CN102416164A - 白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白细胞介素-27在制备抗流感病毒药物中的应用。本发明证实白细胞介素-27在体外对A型流感病毒具有良好的抑制流感病毒复制的作用。用蛋白抗体芯片技术筛选到流感病毒感染的病人血清和体外感染的PBMCs中，IL-27都是显著上调的，并且，A型流感病毒通过促炎因子COX-2激活PKA-CREB通路IL-27的表达，IL-27起到类似干扰素的作用来抑制病毒复制。

Description

白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体涉及白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。

背景技术

流感病毒是引起流行性感冒的病原，甲型流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达400纳米。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中以甲型流感对人类威胁最大。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型，而目前危害严重的高致病性禽流感病毒多为H5、H7和H9亚型，即H5N1、H7N7、H9N2等，其中以H5N1亚型病死率高。本发明主要以甲型流感病毒为研究对象，对白介素-27的抗病毒复制作用进行了探讨。

流感病毒属正粘病毒科，是单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，具有包膜的8个片段，共编码11种蛋白质的单链负RNA病毒。与其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有RNA(mRNA、cRNA、vRNA)的合成均在被感染细胞的核内完成。mRNA在核内合成后转移到胞浆，合成病毒的结构和非结构蛋白；而后开始装配流感病毒，完成后以出芽方式释放出子代病毒颗粒，进一步侵入新的宿主细胞。

目前，流感仍属未能有效控制的急性上呼吸道传染病。由于流感病毒的抗原变异能力强，加之个体免疫力的不同，疫苗的保护率并不高，且疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒无效。流感病毒感染将导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。流感病毒不仅感染人类而且感染畜禽类，给人类和畜禽的健康造成极大的威胁。

白细胞介素27(Interleukin 27，IL-27)是最近发现的I型细胞因子IL-6/IL-12家族的新成员。IL-27是一个异源二聚体蛋白，由p28和Epstein-Barr病毒诱导3蛋白组成。通过由TCCR/WSX-1组成的受体介导信号传导。IL-27具有促进炎症和抑制炎症的作用，在桥接先天免疫和适应性免疫中起到重要作用，并且调控INF-α、IFN-γ、IL-10、IL-17和IL-21的表达。除此以外，IL-27还具有抑制HIV在CD4⁺T细胞中复制，抑制HCV和HCV/HIV共感染。

IL-27通过与IL-27受体结合后，激活STAT1，继而促进转录因子T-bet、IL-12Rβ和IFN-γ等的表达。在IL-27高表达的病毒性肝炎和肿瘤模型中，可增强CD8⁺T细胞IFN-γ产生，增强细胞毒作用和对肿瘤的清除能力。在自身免疫性疾病动物模型中如关节炎，IL-27可促进炎性反应，而IL-27特异性抗体可改善动物模型中的炎性反应。然而，在一些寄生虫和细菌感染的IL-27受体缺失动物模型中，IL-27却主要表现为T细胞反应的拮抗因子。

虽然内源性IL-27在感染过程中促进细胞免疫反应的证据有限，但是一些研究显示它能促进自身免疫性疾病动物模型和肿瘤动物模型的炎症反应。在IL-27高表达的病毒性肝炎和肿瘤模型中，可增强CD8⁺T细胞INF-γ产生，增强细胞毒作用和对肿瘤的清除能力。另外，有报道在严重的由佐剂诱导的关节炎大鼠模型和EAE小鼠模型可通过使用IL-27特异性抗体从而改善其炎性反应，在后一模型中使用IL-27p28能显著增加INF-γ和TNF的产生并放大炎症反应。

虽然在最初的研究证实IL-27及其受体在促进Th1反应中扮演重要角色，但最近的研究表明它们同时也抑制不同的免疫细胞反应的过程，包括抑制免疫细胞的增殖和细胞因子的产生。IL-27及其受体的这种相互矛盾的作用，既可促进炎症反应又可抑制炎症反应，可能对调解控制机体的免疫平衡起到重要作用，进一步深入研究IL-27及其受体的生物学功能可更加完善地了解机体的免疫系统及免疫过程，从而为人们对控制和预防疾病将起到至关重要的作用。

发明内容

本发明研究白细胞介素-27在流感病毒复制中的作用，探讨流感病毒感染后诱导白介素-27表达上调的作用机制，从而揭示出白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。

白细胞介素-27在细胞和分子水平上对流感病毒复制有抑制作用，预示IL-27可以做为临床抗病毒药物而进一步研究开发。通过流感病毒感染上调IL-27在A549细胞和人外周血细胞中的表达实验证实了流感病毒感染人外周血细胞能上调IL-27的表达，并以A549细胞作为细胞模型来研究流感病毒诱导IL-27表达的分子机制；通过流感病毒感染通过CREB激活IL-27/EBI3启动子实验确定了转录调控因子CREB在A型流感病毒感染激活EBI3启动子的过程中是必需的；通过PKA是A型流感病毒通过CREB激活IL-27/EBI3启动子的上游信号通路的实验，我们可以得出A型流感病毒感染通过PKA信号通路激活CREB，促进CREB结合到IL-27/EBI3启动子，激活IL-27表达，同时，Ca离子信号通路又在PKA-CREB信号通路的上游；通过流感病毒通过COX-2/PGE2-PKA通路诱导IL-27表达实验我们得出A型流感病毒感染诱导炎症因子COX-2的高表达和其催化产物PGE2的累积，PGE2累积则激活PKA-CREB信号通路，最后促进IL-27/EBI3启动子的活化和IL-27的表达；通过IL-27可以通过激活PKR来抑制流感病毒的复制实验我们得出流感病毒感染上调IL-27的表达是机体应对病毒的入侵，自我防卫的免疫机制，IL-27能起到类似干扰素的作用，激活抗病毒信号激活因子STAT1和STAT2，促进抗病毒因子PKR的磷酸化，最终抑制流感病毒的复制；通过IL-27在流感病人血清中表达水平和血清PGE2的临床相关性实验验证了签名细胞水平上IL-27表和PGE2的关系，进一步说明了流感病毒感染，PGE2表达和IL-27上调的相关性。

总体实验揭示了尚未被发现的A型流感病毒感染诱导IL-27表达的机制。即A型流感病毒感染后，激活炎症因子COX-2的表达，COX-2催化机体产生大量的PGE2，PGE2促及PKA的磷酸化，磷酸化后的PKA具有激酶活性，激活转录因子CREB转核并结合到IL-27/EBI3的启动子上，促进IL-27的表达。同时A型流感病毒感染也能激活Ca依赖的PKA-CREB信号通路，后者也能促进IL-27的表达。机体应答流感病毒的感染产生的大量IL-27，IL-27发挥类似与干扰素的作用，激活抗病毒信号通路和促进抗病毒因子的表达，最后抑制流感病毒的复制。临床上，IL-27在流感病毒感染者血清中的高表达以及和PGE2的相关性，反过来证明了这里实验在细胞水平的结果和临床一致。

