FR2710920A1 - Procédé pour extraire des acides nucléiques et procédé pour détecter des séquences spécifiées d'acides nucléiques. - Google Patents

Procédé pour extraire des acides nucléiques et procédé pour détecter des séquences spécifiées d'acides nucléiques. Download PDF

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Abstract

Un procédé perfectionné pour extraire les acides nucléiques d'un échantillon comprend le mélange des échantillons avec un support qui est au moins un élément choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose afin de former un mélange liquide; le mélange de ce liquide avec un réactif C de manière à rendre insolubles les acides nucléiques et le support, ce réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-butylique, et de l'alcool tert-amylique; et la séparation de la phase liquide des acides nucléiques et du support insolubilisés. Le procédé est plus facile à utiliser que les modes opératoires antérieurs, implique un plus petit nombre d'étapes, permet de réduire la possibilité de la production d'un aérosol, peut être mis en œuvre dans un bref laps de temps, n'utilise ni phénol ni chloroforme, et permet d'obtenir une efficacité constante dans l'extraction des acides nucléiques. On décrit aussi un procédé pour détecter une séquence spécifiée d'un acide nucléique.

Description

La présente invention concerne un procédé
pour extraire des acides nucléiques d'un échantillon.
Plus particulièrement, elle est relative à un procédé d'extraction d'acides nucléiques et à un procédé pour la détection de séquences spécifiées d'acides nucléiques qu'on peut utiliser en biotechnologie et en diagnostic clinique. L'extraction des acides nucléiques d'un échantillon est une opération importante en biotechnologie, en diagnostic clinique et dans d'autres domaines complexes. Par exemple, la technologie du gène recombiné nécessite l'isolation d'un vecteur acide désoxyribonucléique et de l'acide désoxyribonucléique à cloner et, dans le but de faire un essai des gènes dans des maladies génétiques et des gènes des cancers, il est nécessaire d'extraire les acides nucléiques des cellules des leucocytes et analogues présents dans le sang. Les acides nucléiques ne se présentent généralement pas sous forme de molécules libres mais au contraire dans des bactéries, des cellules des particules de virus etc. car ils sont recouverts des membranes et des parois cellulaires qui sont constituées de protéines, de lipides et de sucres. Les acides nucléiques eux-mêmes forment des complexes avec l'histone et autres protéines. Pour extraire les acides nucléiques qui sont présents de cette manière, les membranes et les parois des cellules les recouvrant doivent être rompues, et les protéines des complexes - mentionnés ci-dessus dénaturées ou dégradées de manière à devenir ainsi solubles, de façon que les acides
nucléiques soient libérés et ensuite extraits.
L'extraction classique des acides nucléiques s'effectue selon l'un des procédés suivants: (a) le procédé dit protéinase K/phénol, dans lequel une enzyme protéolytique tel qu'une protéinase K ou un agent tensio-actif est ajoutée de manière à rompre la membrane cellulaire ou paroi et la protéine d'un complexe
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présentant de l'intérêt est dégradée pour libérer les acides nucléiques; alors on ajoute du phénol/chloroforme et on soumet le mélange à centrifugation pour que les acides nucléiques soient transférés à la phase aqueuse; la phase aqueuse est récupérée par séparation, et de l'éthanol, de l'isopropanol etc. sont ajoutés à la phase aqueuse récupérée, ce qui rend insolubles les acides nucléiques (voir Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Annexes E3 - E4, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989); (b) le procédé dit AGPC, dans lequel un mélange liquide d'isothiocyanate de guanidinium et de phénol est ajouté à un échantillon présentant de l'intérêt pour rompre la membrane et la paroi des cellules, de sorte que la protéine du complexe est dénaturée pour devenir soluble; les acides nucléiques sont alors libérés; et du chloroforme est ajouté pour transférer les acides nucléiques à la phase aqueuse; la phase aqueuse est récupérée par séparation et ensuite, de l'éthanol, de l'isopropanol ou analogue est ajouté à la phase aqueuse récupérée, ce qui rend insolubles les acides nucléiques (voir Acid Guanidinium-Thiocyanate Phenol-Chloroform Method: Analytical Biochemistry, 162, 156 - 159, 1987); (c) le procédé dit au guanidinium, dans lequel du chlorhydrate de guanidinium ou du thiocyanate de guanidinium est ajouté à un échantillon présentant de l'intérêt pour rompre la membrane et la paroi des cellules, de sorte que la protéine du complexe est dénaturée pour devenir soluble; les acides nucléiques - sont alors libérés; et de l'éthanol ou analogue est ajouté pour rendre insolubles les acides nucléiques libérés (voir Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 7.23 - 7.25, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; and Analytical Biochemistry 162, 463, 1987); et; (d) le procédé dit à l'iodure de sodium, dans lequel de l'iodure de sodium contenant du glycogène qui présente de l'affinité pour l'acide nucléique à extraire est ajouté à un échantillon présentant de l'intérêt, d'o il
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résulte que la membrane et la paroi des cellules sont rompues et que la protéine du complexe est dénaturée, de sorte qu'elle devient soluble; les acides nucléiques sont alors libérés; et de l'isopropanol est ajouté pour rendre insolubles les acides nucléiques libérés et le
glycogène (voir Nucleic Acid Res., 129 (20), 592, 1991).
Les quatre procédés venant d'être décrits ont leurs propres inconvénients. Le procédé protéinase K/phénol implique des modes opératoires compliqués car il faut beaucoup de temps pour exécuter la dégradation avec l'enzyme protéolytique et qu'il faut une régulation de la température pour assurer une réaction enzymatique efficace. En outre, le phénol et le chloroforme sont des réactifs chimiques toxiques (tous deux sont désignés comme substances nuisibles) et pour les manipuler il faut utiliser des vêtements, des gants de protection, des hottes étanches, etc. En outre, les déchets liquides provenant de l'extraction doivent être soumis à un traitement spécial, entraînant des coûts, du temps et des installations supplémentaires. De plus, il faut une grande habilité technique pour récupérer par séparation la phase aqueuse à laquelle les acides nucléiques présentant de l'intérêt ont été transférés et cela rend difficile l'obtention d'une efficacité régulière dans
l'extraction des acides nucléiques.
Des problèmes similaires se produisent dans le procédé dit AGPC, se rapportant à la manipulation du phénol et du chloroforme, ainsi qu'à l'efficacité de l'extraction qui est liée à la récupération par séparation de la phase aqueuse à laquelle les acides
nucléiques présentant de l'intérêt ont été transférés.
De plus, ce procédé, plus particulièrement destiné à extraire l'acide ribonucléique (ARN), ne convient pas à
l'extraction de l'acide désoxyribonucléique (ADN).
Dans le procédé au guanidinium, on ajoute de l'éthanol ou analogue à un échantillon présentant de l'intérêt après l'addition du chlorhydrate de guanidinium ou analogue. Dans le but d'éviter une chute ultérieure de la concentration du guanidinium dans une solution, on doit utiliser du guanidinium à concentration élevée (environ 6 - 8 M), mais alors les risques du dépôt d'un sel de guanidinium augmenteront (en particulier en hiver ou lorsque la température ambiante n'est pas supérieure à 20 C). Le dépôt d'un sel de guanidinium peut conduire au bouchage des pipettes ou autre équipement utilisés dans l'addition du chlorhydrate de guanidinium ou analogue et cela présente un obstacle important à toute tentative pour mécaniser le mode opératoire du procédé au guanidinium. On ajoute de l'éthanol ou analogue après le chlorhydrate de guanidinium, etc., et pour rendre insolubles les acides nucléiques, la concentration finale de l'éthanol ou analogue doit être 50 - 70 %. Cependant, lé volume de l'échantillon augmente compte- tenu de l'addition du chlorhydrate de guanidinium ou analogue et, par conséquent, même de l'éthanol de haute pureté (environ %) doit être employé dans une quantité au moins égale au mélange liquide de l'échantillon et du
chlorhydrate de guanidinium ou analogue.
Le procédé à l'iodure de sodium soulève le problème qu'il faut une incubation à 60 C pour solubiliser les protéines ou analogue, ce qui se traduit par un faible rendement de l'extraction de l'acide ribonucléique. Un autre problème est que l'ion iodure instable (I-) a tendance à être oxydé par l'action de la lumière ou analogue et à former une molécule d'iode (I2). Pour éviter cela, on doit stocker les réactifs
dans une pièce froide et sombre.
On connaît la réaction en chaîne de la polymérase (RCP) comme procédé d'amplification de l'acide désoxyribonucléique (voir Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chapitre 14, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) qui est capable de faire un essai des gènes (diagnostic génétique) avec une sensibilité ultra-élevée. Si l'amplification de l'acide désoxyribonucléique est réussie, la réaction RCP a le potentiel d'exécuter une amplification suivant un facteur d'au moins 100 millions. Cependant, compte-tenu de la possibilité d'amplification de même une molécule de l'acide désoxyribonucléique, le résultat de l'essai sera fâcheusement affecté en présence d'un acide désoxyribonucléique (acide désoxyribonucléique exogène) lequel doit être absent de l'échantillon d'acide
nucléique RCP ou du réactif RCP.
