CN114019008A - 一种oct冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用和方法 - Google Patents
一种oct冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种OCT冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用和方法，其中，所述方法包括以下步骤：将生物组织样本固定在具有厚度小于1cm的OCT冷冻剂层的样品托上，然后利用OCT冷冻剂对其进行冷冻包埋，最后进行切片、质谱检测并成像，即可。本发明首次提出使用OCT冷冻剂辅助检测小分子代谢物的质谱成像，该方法不仅保持了生物组织切片的原位性和切片结构的完整性；同时在质谱成像检测时，避免了小分子代谢物的外溢和其局部堆积的问题，从而有效提高了质谱成像技术的检测准确度。
Description
技术领域
本发明属于质谱成像的前处理技术领域，更具体地，涉及一种OCT冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用和方法。
背景技术
OCT冷冻剂，又称OCT包埋剂(optimal cutting temperature compound)，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，被广泛用于免疫组化实验室中冰冻切片时固定生物组织，以增加生物组织的连续性，减少皱折及碎裂，使切片质量得到改善。但是，通常的固定手段只将生物组织放置在少量OCT组织冷冻剂上，且OCT冷冻剂普遍只用于生物组织切片流程中，针对组织样本的简单末端固定而使用。通过切片的冷冻环境使冷冻剂凝固，维持组织的确定位置，防止组织在切片过程中的脱离和位移。但是这种常用手段常常会伴随生物组织在切片过程中的边缘卷翘，折叠和形变，同时会发生组织内小分子代谢物在恢复常温和冻融存储使用过程的明显位移。
质谱成像是以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱为基础的成像方法，该方法通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱直接扫描生物样品成像，可以在同一张组织切片或组织芯片上同时分析数百种分子的空间分布特征。其中，待检测样本的制备过程是影响质谱成像结果真实性和准确性的关键环节，恰当而迅速的样本收集与固定是维持样本中分子或离子的真实空间分布和丰度的保证。在针对质谱成像技术的必要基质覆盖前处理中，常规的基质喷涂法会在氮气喷涂结晶过程中，存在将部分目标物从组织的原始位置移动到组织外部的问题，尤其在质谱成像的实验采集成像结果结构上发生目标小分子代谢物在组织结构内的明显位移及不清晰等现象，而这种现象会对定量研究实验产生极大影响。
因此，解决当前普遍使用的生物组织冷冻切片方法带来的组织结构破损及小分子代谢物信息遗失、位移、聚集等现象对质谱成像造成的不良影响的问题具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种OCT冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用。
本发明的第二个目的在于提供一种生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种OCT冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用。
需要说明的是，一般在通过质谱成像技术观察小分子代谢物在目标生物组织上的空间分布及可能的结构细节的分子分布状态时，前处理过程对小分子代谢物的原始位置会存在一定影响，其中造成较大影响的操作包含：生物组织固定，切片及基质铺盖等。因此，为了减少小分子代谢物在生物组织上的位置移动，本发明通过对生物组织进行包埋处理的方法进行了尝试，本发明发现，通过OCT冷冻剂包埋生物组织可以直接避免生物组织再切片和固定过程中产生的形变，进而在基质覆盖时也抑制了小分子代谢物向组织外流散的趋势，良好辅助了质谱成像技术在观察小分子代谢物在组织内的信息研究，改善了以往使用的生物组织冷冻切片技术带来的小分子代谢物信息遗失、位移、聚集等多种问题的发生。此外，本发明还意外发现，OCT冷冻剂在最终的质谱成像采集结果上，对小分子代谢物的峰值强度信号没有任何影响。
进一步，所述生物组织包含动物组织和/或植物组织。
进一步，所述小分子代谢物的分子量小于1000Da；优选地，所述小分子代谢物的分子量小于500Da。
