CN110093403A - 荧光pcr试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法，涉及生物检测技术领域。所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。由该冻干保护剂制备得到的荧光PCR冻干制剂可长期常温保存，且复溶速度快。本发明还提供一种包括上述冻干保护剂的荧光PCR冻干芯片的制备方法，该方法简单快速，可在八小时内完成冻干步骤。

Description

荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域。更具体地，涉及一种荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法。

背景技术

1996年美国Applied Biosystems公司推出了荧光定量PCR扩增技术，PCR扩增时加入荧光染料或荧光标记的特异性的探针，荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，随着PCR的进行，被仪器检测到的荧光信号越来越强，结合软件可以对产物进行分析，根据标准曲线得到待测模板的初始浓度，从而达到定量的目的。该技术操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、应用范围广，被广泛应用于临床诊断、食品安全、法医学等领域。

荧光定量PCR扩增反应试剂在保存、运输和使用过程中要求在低温条件下进行，否则诊断试剂容易失效，因此试剂盒的长期保存和长途运输将会受到很大的限制，容易因诊断试剂保存温度不当而使其敏感性下降甚至完全失效，最终导致疫病的检测不及时而造成疫病流行。目前，针对核酸扩增反应试剂缺少能在4℃或室温长期保存的方法。市场上的荧光定量PCR扩增试剂按成份不同，分开保存。常见的三种形式：一是酶一管，Buffer、引物、探针、dNTPs一管；二是酶、Buffer、dNTPs一管，引物探针一管；三是酶一管，引物、探针一管，Buffer、dNTPs一管。采用以上三种方式的原因是，各种组分如果混在一起，长时间会降低反应活性，尤其是在4℃以上条件下，混合后保存不宜超过一天，长期保存需要将各组分分开。现有的荧光定量PCR扩增试剂具有以下不足之处：

(1)上述荧光定量PCR扩增试剂需要低温保存，冷链运输，增加了试剂的保存和运输成本；

(2)以上三种形式，在使用时需要10-20分钟在4℃化冻，然后按照说明书将各组分挨个混合，操作复杂，容易出错；

(3)以上三种形式，需要配备不同量程的移液器，携带不便，不适合现场操作，且以上三种形式，每次混合时均需要更换枪头，浪费耗材；

(4)加入模板后需要增加震荡、离心排气的步骤，以使混合均匀，不影响荧光信号采集。

冷冻干燥是把试剂预先进行降温冻结成固体，然后在真空条件下升华，将95％以上的水分蒸发掉，而保护剂作为固剂在升华时不会崩塌，保证了冻干制品的形态。整个过程在低温中进行，试剂活性不会受到影响。冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链、即时活化、不相容试剂共存、无交叉污染等很多明显优势，随着产业的升级，越来越多厂家尝试开发冻干试剂。国内对于冻干技术研究的累积相对较少，从学术到人才，都使得冻干技术在实际应用中有较难逾越的壁垒。实际上绝大部分的试剂都可以做成冻干的，他的风险并不是试剂本身，而是错误的方法和巨大的时间成本。

现在市场上的冻干制剂一般保存在反应管中，这种用反应管盛放冻干制剂的方法有许多不足之处：

(1)由于反应管的结构限制，反应管呈下窄上宽的锥字形，而且反应管需要借助其他工具支撑，反应管试剂与冻干机搁板的接触面积很小，所以升华时传热会受到限制，延长了预冻和升华的时间，反应管中的冻干程序一般在24～30小时，冻干品日产量低；

(2)反应管中的冻干，在加入冻干混合试剂后，需要进行离心处理，排出气泡，并将粘附在反应管壁上的试剂离心下来；

(3)反应管中的冻干，冻干结束后需要关盖，有两种方式：一种是在冻干机中加装机械臂，冻干结束后自动关盖，这种方法提高了设备成本，另一种方式是冻干结束后将反应管取出，在冻干机外部关盖，这种方法对环境有很高的要求，需要恒温恒湿，湿度不能超过10％，而且在产量较高的情况下，需要增加人力，如果人员不够，关盖速度慢，同一批次干燥制剂与空气接触的时间不同，造成差异，而且如果长时间暴露在空气中，容易吸潮复水；

