CN105012963B - 一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶2‑3％、聚乙烯吡咯烷酮K‑301‑2％、海藻糖0‑4％、蔗糖2‑5％、甘露醇0.1‑0.5％、黄芪多糖0‑0.5％、甘氨酸1‑1.5％、精氨酸0‑1％、牛血清白蛋白0‑1％，余量为注射用水。本发明还提供该重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。本发明的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，具有能够延长疫苗在较高温度环境下的保存时间，此外其制备方法简单，便于生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗助剂领域，具体涉及一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法。
背景技术
重组伪狂犬病毒，如保藏在中国典型培养物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408的重组伪狂犬病毒，用于制备猪伪狂犬病防治用的疫苗；现有的疫苗中，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中活疫苗占相当大的比例。将活疫苗进行冻干保存，为疫苗的运输、保存和使用提供了很多的方便。目前，现有的活疫苗耐热冻干保护剂，如常用的猪用冻干活疫苗耐热保护剂，其主要成分为脱脂牛奶、蔗糖和明胶。虽然上述组方简单，成本较低，但其保护性能差，保存时间较短，在2℃-8℃条件下，保存期只有3-6个月，且多需要在-15℃以下保存，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够在较高温度和较长时间保存重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，本发明还提供该耐热冻干保护剂的制备方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶2-3％、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-2％、海藻糖0-4％、蔗糖2-5％、甘露醇0.1-0.5％、黄芪多糖0-0.5％、甘氨酸1-1.5％、精氨酸0-1％、牛血清白蛋白0-1％，余量为注射用水。
本发明中，优选的方案为所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶2.5％、聚乙烯吡咯烷酮K-30 2％、海藻糖4％、蔗糖2％、甘露醇0.1％、黄芪多糖0.5％、甘氨酸1.5％、精氨酸1％、牛血清白蛋白1％，余量为注射用水。
本发明中，优选的方案为所述重组伪狂犬病病毒疫苗保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC-V201408。
本发明还提供该重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其包括如下步骤：
a.取明胶、聚乙烯吡咯烷酮K-30、海藻糖、蔗糖、甘露醇和黄芪多糖，然后溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的3/5-4/5，然后在110-120℃的温度下进行灭菌处理10-20min，得到溶液A；
b.取配方量的甘氨酸、精氨酸和牛血清白蛋白，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.18-0.24μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B混合，即得产品。
本发明中，优选的方案为所述a步骤中，在115℃的温度下进行灭菌处理15min。
本发明中，优选的方案为所述b步骤中，滤膜孔径为0.22μm。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的耐热冻干保护剂中，在冻干过程中聚乙烯吡咯烷酮K-30能够对病毒起到很好的保护作用，同时又是很好的填充剂，对生物制品(即疫苗)起到很强的支撑作用；海藻糖能形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，这一功能在蔗糖、葡萄糖等其他糖类均不具备；甘氨酸则是一种很好的赋形剂；甘露醇可以提高疫苗产品的坍塌温度，结合其余的组分一起，使得应用本发明冻干保护剂的疫苗不仅外观良好，且病毒的损失率低，耐老化程度高，能够使得疫苗能够在较高温度和较长时间保存。
下面结合具体实施方式及附图对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为冻干保护剂配方的冻干曲线图；
图2为用ELISA方法检测的免疫猪体内的PRV gB抗体平均值数据图；
图3为用ELISA方法检测的免疫猪体内的PCV2抗体平均值数据图；
其中，20120701，20120702，20120703分别为根据实验例2.3.1PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的试制的方法制得的3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的批号。
具体实施方式
一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶2-3％、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1-2％、海藻糖0-4％、蔗糖2-5％、甘露醇0.1-0.5％、黄芪多糖0-0.5％、甘氨酸1-1.5％、精氨酸0-1％、牛血清白蛋白0-1％，余量为注射用水。
本发明的具体实施方式中的，所用到的蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇、甘氨酸、精氨酸，均购自Amresco公司；所用到的明胶、黄芪多糖均由新兴化药分公司提供。
本发明实施例中的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其包括如下步骤：
a.取明胶、聚乙烯吡咯烷酮K-30、海藻糖、蔗糖、甘露醇和黄芪多糖，然后溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的4/5，然后在115℃的温度下进行灭菌处理15min，得到溶液A；