L'une des causes de la présence de l'acide désoxyribonucléique exogène se produit au stade dans lequel les acides nucléiques sont extraits de l'échantillon présentant de l'intérêt pour préparer l'échantillon d'acide nucléique RCP et cela concerne également l'aérosol qui est produit dans le mode opératoire de l'extraction des acides -nucléiques présentant de l'intérêt. La production de l'aérosol se produira des plus probablement dans le procédé protéinase K/phénol ou le procédé AGPC car, en dehors de l'étape d'addition du réactif à l'échantillon et de l'exécution d'autres modes opératoires tels que le mélange, ces procédés nécessitent aussi des modes opératoires prenant du temps tels que la récupération de la phase aqueuse par séparation. Les particules de l'aérosol ont un diamètre d'environ 20 gm et leur volume n'est que d'environ 4 x 10-6gL. Considérons, par exemple, le cas d'un patient souffrant d'hépatite B; comme environ 105 particules de virus peuvent être contenues dans 1 pL de sang, une particule d'aérosol peut contenir une particule de virus. En d'autres termes, l'aérosol peut être sérieusement néfaste à la RCP qui est capable d'amplifier une molécule d'acide désoxyribonucléique. Par conséquent, il y a un besoin de
réduire le nombre des étapes de traitement impliquées.
De façon à rendre minimale la production de l'aérosol dans un procédé RCP, on a proposé un procédé dans la publication des brevets européens n 487 218, dans lequel une réaction RCP peut être exécutée facilement en utilisant un colorant fluorescent
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intercalaire (fluorochrome) ou analogue pour quantifier un acide désoxyribonucléique cible. Cependant, la difficulté qu'il y a à rendre minimale la production d'un aérosol dans un processus d'extraction d'un acide nucléique d'un échantillon demeure. La demanderesse a fait des études intenses pour résoudre les problèmes exposés ci-dessus que soulèvent les procédés classiques d'extraction des acides nucléiques. Comme résultat, elle a trouvé un procédé nouveau d'extraction des acides ribonucléiques et désoxyribonucléiques, qu'il est facile de mettre en oeuvre, qui implique un petit nombre d'étapes, est capable de réduire le risque de la production d'un aérosol, peut être mis en oeuvre dans un bref laps de temps, n'utilise ni phénol ni chloroforme, tout en obtenant une efficacité constante lors de l'extraction des acides nucléiques. Sur la base de ce procédé d'extraction, la demanderesse a également mis au point un procédé dans lequel des séquences spécifiées d'acides nucléiques spécifiés peuvent être détectées d'une façon plus simple que les procédés de la technique antérieure tout en évitant le problème de la contamination par aérosol. Selon son premier aspect, la présente invention fournit un procédé pour extraire les acides nucléiques d'un échantillon les renfermant, qui comprend les étapes consistant à: (1) mélanger l'échantillon avec un support qui est au moins un élément choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose pour former un mélange liquide; (2) mélanger ledit mélange liquide avec un réactif C pour rendre insolubles les acides nucléiques et le support, ledit réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool npropylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-butylique et de l'alcool tert-amylique; et (3) séparer de la phase liquide les acides nucléiques et le support insolubilisés. Selon son second aspect, la présente invention fournit un procédé pour détecter une séquence spécifiée d'un acide nucléique, qui comprend les étapes consistant à: (1) mélanger un échantillon avec un support qui est au moins un élément choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose pour former un mélange liquide; (2) mélanger ce mélange liquide avec un réactif C pour rendre insolubles les acides nucléiques et le support, ce réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un
réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-
propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-
butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-
butylique et de l'alcool tert-amylique; (3) séparer de la phase liquide les acides nucléiques et le support insolubilisés; (4) convertir les acides nucléiques séparés en acides désoxyribonucléiques par une réaction de transcription inverse s'il s'agit d'acides ribonucléiques; (5) soumettre les acides nucléiques, soit séparés dans - l'étape (3) soit obtenus dans l'étape (4), à une réaction RCP dans une solution réactionnelle en chaîne polymérase qui contient une sonde d'oligonucléotide pour amplifier au moins une séquence spécifiée, un mélange mononucléotide triphosphate, une polymérase et un fluorochrome intercalaire; (6) mesurer le changement se produisant dans l'intensité de la fluorescence à la suite de la réaction RCP ou du changement ayant lieu dans l'intensité de la
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fluorescence de la solution réactionnelle pendant la réaction RCP; et (7) déterminer, sur la base du changement de l'intensité de la fluorescence, si un acide nucléique ayant la séquence spécifiée est présent dans l'échantillon. Selon son troisième aspect, la présente invention fournit un jeu de réactifs pour extraire des acides nucléiques qui contient au moins le support et le réactif C suivants, l'un étant maintenu séparé de l'autre: (1) au moins un support choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose; et 2) un réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un
réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-
propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-
butyrique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-
butylique et de l'alcool tert-amylique.
La présente invention sera bien comprise
lors de la description suivante, faite en liaison avec
les dessins ci-joints, dans lesquels: La figure 1 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B (VHB) extrait par le procédé de la présente invention est amplifié par RCP; voies 1 et 2, sérum riche en VHB; voies 3 et 4, sérum pauvre en VHB; et voie 5, sérum exempt de VHB; la bande a représente le produit de l'amplification RCP et la bande b un oligomère d'amorçage; La figure 2 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite C (VHC) extrait par le procédé de la présente invention est amplifié par RCP; voies 1 et 2, sérum riche en VHC; voies 3 et 4, sérum pauvre en VHC; et voie 5, sérum exempt de VHC; La figure 3 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B est extrait par le procédé de la présente invention en utilisant les différentes nuances de réactif C indiquées ci- dessous; et est amplifié par RCP; voies 1 et 2, (1) réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate de guanidinium; 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; voies 3 et 4, (2) réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate de potassium, 15 mM de citrate de sodium et 60-% d'alcool isopropylique; et voies 5 et 6, (3) réactif C contenant 3,2 M de chlorhydrate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; La figure 4 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B est extrait par le procédé de la présente invention en utilisant le réactif C décrit dans l'exemple 7 et est amplifié par RCP, avec les types suivants de réactif B utilisés dans
le réactif C: voies 1 et 2, (1) 60 % d'alcool n-
propylique; voies 3 et 4, (2) 60 % d'alcool
isopropylique; voies 5 et 6, (3) 50 % d'alcool n-
butylique; voies 7 et 8, (4) 60 % d'alcool n-butylique, voies 9 et 10, (5) 50 % d'alcool sec-butylique; et voies 11 et 12, (6) 60 % d'alcool sec-butylique; La figure 5 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide ribonucléique du virus de l'hépatite B est extrait par le procédé de la présente invention en utilisant le réactif C décrit dans l'exemple 8 et est amplifié par RCP, avec les types suivants de réactif B utilisés dans
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le réactif C: voies 1 et 2, (1) 50 % d'alcool tert-
amylique; voies 3 et 4, (2) 60 % d'alcool tert-
amylique; voies 5 et 6, (3) 60 % d'alcool tert-butylique et voies 7 et 8, (4) 60 % d'alcool isopropylique; La figure 6 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B est extrait par le procédé de la présente invention et est amplifié par RCP, avec du dextrane utilisé dans les quantités suivantes dans les tests respectifs: voies 1 et 2, O gg; voies 3 et 4, 2 pg; voies 5 et 6, 4 Jg; voies 7 et 8, 8 gg; voies 9 et 10, 16 gg; voies 11 et 12, 32 Fg; et voies 13 et 14, 64. g; La figure 7 est une photographie et son diagramme représentant les résultats d'une électrophorèse effectuée dans le cas o l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B est extrait comme dans l'exemple E en utilisant du dextrane ou de la carboxyméthyl cellulose comme support et est amplifié par RCP; voies 1 et 2, dextrane; et voies 3 et 4, carboxyméthyl cellulose; et La figure 8 représente deux graphiques indiquant les résultats d'une chromatographie sur liquide à haute performance effectuée dans l'exemple 12 sur la solution réactionnelle RCP avant l'extraction des acides nucléiques (figure 8a) et après l'extraction (figure 8b), avec le temps d'élution (en minutes) sur l'axe horizontal et l'absorbance relative sur l'axe - vertical. (La courbe A concerne le produit de l'amplification RCP; B indique l'oligomère d'amorçage, C
l'amorce, et D le désoxynucléotide triphosphate).
La présente invention concerne un procédé pour extraire des acides nucléiques tels qu'un acide ribonucléique et un acide désoxyribonucléique à simple brin ou à double brin. Des exemples d'acides désoxyribonucléiques qu'on peut extraire par le procédé implique non seulement l'acide désoxyribonucléique l 2710920 génomique mais aussi l'acide désoxyribonucléique du mitochondrion ou du chloroplast, et des exemples d'acides ribonucléiques qu'on peut extraire par le
procédé comprennent non seulement l'acide m-
ribonucléique mais aussi l'acide t-ribonucléique et r- ribonucléique. Des échantillons contenant des acides nucléiques sont donnés à titre d'exemples par des échantillons viables tels que des cellules de leucocyte, la culture de cellules hôtes contenant des vecteurs ou analogue qui sont généralement préparés par la technologie du gène recombiné, des cellules infectées par des virus ou des phages, des virus dans le sang, et la culture d'un microorganisme échantillon. La culture peut contenir des microorganismes mais son liquide surnageant seul conviendra. Non seulement, des cultures artificielles mais aussi des cultures naturelles sont applicables. Dans le cas des échantillons contenant des morceaux de microorganismes, l'homogénéisation ou la sonication peuvent être exécutées selon nécessité pour
obtenir un bon rendement de l'extraction.