本发明揭示了尚未被发现的A型流感病毒感染诱导IL-27表达的机制。在流感病毒感染细胞后能促进IL-27表达的上调，抑制病毒的复制，这一新发现为研制流感病毒药物提供基础。

本发明实验结果说明，白细胞介素-27是一种很有潜力的抗甲型流感病毒药物，可以用于制备抗甲型流感病毒药物。

本发明也公开了抗甲型流感病毒的药物，其中含有白细胞介素-27，其制备方法按制药工业现有技术制备。

附图说明

图1A型流感病毒可以上调IL-27在A549细胞和PBMCs中的表达。

A.A/Hong Kong/H3N2感染上调IL-27在A549细胞中的表达。

B.A/Hong Kong/H3N2感染上调IL-27在PBMCs中的表达。

C.A/Hong Kong/H3N2感染后，IL-27在单核细胞和淋巴细胞中的表达情况。

D.A/Hong Kong/H3N2感染PBMCs后，IL-27表达呈时间趋势。

E.A/Hong Kong/H3N2感染PBMCs后，IL-27两个亚基基因的表达呈时间趋势。

图2CREB在A型流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子中是必须的。

A.CREB截短和突变对A型流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子的影响。

B.siCREB敲除对A型流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子的影响。

C.A型流感病毒感染促进CREB转核。

D.A型流感病毒感染促进CREB结合到IL-27/EBI3启动子。

图3流感病毒通过PKA信号通路促进CREB激活IL-27/EBI3启动子和IL-27表达。

A.蛋白酶抑制剂筛选。

B.PKA抑制剂H-89抑制流感病毒诱导IL-27表达。

C.流感病毒感染促进PKA磷酸化。

D.PKA抑制剂H-89抑制流感病毒促进CREB转核。

图4有机化学试剂对细胞活性和病毒感染的影响。

A.各种有机化学试剂对细胞活性的影响。

B.各种有机化学试剂对流感病毒感染的影响，以病毒的NP蛋白是否存在来表示化学试剂是否影响了病毒的感染。

图5Ca离子参与了流感病毒通过PKA-CREB通路诱导IL-27表达。

A-B.Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒激活IL-27/EBI3启动子。

C.Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒诱导IL-27表达。

D.Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒促进CREB转核。

图6A型流感病毒通过COX-2/PGE2-PKA信号通路诱导IL-27表达。

A-C.过表达COX-2上调IL-27表达，促进CREB转核和PKA磷酸化。

D-F.抑制COX-2可抑制流感病毒感染诱导的IL-27表达，CREB转核和PKA磷酸化而外源PGE2可以回复抑制。

G-I.PGE2可以单独上调IL-27表达，促进CREB转核和PKA磷酸化，而这些诱导可以被PKA抑制剂所抑制。

图7重组人IL-27抑制流感病毒的复制。

图8IL-27抗流感病毒的机制。

图9IL-27的临床水平和PGE2的相关性。

具体实施方式

白细胞介素-27目前已经商品化，可以直接购得成品的白细胞介素-27。

一、流感病毒感染上调IL-27在A549细胞和PBMCs中的表达

(一)实验材料

1、临床样本

健康人全血来自献血志愿者。

2、生化试剂及试剂盒

人外周血单核细胞(PBMCs)分离试剂pyrogen-free saline over Histopaque(Sigma，St.Louis，MO，USA)购自武汉天源生物技术公司。

LEGEND MAX^TM Human IL-27 ELISA kit购自BioLegend(San Diego，CA，USA)。

总RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit购自Qigen(Dusselforf，Germany)。

F12K培养基，RPMI 1640培养基和胎牛血清(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)购自武汉生命生物技术公司。

细胞用青霉素和链霉素购自武汉大学校医院。

3、细胞和病毒毒株

人肺癌细胞系A549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室保存。

4、逆转录酶等

M-MLV逆转录酶够自Promega公司。

dNTP和荧光定量预混合物购自Invitrogen公司。

Oligo dT(18T)和RNase抑制剂RNasin购自Invitrogen公司。

5、耗材及仪器

细胞培养板、细胞培养皿和细胞培养瓶购自Corning公司。

4℃高速离心机、台式小型高速离心机、二氧化碳细胞培养箱和细胞操作台购自Herus。

超纯水系统购自Millipore。

荧光定量PCR系统LightCycler480II购自Roche。

RNA提取所使用的RNase free的各种型号枪头和EP管购自Eppendorf。

常规PCR仪购自东胜创新。

(二)实验方法

1、哺乳动物细胞(贴壁)的培养

(1)细胞复苏

1)预先准备好37℃-38℃温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没与水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完全融化。

2)用酒精消毒冻存管。

3)用吸管预先吸取5ml细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍。

4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37℃，5％(体积比)CO₂静置培养。

5)约6-8小时后(取决于不同的细胞)，更换信息培养基以消除细胞冻存液中存留的DMSO对细胞生长的影响。

(2)细胞的传代和冻存

1)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去。

2)加入10ml的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去。

3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37℃，5％CO₂细胞培养箱静止3-5min(消化时间的长短取决于细胞种类)。

4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离。

5)在细胞操作台内，用吸管吸取约4ml培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散细胞和中和胰酶的消化效果。

6)用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5ml的培养基，放置于细胞培养箱中，37℃，5％(体积比)CO₂的环境下继续静置培养。

(3)细胞的冻存

1)处于生长旺盛期的细胞用胰酶消化下后，转移到细胞离心管中，2000rpm离心5min。

2)用全血清重悬细胞，加入终浓度10％(质量比)的冻存液DMSO，吹匀后分装到细胞冻存关。

3)做好标记后，进行梯度降温冻存细胞，即4℃放置1h，-20℃放置1h，-80℃过夜，再转到液氮罐中冻存。

2、单核细胞(monocytes)和淋巴细胞(lymphocytes)

PBMCs分离好计数，按一定的量接种于24孔细胞培养板，放置37℃，5％(体积比)CO₂细胞培养箱静置培养2h，此时单核细胞均贴壁生长，而淋巴细胞则悬浮生长。用移液器将培养全部转移到新的细胞培养板培养即分离得到淋巴细胞，再补充原体积的培养基到原细胞培养板中，即分离得到单核细胞。H3N2感染，polyI:C处理A549细胞、PBMCs、单核细胞和淋巴细胞。