其中，所述小分子代谢物指生物组织通过代谢过程产生或消耗的物质，具体种类与生物组织的种类相关，例如：胆碱类(优选为胆碱、甘油磷酸胆碱)、肉碱类(优选为肉碱、C2:0肉碱)、多胺类(优选为精胺、亚精胺)、有机酸类(优选为牛磺酸、琥珀酸)、氨基酸类(优选为精氨酸、谷氨酸)、核苷 (优选为肌苷、尿苷)、核苷酸(优选为腺苷酸、肌苷酸)、含氮碱基(优选为黄嘌呤、次黄嘌呤)、脂肪酸(优选为亚油酸、花生四烯酸)、胆固醇(优选为硫酸胆固醇)、黄酮(优选为黄芩素、汉黄芩素)、丹参酮(优选为丹参酮I、丹参酮IIA)、酚酸(优选为咖啡酸、阿魏酸)、多糖(优选为植物二糖、植物三糖)、多肽(优选为谷胱甘肽)、磷脂(优选为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺)中的任意一种或多种。
第二方面，本发明提供一种生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法，包括以下步骤：
将生物组织样本固定在具有厚度小于1cm的OCT冷冻剂层的样品托上，然后利用OCT冷冻剂对其进行冷冻包埋，最后进行切片、质谱检测并成像，即可。
进一步，所述方法具体包括以下步骤：
1)在样品托上涂抹一层厚度小于1cm的OCT冷冻剂，进行低温冷冻，形成OCT冷冻剂层；
2)在OCT冷冻剂层上滴加2～4滴OCT冷冻剂，随后立即将生物组织样本放置于OCT冷冻剂液滴上，进行低温冷冻，使生物组织样本固定于样品托上；
3)将生物组织样本浸入OCT冷冻剂中，且保持样品托不浸入，对生物组织样本进行低温冷冻包埋，获得待测生物组织样本；
4)将待测生物组织样本进行切片，放于成像薄膜之上，进行质谱检测并成像，即可。
其中，本发明发现，先在样品托上固定一层特定厚度的OCT冷冻剂层，不仅可以有效防止生物组织样本与样品托粘粘而导致的生物组织样本可能发生的形变和结构性破坏/损伤，而且可以为生物组织样本提供一个适合的高度，即有利于其后续切片过程中调整组织的位置。
进一步，步骤1)或步骤2)中，所述低温冷冻，或步骤3)中，所述的低温冷冻包埋是在-18～-22℃的条件下进行的。
进一步，步骤2)中，所述生物组织样本包含动物组织样本和/或植物组织样本。
进一步，步骤2)中，所述生物组织样本为解冻后的生物组织样本或新鲜的生物组织样本。
其中，当质谱成像使用新鲜的组织样本时，组织样本会有明显血迹，可以使用0.9％生理盐水冲洗组织中的残留血液，然后立即放入液氮速冻(或者异戊烷处理)，5min～10min后将组织放于-20℃冰箱中，继续冷冻至少1 小时，之后进行质谱成像相关操作。如果使用解冻后的生物组织样本即长时间放置的冷冻生物组织样本，一般该样本的储存条件为-80℃，在使用前需转移到-20℃的冰箱中继续冷冻至少1小时，然后再进行质谱成像相关操作。
根据本发明的具体实施方法，步骤3)中，所述低温冷冻包埋可以在玻璃容器中进行。其中，在生物组织通过OCT冷冻剂包埋操作中，需要保证生物组织的完整浸没及OCT冷冻剂包裹厚度，因此，优选使用有一定体积和深度的玻璃容器，其快速的降温导热能力能够促进生物组织在低温下更加顺利和快速地被足够的OCT包裹和固定。此操作的包埋持续时间与组织的表面积大小和冷冻切片机箱体温度相关，通常组织大小在1cm3的体积下切片机内低温浸没时间为1～2分钟，最常持续时间不超过5分钟。再取出包埋后的生物组织过程中需要使用较轻的力量，避免生物组织在拖拽过程中发生破损或包埋的失败。
另外，如无特殊说明，本发明中所用原料均可通过市售商购获得，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。所述百分比如无特殊说明均为质量百分比，所述溶液若无特殊说明均为水溶液。
本发明的有益效果如下：
传统的实验方法冷冻生物组织样本可能会发生的组织形变和切片损伤，且在小分子代谢物的检测上会发生位移及检测量上的损失。本发明首次提出使用OCT冷冻剂包埋辅助检测小分子代谢物的质谱成像，这种方法可在切片过程中直接降低生物组织可能发生的形变和结构性破坏/损伤，既保持了生物组织切片的原位性和切片结构的完整性，同时又在质谱成像检测中，避免了普通无包埋操作经常发生的小分子代谢物外溢和其局部堆积的问题，进而有效提高了质谱成像技术的检测准确度。
本发明提供的生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法，在实验操作上具有很强的实用性，且成本低廉，操作方便，重复性好。
附图说明
图1示出试验例患者1的胶质瘤组织样本在不同质谱成像的方法处理后得到的质谱成像结果图；其中，A示出患者1的胶质瘤组织样本在其他的质谱成像方法处理后得到的质谱成像结果图；B示出患者1的胶质瘤组织样本在本发明的质谱成像方法处理后的质谱成像结果图。
图2示出试验例患者2的胶质瘤组织样本在不同质谱成像的方法处理后得到的质谱成像结果图；其中，A示出患者2的胶质瘤组织样本在其他的质谱成像方法处理后得到的质谱成像结果图；B示出患者2的胶质瘤组织样本在本发明的质谱成像方法处理后的质谱成像结果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