Selon le premier aspect de la présente invention, les acides nucléiques peuvent être extraits des échantillons donnés à titre d'exemple cidessus; une autre application de la présente invention concerne une extraction à haut rendement des acides nucléiques amplifiés à partir d'une solution RCP qui ne contient pas d'enzymes ou de triphosphate de désoxynucléotide à faible masse moléculaire, des amorces, etc. Le procédé de la présente invention commence par le mélange d'un échantillon contenant des acides nucléiques avec un support. Le mélange avec le support aide à former une matière insoluble plus grosse par entrelacement des acides nucléiques et du support dans l'étape ultérieure d'insolubilisation des acides nucléiques et du support par addition du réactif C. Il en résulte que l'opération ultérieure consistant à séparer la matière insoluble peut être exécutée d'une manière simplifiée. Ainsi, l'utilisation du support
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contribue à une extraction d'une efficacité supérieure à
celle du cas o il n'y a pas de support.
Le support présente de l'affinité pour les acides nucléiques à extraire et est rendu insoluble lorsqu'il est mis en contact avec le réactif B dans le réactif C. Comme le support est extrait avec les acides nucléiques, il ne doit pas gêner l'utilisation spécifique des acides nucléiques extraits, par exemple une réaction avec une enzyme de restriction, une réaction de transcription inverse ou une réaction en chaîne polymérase (RCP). Le support à utiliser dans la présente invention est au moins un élément choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose. Ces supports s'avéreront d'une efficacité satisfaisante qu'ils soient utilisés seuls ou en mélanges. Comme autre avantage, ils ne gêneront pas la réaction de transcription inverse, la réaction RCP ou toute autre réaction désirée. Le glycogène et autres supports classiques seront- dégradés par l'amylase ou autres enzymes contenues dans l'échantillon s'il s'agit d'un sérum ou du sang, avec comme résultat la diminution de l'efficacité de l'extraction des acides nucléiques. Par opposition, le support à utiliser dans la présente invention ne sera pas dégradé, et par conséquent, il n'y aura aucune chute
de l'efficacité de l'extraction des acides nucléiques.
On utilise généralement le support dans une quantité d'environ O,O1 - 1000 gg, de préférence d'environ O,1 - 100 gg, par 10 l1 de l'échantillon. On peut placer le support dans un récipient avant de le charger avec l'échantillon. En variante, on peut placer l'échantillon dans le récipient avant de charger le support. Le support peut être rendu solide soit par
lyophilisation soit par séchage à l'air.
Dans l'étape suivante, le réactif C est ajouté au mélange liquide de l'échantillon et du support et les ingrédients sont mélangés afin de rendre insolubles le support et les acides nucléiques. Le
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réactif C contient au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-
propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-
butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-
butylique et de l'alcool tert-amylique.
Le réactif C peut contenir aussi d'autres réactifs tels que: un agent tampon approprié pour supprimer la dégradation des acides nucléiques; un agent de chélation capable de supprimer l'activité de nucléases (désoxyribonucléases), avec comme exemples le citrate de sodium et l'EDTA; un agent de réduction pour obtenir une dénaturation et une solubilisation plus efficaces des protéines, lipides, etc. avec comme exemples le dithiothréitol et le 9-mercaptoéthanol qui
réduisent les liaisons disulfure; et un agent tensio-
actifs tel que le sel de Sarkosyle ou le Triton pour obtenir une solubilisation plus efficace des protéines, etc. Un agent tampon approprié peut être ajouté afin d'ajuster le pH du réactif C dans la gamme 4 - 9, de préférence 5 - 8, de manière à éviter la dégradation des acides nucléiques, ce qui permet d'obtenir une nouvelle
amélioration de l'efficacité de leur extraction.
Dans le procédé d'extraction de la présente invention, au moins un composé choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium est utilisé comme réactif A. Ces composés rompent la membrane ou la paroi des cellules et dénaturent la protéine dans le complexe; ils sont également capables de solubiliser la protéine dénaturée qui se forme soit à la suite de la dénaturation de la protéine dans le complexe soit à cause du réactif B concomitant; en même temps, les composés peuvent supprimer l'activité de nucléases tels que la désoxyribonucléase et la ribonucléase qui peuvent se
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trouver dans l'échantillon. Le réactif A à utiliser dans la présente invention, soit seul soit en combinaison de deux ou plus, présente une grande aptitude à solubiliser les protéines sans provoquer des réactions d'interférence et, par conséquent, est capable d'exécuter une extraction extrêmement efficace des acides nucléiques. Des agents de dénaturation des protéines bien connus tels que l'iodure de sodium, l'iodure de potassium, le bromure de potassium, le bromure de sodium et l'urée ne sont pas efficaces dans la solubilisation des protéines, etc.; d'autre part, le sulfate de guanidinium, le carbonate de guanidinium, etc. provoqueront l'aggrégation des protéines, etc., et, par conséquent, ne sont pas capables de procéder à une
extraction très efficace des acides nucléiques.
Dans la présente invention, au moins un élément choisi dans le groupe constitué du n-propanol, de l'alcool isopropylique, de l'alcool nbutylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-butylique et de l'alcool tert-amylique est utilisé comme réactif B. Lorsqu'on emploie un mélange de deux alcools ou plus, le rapport préférable des alcools peut être déterminé par des expériences préliminaires. Le réactif B à utiliser dans la présente invention a une solubilité élevée dans l'eau et ne provoquera pas facilement la séparation des phases à partir de l'eau; par conséquent, l'emploi du réactif B offre l'avantage que l'opération de séparation des acides nucléiques et du support insolubilisés de la
phase aqueuse peut être effectuée d'une manière simple.
Cela signifie finalement que le pourcentage de la récupération des acides nucléiques insolubilisés lors de
l'étape finale du procédé peut être amélioré.
La concentration des réactifs A et B dans le réactif C peut être ajustée de façon que, lorsque le réactif C est ajouté à l'échantillon contenant le support, les protéines, les lipides, etc. restent solubilisés et les acides nucléiques et le support soient rendus insolubles. Les concentrations qui sont
2710920 particulièrement préférées dans le but d'améliorer l'efficacité de
l'extraction sont telles que la concentration finale du réactif alors qu'il est ajouté à l'échantillon est comprise entre 1,5 et 4,5M pour le réactif A et entre environ 40 et 80 % pour le réactif B. Par exemple, dans le cas o le réactif C contient du thiocyanate de guanidinium comme réactif A et de l'alcool isopropylique comme réactif B, les gammes des concentrations pour l'extraction des acides nucléiques avec une efficacité particulièrement élevée sont telles que la concentration finale du réactif A lors du mélange avec l'échantillon est comprise entre 2 et 3M alors que la concentration finale du réactif B lors du mélange avec l'échantillon est comprise entre 45 et 55 %. Si la concentration finale du thiocyanate de guanidinium est inférieure à 1,5M, les protéines, lipides, etc. qui sont contenus dans l'échantillon ne peuvent être totalement solubilisés. Dans le but d'augmenter la concentration finale du thiocyanate de guanidinium au-delà de 4,5M, la proportion du réactif A dans le réactif C doit être accrue et alors le réactif A est enclin à être insolubilisé, ce qui présente des difficultés pour réaliser une préparation appropriée de l'échantillon. Si la concentration finale de l'alcool isopropylique est inférieure à 40 %, le support et les acides nucléiques ne peuvent être rendus totalement insolubles. Si la concentration finale de l'alcool isopropylique dépasse 80 %, il est difficile d'assurer une concentration du thiocyanate de guanidinium qui est suffisante pour obtenir une solubilisation complète des protéines, lipides, etc., et en outre, l'évaporation de l'alcool isopropylique devient un problème. Par conséquent, on préfère aux fins de la présente invention utiliser des réactifs dans les gammes de concentration
indiquées ci-dessus.
Une quantité appropriée pour l'addition du réactif C est comprise entre 2 et 10 fois le volume de l'échantillon si ce dernier est un sérum. Cependant, si
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l'échantillon présente des concentrations élevées en protéines, lipides, etc., le réactif C est de préférence ajouté dans une quantité supérieure à 10 fois le volume de l'échantillon de manière à assurer une solubilisation complète des protéines, lipides, etc. Les étapes décrites ci-dessus rendent les acides nucléiques et le support insolubles dans l'échantillon; ensuite, les acides nucléiques et le support ainsi insolubilisés sont séparés de la phase aqueuse contenant des protéines, etc. en exécutant un mode opératoire de séparation classique tel que la centrifugation ou la filtration. Si on exécute la centrifugation, les acides nucléiques peuvent être récupérés sous forme de pastilles au fond du récipient; si on exécute une filtration, les acides nucléiques peuvent être récupérés sur la membrane de filtration. La membrane de filtration peut être d'un type ayant des
pores d'un diamètre d'environ O,1 - 10 gm.