(4)反应管中的冻干制剂对封装有很高的要求，需要干燥剂加真空封装的方法，如果真空泄露，会直接降低冻干制剂的活性，甚至失去活性；

(5)反应管中的冻干制品，在运输过程中容易上下移动，冻干粉会粘附在整个反应管内壁上，为了避免损失，实验前需要将反应管离心处理；

(6)反应管中的冻干制品呈球形颗粒，复溶速度慢，液滴瞬间加入冻干粉中，容易产生气泡，为了使复溶充分且无气泡，需要进行震荡和离心处理；

微流控技术，又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)，是一种以在微纳米尺度空间中对流体进行操控为主要特征的科学技术，具有将生物、化学等实验室的基本功能诸如样品制备、反应、分离和检测等缩微到一个几平方厘米芯片上的能力，其基本特征和最大优势是多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成。如何将微流控技术和荧光探针定量技术有效结合，使得荧光定量PCR扩增在医学检测及其他各个领域中的应用前景更加广阔，是一个亟待解决的科学问题。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种荧光PCR试剂的冻干保护剂及包括其的荧光PCR冻干制剂，由该冻干保护剂制备得到的荧光PCR冻干制剂可长期常温保存，且复溶速度快。

本发明的另一个目的在于提供一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，该方法简单快速，可在八小时内完成冻干步骤。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种荧光PCR试剂的冻干保护剂，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。

优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05g/ml、棉子糖0.12g/ml、右旋糖酐0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

一种荧光PCR冻干制剂，所述冻干制剂由荧光定量PCR试剂和如上所述的冻干保护剂混合均匀后冻干制成。

优选地，荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。

优选地，所述荧光定量PCR试剂包括荧光定量PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶。

一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，包括以下步骤：

制备冻干保护剂：称取海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油、焦磷酸二乙酯处理过的水，置于容器中混合均匀，加热至完全溶解，放入2～8℃冷却；

预混荧光定量PCR试剂：将PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶混合均匀；

将预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂混合均匀，制备成冻干试剂；

取5～8μL的冻干试剂点在微流控芯片的试剂冻干腔中，将点好冻干试剂的微流控芯片移入冻干机中冻干；

冻干结束后，从冻干机中取出冻干芯片并真空封装。

优选地，冻干机中的冻干程序为：

预冻阶段：-40℃预冻3h±0.5h；

主干燥阶段：用时5min抽真空到1mbar，用时20～40min将隔板温度升高至-25℃；

解析干燥阶段：真空保持1mbar，用时2h±0.5h将隔板温度升高至30℃；然后抽真空至0.01mbar，保持2h±0.5h。

优选地，冻干试剂中，预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。

优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的荧光PCR冻干制剂，将荧光定量PCR扩增所需的各试剂混合均匀后冻干保存，实验时无需预混、震荡即可迅速复溶，无气泡产生，加入待测样本后可直接上机进行实验，减少荧光定量PCR实验的准备程序，使荧光定量PCR实验的操作更简单；

将荧光定量PCR试剂冻干，以冻干粉或冻干芯片等形式稳定保存，可实现常温运输和常温保存的目的，减少冷链运输和低温保存的成本，且该冻干制剂的常温稳定保存时间可达一年以上；

本发明提供的荧光PCR冻干芯片的制备方法，可将荧光定量PCR试剂简单快速地制成冻干芯片的形式，显著缩短冻干程序所用的时间，将冻干时间控制在八小时以内，可有效提高冻干产品的产量；此外，与现有技术中将冻干产品盛放在反应管中的方法相比，将荧光定量PCR试剂制作成冻干芯片的形式，可以使冻干产品的使用过程更简单，省略了冻干后关盖、使用前震荡离心和开盖的各种操作。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明实施例和对比例中液体试剂(非冻干制剂)荧光定量PCR的扩增检测结果图。