其中，以下试验例使用的OCT冷冻剂是德国莱卡OCT冷冻组织切片包埋剂(LeicaTissue Freezing Medium)。
本发明的生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法，具体包括以下步骤：
1)在冷冻切片机的靶拖上涂抹一层厚度小于1cm的OCT冷冻剂。然后将其放入冷冻切片机(莱卡冷冻切片机，冷冻箱体温度为-18～-22℃)内进行低温固定，直至OCT冷冻剂全部凝固变白，形成OCT冷冻剂层；
2)在第一步的OCT冷冻剂层上再滴加2-4滴OCT冷冻剂，将在冷冻切片机内解冻后的生物组织样本(液氮/-80环境下储存样本，转移至冷冻切片机内进行切片温度环境下的解冻，时间大于一小时)放置在新滴加的还未冷冻的OCT冷冻剂液滴上，将所述生物组织样本放入冷冻切片机内进行低温固定，直至OCT冷冻剂全部凝固变白，使生物组织样本固定于样品托上；
3)使用有一定厚度的玻璃盒(盒体厚度大于样本整体厚度，大小要能承载目标组织的体积)，在该玻璃盒内灌入大于生物组织厚度的OCT冷冻剂，使组织充分浸入，但保持靶拖不浸入，将整体放置在冷冻切片机的低温下，持续时间1-5分钟；将未完全冷冻住的组织，通过手提靶拖，缓慢拿出，颠倒后继续放置在冷冻切片机的低温箱体中进行冷冻，直至生物组织样本上的 OCT冷冻剂整体冷冻凝固变成白色，获得待测生物组织样本；
4)将所述待测组织样本进行切片，放于成像薄膜之上，进入质谱检测并成像，即可。
试验例
分别将两个来自不同患者(分别记为患者1和患者2)的胶质瘤组织样本切割为两组，一组按照本发明提供的生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法进行处理，另一组的处理同本发明提供的生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法，区别仅在于不进行步骤3)，质谱成像结果见图1和图2所示。
由图1和图2可知，经过本发明方法处理的组织切片，小分子代谢物在质谱成像结果中位移现象不明显，能够保持在组织内部，但是其他常规处理方法处理过的组织切片的小分子代谢物在成像的结果上有明显的目标物外溢，目标物为2-HG(小分子代谢物biomarker的一种)。此外，需要说明的是图中来自同一患者的胶质瘤组织样本看起来没有类似形状是因为胶质瘤中晚期会组织稀软无固定形态。
由质谱成像结果的质谱数据可知，小分子代谢物出峰正常，OCT冷冻剂在小分子代谢物的分子范围内的没有任何影响。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种OCT冷冻剂在生物组织中小分子代谢物的质谱成像中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物组织包含动物组织和/或植物组织。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子代谢物的分子量小于1000Da。
4.一种生物组织中小分子代谢物的质谱成像的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将生物组织样本固定在具有厚度小于1cm的OCT冷冻剂层的样品托上，然后利用OCT冷冻剂对其进行冷冻包埋，最后进行切片、质谱检测并成像，即可。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1)在样品托上涂抹一层厚度小于1cm的OCT冷冻剂，进行低温冷冻，形成OCT冷冻剂层；
2)在OCT冷冻剂层上滴加2～4滴OCT冷冻剂，随后立即将生物组织样本放置于OCT冷冻剂液滴上，进行低温冷冻，使生物组织样本固定于样品托上；
3)将生物组织样本浸入OCT冷冻剂中，且保持样品托不浸入，对生物组织样本进行低温冷冻包埋，获得待测生物组织样本；
4)将待测生物组织样本进行切片，放于成像薄膜之上，进行质谱检测并成像，即可。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)或步骤2)中，所述低温冷冻，或步骤3)中，所述的低温冷冻包埋是在-18～-22℃的条件下进行的。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述生物组织样本包含动物组织样本和/或植物组织样本。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生物组织样本为解冻后的生物组织样本或新鲜的生物组织样本。
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