Les acides nucléiques séparés peuvent être utilisés comme tels dans différents dosages et la technologie du gène recombiné, mais de préférence, ils sont lavés avant utilisation. Le pré-lavage est particulièrement efficace lors de l'exécution d'une réaction enzymatique (par exemple une réaction d'enzyme de restriction, une réaction de transcription inverse ou une RCP) sur les acides nucléiques séparés et dans tous les autres cas o le réactif A ou analogue qui est légèrement contenu dans le précipité peut potentiellement inhiber l'activité enzymatique qui est le moteur principal de la réaction. Pour donner un exemple spécifique, une solution contenant un sel et un alcool est ajoutée au précipité obtenu par centrifugation ou filtration et, après mélange, la préparation est soumise à une nouvelle centrifugation ou filtration. Par rapport au cas dans lequel le précipité est simplement lavé à l'eau distillée ou analogue, le lavage avec une solution contenant un sel/alcool présente l'avantage de contribuer à un enlèvement plus
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efficace des substances non désirées telles que le réactif A et les protéines résiduelles sur la surface des pastilles. Des exemples du sel qui peut être contenu dans la solution de lavage sont le chlorure de potassium, le chlorure de sodium, et l'acétate de sodium, qu'on peut utiliser dans des quantités d'environ 0,05 - 0,5 M; des alcools donnés à titre d'exemples comprennent l'éthanol (qui peut être contenu dans une quantité d'au moins 50 %, de préférence de 60 - 80 %), ainsi que l'alcool n-propylique et l'alcool isopropylique (qui peuvent être contenus dans une
quantité d'au moins 30 %, de préférence 40 - 60 %).
S'il y a un besoin particulier d'enlever les protéines résiduelles du précipité, on peut suivre le mode opératoire ci-après: tout d'abord, une solution contenant le réactif A tel que spécifié ici est de nouveau ajoutée au précipité de manière à solubiliser les protéines et, alors, une solution contenant le réactif B spécifié ici est ajoutée, le mélange étant soumis à une nouvelle centrifugation ou filtration. Il va sans dire que les étapes (2) et (3) du procédé de la
présente invention peuvent être simplement répétées.
Lors de l'extraction de très petites quantités d'acides nucléiques, la présente invention est de préférence mise en oeuvre avec l'échantillon maintenu à une basse température par un procédé approprié tel que l'exécution
de l'ensemble des opérations dans un local froid.
Selon le second aspect de la présente invention, on vérifie les acides nucléiques ainsi extraits de manière à voir s'ils contiennent une séquence spécifiée qu'on rencontre dans les acides nucléiques tels que ceux du virus de l'hépatite B ou du virus de l'hépatite C et qui peuvent être distingués des autres acides nucléiques, et la présente invention fournit un procédé de détection qui fait appel à une technique d'amplification de l'acide désoxyribonucléique qu'on appelle couramment "réaction RCP". On incorpore
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ici à titre de référence la divulgation du mémoire de la
publication des brevets européens n 487 218.
Selon le procédé en considération, dans le cas o les acides nucléiques séparés de la manière décrite ci-dessus et de préférence lavés avec des acides ribonucléiques, ils sont tout d'abord convertis en acides désoxyribonucléiques par réaction de transcription inverse. Par exemple, cela est le cas du virus de l'hépatite C, qui comporte un acide ribonucléique comme gène. Dans la présente invention, de façon à utiliser la réaction RCP pour l'amplification des acides ribonucléiques, l'acide ribonucléique est converti en acide ribonucléique amplifiable avant l'étape d'amplification qu'on décrit ci- dessous. Cette étape peut être exécutée par synthèse de l'acide désoxyribonucléique en conformité avec la réaction de transcription inverse ordinaire, l'acide ribonucléique
séparé étant utilisé comme matrice.
Lors de l'étape suivante, les acides nucléiques séparés ou les acides nucléiques obtenus par la réaction de transcription inverse lors de l'étape précédente sont soumis à une réaction RCP dans une solution de réaction à chaîne polymérase qui contient une sonde d'oligonucléotide, un mélange mononucléotide triphosphate, une polymérase et un fluorochrome intercalaire, sonde qui est au moins appropriée à l'amplification de la séquence spécifiée. La sonde d'oligonucléotide dans la solution de la réaction RCP est constituée d'un ou plusieurs oligonucléotides qui ont des longueurs de base appropriées, qui sont nécessaires à la production de fragments d'acide ribonucléique contenant la séquence spécifiée lors de la progression de la réaction RCP, et qui doivent être localisés aux extrémités 5' des fragments d'acide désoxyribonucléique pour être finalement produits. Une sonde d'oligonucléotide approprié peut être choisie en conformité avec la séquence spécifiée devant être détectée.
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Le fluorochrome intercalaire qui doit être utilisé dans la présente invention peut être donné à titre d'exemples par le bromure d'éthidium, l'acridine orange, le bisbentimide, le diaminophénylindole, l'actinomycine, le thiazole, la chromomycine et leurs dérivés. La réaction RCP elle-même a comme seul cycle l'étape opérationnelle dans laquelle, avec les parties des extrémités 3' de la séquence spécifiée et une séquence complémentaire d'hybridisation avec les amorces complémentaires respectives d'oligonucléotide, une réaction pour l'extension de l'extrémité 5' à l'extrémité 3' est effectuée au moyen d'une polymérase,
et dans laquelle le brin double résultant est dissocié.
Ce cycle peut être répété un nombre de fois approprié.
Le changement de l'intensité de la fluorescence est mesuré pour la solution réactionnelle RCP soit après soit pendant cette réaction. Comme le fluorochrome intercalaire subit un changement dans sa caractéristique de fluorescence à la suite de son incorporation dans l'acide désoxyribonucléique à brin double, l'intensité de la fluorescente dans sa variation entre le commencement et la fin de la réaction RCP ou pendant la réaction RCP est une indication du fait que l'acide ribonucléique ou l'acide désoxyribonucléique
séparé a la séquence spécifiée.
Lors de la mise en oeuvre du procédé de détection qu'on décrit ci-dessus, il n'est pas nécessaire de fournir des quantités supplémentaires de réactifs dès que la réaction RCP a démarré. Par conséquent, un récipient est dans la pratique tout d'abord chargé avec la solution réactionnelle RCP, puis avec les acides nucléiques extraits ou ceux qui ont été obtenus en soumettant lesdits acides nucléiques à une réaction de transcription inverse; ensuite, le récipient est fermé pour obtenir un état totalement hermétique, dans lequel les étapes de la réaction RCP et de la mesure de l'intensité de la fluorescence sont exécutées, d'o il résulte une nouvelle réduction de la
probabilité de la production d'un aérosol.
La présente invention fournit aussi un jeu de réactifs pour mettre en oeuvre le procédé d'extraction des acides nucléiques qu'on a décrit cidessus. Le support et le réactif C sont maintenus séparés l'un de l'autre jusqu'à utilisation et cela peut être obtenu, par exemple, en plaçant le support et le réactif C dans des conteneurs séparés, le premier étant
à l'état solide et le second à l'état liquide.
Le jeu de réactifs selon le troisième aspect de la présente invention peut en option contenir un tube réactionnel qui est en matériau plastique approprié et qui peut fournir un espace réactionnel disponible pour la mise en oeuvre du premier aspect de 1-a présente invention (procédé d'extraction des acides nucléiques) ou son second aspect (procédé de détection d'une séquence spécifiée d'acide nucléique). S'il est nécessaire non seulement d'extraire des acides nucléiques mais encore de détecter une séquence spécifié d'acide nucléique, le jeu de réactifs contient de préférence un tube réactionnel pouvant être scellé hermétiquement. L'avantage du jeu de réactifs est que, si le support est chargé au préalable dans le tube sous une forme appropriée telle qu'une poudre lyophilisée, il faut seulement ajouter un échantillon à essayer et ensuite le réactif C dans le tube pour démarrer le processus d'extraction des acides nucléiques et, si nécessaire, détecter une séquence spécifiée d'acide nucléique. On donne les exemples suivants dans le but d'illustrer encore la présente invention, mais ceux-ci
ne doivent être aucunement considérés comme limitatifs.
