CN102816794A - 一种鼠源il-27重组蛋白真核表达载体及构建方法 - Google Patents

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梁瑞芳
刘畅
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Abstract

本发明公开了一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体及构建方法。其构建流程是设计引物分别将编码小鼠EBI3氨基酸1-228的cDNA序列与编码小鼠p28氨基酸29-234的cDNA序列扩增，然后通过SOEPCR的方法获得整合的DNA片段。将此片段与pcDNA3.1+载体连接后得到鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12。其中EBI3和p28通过预先设计的氨基酸编码序列连接。本发明所构建的载体，不仅能高效表达由EBI3和p28组成的异源二聚体IL-27，而且包含6×组氨酸编码序列，极大方便了重组蛋白的纯化。并且可将其关键片段克隆至其他载体上以方便不同情况下的蛋白表达应用，为研究IL-27功能及基因治疗方法的研究提供了一个有效工具。

Description

一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体及构建方法
技术领域
本发明属于免疫学及分子生物学技术领域。
背景技术
IL-27（Interleukin-27），是近些年发现的新的白细胞介素，该细胞因子在免疫系统中对于炎症及肿瘤有广泛而重要的作用。IL-27重组蛋白在此领域的研究中具有重要意义。然而由于IL-27由EBI3和p28亚基共同组成一个异源二聚体，使得该蛋白的表达载体构建相对困难。
发明内容
本发明的目的是解决IL-27重组蛋白的表达载体构建问题，提供一种高效表达IL-27的真核表达载体，以及方法简单、操作方便的构建方法。
本发明首先提供了一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12，以及用于构建该载体的相关引物：引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1，PRM-150如序列表SEQ ID No.2，PRM-151如序列表SEQ ID No.3，PRM-152如序列表SEQ ID No.4。
本发明的关键片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No.7所示，其对应的氨基酸序列为：EBI3(met1-pro228)-(GGGS)4-p28(phe29-ser234)-6×His-stop condon.
本发明同时提供了EBI3和p28的连接链(GGGS)4的编码DNA序列，如序列表SEQ IDNo.9所示。
本发明将pcDNA3.1+作为基础载体实现了高效的蛋白表达效率。
本发明所述鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体的构建方法，包括下列步骤：
第1、设计引物
引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1所示，包含了KpnI酶切位点和EBI3的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-150如序列表SEQ ID No.2所示，包含了(GGGS)4链编码序列、EBI3的3’端编码序列的一部分和p28的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-151如序列表SEQ ID No.3所示，包含了p28的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-152如序列表SEQ ID No.4所示，包含了p28的3’端编码序列的一部分、6×组氨酸编码序列，终止密码子以及XhoI酶切位点；
第2、扩增关键片段pSZ12-insert
首先提取IFN-γ+CpG刺激的小鼠树突状细胞的总RNA，逆转录酶反转成cDNA，以此为模板，以引物PRM-149和PRM-150扩增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No.5所示，以引物PRM-151和PRM-152扩增出片段pSZ12-R，如序列表SEQ ID No.6所示；
然后以纯化后的pSZ12-L和pSZ12-R为模板，以PRM-149和PRM-152为引物做SOEPCR，扩增出关键片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No.7所示（附图1）；
第3、将pSZ12-insert和pcDNA3.1+载体用KpnI+XhoI双酶切并纯化后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性LB培养基平板；
第4、鉴定质粒pSZ12，如序列表SEQ ID No.8所示；
挑取单克隆，氨苄抗性液体LB培养基培养并提质粒。
酶切鉴定（附图2），并测序鉴定，与预期设计完全一致。
本发明的优点和积极效果：
本发明中的关键片段pSZ12-insert可克隆至其他载体上，以方便不同情况下的IL-27重组蛋白的表达应用。
本发明提供了自主设计的(GGGS)4连接两个亚基，可以保证两个亚基的同时表达并形成类似内源性蛋白的结构。
本发明中pcDNA3.1+所包含的neo抗性基因序列可以方便构建稳定表达细胞系。neo抗性基因序列使成功转染的细胞具有对一定浓度G418的抗性，利用这一特点可以通过向培养基中加入适当浓度的G418来筛选出成功转染该表达载体的细胞并进行培养，从而构建出稳定表达的细胞系。
本发明中所包含的6×组氨酸编码序列可以方便IL-27重组蛋白的纯化。现在市场上已经有成熟的筛选带有6×组氨酸标签的蛋白的纯化柱，可以很方便的将表达出的IL-27重组蛋白收集纯化，且不影响IL-27重组蛋白的生物学活性。
本发明的表达载体可以通过转化入DH5α感受态细胞进行扩增，其中pcDNA3.1+所包含的Ampicillin抗性基因序列可用于对转化成功的细菌进行筛选，方便快捷。将该表达载体转入细菌后用含有氨苄抗生素的液体培养基培养细菌至所需浓度，提取质粒即可得到大量扩增的重组蛋白表达载体，用于后续试验。
附图说明
图1.鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12的关键序列pSZ12-insert示意图。
图2.pSZ12的酶切鉴定。
图中，M表示DNA标准条带，从上到下依次是8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp。1-6表示用XhoI对pSZ12进行单酶切，条带大小为6743bp，7-12表示用XhoI和KpnI对pSZ12进行双酶切，条带大小为5364bp和1379bp。
图3.pSZ12转染293T细胞的蛋白表达水平鉴定。
图中，Control表示对照质粒pcDNA3.1+，ND表示未检测出。对照质粒和pSZ12转染293T细胞后24小时及48小时收细胞上清，用ELISA方法检测其中的IL-27含量。
具体实施方式
实施例1（附图1、附图2）
鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体的构建方法
1.引物设计与关键片段pSZ12-insert的扩增
引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1所示，包含了KpnI酶切位点和EBI3的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-150如序列表SEQ ID No.2所示，包含了(GGGS)4链编码序列、EBI3的3’端编码序列的一部分和p28的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-151如序列表SEQ ID No.3所示，包含了p28的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-152如序列表SEQ ID No.4所示，包含了p28的3’端编码序列的一部分，6×组氨酸编码序列，终止密码子以及XhoI酶切位点；
首先提取IFN-γ+CpG刺激的小鼠树突状细胞的总RNA，逆转录酶反转成cDNA，以此为模板，以引物PRM-149和PRM-150扩增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No.5所示，以引物PRM-151和PRM-152扩增出片段pSZ12-R，如序列表SEQ ID No.6所示；
然后以纯化后的pSZ12-L和pSZ12-R为模板，以PRM-149和PRM-152为引物做SOEPCR，扩增出关键片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No.7所示（附图1）。扩增的反应条件为98℃预变性2min，以98℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸1min，扩增30个循环，末次循环后再72℃延伸10min，之后4℃保温。PCR产物均经1%琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化。
2.鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12的构建与鉴定
将pSZ12-insert和pcDNA3.1+载体用KpnI+XhoI双酶切，分别用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下定向连接pSZ12-insert至pcDNA3.1+，将连接产物转化入DH5α感受态细菌中，在LB（Amp+）培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒，分别对pSZ12进行XhoI单酶切与KpnI和XhoI双酶切鉴定（附图2），选取阳性克隆进行测序，测序结果与预期设计完全一致。
实施例2（附图3）
利用鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12体外表达IL-27重组蛋白1.293T细胞培养在10cm细胞培养盘中，加入10ml含10%小牛血清的DMEM新鲜培养基至80%左右生长密度。
2.将10μg的pSZ12质粒和control对照质粒分别加入500μLOpti-MEM培养基，混匀，再加入15μL FuGENE HD转染试剂，混匀。室温放置15分钟。
3.将转染试剂混合物滴加入细胞培养盘，轻轻晃匀，继续放入培养箱培养。
4.转染后24小时和48小时分别收集细胞上清，用IL-27的ELISA试剂盒检测上清中表达的IL-27重组蛋白。在用control对照质粒转染的293T细胞上清中均检测不到IL-27重组蛋白的表达；在用pSZ12质粒转染的293T细胞上清中则能够检测到IL-27重组蛋白的表达，且表达量较高。
Figure IDA00002046770800031
Figure IDA00002046770800041

