CN114480591B

CN114480591B - 一种用于一步法qpcr试剂的冻干保护剂及其应用

Info

Publication number: CN114480591B
Application number: CN202210233342.2A
Authority: CN
Inventors: 陈亮; 周倩; 王�锋; 冯延叶; 赖煦卉
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114480591A

Abstract

本发明属于生物技术体外诊断核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂及其应用，保护剂的主要成分包括：海藻糖、甘露醇、明胶、BSA、Triton X‑100、Biolipidure‑103以及焦磷酸二乙酯处理过的水。使用本发明提供的冻干保护剂对扩增试剂进行保护时，冻干后与冻干前相比较，ct值和荧光信号值基本一致，说明本发明提供的保护剂，对QPCR试剂保护效果好，不用在冻干前额外添加酶或者探针，这降低了成本。本发明提供的冻干保护剂，通过各组分之间的协同配合关系，可以发挥最佳的维持荧光PCR反应试剂活性与稳定性的作用。且冻干品可以在常温条件下稳定保存，且使用时冻干品可迅速复溶。

Description

一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术体外诊断核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂及其应用。

背景技术

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该技术操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、应用范围广，被广泛应用于临床诊断、食品安全、法医学等领域。

荧光PCR反应缓冲系统组成成分通常为化学试剂组成的缓冲Buffer、水等，这一类试剂在储存过程中较为稳定。但是，引物、探针、dNTP为通过化学方法合成的试剂，需要低温保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果。DNA聚合酶，RNA逆转录酶、UNG酶为通过基因重组表达方法得到的活性蛋白，也需要低温保存以保持其活性。若将酶、dNTP、引物、探针混合在一起保存，则在液体状态下引物探针会结合形成二聚体结构，影响扩增效果。

为了保持试剂的稳定性，通常市场上的荧光定量PCR扩增试剂按不同成份分开低温保存，这增加了运输、保存的成本。同时，按照说明书将各组分挨个混合，操作复杂，容易出错。为了防止交叉污染，每取一种组分，需要更换枪头，既增加人工时间，也增加了耗材的成本。所以，为了满足临床大规模检测的需求，急需发明一种使用方便、且不需要低温保存及运输的可冻干的荧光PCR检测扩增试剂。

真空冷冻干燥(简称冻干)是一种能有效提升生物制品保存稳定性的方法，能防止有效成分在冻干过程中丢失生物学活性。冻干试剂有着常温稳定、摆脱冷链、即时活化、不相容试剂共存、无交叉污染等很多明显优势。但常见的保护剂如：蔗糖、PEG、BSA等对PCR反应有一定的抑制作用。甘油是保存DNA聚合酶最常用的试剂，虽然也可以作为冻干保护剂，但由于其吸水性较强，冻干后极容易吸潮，或者冻干后形态不规则，呈油状，这给冻干试剂的批內和批间稳定性带来不良影响。

目前的现有技术如公开号为CN 112210593 A，一种冻干保护剂、可冻干的PCR试剂及其应用。该技术方案，冻干后与未冻干前相比，ct值有延迟，荧光信号值降低。

现有技术中关于PCR试剂冻干产品，在对冻干后保护效果评估时，大多没有与未冻干前的试剂做比较，只评价了冻干后的稳定性，导致在实际应用时发现冻干后与冻干前不一致。部分现有技术只用CT值来评估稳定性，而没有评价荧光信号值的稳定性，荧光定量PCR稳定性一般2个指标都应该评价。还有部分现有技术添加了1wt％及以上的甘油，由于甘油自身的性质，这给批内、批间差的稳定性带来了风险。

综上，现有技术还未能完全解决酶，或者荧光探针在冻干过程中，酶的活性降低，或者探针不稳定的问题，特别是冻干后CT值后移，荧光信号值降低问题。同时，现有技术对体系中的甘油含量，对冻干是否有影响，特别是对冻干后的形态有什么影响，没有报道。

发明内容

现有技术中，荧光PCR试剂的冷冻保存和低温运输成本较高，且容易失活；现有冷冻干燥技术保护剂中大多含有较多甘油，造成批间和批內稳定性较差。针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂，包括以下组分：海藻糖、甘露醇、明胶、BSA、Triton X-100、Biolipidure-103以及焦磷酸二乙酯处理过的水。

进一步地，海藻糖质量体积比为10-20％、甘露醇质量体积比为5-10％、明胶质量体积比为0.05-0.1％、BSA质量体积比为0.5-1％、Triton X-100体积比为0.04％-0.1％，Biolipidure-103体积比为0.5-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

进一步地，海藻糖质量体积比为20％、甘露醇质量体积比为8％、明胶质量体积比为0.05％、BSA质量体积比为0.8％、Triton X-100体积比为0.05％，Biolipidure-103体积比为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