Exemple 1: Extraction à partir de cellules cultivées Des cellules d'hybridome de cellules de myélome de souris et des cellules de lymphocyte de souris sensibilisées à l'antigène embryonique du cancer
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sont cultivées dans un milieu DMEM. Lorsque le nombre de cellules CEL atteint 4 x 105 par ml de la solution de la culture, une portion de 100 J1 de la solution est prélevée pour être placée dans un tube d'échantillonnage ayant une capacité de 0,5 ml. Le tube est soumis à centrifugation à 7000 tours/minute pendant 1 minute et le liquide surnageant est enlevé. Le précipité est remis en suspension dans 20 Im d'un milieu DMED. A la suspension, on ajoute et mélange 1 pl (10 gg) de dextrane (masse moléculaire 5 x 105); ensuite, on ajoute pî du réactif C (2,4 M de thiocyanate de
guanidinium, 15 mM du citrate de sodium, 0,3 % de N-
lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) et le mélange est agité pendant environ 20 secondes, ce qu'on fait suivre d'une centrifugation à 15000 tours/minute pendant 2 minutes pour avoir les acides nucléiques extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est éliminé et 100 p1 d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés au précipité. A la suite de l'agitation pendant environ 20 secondes, le mélange est soumis à centrifugation à 15000 tours/minute pendant 1 minute et le liquide surnageant est enlevé, d'o il résulte que davantage d'acides nucléiques sont extraits dans le précipité. Le précipité est essayé par le procédé fluorimétrique de Kissane et Robins (J. Biol. Chem., 233, 184, 1958) pour déterminer la quantité d'acide désoxyribonucléique. Le précipité est également soumis à un traitement de cendrage et la détermination du phosphore est effectué (Anal. Chem. 28, 1756, 1956) pour mesurer la quantité totale des acides nucléiques (acide ribonucléique + acide désoxyribonucléique) dans le précipité. La quantité de l'acide ribonucléique est calculée en soustrayant la quantité de l'acide désoxyribonucléique de la quantité totale des acides nucléiques (acide ribonucléique + acide désoxyribonucléique).
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A titre de comparaison, des acides nucléiques sont extraits du même échantillon par le
procédé protéinase K/phénol et le procédé AGPC.
On exécute le procédé protéinase K/phénol en conformité avec le mode opératoire de Keller, G.H. et coll. (Anal. Biochem., 170, 441 - 450, 1988). Tout d'abord, 40 1I d'un réactif (150 mM de chlorure de sodium, 10 mM d'EDTA, 10 mM de Tris à un pH de 8, 2 % de SDS et 250 Jg/ml de protéinase K) sont ajoutés à 20 g1 d'une suspension de cellules dans un tube d'échantillonnage ayant une capacité de 0,5 ml et le mélange est agité pendant environ 20 secondes, ce qu'on
fait suivre d'une incubation à 50 C pendant 1 heure.
Lors de l'étape suivante, 60 1. d'une solution (phénol/chloroforme/al-cool isoamylique = 25-: 24: 1) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes, ce qu'on fait suivre d'une centrifugation de minutes à 15000 tours/minute. Une partie (40 g1) du liquide surnageant (phase aqueuse) est prélevée et 8 il d'acétate de potassium 4M sont ajoutés. En outre, 10 jg (1 i1) de glycogène et 50 il d'alcool isopropylique sont ajoutés, et le mélange est agité, ce qu'on fait suivre d'un refroidissement à -20 C pendant 30 minutes. Le liquide surnageant est enlevé et 100 il d'éthanol à 75 % sont ajoutés au précipité et le mélange est agité. A la suite d'une centrifugation de 20 minutes à 4 C, le liquide surnageant est enlevé, d'o il résulte que les
acides nucléiques sont extraits dans le précipité.
On exécute le procédé AGPC en conformité
- avec le mode opératoire de Chomczymski, P. et coll.
(Anal. Biochem., 162, 156 - 159, 1987). Tout d'abord, f1 d'un réactif (6 M de thiocyanate de guanidinium, 37,5 mM de citrate de sodium, 0,75 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 0,15M de 2-mercaptoéthanol) sont ajoutés à 20 p1 d'une suspension de cellules dans un tube d'échantillonnage ayant une capacité de 0,5 ml et le mélange est agité pendant environ 20 secondes. En outre, 6 g1 d'acétate de sodium 2 M (ph 4) sont ajoutés
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et le mélange est agité pendant environ 20 secondes.
Ensuite, 60 g1 de phénol saturé d'eau sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes. Lors de l'étape suivante 12 g1 d'une solution (chloroforme/alcool isoamylique = 49: 1) sont ajoutés
et le mélange est agité pendant environ 20 secondes.
Alors, le mélange liquide est refroidi dans de l'eau glacée pendant 15 minutes et soumis à centrifugation à 4 C pendant 20 minutes à 15000 tours/minute. Une partie (60.1) du liquide surnageant (phase aqueuse) est
extraite et 60 il d'alcool isopropylique sont ajoutés.
Le mélange est agité et refroidi à -20 C pendant 1 heure. Ensuite, le liquide surnageant est enlevé et 100 J1 d'éthanol à 75 % sont ajoutés au précipité, ce qu'on fait suivre d'une agitation. Lors de la dernière étape, le mélange est soumis à centrifugation à 4 C pendant 20 minutes, et le liquide surnageant est enlevé, d'o il résulte que les acides nucléiques sont extraits dans le précipité. On analyse les précipités obtenus dans les deux procédés classiques sont analysés par le même mode opératoire que celui décrit ci-dessus. On indique les résultats des analyses dans le tableau 1 ci-après. Il apparaît dans le tableau 1 que le procédé de la présente invention est supérieur aux deux procédés classiques en
termes d'efficacité de l'extraction.
Tableau 1
Procédé Acide Acide Acide désoxy-
désoxy- ribonu- ribonucléique
ribonu- cléique + acide ribo-
(<g) (.g) nucléique Invention 2,9 1,4 4,3 Procédé protéinase K /phénol 1,6 0,7 2,3 Procédé AGPC 0,2 1,0 1,2
I _________________________________________________________________
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Exemple 2: Extraction à partir de E. coli Du E. coli (JM 109) est cultivé dans un milieu L-Broth. Lorsque le nombre de cellules d'E. coli atteint 2 x 108 par ml de la solution de la culture, 1 ml de la solution est prélevé et mis dans un tube d'échantillonnage de 1,5 ml et soumis à centrifugation à 7000 tours/minute pendant 1 minute. Le liquide surnageant est enlevé et le précipité mis en suspension dans 50 J1 d'un milieu L-Broth. A la suspension, 2 g1 (20 gg) de dextrane (masse moléculaire 5 x 105) sont ajoutés et mélangés; ensuite, 250 J1 du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 0,3 % de N-lauroyl sacrosine de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes, ce qu'on fait suivre d'une centrifugation de 2 minutes à 15000 tours/minute pour avoir les acides nucléiques extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 250.1 d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés au précipité. A la suite de l'agitation pendant environ 20 secondes, le mélange est soumis à centrifugation à 15000 tours/minute pendant 1 minute et le liquide surnageant est enlevé, d'o il résulte que davantage d'acides nucléiques sont extraits dans le précipité. La quantité de l'acide désoxyribonucléique et la quantité totale des acides nucléiques (acide ribonucléique + acide désoxyribonucléique) sont mesurées comme dans l'exemple
1 et la quantité de l'acide ribonucléique est calculée.
Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 ci-après.
Tableau 2
Acide désoxyribo- Acide ribonu- Acide désoxyribonucléi-
nucléique cléique que + acide ribonucléi-
(<g) (<g) que 4, 4 36,6 41,0(g)
4,4 36,6 41,0
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Exemple 3: Extraction des acides désoxyribonucléiques du virus de l'hépatite B Du dextrane (1 g1, 10 gg) d'une masse moléculaire de 5 x 105 est placé dans des tubes d'échantillonnage, chacun ayant une capacité de 0,5 ml et 20 pl de sérum de patients souffrant de l'hépatite B
sont également placés dans les tubes respectifs.
Ensuite, 100 il du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes. Par une centrifugation de 2 minutes à 15000 tours/minute, les acides nucléiques sont extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est éliminé et 100 1 d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés, ce qu'on fait suivre d'une agitation pendant environ 20 secondes et d'une centrifugation d'une minute à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est éliminé pour avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le
précipité.
Au précipité, on ajoute 25 pl d'un réactif RCP (Takara Shuzo Co., Ltd.) et on effectue la RCP pendant 40 cycles en utilisant le dispositif de cyclage
thermique de l'acide désoxyribonucléique (Perkin-Elmer-
Cetus). Les conditions de la réaction RCP sont les suivantes (les amorces indiquées ci-dessous sont utilisées pour l'amplification spécifique des acides nucléiques dans le virus de l'hépatite B, VHB): Durée du cycle Dénaturation 94 C 1 mn Annelage 55 C 45 s Synthèse 72 C 1 mn Séquence de base des amorces
'-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3'
5'-CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC-3'
Après la réaction RCP, on soumet les acides nucléiques amplifiés à une électrophorèse et compare les densités optiques des bandes respectives par coloration
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avec du bromure d'éthidium. On indique les résultats en
figure 1.
Exemple 4: Extraction des acides ribonucléiques du virus de l'hépatite C Du dextrane (1.1, 10 gg) d'une masse moléculaire de 5 x 105 est placé dans des tubes d'échantillonnage, ayant chacun une capacité de 0,5 ml, et 20 g1 de sérum de patients souffrant de l'hépatite C
sont également placés dans les tubes respectifs.