H3N2感染或polyI:C诱导A549前，将含有胎牛血清的完全培养基换成无血清培养基，H3N2感染的剂量为1MOI，polyI:C的终浓度为50μg。

PBMCs，单核细胞和淋巴细胞的处理由于分离后为无血清培养基培养，所以无需更换培养基，处理方法同A549细胞。

感染或处理24h后，收集培养上清进行下一步实验。

3、ELISA试剂盒检测IL-27表达水平(根据LEGEND MAX^TM Human IL-27 ELISAKit)

1)使用前1h，将试剂盒所有试剂放到室温平衡。

2)准备500μl浓度为16ng/ml的标准曲线母液。在6个EP管中依次倍比稀释母液，得到浓度为8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml和0.25ng/ml的标准品，另外以稀释液作为0ng/ml。

3)每孔加入300μl 1×漂洗缓冲液振荡洗涤所需要的ELISA板，吸水纸上拍干，重复4次。

4)每孔加入50μl Assay Buffer A和50μl标准品或待测样品，标准品和待测样品均做3个复孔作为重复。

5)用ELISA板密封膜将所以空密封，室温，水平摇床放置2h。

6)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入300μl 1×漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复4次。

7)每孔加入100μl IL-27检测抗体，用密封膜封好，室温，水平摇床放置1h。

8)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入300μl 1×漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复4次。

9)每空加入100μl Avidin-HRP A溶液，用密封膜封好，避光，室温，水平摇床放置1h。

10)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入300μl 1×漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复5次。加入漂洗缓冲液后静置30s到1min，有助于减少背景。

11)每孔加入100μl底物溶液F，室温避光放置15min，IL-27含量高的孔，此时溶液颜色会变蓝。

12)每孔加入100μl终止液，此时此时溶液颜色变成黄色。

13)30min内，酶标仪450nm参考波长，570nm校正波长读板，450nm波长下的读数减去570nm波长下的读数即为最后的读数。

4、荧光定量PCR检测IL-27两个亚基EBI3和p28的mRNA表达水平(1)细胞总RNA的提取(以用Qiagen试剂盒提前6孔板培养贴壁细胞为例)

1)用移液枪吸取细胞培养板每个孔中的培养基并弃去，加入1ml预冷的PBS漂洗细胞2次。

2)加入600μl Buffer RLT Plus，用枪反复吹吸，使细胞裂解均匀。

3)将细胞裂解液转移至除gDNA的离心柱中，12000rpm离心30s，弃去离心柱，留溶液。

4)加入1200μl 70％(体积比)的乙醇到含离心溶液离心管中，轻轻吹打混匀。

5)每700μl混合物转移到RNeasy离心柱中，12000rpm离心15s，保留离心柱，弃去离心所得。

6)向离心柱中加入500μl Buffer RPE，12000rpm离心15s，漂洗离心柱，弃去离心所得。

7)向离心柱中加入500μl Buffer RPE，12000rpm离心2min，漂洗离心柱。

8)将离心柱转移到新的套管中，12000rpm离心1min，以除去残余的漂洗液。

9)将离心柱转移到新的套管中，加入50μl RNase-free水溶解挂在离心柱上的RNA，12000rpm离心1min得到总RNA，取2μl RNA溶液，在测定RNA浓度以进行下一步实验。

(2)逆转录荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平

1)在PCR管中按如下体系依次加入M-MLV 10×buffer 2.5μl，RNasin 0.5μl，dNTP 2μl，Olgio dT 3μl，M-MLV 1μl，用RNase-free水补足总体积至25μl，混匀。

2)逆转录反应条件：37℃1h，75℃10min

Real-time反应体系

1)目的基因的检测引物和内参引物：

EBI3：5’-GAGCCAGGTACTACGTCCAA-3’(正义链，SEQ ID NO：1)

5’-GCTAGGCAGATCCCATCC-3’(反义链，SEQ ID NO：2)

p28：5’-CGCTTTGCGGAATCTCAC-3’(正义链，SEQ ID NO：3)，

5’-GGGCATGGAAGGGCTGAA-3’(反义链，SEQ ID NO：4)

GAPDH：5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’(正义链，SEQ ID NO：5)

5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’(反义链，SEQ ID NO：6)

2)反应体系L：

3)反应条件：

(三)实验结果和讨论

当A型流感病毒1 MOI A/Hong Kong/H3N2感染A549细胞24小时或终浓度为50μg/ml的polyI:C作为模拟流感病毒复制过程中产生的dsRNA模型作为对照诱导A549细胞24小时后，和对照组相比IL-27的表达量都有显著提高。病毒感染使IL-27的表达量从176.45±19.81pg/ml上升到327.73±13.50pg/ml；polyI:C诱导使IL-27的表达量上升到245.88±21.36pg/ml(图1A)。同样的处理，在PBMCs中，H3N2感染使IL-27的表达量从98.00±26.43pg/ml上升到309.73±91.54pg/ml；polyI:C诱导使IL-27的表达量上升到198.17±37.69pg/ml (图1B)。由于PBMCs是淋巴细胞(B细胞和T细胞)、单核细胞(包括为分化的单核细胞、由单核细胞分化而来的巨噬细胞和树突状细胞)的混合物。为了区分流感病毒感染哪一种类的细胞，淋巴细胞还是单核细胞，在分泌IL-27起主要作用，我们又用1MOI的病毒或50μg/ml的polyI:C分别感染或诱导贴壁生长的单核细胞和悬浮生长的淋巴细胞，结果显示两种细胞类型在应答流感病毒感染或polyI:C诱导时都产生大量的IL-27，但两种细胞相比并无显著性差异(图1C)。因此，后面感染PBMCs实验不再区分细胞类型。接着我们用1MOI H3N2感染PBMCs，再不同的时间点检测IL-27的表达情况。结果显示，流感病毒感染PBMCs后，IL-27的表达呈现出时间梯度，对比0小时的IL-27表达量84.24±20.77pg/ml，感染6小时后的表达量上升为342.00±13.41pg/ml；感染12小时后的表达量升到顶峰，为411.04±38.52pg/ml；到24小时，IL-27的表达量略有下降，为312.49±26.68pg/ml；到48小时，IL-27的表达量则进一步下降，为167.10±18.02pg/ml，但仍显著高于感染0小时的表达(图1D)。由于IL-27是一个异源二聚体复合物，我们进一步检测的流感病毒感染后，IL-27的两个亚基EBI3和p28基因的表达情况。和IL-27蛋白表达水平一样，两个亚基EBI3和p28基因的表达水平也呈现出时间梯度。和0小时相比，感染6小时后，EBI3和p28基因的表达水平即显著上调。到12小时，p28基因的表达水平即达到峰值，并且从24小时到48小时开始逐渐降低；EBI3基因的表达水平则在感染后24小时达到峰值，并且也是到48小时开始降低(图1E)。

