CN1869217A - 以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法。其特征是：利用复制缺陷型腺病毒骨架质粒载体携带不同种目标蛋白基因序列，在含有Ad5型腺病毒基因组E1A区序列的包装细胞系获得重组蛋白基因载体，在动物乳腺，获得瞬时高效表达的各种外源目标基因药物蛋白。操作步骤如下：(1)分离、克隆目标药物蛋白基因序列；(2)将所克隆目标蛋白基因与单标记筛选载体或双标记选择载体构成融合真核表达载体，体外真核细胞表达检测目标蛋白，获得体外表达正确的药物蛋白基因；(3)将所需目标蛋白基因与腺病毒基因组骨架分子重组，获得含重组目标药物蛋白基因的腺病毒载体；(4)将该重组目标药物蛋白基因腺病毒载体导入动物乳腺；(5)乳汁中分泌获得所需目标药物蛋白，获得高表达目标蛋白药物的动物。该乳汁中表达的重组蛋白可直接开发成各种保健品和药品，含有重组目标蛋白的动物奶也可直接开发成高附加值的保健奶及奶制品。

Description

以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法

技术领域

本发明属于细胞生物学、分子生物学和基因工程技术领域，尤其是一种以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法。

背景技术

转基因动物技术可按照人们的意愿将所需目标蛋白通过动物体表达生产，从而转基因动物成为活的“药物工厂”。其中，动物乳腺生物反应器是转基因蛋白药物生产中最为热门的研究之一，其原理是利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在动物乳腺中表达，并从转基因动物乳腺分泌的乳中获取需要的重组药用或保健蛋白。

其常规方法是利用DNA基因重组技术和转基因技术将表达目标蛋白的基因导入到动物早期受精胚胎中，再经胚胎移植技术，获得整合有目标基因的乳腺表达个体，转基因后代再经过进一步繁育，通过检测筛选获得稳定表达有目标蛋白的转基因群体。从而可通过转基因动物的乳汁，来获得目的基因表达产物即药用或保健蛋白。其主要步骤包含：(1)构建乳腺特异表达载体，在构建乳腺表达的外源基因时，外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即要有一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达，再通过回收乳汁得到目标蛋白。(2)通过各种转基因方法将乳腺特异表达载体导入原核期胚胎或体细胞，获得重组胚胎或转基因细胞；(3)将筛选正确的转基因胚胎或转基因体细胞，通过胚胎移植或核移植技术获得转基因动物个体；(4)将转基因动物个体进一步繁育，检测筛选后代目标基因蛋白表达，获得稳定遗传健康的转基因动物。

目前，乳腺生物反应器的应用主要体现在四个方面：一是建立转基因动物生物反应器模型，如利用转基因小鼠可为其它转基因动物生物反应器的研究和应用开辟道路；二是生产药用珍稀的蛋白或因子，如导入人凝血因子等；三是提高乳汁的营养价值，并降低有害物质的含量，如导入乳铁蛋白基因以提高乳铁蛋白在乳中的含量，导入溶菌酶基因以降低乳中细菌的含量。四是改变乳汁的组成成分，使其性质更接近人乳，提高动物乳汁的应用价值，更好的为人类服务。

由此可见，利用乳腺生物反应器原理生产基因工程蛋白药物是目前国际上的研究热点，外源基因蛋白可在动物乳腺上皮细胞中表达，并分泌到乳汁中，从而在动物乳汁中获得重组蛋白药物。因而，动物乳腺成为生产基因工程蛋白药物的首选体系，目前通过原核显微注射或体细胞核移植转基因技术已成功获得了表达人类重要药用蛋白或生物活性因子的转基因牛、羊、兔、猪等。然而，该技术仍存在不可避免的缺陷：(1)是需要复杂的技术程序操作，导致转基因结果不稳定。(2)该法在大动物上转基因成功率极低，造成生产成本居高不下。(3)由于转入的外源目标基因的位置效应，使得目标基因表达水平很低。(4)外源基因在动物体内的异源表达往往给动物健康造成伤害，影响基因工程蛋白药物的生产。本发明针对上述技术体系缺陷，首次以腺病毒为载体，研制开发了导入动物乳腺生产基因工程蛋白药物的方法。本技术发明的优势在于：(1)不需要构建乳腺特异表达载体，从而简化了转基因蛋白药物生产程序；(2)以腺病毒为载体直接导入乳腺，可获得高表达的目标蛋白药物；(3)乳腺组织可以对人体蛋白质进行正确的修饰和转录后加工，蛋白药物产品的生物学活性接近天然产品：(4)目标蛋白药物在乳腺中高水平短期表达，无需对动物进行长期维持培育，大大降低了生产成本。