Ensuite, 100 Rl du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes. Par une centrifugation de 2 minutes à 15000 tours/minute, les acides nucléiques sont extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 100 pl d'alcool isopropylique à 40 % contenant mM de chlorure de potassium sont ajoutés, ce qu'on fait suivre d'une agitation pendant environ 20 secondes et d'une centrifugation d'une minute -à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est enlevé pour avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le précipité. Au précipité, on ajoute 10 i1 d'un réactif pour transcription inverse (Takara Shuzo Co., Ltd.) et le solubilise. Ensuite une réaction pour transcription inverse est effectuée avec un dispositif de cyclage thermique (Perkin-Elmer- Cetus). Les conditions de la réaction sont les suivantes: Annelage 25 C 10 mn Synthèse 42 C 30 mn Inactivation
de la trans-
criptase inverse 99 C 5 mn Stockage 25 C Ensuite, 20 Fg d'un réactif RCP sont ajoutés à 5 I1 de la solution de la réaction de transcription inverse et une réaction RCP est exécutée pendant 40
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cycles en utilisant un dispositif de cyclage thermique (Perkin-ElmerCetus). Les conditions de la réaction RCP sont les suivantes (les amorces identifiées ci-dessous sont utilisées pour une amplification spécifique des acides nucléiques dans le virus de l'hépatite C, VHC): Durée du cycle Dénaturation 95 C 30 s Annelage 65 C 30 s Synthèse 72 C 1 mn Séquence de base des amorces
'-CTCCACCATAGATCACTCCCC-3'
'-GCACTCGCAAGCACCCTAT-3'
Après la réaction RCP, on soumet les acides nucléiques amplifiés à une électrophorèse et compare les densités optiques des bandes respectives par coloration avec du bromure d'éthidium. On indique les résultats en
figure 2.
Exemple 5: Extraction des acides ribonucléiques du virus de l'hépatite C Du dextrane (2 g1, 20 gg) d'une masse moléculaire de 5 x 105 est placé dans des tubes d'échantillonnage, ayant chacun une capacité de 1,5 ml, et 100 g1 de sérum provenant de patients souffrant de
l'hépatite C sont placés dans les tubes respectifs.
Ensuite, 500 g1 du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes. Par une centrifugation de 3 minutes à 15000 tours/minute, les acides nucléiques sont extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 200 Rl d'alcool isopropylique à 40 % contenant mM de chlorure de potassium sont ajoutés, ce qu'on fait suivre d'une agitation pendant environ 20 secondes et d'une centrifugation d'une minute à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est éliminé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits
dans le précipité.
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Au précipité, 20 j1 d'un réactif pour
transcription inverse sont ajoutés et solubilisés.
Ensuite une réaction pour transcription inverse est effectuée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4. Ultérieurement 40 1U d'un réactif RCP sont ajoutés à g1 de la solution de réaction de transcription inverse et la réaction RCP est effectuée dans les mêmes
conditions que dans l'exemple 4.
A titre de comparaison, les acides nucléiques sont extraits par le procédé à l'iodure de sodium (de Ishizawa, M et coll., Nucleic Acid Res. 19(20): 5792, 1991). Tout d'abord, 100 11 d'un sérum provenant de patients souffrant de l'hépatite C sont placés dans des tubes d'échantillonnage ayant chacun une capacité de 1,5 ml. Ensuite, 300 pl d'un réactif (6M de NaI, 13 mM d'EDTA, 0,5 % de N-lauroyl sarcosine de sodium, 10 fg de glycogène et du Tris-HCl à un pH de 8) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes, ce qu'on fait suivre d'un incubation de 15 minutes à 60 C. Ensuite, 400 pi d'alcool isopropylique sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20
secondes, ce qu'on fait suivre d'un repos de 15 minutes.
Alors, la solution est soumise à une centrifugation à 15000 tours/minute pendant 5 minutes et le liquide surnageant est enlevé. Lors de l'étape suivante, 1000 J1 d'alcool isopropylique à 40 % sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes, ce qu'on fait suivre d'une centrifugation de 5 minutes à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques dans le précipité. Le précipité est soumis à une réaction de transcription inverse et à une réaction RCP dans les mêmes conditions que dans le paragraphe précédent. A l'issue de la réaction RCP, 10 g1 de la solution réactionnelle sont essayés par chromatographie liquide de haute performance sur un appareil fabriqué par Tosoh Corp. La colonne est du gel TSK, G4000SW pour chromatographie à perméation de gel, et la détection des 2 9
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UV est effectuée à 260 nm avec UV 8000 (Tosoh Corp.) L'éluant est un tampon de phosphate de potassium (0,1 M, pH 6,8) et son débit est de 1 ml/mn. On indique les résultats de l'analyse dans le tableau 3. Selon le procédé de la présente invention, le produit de l'amplification par RCP est détecté suivant une quantité moyenne de 26 ng par 10 p1 de la solution réactionnelle RCP; d'autre part, seuls 3 ng du produit de l'amplification peuvent être détectés par le procédé à
l'iodure de sodium.
Tableau 3
Produit de l'amplification RC (ng) Moyenne Invention 25 26 Procédé à l'iodure de sodium 3 3
2
Exemple 6: Extraction des acides désoxyribonucléiques du virus de l'hépatite B Du dextrane (1 Rl, 10 gg) de masse moléculaire 5 x 105 est placé dans une multitude de tubes d'échantillonnage, chacun ayant une capacité de 0,5 ml, et 20 t1 de sérum provenant de patients souffrant de l'hépatite B sont également placés dans les tubes respectifs. Diverses nuances de réactif C (voir ci-dessous) sont ajoutées aux échantillons etmélangées: (1) 100 p1 du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; (2) 100 g1 du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; et (3) 100 g1 du réactif C contenant 3,2 M de chlorhydrate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 %
d'alcool isopropylique.
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Après l'addition de ces nuances du réactif C et mélange, la centrifugation est effectuée à 15000 tours/minute pendant 2 minutes de façon que les acides nucléiques soient extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 100 g1 d'isopropanol à 40 %
contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés.
A la suite d'une agitation d'environ 20 secondes, le mélange est soumis à centrifugation à 15000 tours/minute pendant 1 minute et le liquide surnageant est éliminé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le précipité. Les acides nucléiques ainsi extraits sont soumis à une réaction RCP dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. A l'issue de la réaction, une électrophorèse est effectuée pour comparer les densités optiques des bandes respectives produites. On indique les résultats dans le tableau 3. Il est évident que les solutions contenant les nuances (1) - (3) du réactif C
donnent des bandes ayant des densités comparables.
Exemple 7: Extraction des acides désoxyriborrucléiques du virus de l'hépatite B Du dextrane (1 il, 10 Fg) de masse moléculaire 5 x 105 est placé dans une multitude de tubes d'échantillonnage, chacun ayant une capacité de 0,5 ml, et 20 g1 de sérum provenant de patients souffrant de l'hépatite B sont également placés dans les tubes respectifs. Diverses nuances du réactif C (voir ci-dessous) sont ajoutées aux échantillons et mélangées: (1) 100 J1 du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool n-propylique; (2) 100 g1 du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; (3) 80 p1 du réactif C contenant 3 M de thiocyanate de
guanidinium, 19 mM de citrate de sodium, 75 mM de 2-
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mercaptoéthanol, 0,38 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 50 % d'alcool n-butylique; (4) 100 pl du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool n-butylique; (5) 80 il du réactif C contenant 3 M de thiocyanate de
guanidinium, 19 mM de citrate de sodium, 75 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,38 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 50 % d'alcool sec-butylique; et (6) 100 Rl du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium
et 60 % d'alcool sec-butylique.
Après l'addition de ces nuances du réactif C et mélange, la centrifugation est effectuée à 15000 tours/minute pendant 2 minutes de façon que les acides nucléiques soient extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 100 Rl d'isopropanol à 40 %
contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés.
A la suite d'une agitation d'environ 20 secondes, le mélange est soumis à centrifugation à 15000 tours/minute pendant 1 minute et le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le précipité. Les acides nucléiques ainsi extraits sont soumis à une réaction RCP dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. A l'issue de la réaction, une électrophorèse est effectuée pour comparer les densités optiques des bandes respectives. On indique les résultats dans la figure 4. Il est évident que les solutions contenant les nuances (1) - (6) du réactif C
donnent des bandes ayant des densités comparables.
* Exemple 8: Extraction des acides désoxyribonucléiques du virus de l'hépatite B Du dextrane (1 pl, 10 gg) de masse moléculaire 5 x 105 est placé dans une multitude de tubes d'échantillonnage, chacun ayant une capacité de 0,5 ml, et 20 J1 de sérum provenant de patients
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souffrant de l'hépatite B sont également placés dans les tubes respectifs. Diverses nuances du réactif C (voir ci-dessous) sont ajoutées aux échantillons et mélangées: (1) 80 pl du réactif C contenant 3 M de thiocyanate de guanidinium, 19 mM de citrate de sodium, 75 mM de 2mercaptoéthanol, 0,38 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 50 % d'alcool tert-amylique; (2) 100 pl du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool tert-amylique; (3) 100 pl du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool tert-butylique; et (4) 100 pl du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de 2-
mercaptoéthanol, 0,3 % de N-lauroyl sarcosine de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; Après l'addition de ces nuances du réactif C et mélange, une centrifugation est effectuée à 15000 tours/minute pendant 2 minutes de façon que les acides nucléiques soient extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 100 g1 d'isopropanol à 40 %
contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés.
A la suite d'une agitation d'environ 20 secondes, le mélange est soumis à centrifugation à 15000 tours/minute pendant 1 minute et le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le précipité. Les acides nucléiques ainsi extraits sont soumis à une réaction RCP dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. A l'issue de la réaction, une électrophorèse est effectuée pour comparer les densités optiques des bandes respectives. On indique les résultats en figure 5. Il est évident que les solutions contenant les nuances testées du réactif C donnent des
bandes ayant des densités comparables.