该部分实验表明流感病毒感染PBMCs能上调IL-27的表达。而感染A549细胞也同样能上调IL-27的表达则为我们的后续实验，即A549细胞可以作为细胞模型来研究流感病毒诱导IL-27表达的分子机制。对于流感病毒感染PBMCs后，IL-27的两个亚基EBI3和p28基因的表达水平在时间上不同步。p28基因的表达比EBI3基因的表达早12小时达到峰值，也印证了别人研究的结果，即p28的表达比EBI3早10-12小时。

二、流感病毒感染通过CREB激活IL-27/EBI3启动子

(一)实验材料

1、细胞及病毒株

同前所述。

2、生化试剂及试剂盒

转染试剂Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen)。

荧光素酶活性报告基因试剂盒购自Promega公司。

高纯度基因组DNA提取试剂盒购自Qigen公司。

核抽提物试剂盒购自Chemicon公司。

DNA胶回收试剂盒购自Tiangen公司。

兔多克隆抗体CREB，鼠单克隆抗体lamin A，prtoeinA/G购自Santa CruzBiotechnology，Inc(Santa Cruz，CA，USA)。

3、工具酶和质粒载体

高保真Taq酶KOD购自日本TOYOBO公司。

限制性内切酶MluI and BglII购自大连Takara公司。

限制性内切酶DpnI购自晶美公司。

T4 DNA连接酶购自Promega公司。

pGL3载体购自Promega公司，由本室保存。

pSliencer2.1U6-neo购自美国Ambion公司，由本室保存。

pSliencer2.1 U6-siCREB有本室构建保存。

4、感受态细菌DH5α

由本室保存。

5、耗材及仪器

荧光素酶活性检测仪。

超声破碎仪、16℃低温连接水浴锅购自Fisher公司。

凝胶成像系统、电泳仪及Western转膜仪购自北京君意东方公司。

Western扫描系统购自日本富士公司。

(二)实验方法

1、IL-27/EBI3启动子的预测、克隆、截短和突变

启动子的预测由在线软件http://www.genomatix.de/cgi-bin/./eldorado/main.pl完成。

2、IL-27/EBI3启动子的克隆之人基因组DNA的提取(以Qigen细胞基因组DNA提取试剂盒从H3N2感染的PBMCs提取DNA为例)：

1)H3N2感染PBMCs如前所述。

2)用细胞刮轻轻刮动细胞生长面，使细胞全部从细胞培养板的生长面脱落，悬浮于培养液中。

3)用移液枪将悬浮液转移至EP管，500g离心3min以收集细胞。

4)加入预冷的PBS，重新悬浮细胞，500g离心3min以清洗细胞，除去培养基。

5)除去上清，加入1ml细胞裂解液，用移液枪反复吹打，是细胞均匀重悬，37℃放置，直至溶液均匀无细胞块存在。

6)加入15μl RNase A，37℃放置5min以除去RNA。

7)加入1ml蛋白沉淀溶液，振荡器最高速度振荡20s。

8)13000g离心1min，将上清转移到15ml离心管中，加入3ml异丙醇并上下颠倒轻柔混匀50次。

9)13000g离心1min，弃去上清，此时DNA作为可见的白色小团被离到管底。

10)加入3ml 70％(体积比)乙醇，上下颠倒洗涤DNA团。

11)13000g离心1min，弃去上清，空气中干燥DNA团。

12)加入250μl DNA溶解液，中速振荡以促进DNA溶解。

13)65℃放置1h以彻底溶解DNA，此时得到的DNA将作为模版供PCR使用。

3、IL-27/EBI3启动子的克隆、截短和突变

1)引物

正义链：5’-CTACGCGTTCTGTCATCCCCCTT-3’，(SEQ ID NO：7)

反义链：5’-ATTAGATCTAGACATGATCCGAGGCCAGTCCTCG-3’(SEQ IDNO：8)

-464/+142正义链：5’-CTACGCGTGTCTCTGTATCCCTC-3’，(SEQ ID NO：9)

-105/+142正义链：5’-CTACGCGTGGCCTGTGCTCCCCA-3’，(SEQ ID NO：10)

+50/+142正义链：5’-CTACGCGTTCCCACGACGTTCCC-3’(SEQ ID NO：11)

2)反应体系

3)反应条件

4、PCR产物的回收(以Tiangen DNA胶回收试剂盒为例)

1)琼脂糖电泳分离PCR产物，在凝胶成像系统下，按DNA marker指示的大小，迅速的切下所需的DNA片段，所切琼脂糖凝胶在包含所以的目的片段的前提下，尽量切小切薄。

2)将所切的琼脂糖胶放入EP管中，加入3倍体积的溶胶液PN，55℃水浴10分钟，期间不断的轻柔上下振荡EP管，以促进琼脂糖胶的完全溶解；化胶的同时，将吸附柱放入收集管中，并向吸附柱CA2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，完成吸附柱平衡。

3)琼脂糖胶的完全溶解并且温度将至室温后，将所得的溶液加入平衡好的吸附柱CA2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4)向吸附柱CA2中加入600μl的，已加好无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，再重复洗涤一遍。

5)12000rpm离心2min，空甩吸附柱CA2以尽量除尽漂洗液，室温干燥5-10min。

6)将吸附柱CA2放入一个新的EP管中，加入适量预热的洗脱缓冲液EB，室温放置5min，12000rpm离心2min，得到回收的PCR产物。

5、PCR产物的酶切、回收、连接和转化

1)酶切体系如下

37℃水浴3-4h。

2)酶切产物回收(同前)

3)连接体系如下

16℃水浴连接过夜。

6、转化感受态细胞

1)取连接产物10μl(不足10μl则用ddH₂O补至10μl)，5×KCM溶液10μl，ddH₂O 30μl，混匀后置于冰上。

2)从-80℃冰箱取出抑支感受态细胞，放置于冰上融解，然后立即加入上述混合溶液，并吹打混匀。

3)混匀后，在冰上放置20min，然后室温放置10min。

4)加入500μl LB培养基，混匀，37℃细菌摇床培养60min。

5)4000rpm离心3min，弃去大部分上清，留少部分，重悬细菌后涂板培养过夜，第二天挑菌做鉴定。

7、重组质粒的提取(以Tiangen高纯质粒小提试剂盒为例)

1)LB培养基接菌，37℃细菌摇床培养过夜。

2)12000rpm离心收集菌，弃去培养基上清。

3)向菌体沉淀加入已经加好RNaseA的溶液P1 250μl，用移液枪反复吹打菌体，是细菌彻底均匀悬浮，无成团菌块存在。

4)向离心管中加入250μl溶液P2，轻柔的上下颠倒混匀，冰上放置，以充分裂解菌体，此时菌液变得清亮粘稠。

5)向离心管中加入250μl溶液P3，轻柔的上下颠倒混匀6-8次，以充分混匀，此时，离心管中出现白色絮状沉淀。

6)12000rpm离心10-15min，于此同时，向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。然后将离心好的上清，转移到过滤柱CS中，注意尽量不要吸出白色絮状沉淀，12000rpm离心2min。