图2示出本发明实施例和对比例中冻干芯片室温存放0天后荧光定量PCR的扩增检测结果图；图中，扩增曲线由下至上依次为实施例2、实施例1、对比例2、实施例3、对比例1、对比例3、实施例4；

图3示出本发明实施例和对比例中冻干芯片室温存放50天后荧光定量PCR的扩增检测结果图；图中，扩增曲线由下至上依次为对比例1、实施例3、对比例3、实施例2、对比例2、实施例4、实施例1；

图4示出本发明实施例和对比例中冻干芯片室温存放100天后荧光定量PCR的扩增检测结果图；图中，扩增曲线由下至上依次为对比例1、对比例2、实施例2、对比例3、实施例4、实施例3、实施例1；

图5示出本发明实施例和对比例中冻干芯片室温存放200天后荧光定量PCR的扩增检测结果图；图中，扩增曲线由下至上依次为对比例1、对比例2、对比例3、实施例3、实施例4、实施例2、实施例1；

图6示出本发明实施例和对比例中冻干芯片室温存放300天后荧光定量PCR的扩增检测结果图；图中，扩增曲线由下至上依次为对比例1、对比例2、对比例3、实施例4、实施例3、实施例2、实施例1。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

现有技术中，荧光PCR试剂的冷冻保存和低温运输成本高，且容易失效。基于现有技术中存在的问题，本发明提供了如下技术方案。

首先，本发明提供一种荧光PCR试剂的冻干保护剂，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。

海藻糖是一种天然糖类，是由特殊双糖分子构成的非还原性糖，非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在有效组分表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生物活性。

棉子糖是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成，它也被称为蜜三糖、蜜里三糖，是一种功能性低聚糖。棉子糖与其他低聚糖不同，棉子糖晶体粉末含有5分子结晶水，因此即使在相对湿度90％的环境下也不会吸湿结块，相比其他低聚糖粉末较强的吸湿性，这是棉子糖晶体粉末的一个显著特点，对片状、粉状食品和药品的添加极为有利。

右旋糖酐一种高分子葡萄糖聚合物，可以抑制冰晶的长大，提供冷冻稳定性。

甘油，可以保护Taq酶，增加酶的稳定性，以提高产量。

本发明提供的冻干保护剂，通过各组分之间的协同配合关系，使得冻干品可以在常温条件下稳定保存，且使用时冻干品可迅速复溶，无气泡产生。

优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。通过该配方比例混合得到的冻干保护剂，各组分之间协调配合，可以发挥最佳的维持荧光PCR反应试剂活性与稳定性的作用。

进一步优选地，通过大量对比实验发现，当配方为海藻糖0.05g/ml、棉子糖0.12g/ml、右旋糖酐0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水时，可以达到最优的保护效果，使得荧光PCR试剂的常温稳定保存时间最长。

本发明还提供一种荧光PCR冻干制剂，所述冻干制剂由荧光定量PCR试剂和如上任一所述的冻干保护剂混合均匀后冻干制成，最终的形式可以为冻干芯片、盛放在反应管中的普通冻干粉等。

优选地，荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。该配合比例可以使冻干保护剂起到有效的保护作用，避免在冻干和常温储存过程中荧光定量PCR试剂失效。

进一步地，所述荧光定量PCR试剂包括PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶。其中引物和探针均可根据具体实验进行特异性设计；此外，还可以根据具体的PCR反应要求，添加其他可能使用的PCR反应试剂，例如荧光染料等。

此外，本发明还提供一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，包括以下步骤：

制备冻干保护剂：称取海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油、焦磷酸二乙酯处理过的水，置于容器中混合均匀，加热至完全溶解，放入2～8℃冷却；