Exemple 9: Extraction des acides ribonucléiques du virus de l'hépatite C Des tubes d'échantillonnage ayant chacun une capacité de 1,5 ml sont chargés avec 0, 0,5, 1, 2 et 5 l1 (O, 5, 10, 20 et 50 gg) d'une solution d'acrylamide (masse moléculaire d'environ 7 x 105) ou avec 2 g1 (20
lg) de dextrane ayant une masse moléculaire de 5 x 105.
Les tubes sont en outre chargés avec 100 pl de sérum provenant de patients souffrant de l'hépatite C, et les mélanges sont agités pendant environ 5 secondes. Alors, 500 1 du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés. A la suite de l'agitation pendant environ 20 secondes, une centrifugation de 3 minutes est effectuée à 15000 tours/minute de façon que
les acides nucléiques soient extraits dans le précipité.
Le liquide surnageant est enlevé et 200 pl d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés au précipité. A la suite d'une agitation d'environ 20 secondes, une centrifugation de 3 minutes est exécutée à 15000 tours/minute et le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage
d'acides nucléiques extraits dans le précipité.
Au précipité, 20 g1 d'un réactif pour transcription inverse sont ajoutés et solubilisés. La solution est soumise à une réaction pour transcription
inverse dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4.
Ensuite, 40 il d'un réactif RCP sont ajoutés à 10 il de la solution réactionnelle (pour transcription inverse) - et la réaction RCP est exécutée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 4. A l'issue de la réaction RCP, 10 il de la solution réactionnelle sont soumis à un dosage par chromatographie liquide à haute performance sur un appareil fabriqué par Tosoh Corp. comme dans l'exemple 5. On indique les résultats de
l'analyse dans le tableau 4 ci-après.
3 4
Tableau 4
Quantité d'acrylamide Produit de l'amplification (Ig)f RCP (ng)
0 O
26
33,5
35
35
Quantité de dextrane (ag)
44
En l'absence d'acrylamide qui est un coprécipitant des acides nucléiques, l'acide ribonucléique du virus de l'hépatite C n'est pas extrait et, par conséquent, le produit de l'amplification RCP ne peut être détecté. Lorsque l'acrylamide est ajouté dans des quantités de 20 gg et plus, le produit de l'amplification RCP est détecté suivant une quantité d'environ 35 ng. Lorsque 20 ig de dextrane sont ajoutés, le produit de l'amplification RCP est détecté suivant
une quantité d'environ 44 ng.
Exemple 10: Extraction de l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B Les acides nucléiques sont extraits et soumis à RCP comme dans l'exemple 4, sauf que du dextrane (masse moléculaire = 5 x 105) est ajouté dans les quantités variables de 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 et 6,4 p1 (O, 2, 4, 8, 16, 32 et 64 fg). A l'issue de la réaction RCP, une électrophorèse est effectuée et les densités optiques des bandes sont comparées par coloration au bromure d'éthidium. On indique les résultats en figure 6. Il est évident qu'en l'absence de dextrane qui est un coprécipitant des acides nucléiques, l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B n'est pas extrait, et par conséquent, aucune bande n'est détectée. Lorsque du dextrane est ajouté suivant des
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quantités de 16 gg ou plus, les densités des bandes sont
presque comparables les unes aux autres.
Exemple 11: Extraction de l'acide désoxyribonucléique du virus de l'hépatite B Les acides nucléiques sont extraits et soumis à une réaction RCP comme dans l'exemple 3, sauf que le dextrane est remplacé par la carboxyméthyl cellulose (produit de SIGMA; faible viscosité) et que
celle-ci est utilisée dans une quantité de 1 pl (10 gg).
A l'issue de la réaction RCP, une électrophorèse est effectuée et les densités optiques des bandes sont comparées par coloration au bromure d'éthidium. On indique les résultats en figure 7. Il est évident que les densités des bandes sont presque comparables lorsque le dextrane et la carboxyméthyl cellulose sont utilisés comme supports (à titre de référence, on indique aussi en figure 7 le résultat de l'extraction en utilisant du dextrane). Exemple 12: Application au produit de la réaction RCP Des tubes d'échantillonnage ayant chacun une capacité de 1,5 ml sont chargés avec 2 R1 (20 Jg) d'une solution de dextrane (masse moléculaire 5 x 105). Les tubes sont en outre chargés avec 200 ml d'une solution réactionnelle RCP-VHB et avec 80 g1 d'eau, qu'on mélange alors. Ensuite 500 g1 du réactif C (2,4 M de thiocyanate
de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 60 mM de p-
mercaptoéthanol et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés. A la suite d'une agitation d'environ 20 secondes, une centrifugation de 3 minutes est effectuée à 15000 tours/minute de façon que les acides nucléiques soient extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 100 g1 d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés au précipité. A la suite d'une agitation d'environ 20 secondes, une centrifugation de 3 minutes est exécutée à 15000 tours/minute et le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le précipité. De l'eau (20 Al) est ajoutée
au précipité pour sa solubilisation.
On analyse la solution réactionnelle RCP (10 il) avant ainsi qu'après l'extraction des acides nucléiques par chromatographie liquide de haute performance comme dans l'exemple 5 sur un appareil fabriqué par Tosoh Corp. La colonne est du gel TSK,
G3000SW pour chromatographie à perméation de gel.
On indique les résultats en figure 8, dans laquelle on peut voir que le produit de l'amplification RCP et l'oligomère d'amorçage sont récupérés dans des rendements d'environ 100 %. Il est également clair que l'amorce et le triphosphate de désoxynucléotide ont été enlevés. Exemple 13: Réaction RCP en utilisant des acides nucléiques extraits Du dextrane (2 pl, 20 Fg) de masse moléculaire de 5 x 105 est placé dans des tubes d'échantillonnage, ayant chacun une capacité de 1,5 ml, et 100 g1 d'un sérum provenant de patients souffrant de l'hépatite B sont également placés dans les tubes respectifs. Alors, 500 pl du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés et le mélange est agité pendant environ 20 secondes. Par une centrifugation de 3 minutes à 15000 tours/minute, les acides nucléiques sont extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 200 g1 d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés, ce qu'on fait suivre d'une agitation d'environ 20 secondes et d'une centrifugation d'une minute à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits dans le précipité. Au précipité, 50 g1 d'un réactif RCP sont ajoutés et une réaction RCP est effectuée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3.
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A titre de comparaison, les acides nucléiques sont extraits par le procédé à l'iodure de sodium (de Ishizawa, M et coll., Nucleic Acid Res. 19(20): 5792, 1991) comme dans l'exemple 5 et la réaction RCP est exécutée dans les mêmes conditions que celles venant juste d'être décrites. A l'issue de la réaction RCP, 10 g1 de la solution réactionnelle sont essayés par chromatographie liquide à haute performance sur un appareil fabriqué par Tosoh Corp. comme dans
l'exemple 5.
Les résultats de l'analyse sont indiqués dans le tableau 5. Selon le procédé de la présente invention, le produit de l'amplification RCP est détecté dans une quantité moyenne de 7,5 ng par 10 pl de la solution réactionnelle RCP; d'autre part, seuls 4,3 ng du produit d'amplification peuvent être détectés par le procédé à l'iodure de sodium. Les résultats du tableau 5
représentent une moyenne de 4 échantillons.
Tableau 5
Produit de l'amplification RCP (ng) Invention 7.5 Procédé à l'iodure de sodium 4.3
Exemple 14
Des tubes d'échantillonnage ayant chacun une capacité de 1,5 ml sont chargés avec divers supports: (1) dextrane 2 g1 (masse moléculaire 5 x 105; 20 Lg); (2) dextrane 1 g1 (masse moléculaire 5 x 105; 10 fg); et acrylamide 1 pl (masse moléculaire 7 x 105; 10 pg); (3) acrylamide 1.1 (masse moléculaire 7 x 105; 10 Fg) et carboxyméthyl cellulose 1 g1 (10 gg; produit de SIGMA;
faible viscosité).
Les tubes sont en outre chargés avec 100 g1 du sérum de patients souffrant d'hépatite B. Alors, 500 J1 du réactif C (2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique) sont ajoutés, et les mélanges sont agités pendant
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environ 20 secondes. Par une centrifugation de 3 minutes à 15000 tours/minute, les acides nucléiques sont extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 200 g1 d'alcool isopropylique à 40 % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés, ce qu'on fait suivre d'une agitation pendant environ 20 secondes et d'une centrifugation d'une minute à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est éliminé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits
dans le précipité.
Au précipité, 50 g1 d'un réactif RCP sont ajoutés et la réaction RCP est exécutée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. A l'issue de la réaction RCP, la solution réactionnelle est essayée par chromatographie sur liquide de haute performance avec un appareil fabriqué par Tosoh Corp. comme dans l'exemple 5. On indique les résultats de l'analyse dans le tableau 6 ci-après. Il est évident qu'un support simple et un mélange de supports donnent des bandes ayant des densités comparables. Les résultats du tableau 6
représentent une moyenne de 4 échantillons.