7)将离心得到的溶液转移到已经平衡好的吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，弃去离心得到的溶液。

8)向吸附柱CP3中加入去蛋白溶液PD 500μl，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液。

9)向吸附柱CP3中加入去内毒素溶液500μl，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液。

10)向吸附柱CP3中加入已加好无水乙醇的漂洗液PW 600μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，弃去收集管中的废液。

11)重复步骤10)。

12)12000rpm离心吸附柱CP3 2min，空甩有助于将残留在吸附柱中的漂洗液去除。

13)将附柱CP3转移至一个新的EP管中，加入预热的洗脱缓冲液TB 50-100μl，室温放置2min，12000rpm离心吸附柱2min，即得到高纯无内毒素的质粒，可以进行下一步细胞转染实验。

8、哺乳动物细胞的转染(以Lipofectamine 2000转染6孔细胞培养板为例)

1)细胞转染前，调整细胞密度，达到85％-90％(体积比)，并将含胎牛血清的全培养基更换为无血清培养基。

2)按转染6孔板所需的质粒DNA的量和转染试剂的量分别稀释质粒DNA和转染试剂；6空板每空需4μg质粒DNA，用250μl opti-MEM稀释，转染试剂需要8μl，用250μl opti-MEM稀释。

3)将稀释好的转染试剂溶液逐滴滴加到稀释好的质粒DNA溶液中，一边滴加一边轻弹EP管，注意，滴加的顺序一定不能反。

4)滴加混合好质粒DNA/转染试剂混合物后，放置室温孵育15-20min。

5)孵育完成后，将质粒DNA/转染试剂混合物滴加到细胞培养基中，轻柔混匀，放置37℃，5％(体积比)CO₂细胞培养箱静置培养4-6h。

6)如果细胞株很敏感，培养培养4-6h后应更换培养液，除去转染复合物并加入新鲜含胎牛血清的完全培养基。

7)培养24-48h后，根据实验设计进行下一步实验。

9、荧光素酶活性的测定(以Promega Luciferase试剂盒为例)

1)取出Luciferase试剂盒以及试剂，室温平衡1h。

2)荧光测定仪开机自检，并设定相应的参数。

3)待测细胞样品，弃去细胞培养基，并用预冷的PBS洗涤一次，加入Luciferase细胞裂解液，轻柔混匀，37℃裂解15min。

4)用移液枪吹打裂解物，并转移到新的EP管中。

5)4℃，12000rpm离心1min，转移上清至新的EP管中，弃去沉淀。

6)取样品100μl，加入Luciferase底物100μl，移液枪吹打混匀后，上机测定。

7)每次测定设3个平行复孔，最后的数据以Luciferase的读值和Renila读值的比值来表示。

10、细胞核抽提物的制备(以Chemicon Nuclear Extraction Kit为例)

1)贴壁细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤一次，再加入一定量的PBS，细胞刮轻柔刮动细胞生长面，收集细胞。

2)4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去PBS上清。

3)估计细胞体积，加入5倍细胞体积的，已预先加好蛋白酶抑制剂Cocktail和终浓度为0.5mM DTT，预冷的细胞质裂解液。

4)轻柔上下颠倒EP管，重悬细胞，避免气泡产生和不要振荡。

5)冰上放置15min。

6)4℃，250g离心5min，弃去上清，再加入2倍细胞体积的细胞质裂解液。

7)用移液枪吹打重悬细胞，不要超过5次，使细胞均匀裂解。

8)4℃，8000g离心20min，上清即是细胞质提取物。

9)转移上清至另一新的EP管。

10)向沉淀物加入2/3原始细胞体积的，已预先加好蛋白酶抑制剂Cocktail和终浓度为0.5mM DTT，预冷的细胞核抽提缓冲液。

11)用用移液枪吹打重悬，4℃，振荡器低速振荡30-60min。

12)4℃，16000g离心5min，转移上清至另一新的EP管即得到细胞核抽提物。

11、Western检测蛋白表达水平

(1)蛋白制样(以6孔细胞培养板培养细胞为例)

1)贴壁细胞弃去培养基贴壁细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤一次，再加入一定量的PBS，细胞刮轻柔刮动细胞生长面，收集细胞。

2)4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去PBS上清。

3)加入60-80μl已预先加好蛋白酶抑制剂Cocktail和终浓度为0.5mM DTT，预冷的细胞裂解液，用移液枪吹打，重悬细胞。

4)超声破碎仪调至3档，冰上超声，每次3-5s，重复3次。

5)4℃，12000rpm离心10min，将上清转移至另一新的EP管，即得到细胞总蛋白。

6)测定样品蛋白浓度。

7)按实验设计的上样量分装，加入loading buffer，煮沸样品5min制样。

(2)SDS-PAGE分离蛋白和转膜曝光

1)SDS-PAGE胶上样，Tris-gly缓冲液系统电泳分离蛋白，90V进浓缩胶，110V进分离胶，以预染的蛋白质marker为指示。

2)将SDS-PAGE胶从电泳系统中取下，浸入转膜缓冲液平衡，同时将相应大小的NC膜也浸入转膜缓冲液平衡。

3)按转膜垫、三层滤纸、NC膜、SDS-PAGE胶、三层滤纸、转膜垫的三明治模型制备转膜芯体系，放入转膜槽，负极对SDS-PAGE胶，正极对NC膜，并且NC膜和SDS-PAGE胶的接触面事先做好标记。

4)4℃，70V恒压转膜2h。

5)转膜结束，撤下NC膜，用圆珠笔根据预染的蛋白质marker的位置，划定标识，用丽春红预染，粗略判断目的蛋白是否转膜成功。

6)PBS洗去丽春红，5％(质量比)的脱脂牛奶室温封闭1-2h。

7)PBS洗去脱脂牛奶，用PBS根据说明书的介绍稀释一抗，室温孵育1h。

8)TBS-T洗膜缓冲液，摇床洗膜5次，每次5min。

9)用PBS根据说明书的介绍稀释二抗，室温孵育30min。

10)TBS-T洗膜缓冲液，摇床洗膜5次，每次10min。

11)滤纸吸管膜上的洗膜缓冲液，按比例加入曝光底物，暗处孵育5min。

12)Western扫描系统采集信号分析。

12、染色质免疫共沉淀(ChIP)

1)贴壁细胞弃去培养基贴壁细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤一次，加入胰酶消化收集细胞。

