液提前3h 4℃预冷。
（2）组织样本包埋：以下操作在干冰中进行：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液溶液进行包埋，使1×PBS缓冲液完全没过组织即可，等PBS包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为2mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到前述冰冻切片机中预冷10min，等待切片。
（3）组织样本切片：设置样品头温度为-20℃，将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。设置组织样本切片的厚度为300 µm，前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。
（4）组织样本切片收集：将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。
（5）组织样本切片外泌体提取：
1)向离心管中加入2.5mL组织消化酶解离液（美天旎生物技术有限公司，货号130095929）；将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟摇动混合一次，解离时间为10min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中得到组织细胞悬液，并向组织细胞悬液中添加25uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞生物科技有限公司，货号78443）；
2)将上述混合物于分别于4℃ 300~600g、2000~3000g、10000~12000g离心10min，收集上清液；
3)将步骤2）的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的1×PBS缓冲液到14ml，4℃ 100000~150000g超离2 h，之后将超离管中的沉淀用1ml 1×PBS缓冲液溶解，加入到排阻柱中，待液体流尽，再加入2.5mL 1×PBS缓冲液，同时开始收集流出液；
4)将流出液转移到超滤管中，4℃ 3000~5000g离心1~5min，截留液即为高纯度小鼠脑组织外泌体。
对比实施例1中使用冰冻切片提取小鼠脑组织外泌体的方法，以下是使用手术刀提取小鼠脑组织外泌体的方法。
手术刀富集小鼠脑组织外泌体的方法，包括以下步骤：
（1）用刀片将低温冷冻（-80℃）的组织切成1~2mm3大小；
（2）将组织碎片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中；
（3）将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为30min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，并向组织细胞悬液中添加25 µL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物；
（4）将上述混合物于分别于4℃ 300~600g、2000~3000g、10000~12000g离心10min，收集上清液；
（5）将步骤4）的上清液使用0.22 μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的1×PBS缓冲液到14 ml，4℃ 100000~150000g超离2 h，之后将超离管中的沉淀用1ml 1×PBS缓冲液溶解，加入到排阻柱中，待液体流尽，再加入2.5mL 1×PBS缓冲液，同时开始收集流出液；
（6）将流出液转移到超滤管中，4℃ 3000~5000g离心1~5min，截留液即为高纯度小鼠脑组织外泌体。
表1中汇总了不同方法提取小鼠脑组织外泌体的组织重量，外泌体BCA蛋白总量和外泌体得率。
图1a为小鼠脑组织冰冻切片外泌体的NTA结果，粒径主峰88.0nm，图1b为小鼠脑组织手术刀外泌体的NTA结果，粒径主峰86.6nm，（通常外泌体粒径介于30~150nm之间），与外泌体粒径范围吻合。
图2a为小鼠脑组织冰冻切片外泌体TEM电镜结果，图2b为小鼠脑组织手术刀外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图3a为小鼠脑组织冰冻切片和小鼠脑组织手术刀外泌体的Western Blot（WB）检测结果，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的外泌体样本进行着色，分析着色的位置和深度获得外泌体的阳性蛋白标志物CD9、TSG101、Alix，外泌体阴性蛋白标志物Calnexin特定蛋白质的表达情况信息，图中清晰可见阳性蛋白标志物CD9、Alix、TSG101的表达，阴性蛋白标志物Calnexin无表达。符合国际囊泡协会对于外泌体检验的标准要求。
图4为通过对比冰冻切片和手术刀方法提取小鼠脑组织外泌体的得率，结果显示使用冰冻切片方法提取的小鼠脑组织的外泌体得率较使用手术刀方法提高了3.54倍。
Figure 755269DEST_PATH_IMAGE001
实施例2一种使用冰冻切片机提高小鼠脾脏组织外泌体产量的方法
本实施例提供的一种使用冰冻切片机提取小鼠脾脏组织外泌体的方法，具体步骤如下：
（1）实验前预处理：冰冻切片机提前3h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-20℃，组织样本、包埋盒和样品托盘提前30min干冰中预冷，包埋剂提前3h 4℃预冷。
（2）组织样本包埋：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液进行包埋，使1×PBS缓冲液完全没过组织即可，等1×PBS缓冲液包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为3mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到冰冻切片机中预冷20min，等待切片。