b.取配方量的甘氨酸、精氨酸和牛血清白蛋白，溶于剩余部分(即占注射用水总量的1/5)的注射用水中，然后用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B混合，即得产品。
实施例1-5、对比例1-3
本发明的实施例1-5、对比例1-3的耐热冻干保护剂，具体的配方组成详见下表1(配方表中的数字代表质量百分数)，
表1：实施例、对比例的耐热冻干保护剂配方表
实验例
对本发明的实施例、对比例制得的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，对其性能进行测试；
1.1材料
1.1.1病毒和细胞
重组病毒rPRV-ORF2为发明人自主构建与保存，该重组病毒保藏在中国典型培养物培养中心、保藏号为：CCTCC-V201408；该重组病毒可有效表达PCV2的ORF2基因，可用于制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。ST细胞购自中国兽药监察所。
1.1.2血清、培养基和胰蛋白酶类试剂
胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，胰蛋白酶为Sigma公司产品。氯化钠、氯化钾、葡萄糖、NaHCO3、EDTA为分析纯试剂。
1.1.3试验动物与抗体检测试剂盒
35日龄PRV抗体阴性、PCV2抗体阴性断奶仔猪购自新兴某猪场，PRV gB抗体检测试剂盒为IDEXX公司产品，PCV2抗体检测试剂盒为武汉科前公司产品。
1.2方法
1.2.1制苗用毒液的制备与毒价测定
选用生长良好单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0.2‰重组病毒rPRV-ORF2病毒液，37℃吸附1h后，加入适量细胞维持液(2％FBS的DMEM)，37℃继续培养，当全部细胞出现CPE时，冻融收获病毒，置-80℃以下保存备用。按Reed-Muench两氏法测定与计算病毒滴度TCID50。
1.2.2耐热保护剂配方的确定
取实施例1-5、对比例1-3的耐热冻干保护剂。将各配方保护剂分别与rPRV-ORF2病毒悬液以1∶1混合配苗分装，2mL/瓶，按照设计的冻干曲线进行冻干试验，冻干后测定毒价，筛选出最佳的耐热保护剂配方，确定为生产条件。产品在-80℃预冻过夜后，转入CHRIST公司的ALPHA1-4冻干机的冻干箱内，探索主干燥时的真空度及干燥时间以确定最佳的冻干曲线。
1.2.3 PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的生产
按1.2.2筛选出的最佳保护剂配方配制保护剂，与rPRV-ORF2病毒悬液配苗，生产3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗。
1.2.4疫苗的安全性检验与毒价测定
疫苗的安全性检验：每批疫苗注射35日龄PRV抗体与PCV2抗体阴性的健康断奶仔猪5头，颈部肌肉注射10头份/头，连续观察局部及全身性不良反应21日。
疫苗的毒价测定：以ST细胞按Reed-Muench两氏法测定与计算疫苗滴度TCID50。
1.2.5疫苗的耐老化试验
每批随机抽取疫苗5瓶，在37℃存放7d后测定其TCID50，并观察物理性状，判断疫苗的热稳定性。
1.2.6疫苗保存期试验
将实验室制备的3批疫苗置2℃-8℃保存，每3个月后每批随机抽取5瓶测定其TCID50，观察疫苗保存期内的稳定性。
1.2.7疫苗的效力试验
将3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，于37℃保存7天后，分别免疫35日龄PRV抗体与PCV2抗体双阴性健康断奶仔猪5头，免疫剂量1头份，颈部肌肉注射，2周后二免，首免后2周与二免后2周分别采血，分离血清，用PRVgB抗体检测试剂盒与PCV2抗体检测试剂盒分别测定PRV抗体与PCV2抗体。PRV gB抗体检测试剂盒判断标准：S/N值大于0.7为阴性，小于0.6为阳性，位于两者之间为可疑；PCV2抗体检测试剂盒判断标准：OD630值大于0.42为阳性，小于0.38为阴性，位于两者之间为可疑。
2.结果
2.1制苗用毒液的制备与毒价测定
按1.2.1中增殖重组病毒rPRV-ORF2，测定其毒价TICD50为107.2/0.1mL。
2.2冻干保护剂配方筛选与冻干曲线的确定
取实施例1-5、对比例1-3的耐热冻干保护剂，然后将重组病毒rPRV-ORF2悬液适当稀释后与各保护剂配方以1∶1混合配苗分装，2mL/瓶，冻干前毒价为107.78TCID50/瓶，冻干后测定毒价，结果见表2，疫苗外观良好，微黄色海绵状疏松团块，体积略有萎缩，疫苗脱离瓶壁，无结晶，综合以上两项结果，确定实施例1为最佳的冻干保护剂配方。同时确定主干燥真空度为0.14-0.16mbar、主干燥时间约为6-7h，冷凝器温度为-55℃的冻干曲线(见图1)。
表2不同保护剂配方冻干前后疫苗的毒价(TCID50/瓶)
| 配方 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 冻干前 | 107.78 | 107.78 | 107.78 | 107.78 |
| 冻干后 | 107.52 | 107.14 | 107.28 | 106.29 |
| 配方 | 实施例5 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 冻干前 | 107.78 | 107.78 | 107.78 | 107.78 |
| 冻干后 | 105.62 | 106.85 | 106.98 | 106.78 |
2.3 PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的试制及其耐老化、保存期检验
2.3.1 PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的试制
将重组病毒rPRV-ORF2适当稀释后与实施例1配制的冻干保护剂按1∶1混合配苗，以2mL/瓶分装入西林瓶，按照图1所示的冻干曲线冻干，制备3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，批号分别为：20120701，20120702，20120703。
2.3.2 PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的耐老化、保存期检验
疫苗在37℃放置7天的耐老化试验后，每瓶疫苗病毒含量下降不大于0.5个滴度，2℃-8℃保存12个月，每瓶疫苗病毒含量无明显下降。
表3 3批疫苗耐老化试验和保存期试验