2)4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去上清。

3)加入预冷的PBS重悬洗涤细胞，4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去上清。

4)加入1ml PBS重悬细胞，再加入30μl甲醛溶液固定蛋白，终浓度为1×蛋白酶抑制剂Cocktail，37℃摇床孵育15min。

5)加入终浓度为0.125M的甘氨酸，37℃摇床孵育5min。

6)4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去上清，并用预冷的PBS重悬洗涤细胞，4℃，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去上清。

7)每管加入300μl裂解缓冲液，4℃放置10min。

8)超声破碎仪调至3档，冰上超声，每次3-5s，直至将基因组DNA打断成400-500bp的片段。

9)4℃，12000rpm离心10min，1/3的上清作为DNA内参，冻存于-80℃。

10)剩余2/3的上清用稀释缓冲液稀释，然后加入10μl一抗，4℃摇床过夜。11)振荡重悬protein A/G，每管加入25μl。

12)配制10mg/ml鲑鱼精DNA，使用前煮沸5min，然后立即放置于冰上，每管加入2μl制好的鲑鱼精DNA，4℃摇床孵育2h。

13)4℃，2500rpm离心10min，弃去上清，用预冷的PBS洗涤沉淀2次。

14)配制含1％(质量比)SDS，0.11M NaHCO₃的溶解缓冲液，每管加入150μl制好的溶解缓冲液，4℃旋转洗涤沉淀20min，然后4℃，12000rpm离心5min，转移上清至另一EP管，再重复洗涤沉淀一次，两次共得上清300μl。

15)上清中加入2μl，浓度为5mg/ml的RNase A和终浓度为0.3M的NaCl；同时取出冻存于-80℃的DNA input control，加入10％(质量比)溶解缓冲液，使终体积为300μl。

16)65℃水浴5h，解交联。

17)每管加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后，-80℃过夜。

18)4℃，13000rpm离心20min，弃去上清，室温干燥沉淀。

19)用75％(体积比)的乙醇洗涤沉淀，室温干燥。

20)用100μl TE溶液溶解沉淀，加入1μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，55℃水浴1h。

21)补足TE溶液，使终体积为400μl，用酚、氯仿抽提。

22)水相溶液加入1/3体积的浓度为3M的NaAc和1ml的无水乙醇，混匀后-80℃过夜。

23)4℃，13000rpm离心20min，弃去上清，室温干燥沉淀。

24)用75％(体积比)的乙醇洗涤沉淀，室温干燥后用50μl TE溶液溶解沉淀。

25)测定DNA浓度，进行下一步PCR鉴定。

26)所用引物为：正义链5’-GTCATGCCCCTTTCTCTGTCTGTCA-3’(SEQ IDNO：12)和反义链：5’-GAGAAAGACAAGAGGAAGAGGACAA-3’(SEQ IDNO：13)。

27)反应条件如常规PCR反应条件。

(三)实验结果和讨论

前面我们已经证明了A型流感病毒感染可以上调IL-27蛋白和IL-27两个亚基，EBI3和p28基因的表达。因为流感病毒感染上调p28基因的已经有报道，而且EBI3负责调控二聚体IL-27分泌的功能，因此我们主要集中研究流感病毒是通过什么样的机制调控EBI3来诱导IL-27的表达。

为此，我们克隆了EBI3的启动子，并构建到pGL3-basic质粒上。通过在线启动子分析软件，我们发现EBI3启动子上有很多转录因子结合位点，包括NF-κB，CREB和AP1这三种重要的转录因子结合位点。我们将包含这些转录因子结合位点的pIL-27/EBI3-Luc报告基因质粒系统转在A549细胞镇中过表达，同时用H3N2感染诱导，结果发现H3N2感染可以明显的激活EBI3启动子活性。然后通过一系截短实验，我们发现，当EBI3启动子上CREB结合位点被截断后，H3N2感染激活EBI3启动子活性的程度明显降低。类似的实验结果也同样在全长的EBI3启动子的CREB位点突变后的实验中发现(图2A)。接着，我们用siRNA的方法将A549细胞中的CREB敲除，再过表达pIL-27/EBI3-Luc，并用H3N2感染，然后检测EBI3启动子的活性。实验结果显示，当CREB被敲除后，H3N2感染不能显著激活EBI3启动子活性(图2B)。通过Western和ChIP实验，我们进一步发现，A型流感病毒感染能促进CREB进入细胞核并结合到EBI3启动子上(图2C和D)。

综合这部分的实验结果，我们可以确定转录调控因子CREB在A型流感病毒感染激活EBI3启动子的过程中是必需的。

三、PKA是A型流感病毒通过CREB激活IL-27/EBI3启动子的上游信号通路

(一)实验材料

1、细胞及病毒株

同前所述。

2、生化试剂及试剂盒

MEK特异性抑制剂PD-98059，JNK特异性抑制剂SP600125，ERK特异性抑制剂U0126，p38特异性抑制剂SB203580，PI3K特异性抑制剂LY294002，PKA特异性抑制剂H-89，PKC特异性抑制剂GF109203，EGTA，BAPTA/AM购自Sigma(St.Louis，MO)。

鼠单克隆抗体甲型流感病毒NP；兔多克隆抗体磷酸化-PKA，PKA购自SantaCruz Biotechnology，Inc。

细胞增殖检测试剂盒CellTiter

AQueous One Solution Assay购自Promega。

3、耗材及仪器

同前所述。

(二)实验方法

1、高纯质粒的提取

同前所述。

2、细胞培养、病毒感染、瞬时转染

同前所述。

3、抑制剂的处理

所有抑制剂的处理在细胞感染前2h进行；对于转染实验，在转染后12h加抑制剂处理并且维持到收样测定前。PI3K抑制剂LY294002(25μM)，PKA抑制剂H-89(10μM)，ERK抑制剂U0126(10μM)，JNK抑制剂SP600125(30μM)，PKC抑制剂GF109203(50μM)，P38抑制剂SB203580(10μM)，MEK抑制剂PD98059(10μM)，EGTA(0.5，1，and 2mM)，BAPTA(0.5，1，and 2mM)。

4、ELISA检测IL-27的表达

同前所述。

5、荧光素酶活性的测定

同前所述。

6、细胞增殖测定(以Cell Titer

AQueous One Solution Assay为例)