本发明还提供了一种一步法QPCR扩增试剂盒，包括如上述的用于QPCR试剂的冻干保护剂、One Step Probe Enzyme Mix V和One Step RT-qPCR Probe Buffer IV。

进一步地，还包括引物。

进一步地，还包括探针。

进一步地，还包括甘油。

本发明还提供了如上述的一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂在DNA扩增中的应用，特别是在QPCR中的应用。

一般来说，冻干会影响酶的活性，导致活性只有冻干前的70％左右。本领域中对于相同的体系，一般是在冻干前加大酶的添加量。对于荧光探针，在冻干过程中如果保护剂无效，则会造成探针降解，与冻干前试剂相比，荧光信号值会下降。因此，目前急需一种荧光定量PCR的保护剂，能用CT值、荧光信号值两个指标作为稳定性评价，还能仅添加较低甘油含量(1wt％以下)甚至无甘油，且冻干后与冻干前保护效果一致的保护剂。

本申请通过探索不同保护剂对冻干后的ct、荧光信号值的影响，筛选出了一种最优的保护剂。本申请中分析了QPCR体系中，甘油含量对冻干后形态和QPCR性能的影响。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1、本发明提供的冻干保护剂对扩增试剂进行保护时，冻干后与冻干前相比较，ct值和荧光信号值基本一致，说明本发明提供的保护剂，对PCR试剂保护效果好，不用在冻干前额外添加酶或者探针，这降低了成本。本发明提供的冻干保护剂，通过各组分之间的协同配合关系，可以发挥最佳的维持荧光PCR反应试剂活性与稳定性的作用。且，冻干品可以在常温条件下稳定保存，且使用时冻干品可迅速复溶。

2、本发明所提供的保护剂及冻干程序，可以兼容一定含量的甘油，而一般的保护剂，甘油含量达到1％及以上时，会造成很难冻干，或者冻干的形态不严实，开盖后，很快溶解。

3、本发明提供了一种适用于大规模冻干的底座，可以增大PCR管接触面积，便于冻干程序的控制。

附图说明

图1是实施例1中的扩增效果图，Human三重从左到右为FAM VIC Cy5；

图2是实施例2中，在有无甘油条件下冻干后的效果图；

图3是实施例3中的扩增效果图；浅色为液体对照、深色为待测样品；

图4是一种金属底座，可以增大PCR管接触面积，便于大规模冻干PCR管中的试剂。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂及其应用。冻干保护剂为以下组分制备得到的溶液：海藻糖、甘露醇、明胶、BSA、Triton X-100、Biolipidure-103以及焦磷酸二乙酯处理过的水。

本发明中涉及的主要试剂仪器耗材来源见下表1所示：

表1试剂来源

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

S1、配制PCR扩增冻干试剂，20μL体系中各组分的配比如下：

其中4x冻干保护剂中各组分如下：海藻糖质量体积比为20％、甘露醇质量体积比为8％、明胶质量体积比为0.05％、BSA质量体积比为0.8％、Triton X-100体积比为0.05％，Biolipidure-103体积比为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。具体的，4x冻干保护剂的配制方法如下：准确称量海藻糖20g，甘露糖8g，明胶50mg，BSA0.8g，然后用80ml的焦磷酸二乙酯处理过的水，搅拌使其充分溶解。之后加入1ml的Biolipidure-103和50ul的Triton X-100，继续搅拌均匀，然后加入焦磷酸二乙酯处理过的水定容至100ml。最后，再无菌过滤即得。One Step Probe Enzyme Mix V试剂中，各组分如下：1U/ul的采用抗体封闭的热启动Taq、2U/ul的Reverse Transcriptase、0.5mg/ml的RNase Inhibitor、0.2U/ul的Heat-labile UDG；5X One Step RT-qPCR Probe Buffer IV试剂中，各组分如下：1.25mM的dNTP/dUTP Mix、25mM的Mg²⁺；引物及探针试剂中，各组分如下：

GAPDH-F：CCCATGTTCGTCATGGGTGT，

GAPDH-R：TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA，

Probe1：FAM-CTGCACCACCAACTGCTTAGCACCC-BHQ；

b-Actin-F：GAGCTACGAGCTGCCTGACG，

b-Actin-R：GTAGTTTCGTGGATGCCACAG，

Probe2：VIC-CATCACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-BHQ；

GUSB-F：CCCACTCAGTAGCCAAGTCA，

GUSB-R：CACGCAGGTGGTATCAGTCT，

Probe5：Cy5-TCAAGTAAACGGGCTGTTTTCCAAACA-BHQ1

S2、将上述配制的PCR扩增试剂按照20μL/管分装到0.2mL的PCR八连管中。

S3、将八连PCR管放入金属管架(莫纳生物，货号GS40101，见图4)。该金属管架可以快速升降温，与PCR管管壁下部完整结合，适合冻干机大批量放置PCR管，用于冻干。将金属管架已预冷的4℃冻干机中，并按照如下程序运行：