Claims (5)

1.一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12，如序列表SEQ ID No.8所示。
2.一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体的构建方法，包括下列步骤：
第1、设计引物
引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1所示，包含了KpnI酶切位点和EBI3的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-150如序列表SEQ ID No.2所示，包含了(GGGS)4链编码序列、EBI3的3’端编码序列的一部分和p28的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-151如序列表SEQ ID No.3所示，包含了p28的5’端编码序列的一部分；
引物PMR-152如序列表SEQ ID No.4所示，包含了p28的3’端编码序列的一部分，6×组氨酸编码序列，终止密码子以及XhoI酶切位点；
第2、扩增关键片段pSZ12-insert
首先提取IFN-γ+CpG刺激的小鼠树突状细胞的总RNA，逆转录酶反转成cDNA，以此为模板，以引物PRM-149和PRM-150扩增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No.5所示，以引物PRM-151和PRM-152扩增出片段pSZ12-R，如序列表SEQ ID No.6所示；
然后以纯化后的pSZ12-L和pSZ12-R为模板，以PRM-149和PRM-152为引物做SOEPCR，扩增出关键片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No.7所示；
第3、将pSZ12-insert和pcDNA3.1+载体用KpnI+XhoI双酶切并纯化后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性LB培养基平板；
第4、鉴定质粒pSZ12
挑取单克隆，氨苄抗性液体LB培养基培养并提质粒，酶切鉴定并测序鉴定。
3.引物PRM-149如序列表SEQ ID No.1，PRM-150如序列表SEQ ID No.2，PRM-151如序列表SEQ ID No.3，PRM-152如序列表SEQ ID No.4。
4.一种鼠源IL-27重组蛋白真核表达载体pSZ12中的关键片段pSZ12-insert的序列，如序列表SEQ ID No.7所示。
5.EBI3和p28的连接链(GGGS)4的编码DNA序列，如序列表SEQ ID No.9所示。
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