腺病毒(adenovirus)是线状双链DNA病毒，基因组内有14个基因。其形态特征表现为二十面体病毒壳体。其病毒壳体含有3种主要的蛋白：六邻体(II)，五邻体基底(III)和纤突(IV)，还有多种其他的辅助蛋白VI，VIII，IX，IIIa和Iva2。腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，其5′端与一种末端蛋白(TP)共价结合，5′端上还具有末端反向重复序列(ITRS)。病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合。另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体之间提供了结构上的联系。病毒含有一种病毒自身编码的蛋白酶，这种蛋白酶对于加工某些结构蛋白从而产生成熟的具有感染性的病毒是必需的。腺病毒载体的主要特点是：(1)宿主范围较广，不仅能感染分裂期的细胞，也能感染非分裂期的细胞，如神经细胞。(2)腺病毒载体不会整合进入宿主细胞基因组，而是以附加体形式游离在宿主细胞基因组外，这样就避免了病毒载体插入宿主细胞基因组可能引起基因突变等后果，因而使用时更安全。

至今，国内外有关腺病毒载体的应用一直侧重于基因治疗方面，由于腺病毒可将自身的基因组传递到细胞核中，并且高效率地复制，所以腺病毒一直成为表达和传递治疗型基因的主要候选载体。目前国际上有关腺病毒基因治疗的临床实例应用已上千种，而国内近3年来也已批准了3个有关腺病毒载体应用于人类基因治疗的基因工程药物。但是，迄今为止，腺病毒载体在重组药物蛋白生产方面至今未见到相关应用报道。

发明内容

为了克服目前转基因蛋白药物生产种存在的上述技术体系缺陷，本发明提供一种以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法。该发明首次以腺病毒为载体，将其导入动物乳腺，获得高质量、高表达的重组基因蛋白药物，该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用，是乳腺生物反应器原理生产转基因蛋白药物产品的新应用。该方法无论在转基因技术理论领域，还是在基因工程药物生产方面，均具有其创造性和实用性。

本发明的技术方案由以下步骤组成：

(1)分离、克隆目标药物蛋白基因序列：

以pUC18、pUC19、pGEM-3ZF、pShuttle、pcDNA3系列质粒为克隆载体，将目标蛋白或细胞因子hLTF(人乳铁蛋白基因)hGH(人生长激素基因)、hEPO(人促红细胞生成素)、t-PA(组织型纤溶酶原激活剂)、IL-15(白细胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白细胞介素-2)、hVEGF(血管内皮细胞生长因子)、NKSF(自然杀伤细胞刺激因子)、HGF(肝细胞生长因子)10种基因通过分子克隆，分别获得了含有目标基因的质粒系列载体；

(2)将所克隆目标蛋白基因与单标记筛选载体或双标记选择载体构成融合真核表达载体，体外真核细胞表达检测目标蛋白，获得体外表达正确的药物蛋白基因：

以COS7(非洲绿猴肾细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293(人胚胎肾细胞)为宿主细胞对所构建的真核融合蛋白表达载体进行体外表达。Western Blotting、ELASA检测目标基因表达水平，获得了体外表达正确的所需蛋白药物基因；