预混荧光定量PCR试剂：将PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶混合均匀；

将预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂混合均匀，制备成冻干试剂；

取5～8μL的冻干试剂点在微流控芯片的试剂冻干腔中，将点好冻干试剂的微流控芯片移入冻干机中冻干；

冻干结束后，从冻干机中取出冻干芯片并真空封装。

本发明中利用微流控芯片设备将冻干试剂制备成冻干芯片，而非如现有技术中那样将试剂冻干后盛放在反应管中。冻干芯片的制作过程简单，冻干所用时间短，可在8小时内完成，且冻干芯片使用方便，可以解决利用反应管盛放冻干制品存在的诸多问题。

优选地，冻干机中的冻干程序为：

预冻阶段：-40℃预冻3h±0.5h；

主干燥阶段：用时5min抽真空到1mbar，用时20～40min将隔板温度升高至-25℃；

解析干燥阶段：真空保持1mbar，用时2h±0.5h将隔板温度升高至30℃；然后抽真空至0.01mbar，保持2h±0.5h。

预冻阶段：预冻过程在很大程度上决定了干燥过程的快慢和冻干产品的质量，产品预冻的效果由三个参数确定：预冻最低温度(即-40℃)、预冻速率(快速降温)和预冻时间(3h+0.5h)。预冻条件的优化需要我们做到针对自己使用的冻干机性能和三个参数，优化找到合适的条件。

主干燥阶段：即升华干燥阶段，将冻结后的产品置于密闭的真空干燥机内加热，其冰晶就会升华成水蒸气逸出而使产品脱水干燥，升华干燥是决定产品质量的主要因素，该阶段可以除去90％左右的水分。

解析干燥也称第二阶段干燥，在此阶段要除去不能被冻结的水。解析干燥对大多数产品来说，只是注意最高湿度和水分，对产品质量影响小，最终产品的残余含水量一般为0.5％-4％，根据产品种类和要求不同而不同。

优选的，冻干试剂中，预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。

优选地，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

本发明的具体实施例中未做特殊说明的，均采用本领域最常规的实验方法，例如荧光定量PCR的程序等。

实施例1

(1)按照表1中实施例1的冻干保护剂配方，称取海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油、焦磷酸二乙酯处理过的水，置于容器中混合均匀，加热至完全溶解，得到冻干保护剂，放入2～8℃冷却；

(2)将PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶混合均匀，得荧光定量PCR试剂；其中，本实施方式采用的引物和探针序列为：

上游引物：5’-CTC ACC AGG AGA TTA CAA CAT GG-3’(如SEQ ID No.1所示)；

下游引物：5’-AGC TCA GAC CAA AAG TGA CCA TC-3’(如SEQ ID No.2所示)；

探针：FAM-CAC CGA CGG CGAGAC CGACTT T-TAMARA(如SEQ ID No.3所示)。

荧光定量PCR试剂中，各成分的终浓度分别为：PCR反应缓冲液1×，上游引物0.2μmol/L；下游引物0.2μmol/L，探针0.1μmol/L，dNTPs 0.4mmol/L，DNA聚合酶Taq DNA酶0.05U/μL，其余为DEPC处理过的水。

(3)将预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂按照3:1的体积比混合均匀，制备成冻干试剂；

(4)取5～8μL的冻干试剂点在微流控芯片的试剂冻干腔中，将点好冻干试剂的微流控芯片移入冻干机中冻干，冻干机中的冻干程序为：

预冻阶段：-40℃预冻3h±0.5h；

主干燥阶段：用时5min抽真空到1mbar，用时20～40min将隔板温度升高至-25℃；

解析干燥阶段：真空保持1mbar，用时2h±0.5h将隔板温度升高至30℃；然后抽真空至0.01mbar，保持2h±0.5h。

5、冻干结束后，从冻干机中取出冻干芯片并真空封装。

实施例2

冻干保护剂的配方采用表1中实施例2的配方，预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂按照5:2的体积比混合均匀，其余步骤同实施例1。