（3）组织样本切片：设置样品头温度为-25℃，将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。设置组织样本切片的厚度为300 µm，前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。
（4）组织样本切片收集：将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。
（5）组织样本切片外泌体提取：
1）向离心管中加入2.5mL组织消化酶解离液；
将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟混合一次，解离时间为15min，得到组织解离液，之后用70 μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中，并向组织细胞悬液中添加25uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞生物科技有限公司，货号78443）；
2）将上述混合物于分别于4℃ 300~600g、2000~3000g、10000~12000g离心10min，收集上清液；
3）将步骤2）的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的1×PBS缓冲液到14ml，4℃ 100000~150000g超离2 h，之后将超离管中的沉淀用1ml 1×PBS缓冲液溶解，加入到排阻柱中，待液体流尽，再加入2.5mL 1×PBS缓冲液，同时开始收集流出液；
4）将流出液转移到超滤管中，4℃ 3000~5000g离心1~5min，截留液即为高纯度小鼠脾脏组织外泌体。
对比实施例2中使用冰冻切片提取小鼠脾脏组织外泌体的方法，以下是使用手术刀提取小鼠脾脏组织外泌体的方法。
手术刀富集小鼠脾脏组织外泌体的方法，包括以下步骤：
（1）用刀片将低温冷冻（-80℃）的组织切成1~2mm3大小；
（2）将组织碎片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中；后续提取外泌体具体步骤同实施例2的步骤（5）。
表1中汇总了不同方法提取小鼠脾脏组织外泌体的组织重量，外泌体BCA蛋白总量和外泌体得率。
图1c为小鼠脾脏组织冰冻切片外泌体的NTA结果，粒径主峰77.9nm，图1d为小鼠脾脏组织手术刀外泌体的NTA结果，粒径主峰78.7nm，（通常外泌体粒径介于30~150nm之间），与外泌体粒径范围吻合。
图2c为小鼠脾脏组织冰冻切片外泌体TEM电镜结果，图2d为小鼠脾脏组织手术刀外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图3b为小鼠脾脏组织冰冻切片和手术刀外泌体的Western Blot（WB）检测结果，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的外泌体样本进行着色，分析着色的位置和深度获得外泌体的阳性蛋白标志物CD9、TSG101、Alix，外泌体阴性蛋白标志物Calnexin特定蛋白质的表达情况信息，图中清晰可见阳性蛋白标志物CD9、Alix、TSG101的表达，阴性蛋白标志物Calnexin无表达。符合国际囊泡协会对于外泌体检验的标准要求。
图4为通过对比冰冻切片和手术刀方法提取小鼠脾脏组织外泌体的得率，结果显示使用冰冻切片方法提取的小鼠脾脏组织的外泌体得率较使用手术刀方法提高了7.49倍。
实施例3一种使用冰冻切片机提高小鼠胃组织外泌体产量的方法
本实施例提供的一种使用冰冻切片机提取小鼠胃组织外泌体的方法，具体步骤如下：
（1）实验前预处理：冰冻切片机提前3h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-20℃，组织样本、包埋盒和样品托盘提前30min干冰中预冷，包埋剂提前3 h 4℃预冷。
（2）组织样本包埋：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液进行包埋，使1×PBS缓冲液完全没过组织即可，等1×PBS缓冲液包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为2mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到冰冻切片机中预冷10min，等待切片。
（3）组织样本切片：设置样品头温度为-30℃，将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。设置组织样本切片的厚度为300 µm，前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。
（4）组织样本切片收集：将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。
（5）组织样本切片外泌体提取：向离心管中加入2.5mL组织消化酶解离液；具体操作参见实施例1和实施例2的对应步骤，提取得到高纯度小鼠胃组织外泌体。
对比实施例3中使用冰冻切片提取小鼠胃组织外泌体的方法，以下是使用手术刀提取小鼠胃组织外泌体的方法。
手术刀富集小鼠胃组织外泌体的方法，包括以下步骤：
（1）用刀片将低温冷冻（-80℃）的组织切成1~2mm3大小；
（2）将组织碎片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中；后续提取外泌体具体步骤同实施例3的步骤（5）。
表1中汇总了不同方法提取小鼠胃组织外泌体的组织重量，外泌体BCA蛋白总量和外泌体得率。
图1e为小鼠胃组织冰冻切片外泌体的NTA结果，粒径主峰76.7nm，图1f为小鼠胃组织手术刀外泌体的NTA结果，粒径主峰78.7nm，（通常外泌体粒径介于30~150nm之间），与外泌体粒径范围吻合。