1)使用前，将试剂盒所以试剂放入室温平衡60min。

2)所测定的细胞，对照组和实验组，按每100μl的细胞培养基加入20μl的Cell Titer

AQueous One Solution Reagent，轻轻摇晃混匀。

3)37℃，5％CO₂细胞培养箱静置培养1-4h。

4)490nm波长下读值，细胞增殖越快或活性越高，读值越高。

7、细胞核抽提物的制备。

同前所述。

8、细胞蛋白样的制备和Westren blot

同前所述。

(三)实验结果与讨论

通过前面的实验我们已经证明了CREB在流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子活性中是必须的。作为转录因子，CREB只是信号通路中下游的信号分子。为了弄清流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子，促进IL-27表达所涉及的信号通路，我们使用了多种蛋白激酶的抑制剂来筛选哪些蛋白激酶在病毒感染激活IL-27/EBI3启动子，促进IL-27表达中发挥作用。实验结果显示，当PKA活性被其特异性抑制剂H-89抑制，ERK活性被其特异性抑制剂U0126抑制后，H3N2感染诱导IL-27/EBI3启动子活性都被抑制(图3A)。并且这种抑制不是由于化学试剂对细胞的毒性或对病毒感染的影响造成(图4)。接着，我们用H-89处理PBMCs，然后用H3N2感染，和IL-27/EBI3启动子活性被抑制相似，IL-27的表达也被抑制，由288.79±122.30pg/ml降到177.11±57.14pg/ml(图3B)。由于H-89是PKA的特异性抑制剂，我们接着检测了流感病毒感染对PKA磷酸化的影响，结果发现，流感病毒感染能促进PKA磷酸化(图3C)。同时，当PKA的活性被H-89抑制后，流感病毒促进CREB的转核也被抑制(图3D)，这说明在流感病毒感染激活CREB是通过促进PKA的磷酸化而实现的。

Ca调控PKA-CREB信号通路中起到一个重要的作用，为了验证Ca是否也参与了流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子，促进IL-27表达，我们使用了Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM。结果显示，当Ca离子被2mM EGTA或BAPTA/AM螯合后，流感病毒激活IL-27/EBI3启动子活性都被抑制(图5A-B)。同样用2mM EGTA或BAPTA/AM处理PBMCs后，流感病毒感染诱导IL-27的表达量也被抑制，前者由288.79±122.30pg/ml降到116.61±38.44pg/ml；后者将到212.01±60.85pg/ml(图5C)。Ca离子被螯合后，同样也抑制了流感病毒促进的CREB入核(图5D)。

综合这部分的实验，我们可以得出A型流感病毒感染通过PKA信号通路激活CREB，促进CREB结合到IL-27/EBI3启动子，激活IL-27表达。同时，Ca离子信号通路又在PKA-CREB信号通路的上游。

四、流感病毒通过COX-2/PGE2-PKA通路诱导IL-27表达

(一)实验材料

1、细胞及病毒株

同前所述。

2、质粒

p-CMV-COX-2真核细胞过表达质粒有本室保存。

3、生化试剂及试剂盒

COX-2特异性抑制剂NS-398，PGE2购自Sigma(St.Louis，MO)。

兔多克隆抗体磷酸化-PKA，PKA，COX-2购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

4、耗材及仪器

同前所述。

(二)实验方法

1、高纯质粒的提取

同前所述。

2、细胞培养、病毒感染和瞬时转染

同前所述。

3、抑制剂的处理

同前所述。

4、细胞核抽提物的制备、细胞蛋白样品的制备和Western blot同前所述。

(三)实验结果与讨论

炎症因子COX-2在A型流感病毒感染中显著上调已有很多研究结果报道，而COX-2的催化产物PGE2，又是PKA-CREB信号通路的主要调节因子。为了验证是否由PGE2调控的PKA-CREB通路也参与了流感病毒感染诱导IL-27的表达，我们首先在A549细胞中过表达COX-2，然后检测IL-27的表达水平。结果显示，过表达COX-2显著上调了IL-27，由146.08±40.35pg/ml上升到246.96±36.40pg/ml(图6A)。同时，过表达COX-2也促进了CREB转核和PKA的磷酸化(图6B-C)。这一结果说明，流感病毒感染可能通过上调COX-2来激活PKA-CREB通路，最终诱导IL-27表达。接着，我们用COX-2的特异性抑制剂NS-398处理PBMCs，并用流感病毒感染。结果显示，当COX-2的活性被NS-398抑制后，流感病毒诱导的IL-27表达也随之下降，由288.79±122.30pg/ml降到198.05±14.00pg/ml。由于NS-398是抑制COX-2的催化活性，使其不能催化产生PGE2。我们于是在NS-398抑制COX-2后补加了外源的PGE2，检测了IL-27的表达。结果发现外源的PGE2可以补偿COX-2被NS-398抑制后的生物活性，被抑制的流感病毒诱导的IL-27表达重新回复到263.20±96.30pg/ml(图6D)。同样的结果，COX-2被抑制后，流感病毒激活的CREB转核和PKA的磷酸化均被抑制，而加入外源的PGE2则可以回复流感病毒促进的CREB转核和PKA的磷酸化(图6E-F)。为了进一步流感病毒诱导PGE2的作用，我们单独用外源的PGE2处理PBMCs。结果发现，PGE2可以单独诱导产生IL-27，由98.00±26.43pg/ml上调到346.96±50.50pg/ml。当PKA被H-89抑制后，PGE2诱导产生的IL-27下降到105.50±56.00pg/ml(图6G)。类似的，PGE2可以单独诱导CREB转核和促进PKA的磷酸化。但这同样可以被PKA抑制剂H-89抑制(图6H-I)。

总结这一部分结果，我们得出A型流感病毒感染诱导炎症因子COX-2的高表达和其催化产物PGE2的累积。PGE2累积则激活PKA-CREB信号通路，最后促进IL-27/EBI3启动子的活化和IL-27的表达。

五、IL-27可以通过激活PKR来抑制流感病毒的复制

(一)实验材料

1、细胞及病毒株

同前所述。

2、Real-time PCR混合物

同前所述。

3、生化试剂及试剂盒

重组人IL-27蛋白购自R&D SystemsR&D Systems(Minneapolis，MN，USA)。羊多克隆抗体-磷酸化-PKR，磷酸化-STAT1，人-actin；鼠单克隆抗体PKR；兔多克隆抗体-STAT2购自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

兔多克隆抗体-STAT1和兔多克隆抗体-磷酸化-STAT2购自Cell Signaling(Danvers，MA，USA)。

4、耗材及仪器

同前所述。

(二)实验方法

1、细胞培养和病毒感染

同前所述。

2、重组人IL-27蛋白处理细胞

处理前，弃去细胞培养基，更换为无胎牛血清的培养基，加入终浓度为50ng/ml的重组人IL-27蛋白，37℃，5％(体积比)CO₂细胞培养箱静置培养12h，然后进行下一步并病毒感染或检测相应蛋白表达。