2.3.3 PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的安全检验
每批疫苗颈部肌肉注射35日龄PRV抗体与PCV2抗体阴性的健康断奶仔猪5头，10头份/头，连续21如观察临床症状及进行测定体温，所有接种猪均无临床症状及无体温升高。
2.3.4 PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的效力试验
将3批37℃存放7天PCV2-PRV二联基因工程活疫苗分别免疫35日龄PRV抗体与PCV2抗体双阴性健康断奶仔猪，一免后2周及二免后2周均采血，分别检测PRV与PCV2抗体。PRVgB抗体检测：本实验3批疫苗免疫猪在首免后2周，除一头可疑外，其它均转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳，大华农PRV活疫苗免疫猪在一免后2周即全部转阳，各组免疫猪的PRVgB抗体平均值见附图2，且可以看出，二免后2周的抗体平均值显著高于一免后2周。PCV2抗体检测：本实验3批疫苗免疫猪在首免后2周，除一头阴性外，一头可疑外，其它均转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳，而维科PCV2疫苗在一免后2周PCV2抗体仍为阴性，二免后2周全部转阳，各组免疫猪的PCV2抗体平均值见附图3，从图中3可以看出二免后2周的抗体平均值显著高于一免后2周。
3.讨论与结论
本研究通过设计不同配方进行冻干比较，筛选到一个有效的冻干保护剂配方。该配方中添加了PVP、海藻糖、甘氨酸等物质，在冻干过程中PVP能够对病毒起到很好的保护作用，同时又是很好的填充剂，对生物制品起到很强的支撑作用；海藻糖能形成独特的保护模，有效地保护生物分子结构不被破坏，这一功能在蔗糖、葡萄糖等其他糖类均不具备；甘氨酸则是一种很好的赋形剂；甘露醇还可以提高产品的坍塌温度，因此该配方冻干的产品不仅外观良好，且病毒的损失率低，耐老化程度高。
该配方的冻干产品在37℃存放7天后，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒滴度仅下降0.1-0.3个滴度，2℃-8℃可保存12个月，每瓶疫苗病毒含量无明显下降，可见该配方能有效提高疫苗的保存期。
通过37℃存放7天PCV2-PRV二联基因工程活疫苗分别免疫35日龄PRV抗体与PCV2抗体双阴性健康断奶仔猪试验结果说明，该冻干保护剂中的各种成分及在有效的保存时间内并不影响疫苗的免疫效力，二免后2周，所有免疫猪均能产生高水平的ELISA抗体。
综上所述，本研究筛选到的冻干保护剂配方是一个很好耐热冻干保护剂，可以用于重组伪狂犬病病毒活疫苗产品的冻干。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶2.5%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 2%、海藻糖4%、蔗糖2%、甘露醇0.1%、黄芪多糖0.5%、甘氨酸1.5%、精氨酸1%、牛血清白蛋白1%，余量为注射用水。
2.一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶3%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 1%、蔗糖5%、甘露醇0.1%、黄芪多糖0.3%、甘氨酸1%、精氨酸1%、牛血清白蛋白1%，余量为注射用水。
3.一种重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于由按照重量百分数计的如下组分制成：明胶3%、聚乙烯吡咯烷酮K-30 2%、海藻糖4%、蔗糖2%、甘露醇0.5%、黄芪多糖0.3%、甘氨酸1.5%、精氨酸1%、牛血清白蛋白1%，余量为注射用水。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于：所述重组伪狂犬病病毒疫苗保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC-V201408。
5.一种根据权利要求1或3所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a．取明胶、聚乙烯吡咯烷酮K-30、海藻糖、蔗糖、甘露醇和黄芪多糖，然后溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的3/5-4/5，然后在110-120℃的温度下进行灭菌处理10-20min，得到溶液A；
b．取配方量的甘氨酸、精氨酸和牛血清白蛋白，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.18-0.24μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c．将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B混合，即得产品。
6.一种根据权利要求2所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a．取明胶、聚乙烯吡咯烷酮K-30、蔗糖、甘露醇和黄芪多糖，然后溶于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的3/5-4/5，然后在110-120℃的温度下进行灭菌处理10-20min，得到溶液A；
b．取配方量的甘氨酸、精氨酸和牛血清白蛋白，溶于剩余部分的注射用水中，然后用孔径为0.18-0.24μm的滤膜过滤除菌，得到溶液B；
c．将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B混合，即得产品。
7.根据权利要求5或6所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于：所述a步骤中，在115℃的温度下进行灭菌处理15min。
8.根据权利要求5或6所述的重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于：所述b步骤中，滤膜孔径为0.22μm。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
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| GR01 | Patent grant | ||
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