图2e为小鼠胃组织冰冻切片外泌体TEM电镜结果，图2f为小鼠胃组织手术刀外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图3c为小鼠胃组织冰冻切片和手术刀外泌体的Western Blot（WB）检测结果，通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的外泌体样本进行着色，分析着色的位置和深度获得外泌体的阳性蛋白标志物CD9、TSG101、Alix，外泌体阴性蛋白标志物Calnexin特定蛋白质的表达情况信息，图中清晰可见阳性蛋白标志物CD9、Alix、TSG101的表达，阴性蛋白标志物Calnexin无表达。符合国际囊泡协会对于外泌体检验的标准要求。
图4为通过对比冰冻切片和手术刀方法提取小鼠胃组织外泌体的得率，结果显示使用冰冻切片方法提取的小鼠胃组织的外泌体得率较使用手术刀方法提高了3.10倍。
实施例4一种使用冰冻切片机提高人胃癌组织外泌体产量的方法
本实施例提供一种使用冰冻切片机提取人胃癌组织外泌体的方法，具体步骤如下：
（1）实验前预处理：冰冻切片机提前3h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-20℃，组织样本、包埋盒和样品托盘提前30min干冰中预冷，包埋剂提前3h 4℃预冷。
（2）组织样本包埋：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液进行包埋，使1×PBS缓冲液完全没过组织即可，等1×PBS缓冲液包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为2mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到冰冻切片机中预冷10min，等待切片。
（3）组织样本切片：设置样品头温度为-30℃，将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。设置组织样本切片的厚度为300 µm，前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。
（4）组织样本切片收集：将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。
（5）组织样本切片外泌体提取：具体操作参见实施例1和实施例2的对应步骤，提取得到高纯度人胃癌组织外泌体。
对比实施例4中使用冰冻切片提取人胃癌组织外泌体的方法，以下是使用手术刀提取人胃癌组织外泌体的方法。
手术刀富集人胃癌组织外泌体的方法，包括以下步骤：
用刀片将低温冷冻（-80℃）的组织切成1~2mm3大小；将组织碎片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中；后续提取外泌体具体步骤同实施例4的步骤（5）。
表1中汇总了不同方法提取人胃癌组织外泌体的组织重量，外泌体BCA蛋白总量和外泌体得率；其中冰冻切片方法提取样本有4个，手术刀方法提取的样本有4个。
图2g为人胃癌外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图5a为冰冻切片和手术刀方法提取人胃癌组织外泌体的得率的箱型图，经比较发现使用冰冻切片方法提取的人胃癌组织的外泌体得率较使用手术刀方法提高了2~8倍。
实施例5一种使用冰冻切片机提高人乳腺癌组织外泌体产量的方法
本实施例提供了一种使用冰冻切片机提取人乳腺癌组织外泌体的方法，具体步骤如下：
（1）实验前预处理：冰冻切片机提前3h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-20℃，组织样本、包埋盒和样品托盘提前30min干冰中预冷，包埋剂提前3h 4℃预冷。
（2）组织样本包埋：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液进行包埋，使1×PBS缓冲液完全没过组织即可，等1×PBS缓冲液包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为2mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到冰冻切片机中预冷10min，等待切片。
（3）组织样本切片：设置样品头温度为-20℃，将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。设置组织样本切片的厚度为100 µm，前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。
（4）组织样本切片收集：将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。
（5）组织样本切片外泌体提取：具体操作参见实施例1和实施例2的对应步骤。提取得到高纯度人乳腺癌组织外泌体。
对比实施例3中使用冰冻切片提取人乳腺癌组织外泌体的方法，以下是使用手术刀提取人乳腺癌组织外泌体的方法。
手术刀富集人乳腺癌组织外泌体的方法，包括以下步骤：
用刀片将低温冷冻（-80℃）的组织切成1~2mm3大小；将组织碎片转移到含有2.5mL组织消化酶解离液的离心管中；后续提取外泌体具体步骤同实施例5的步骤（5），获得高纯度人乳腺癌组织外泌体。
表1中汇总了不同方法提取人乳腺癌组织外泌体的组织重量，外泌体BCA蛋白总量和外泌体得率；其中冰冻切片方法提取样本有4个，手术刀方法提取的样本有3个。
图2h为人乳腺癌组织外泌体TEM电镜结果，外泌体茶托装结构清晰可见，粒径与NTA结果吻合。
图5b为冰冻切片和手术刀方法提取人乳腺癌组织外泌体的得率的箱型图，经比较发现使用冰冻切片方法提取的人乳腺癌组织的外泌体得率较使用手术刀方法提高了3~10倍。
实施例6 包埋剂1×PBS缓冲液和OCT对于外泌体得率的比较
本实施例提供了基于本发明的方法使用不同包埋剂提取小鼠肝组织外泌体的方法，具体步骤如下：
（1）实验前预处理：冰冻切片机提前3h开机预冷，设置切片机和样品头温度为-25℃，组织样本0.2g、包埋盒（南通美韦德实验器材有限公司，货号为EM05-0707）和样品托盘提前30min干冰中预冷，包埋剂分别选1×PBS缓冲液和OCT（美国樱花SAKURA，货号为4583）提前3h 4℃预冷。