3、抗病毒实验

A549细胞预先如4.6.2.2处理后，感染1 MOI的A/HongKong/H3N2，感染3h后，收集细胞，提取总RNA，方法如前所述。对于每个时间见梯度，病毒HA效价的测定，则在设计的时间点，取A549细胞的培养上清。

4、荧光定量检测病毒NP基因三种类型RNA的表达

1)因为是检测病毒在细胞内的复制，所以常规的提取细胞总RNA。

2)逆转录三种类型病毒NP RNA，引物如下：

NP-vRNA：5′-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3’(SEQ ID NO：14)；

NP-cRNA：5′-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3′(SEQ IDNO：15)；

NP-mRNA：oligo(dT)。

逆转录反应条件如前所述：

3)荧光定量PCR检测，引物如下

正义链：5’-ATCAGACCGAACGAGAATCCAGC-3’(SEQ ID NO：16)

反义链：5’-GGAGGCCCTCTGTTGATTAGTGT-3’(SEQ ID NO：17)

以GAPDH为内参，荧光定量PCR反应条件如前所述。

5、病毒HA效价的测定

1)病毒HA效价测定的原理是根据流感病毒表面的HA，能作用于红细胞表面相应的受体，将大量的红细胞连接在一起，发生肉眼可见的红细胞凝集现象。

2)吸取0.9ml的生理盐水或PBS加于血凝板的第2空，从第3孔到第10空，各加生理盐水或PBS 0.4ml，第1孔加入0.4ml感染病毒的细胞培养上清，第2空加入0.1ml感染病毒的细胞培养上清，用移液枪反复吹打3-4次，混匀。

3)从混匀的第2空中吸取0.4ml混合液至第3孔，混匀；再吸取0.4ml混合液至第4孔，如此倍比稀释至第9孔，第10孔为红细胞对照，即不加感染病毒的细胞培养上清，各孔内的液体量应为0.4ml，多余的弃去。

4)从第10孔开始，按10-1的方向，向每空加入0.4ml 1％(体积比)的鸡红血球，轻轻振荡混匀，室温放置1h后，观察实验结果并记录，各孔液体总体积应为0.8ml。

5)实验结果以++++，+++，++，+，-，表示；红细胞均匀分布于孔底记录为++++；红细胞均匀分布于孔底，但有卷边现象，记录为+++，即不完全凝集；红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集者以++表示。

6)血球凝集实验的血凝滴度是以++凝集的病毒稀释度表示，这一稀释病毒液的效价就是一个HA单位。

6、细胞蛋白样的制备和Western blot

如前所述。

(三)实验结果和讨论

为了进一步探讨流感病毒感染上调IL-27表达的生物学功能，根据已经报道的IL-27抑制病毒复制实验。我们用50ng/ml重组人IL-27预先处理A549细胞12h，然后感染H3N23小时，然后收集细胞，检测病毒NP基因的表达情况。结果显示，和对照组相比，IL-27能够明显抑制流感病毒的复制，三种类型的病毒NP基因的表达水平都被显著抑制(图7A)。进一步研究显示，随着时间的推移释，IL-27处理过的细胞，感染后放到细胞培养基上清的病毒明显减少，显示为HA效价不能升高(图7B)。

对于IL-27抗流感病毒复制的机制，我们也进行了研究。Western blot显示，50ng/ml重组人IL-27处理A549细胞12h后，干扰素抗病毒信号激活因子STAT1和STAT2的磷酸化水平都有了上调(图8A-B)，抗病毒因子PKR的磷酸化水平也同样提高(图8C)。

通过这一部分的实验，我们得出流感病毒感染上调IL-27的表达是机体应对病毒的入侵，自我防卫的免疫机制。IL-27能起到类似干扰素的作用，激活抗病毒信号激活因子STAT1和STAT2，促进抗病毒因子PKR的磷酸化，最终抑制流感病毒的复制。

六、IL-27在流感病人血清中表达水平和血清PGE2的临床相关性

(一)实验材料

1、临床样本

115份健康人血清标本，85份H3N2感染病人血清标本，20份2009-A型H1N1感染病人血清由湖北省疾病预防与控制中心协助收集。其中病人标本确定为H3N2感染或2009-A型H1N1感染并且无HBV、HCV、HIV等病毒感染，血清收集时，病人并无用药史。

2、试剂盒

LEGEND MAX^TM Human IL-27ELISA kit购自BioLegend(San Diego，CA，USA)Parameter^TM Prostaglandin E2 Immunoassay kit购自R&D Systems。

3、仪器和耗材

同前所述。

(二)实验方法

1、ELISA检测IL-27，PGE2表达

同前所述。

(三)实验结果与讨论

我们分别检测了健康人、H3N2季节性流感病毒感染者和2009-H1N1感染者中IL-27表达，结果发现无论是季节性流感还是2009-H1N1感染者，其血清中IL-27的表达量都显著高于正常人。H3N2：961.65±403.67pg/ml；H1N1：964.51±483.28pg/ml；正常人：503.45±312.20pg/ml(图9A)。而和通过相关性分析，血清中IL-27的表达量和对应PGE2的表达量成线性相关，相关系数R2＝0.6464(图9B)。这一结果，验证了签名细胞水平上IL-27表和PGE2的关系，进一步说明了流感病毒感染，PGE2表达和IL-27上调的相关性。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用

 

<130> 

 

<160>  17   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gagccaggta ctacgtccaa                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gctaggcaga tcccatcc                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cgctttgcgg aatctcac                                                   18

 

 

<210>  4

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gggcatggaa gggctgaa                                                   18

 

 

<210>  5

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggaaggtgaa ggtcggagtc aacgg                                           25

 

 

<210>  6

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ctcgctcctg gaagatggtg atggg                                           25

 

 

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

ctacgcgttc tgtcatcccc ctt                                             23

 

 

<210>  8

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

attagatcta gacatgatcc gaggccagtc ctcg                                 34

 

 

<210>  9

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

ctacgcgtgt ctctgtatcc ctc                                             23

 

 

<210>  10

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

ctacgcgtgg cctgtgctcc cca                                             23

 

 

<210>  11

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ctacgcgttc ccacgacgtt ccc                                             23

 

 

<210>  12

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

gtcatgcccc tttctctgtc tgtca                                           25

 

 

<210>  13

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

gagaaagaca agaggaagag gacaa                                           25

 

 

<210>  14

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

ctcaccgagt gacatcaaca tcatg                                           25

 

 

<210>  15

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

agtagaaaca agggtatttt tctttaattg tcat                                 34

 

 

<210>  16

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

atcagaccga acgagaatcc agc                                             23

 

 

<210>  17

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

ggaggccctc tgttgattag tgt                                             23

Claims (2)

1.白细胞介素-27用于制备抗甲型流感病毒药物。

2.抗甲型流感病毒的药物，其中含有白细胞介素-27。

Images