Tableau 6
Support Produit de l'amplifica _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ tion RCP (ng) Dextrane 37 Dextrane et Acrylamide 33 Acrylamide et carboxyméthyl cellulose 37 Exemple 15 Des tubes d'échantillonnage ayant chacun une capacité de 0,5 ml sont chargés avec 2 g1 (20 gg) d'une solution de dextrane (masse moléculaire 5 x 105). Les tubes sont en outre chargés avec 100 g1 de sérum provenant de patients souffrant de l'hépatite B. Diverses nuances du réactif C (voir ci-dessous) sont ajoutées aux échantillons et mélangées:
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(1) 500 J1 du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium et 60 % d'alcool isopropylique; (2) 500 pl du réactif C contenant 2,4 M de thiocyanate de guanidinium, 15 mM de citrate de sodium, 30 %
d'alcool isopropylique et 30 % d'alcool tert-butylique.
Après l'addition de ces nuances du réactif C et mélange, une centrifugation est effectuée à 15000 tours/minute pendant 3 minutes de façon que les acides nucléiques soient extraits dans le précipité. Le liquide surnageant est enlevé et 200 g1 d'alcool isopropylique à % contenant 200 mM de chlorure de potassium sont ajoutés, ce qu'on fait suivre d'une agitation d'environ secondes et d'une centrifugation d'une minute à 15000 tours/minute. Le liquide surnageant est enlevé de manière à avoir davantage d'acides nucléiques extraits
dans le précipité.
Au précipité, on ajoute 50 g1 d'un réactif RCP et on exécute la réaction RCP dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. A l'issue de la réaction RCP, la solution réactionnelle est essayée par chromatographie sur liquide de haute performance dans un appareil fabriqué par Tosoh Corp. comme dans l'exemple 5. On indique les résultats de l'analyse dans le tableau 7 ci-après. Lorsque le réactif C ne contient que de l'alcool isopropylique, le produit de l'amplification RCP est détecté suivant une quantité moyenne de 42 ng par 10 g1 de la solution de la réaction RCP. Lorsque le réactif C contient de l'alcool isopropylique et de l'alcool tert- butylique, le produit de l'amplification RCP est détecté suivant une quantité moyenne de 33 ng par 10 J1 de la solution de la réaction RCP. Les données
du tableau 7 représentent une moyenne de 2 échantillons.
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Tableau 7
Alcool contenu dans Produit de l'amplification le réactif C RCP (na) Alcool isopropylique 42 Alcool isopropylique et alcool tert-butylique 33 La présente invention offre les avantages suivants. Au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-butylique et de l'alcool tert-isoamylique, sont tout d'abord mélangés au préalable pour préparer un réactif C et cela aide à réduire la quantité dans laquelle ces réactifs doivent être utilisés. Prenons, par exemple, le cas o un échantillon de 10 gl est préparé de façon à contenir un agent dénaturant les protéines et de l'isopropanol dans les concentrations finales respectives de 2 M est d'environ 50 %. Dans le procédé au guanidinium, il faut généralement qu'une solution de guanidinium 6 M soit ajoutée suivant une quantité de 20 gl et alors environ % d'isopropanol suivant une quantité de 30 Al. Par opposition, le procédé de la présente invention nécessite seulement l'addition de 20 1l d'un agent extrayant les acides nucléiques qui est constitué d'environ 75 % d'isopropanol contenant 3 M de thiocyanate de guanidinium. Dans le procédé au guanidinium, une solution de 60 gl apparaîtra finalement qui contient l'échantillon, 2 M de thiocyanate de guanidinium et environ 50 % d'isopropanol, alors que seuls 30 gl d'une solution ayant la même concentration apparaîtront dans la présente invention. Par conséquent, la quantité du déchet liquide qui doit être traité après
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l'opération d'extraction peut être réduite à l'avenant.
De plus, le procédé de la présente invention n'a pas à utiliser de substances toxiques ou néfastes telles que le chloroforme ou le phénol, et par conséquent, il peut être exécuté d'une façon assez simple par rapport à la
technique antérieure.
Selon le premier aspect de la présente invention, les acides nucléiques extraits peuvent être obtenus dans le précipité et, par rapport à la technique antérieure qui dépend de la différence de la solubilité d'un acide nucléique dans deux liquides non miscibles et dans lesquels la phase liquide ayant l'acide nucléique présentant de l'intérêt qui y est dissous doit être séparée de l'autre phase liquide de manière à extraire l'acide nucléique, la présente invention peut être mise en oeuvre par des étapes opérationnelles extrêmement simples. Par conséquent, aucune technicité importante n'est nécessaire dans la pratique de la présente invention et les acides nucléiques désirés peuvent être
extraits avec une efficacité constamment élevée.
Comme autre avantage, la présente invention permet au réactif A d'être contenu à une concentration plus faible dans le réactif C devant être ajouté à l'échantillon et cela permet d'éviter le dépôt du réactif A. De plus, la concentration du réactif B peut être également abaissée suivant un degré suffisant pour éviter son évaporation. Par conséquent, le procédé de la présente invention se prête à sa mécanisation. Si les réactifs A et B sont utilisés seuls, il est généralement difficile d'améliorer la précision de leur addition en petites portions; cependant, on peut attendre du réactif pour l'extraction des acides nucléiques selon la présente invention qu'il soit ajouté avec une précision
plus grande.
En conformité avec le premier aspect de la présente invention, le support ainsi que le réactif C contenant les réactifs A et B sont utilisés et, en dehors des avantages venant d'être exposés, l'invention
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permet d'obtenir un rendement plus élevé de l'extraction des acides nucléiques que dans les procédés de la
technique antérieure.
Selon son second aspect, la présente invention fournit un procédé pour détecter une séquence spécifiée d'acide nucléique, qui permet l'exécution d'une réaction RCP et de mesurer l'intensité de la fluorescente à l'intérieur d'un récipient fermé. Par conséquent, par rapport aux procédés classiques qui amplifient simplement les acides nucléiques par le mode opératoire RCP et qui détectent les acides nucléiques amplifiés, le procédé de détection du second aspect de la présente invention implique un mode opératoire simple et peut également réduire la probabilité de la
production d'un aérosol.
La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de
variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art.
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Claims (4)

REVENDICATIONS
1 - Procédé pour extraire des acides nucléiques d'un échantillon, comprenant les étapes consistant à: (1) mélanger l'échantillon avec un support qui est au moins un élément choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose afin de former un mélange liquide; (2) mélanger ce mélange liquide avec un réactif C afin de rendre insolubles les acides nucléiques et le support, ce réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-butylique et de l'alcool tert-amylique; et (3) séparer de la phase liquide les acides nucléiques et
le support insolubilisés.
2 - Procédé pour détecter une séquence spécifiée d'un acide nucléique, qui comprend les étapes consistant à: (1) mélanger un échantillon avec un support qui est au moins un élément choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose afin de former un mélange liquide; (2) mélanger ce mélange liquide avec un réactif C afin de rendre insolubles les acides nucléiques et le support, ce réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n- butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-butylique et de l'alcool tert-amylique;
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(3) séparer de la phase liquide les acides nucléiques et le support insolubilisés; (4) convertir les acides nucléiques séparés en acide désoxyribonucléique par une réaction de transcription inverse s'il s'agit d'acides ribonucléiques; (5) soumettre les acides nucléiques, soit séparés dans l'étape (3) soit obtenus dans l'étape (4), à une réaction à chaîne polymérase (RCP) qui contient une sonde d'oligonucléotide permettant d'amplifier au moins une séquence spécifiée, un mélange mononucléotide triphosphate, une polymérase et un fluorochrome intercalaire; (6) mesurer le changement se produisant dans l'intensité de la fluorescence à la suite de la réaction RCP ou le changement ayant lieu dans l'intensité de la fluorescence de la solution réactionnelle pendant la réaction RCP; et (7) déterminer, sur la base du changement de l'intensité de la fluorescence, si un acide nucléique -ayant la
séquence spécifiée est présent dans l'échantillon.
3 - Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la réaction RCP et la mesure du changement de l'intensité de la fluorescence sont exécutées dans un récipient fermé qui contient les acides nucléiques extraits et la solution réactionnelle
RCP à l'état hermétique.
4 - Jeu de réactifs pour extraire des acides nucléiques qui contient au moins le support suivant et un réactif C, ceux-ci étant séparés l'un de l'autre: (1) au moins un support choisi dans le groupe constitué du dextrane, de l'acrylamide et de la carboxyméthyl cellulose; et 2) un réactif C contenant au moins un réactif A choisi dans le groupe constitué du thiocyanate de guanidinium, du chlorhydrate de guanidinium, du thiocyanate de potassium et du thiocyanate de sodium et au moins un
réactif B choisi dans le groupe constitué de l'alcool n-
propylique, de l'alcool isopropylique, de l'alcool n-
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butylique, de l'alcool sec-butylique, de l'alcool tert-
butylique et de l'alcool tert-amylique.
FR9311797A 1993-09-28 1993-10-04 Procédé pour extraire des acides nucléiques et procédé pour détecter des séquences spécifiées d'acides nucléiques. Expired - Fee Related FR2710920B1 (fr)

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