（2）组织样本包埋
（a）1×PBS缓冲液：以下操作在干冰中进行：将组织样本放入包埋盒中使用预冷的1×PBS缓冲液溶液进行包埋，使1×PBS缓冲液完全没过组织即可，等PBS包埋好组织后，在样品托盘上浅涂一层1×PBS缓冲液，厚度约为2mm，等托盘上1×PBS缓冲液变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中，继续添加预冷的1×PBS缓冲液进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到前述冰冻切片机中预冷10min，等待切片。
（b）组织样本包埋（OCT）：以下操作在干冰中进行：将组织样本放入包埋盒中使用4℃预冷的OCT（美国樱花SAKURA，货号为4583）进行包埋，使OCT（美国樱花SAKURA，货号为4583）完全没过组织即可，等组织包埋好之后，在样品托盘上浅涂一层OCT（美国樱花SAKURA，货号为4583），厚度约为4 mm，等托盘上OCT（美国樱花SAKURA，货号为4583）变白时迅速将包埋盒包埋好的组织转移到样品托盘中进行组织固定，之后将固定好组织的样品托盘转移到前述冰冻切片机中预冷10min，等待切片。
（3）组织样本切片：设置样品头温度为-20℃，将预冷的带有上述两种包埋剂分别包埋的组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定。设置组织样本切片的厚度为300 µm，前后调节伸缩样品头的位置，使得包埋样品正好可以被钢刀切到的位置，后转动手轮进行切片，一直到包埋样品切完。
（4）组织样本切片收集：将所有样本切片收集到50ml的离心管中，离心管放入干冰中暂存。
（5）组织样本切片外泌体提取：向离心管中加入2.5mL组织消化酶解离液（美天旎生物技术有限公司，货号130095929）；将上述混合物放入37℃水浴，每隔5分钟摇动混合一次，解离时间为10min，得到组织解离液，之后用70μm滤膜过滤上述组织解离液到新的离心管中得到组织细胞悬液，并向组织细胞悬液中添加25uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（赛默飞生物科技有限公司，货号78443）；将上述混合物于分别于4℃ 300~600g、2000~3000g、10000~12000g离心10min，收集上清液；
（6）将步骤（5）的上清液使用0.22μm滤膜过滤到超离管中，并补充预冷的1×PBS缓冲液到14ml，4℃ 100000~150000g超离2 h，之后将超离管中的沉淀用1ml 1×PBS缓冲液溶解，加入到排阻柱中，待液体流尽，再加入2.5mL 1×PBS缓冲液，同时开始收集流出液；
（7）将流出液转移到超滤管中，4℃ 3000~5000g离心1~5min，截留液即为高纯度小鼠脑组织外泌体。
图6显示了对比使用1×PBS缓冲液和OCT包埋剂提取小鼠肝组织外泌体得率的结果，结果显示使用1×PBS缓冲液作为包埋剂提取小鼠肝组织的外泌体得率为2770.87ug/g，使用OCT作为包埋剂提取小鼠肝组织的外泌体得率为560.83ug/g，1×PBS缓冲液作为包埋剂比OCT作为包埋剂提取小鼠肝组织的外泌体得率提高了4. 94倍。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种提高组织外泌体产量的方法，其特征在于，使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片，收集组织样品切片提取外泌体；
所述使用冰冻切片机对包埋好的组织样品切片包括以下步骤：
（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷；包埋剂1~8℃预冷；所述包埋剂为磷酸盐缓冲溶液PBS；
（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，在样品托盘上浅涂一层PBS，厚度为1~4 mm，将包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；
（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，组织样品切片的厚度为100~300 µm；直到包埋样品切完。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，冰冻切片机开机预冷2~4 h，设置切片机和样品头温度为-15~-30℃，组织样本、包埋盒和样品托盘在干冰中预冷20~40min，包埋剂在1~8℃预冷不低于2 h。
3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷10~30 min。
4.一种获取组织外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理：冰冻切片机开机预冷；组织样本、包埋盒和样品托盘放入干冰中预冷；包埋剂1~8℃预冷；所述包埋剂为磷酸盐缓冲溶液PBS；
（2）组织样本包埋：在干冰环境下将组织样本放入包埋盒中使用包埋剂进行包埋，包埋好的组织转移到样品托盘中，添加包埋剂进行组织固定，将固定好组织的样品托盘放入冰冻切片机中预冷；
（3）组织样本切片：将预冷的带有组织的样本托盘放入冰冻切片机的制冷系统样品头上进行固定；调整位置后进行切片，直到包埋样品切完；
（4）收集组织样品切片，进行酶解、差速离心、超离、排阻和超滤，完成组织外泌体的富集纯化。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，酶解温度37℃，酶解时间为10~20min；
所述差速离心为：1~8℃条件下： 300~600g 10min；2000~3000g 10min；10000~12000g10min；
所述超离为：1~8℃条件下，100000~150000g 2 h；
所述超滤为： 1~8℃条件下， 3000~5000g 1~5min。
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