实施例3

冻干保护剂的配方采用表1中实施例3的配方，其余步骤同实施例1。

实施例4

冻干保护剂的配方采用表1中实施例4的配方，其余步骤同实施例1。

对比例1

冻干保护剂的配方采用表1中对比例1的配方，其余步骤同实施例1。

对比例2

冻干保护剂的配方采用表1中对比例2的配方，其余步骤同实施例1。

对比例3

冻干保护剂的配方采用表1中对比例3的配方，其余步骤同实施例1。

表1冻干保护剂的配方表

实验例1

1.实验目的：检测实施例和对比例中荧光PCR冻干芯片的稳定性

2.实验步骤：

(1)向实施例1-4和对比例1-3制备得到的冻干芯片中，分别加入12-15μL DEPC水复溶，得到PCR扩增溶液；

(2)向PCR扩增溶液中加入沙门氏菌基因组模板，得到最终的荧光定量PCR反应体系，进行常规的荧光定量PCR反应。

(3)实施例1-4和对比例1-3制备得到的冻干芯片分别室温放置0天，50天，100天，200天，300天，重复上述的荧光定量PCR反应实验，对得到的数据进行比对分析。

3.实验结果：

实施例1中得到的冻干芯片，室温放置300天后，扩增曲线有明显的指数期，Ct值变化不大；实施例2、3、4虽然也有明显的指数期，但是Ct值延后明显，说明部分有效组分失活；对比例1、2、3无扩增曲线，无Ct值，说明有效成分已完全失活，室温最长只能保存100天。

表2不同配方Ct随时间的变化

序号	0天	50天	100天	200天	300天
						实施例1	27.78	28.10	29.29	30.60	30.61
实施例2	28.09	28.56	30.17	31.44	31.67
						实施例3	27.44	29.04	29.35	32.95	31.86
实施例4	27.13	28.15	29.47	32.23	33.47
						对比例1	27.37	30.68	31.52	39.26	0
对比例2	27.69	28.48	31.46	36.67	0
						对比例3	27.29	28.97	29.96	33.47	0

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 融智生物科技（青岛）有限公司

<120> 荧光PCR试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法

<130> JLC19I0084E

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcaccagga gattacaaca tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agctcagacc aaaagtgacc atc 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgacggc gagaccgact tt 22

Claims (10)

1.一种荧光PCR试剂的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂为由以下组分制备得到的溶液：海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油，以及焦磷酸二乙酯处理过的水。

2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

3.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05g/ml、棉子糖0.12g/ml、右旋糖酐0.10g/ml、甘油的体积百分比含量为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

4.一种荧光PCR冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂由荧光定量PCR试剂和如权利要求1所述的冻干保护剂混合均匀后冻干制成。

5.根据权利要求4所述的冻干制剂，其特征在于，荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。

6.根据权利要求4所述的冻干制剂，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂包括荧光定量PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶。

7.一种荧光PCR冻干芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备冻干保护剂：称取海藻糖、棉子糖、右旋糖酐、甘油、焦磷酸二乙酯处理过的水，置于容器中混合均匀，加热至完全溶解，放入2～8℃冷却；

预混荧光定量PCR试剂：将PCR反应缓冲液、引物、探针、dNTPs和DNA聚合酶混合均匀；

将预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂混合均匀，制备成冻干试剂；

取5～8μL的冻干试剂点在微流控芯片的试剂冻干腔中，将点好冻干试剂的微流控芯片移入冻干机中冻干；

冻干结束后，从冻干机中取出冻干芯片并真空封装。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，冻干机中的冻干程序为：

预冻阶段：-40℃预冻3h±0.5h；

主干燥阶段：用时5min抽真空到1mbar，用时20～40min将隔板温度升高至-25℃；

解析干燥阶段：真空保持1mbar，用时2h±0.5h将隔板温度升高至30℃；然后抽真空至0.01mbar，保持2h±0.5h。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，冻干试剂中，预混的荧光定量PCR试剂和冻干保护剂的体积比为3:1。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂中各组分的含量为：海藻糖0.05-0.20g/ml、棉子糖0.05-0.20g/ml、右旋糖酐0.025-0.10g/ml、甘油的体积百分比1％-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。