S4、将冻干后的样本复溶，进行qPCR实验，包括以下步骤：

(1)向冻干后的PCR管中加入20μL ddH2O进行复溶。同时，做好正对照，即未冻干前的试剂。

(2)向每个PCR管中加入模板RNA(常规方法提取的Hela细胞总RNA)0.1μL。盖好盖子后，短暂离心，使PCR样本混合均匀。之后，将PCR管放入荧光定量PCR仪。

(3)设置扩增参数，PCR程序为：预变性，95℃，3min，循环1次；变性，95℃，15s，退火延伸60℃，30s，循环45次，在60℃采集荧光信号。

(4)结果见图1。扩增效果显示，冻干前与冻干后CT值与荧光信号值无差别。

实施例2

本实施例中比较了添加甘油与不添加甘油的使用情况。操作步骤如下：

S1、配制PCR扩增冻干试剂，无甘油和有甘油的各做4个复孔。20μL体系中各组分的配比如下：

S3、将分装好的试剂放入已预冷的4℃冻干机中，并按照如下程序运行：

S4、将冻干后的拍照观察，如图2所示：无甘油的组，冻干后形态紧密，大小均一，状态良好；而有甘油的组，管壁呈油装，冻干形态不规则，大小不一。但经过我们测试发现，有甘油的组，开盖后容易吸潮，这可能给数据的多批次间的稳定性带来一定风险。

实施例3

本实施例提供了几种冻干的PCR试剂配方，其4x冻干保护剂配方组分如下表，其余组分为用焦磷酸二乙酯处理过的水。

组分

对比例1

对比例2

对比例3

对比例4

对照例1

对照例2

海藻糖

15％

/

12％

15％

甘露醇

10％

5％

10％

8％

10％

明胶

/

0.05％

0.1％

0.05％

Biolipidure-103

2％

/

2％

1％

2％

Triton X-100

0.08％

/

0.08％

0.1％

0.08％

BSA

0.6％

2％

0.6％

1％

0.6％

蔗糖

/

5％

/

10％

/

叔丁醇

1.25％

/

1％

/

S1、配制PCR扩增冻干试剂，20μL体系中各组分的配比如下：

4x冻干保护剂	5μL(1个配方)
		One Step Probe Enzyme Mix V	0.53μL
5X One Step RT-qPCR Probe Buffer IV	4μL
		引物及探针	3μL
ddH<sub>2</sub>O	7.47μL

S4、将冻干后的样本复溶，进行qPCR实验，包括以下步骤：

(1)向冻干后的PCR管中加入25μL ddH2O进行复溶。同时，做好正对照，即未冻干前的试剂。

(2)向每个PCR管中加入模板DNA，0.1μL。盖好盖子后，短暂离心，使PCR样本混合均匀。之后，将PCR管放入荧光定量PCR仪。

(4)结果分析见图3。扩增效果显示，对比例配方，冻干前与冻干后CT值与荧光信号值有较大差别，特别是荧光信号值，大多出现降低。我们提供的对照例，均出现了较好的保护效果，说明本发明提供的冻干保护剂稳定性较好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂，其特征在于，包括以下组分：海藻糖、甘露醇、明胶、BSA、Triton X-100、Biolipidure-103以及焦磷酸二乙酯处理过的水；

海藻糖质量体积比为10-20％、甘露醇质量体积比为5-10％、明胶质量体积比为0.05-0.1％、BSA质量体积比为0.5-1％、Triton X-100体积比为0.04％-0.1％，Biolipidure-103体积比为0.5-2％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

2.根据权利要求1所述的一种用于一步法QPCR试剂的冻干保护剂，其特征在于：海藻糖质量体积比为20％、甘露醇质量体积比为8％、明胶质量体积比为0.05％、BSA质量体积比为0.8％、Triton X-100体积比为0.05％，Biolipidure-103体积比为1％，其余为焦磷酸二乙酯处理过的水。

3.一种一步法QPCR扩增试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-2任一所述的用于QPCR试剂的冻干保护剂、One Step Probe Enzyme Mix V和One Step RT-qPCR Probe BufferIV。

4.根据权利要求3所述的一种一步法QPCR扩增试剂盒，其特征在于：还包括引物。

5.根据权利要求4所述的一种一步法QPCR扩增试剂盒，其特征在于：还包括探针。

6.根据权利要求3所述的一种一步法QPCR扩增试剂盒，其特征在于：还包括甘油。

7.如权利要求1-2任一所述的一种用于QPCR试剂的冻干保护剂在一步法QPCR扩增中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述一步法QPCR扩增包括RNA逆转录为DNA和QPCR。