(3)将所需目标蛋白基因与腺病毒基因组骨架分子重组，获得含重组目标药物蛋白基因的腺病毒载体：

将所需目标基因接入穿梭载体，再与腺病毒基因组骨架质粒在细菌或真核细胞中重组，并在腺病毒包装细胞系生产出含有重组目标蛋白基因的复制缺陷型腺病毒载体；

(4)将该重组目标药物蛋白基因腺病毒载体导入动物乳腺：

以含有重组目标蛋白基因的复制缺陷型腺病毒为载体，直接导入动物乳腺，使目标蛋白基因在乳腺上皮细胞内表达，利用乳腺上皮细胞基本特性，将目标蛋白分泌到动物乳汁中；

(5)乳汁中分泌获得所需目标药物蛋白，获得高表达目标蛋白药物的动物。

其中步骤一中所使用目标蛋白基因主要包括：hLTF(人乳铁蛋白基因)hGH(人生长激素基因)、hEPO(人促红细胞生成素)、t-PA(组织型纤溶酶原激活剂)、IL-15(白细胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白细胞介素-2)、hVEGF(血管内皮细胞生长因子)、NKSF(自然杀伤细胞刺激因子)、HGF(肝细胞生长因子)。

其中步骤一中克隆分离的目标蛋白基因大小范围在0.5kb-10Kb之间，乳汁中均可获得重组目标蛋白，且具有与天然蛋白相同或相似的生物学功能。

其中步骤二中所用表达载体pCDNA3.1(INVITROGEN)含有NEO(新霉素抗性基因)抗性标记，可进行抗性阳性细胞蛋白表达筛选。所用双标记选择载体为pGFP-IRES-NEO(CLONTECH)，增添了绿色荧光表达阳性细胞克隆筛选功能。

其中步骤二中，所使用宿主细胞为COS7(非洲绿猴肾细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293(人胚胎肾细胞)，使用转染方法为用常规磷酸钙法或脂质体法作瞬时转染或稳定转染不同细胞，瞬时转染48-72h，稳定转染经G418抗性筛选阳性细胞克隆，分别对转染细胞上清或细胞沉淀进行免疫印迹检测基因表达产物。

其中步骤二中，所用表达载体pCDNA3.1含有NEO(新霉素抗性基因)抗性标记，可进行抗性阳性细胞蛋白表达筛选。所用双标记选择载体为pGFP-NEO，增添了绿色荧光表达阳性细胞克隆筛选功能。

其中步骤三中，腺病毒骨架序列保留了野生型腺病毒大部分基因组序列，删除了E1、E3以及IVa2，允许插入最大约14kb的目标蛋白核苷酸序列。

其中步骤三中，所用穿梭载体为pShuttle(STRAGENE)或pshuttle-cmv(STRAGENE)、pDC311(MICROBIX)或pDC315(MICROBIX)，所用腺病毒骨架质粒为pAdeasy(STRAGENE)或pBHGlox(delta)E1.3Cre(MICROBIX)。

其中步骤三中所用腺病毒包装系细胞为911、HEK293。

其中步骤四中，将获得的重组腺病毒载体经两轮氯化铯密度梯度离心纯化后，PBS(pH7.2)溶解，滴度范围10⁶-10¹²PFU/ml，直接导入动物乳腺。

其中步骤五中所述重组蛋白乳汁，经过常规缓冲液稀释后，通过常规高速离心方法，从乳清中获取目标蛋白药物。

本发明中所述生产重组药物蛋白在动物乳汁中持续表达时间为10-20天，目标蛋白表达量为0.3g-8g/L。

本发明所使用的技术路线适合于腺病毒为载体进行乳腺表达的牛、羊、猪和兔生产所需目标药物蛋白。

本发明的有益效果：(1)选用乳腺生产蛋白药物具有优势：动物乳腺是一个封闭系统，乳腺组织内环境表达的蛋白具有接近天然蛋白生物活性，可对外源目标基因蛋白进行复杂修饰功能，且乳腺表达的蛋白大多不会回流到血液循环，避免高表达的外源蛋白对动物造成伤害。(2)选用复制缺陷型腺病毒载体是真核表达载体系统，可正确运载并高效表达目标蛋白药物基因。由于腺病毒载体不整合进宿主细胞基因组，而是以附加体形式游离在宿主细胞基因组外，这样就避免了病毒载体插入宿主细胞基因组可能引起基因突变等后果，因而使用时更安全。(3)动物乳腺组织是一种有效的活的“蛋白合成工厂”。例如，一头奶牛一天可生产乳20-60kg，一只绵羊和山羊一天可产乳2-5kg，如将把百分之一的乳合成药用蛋白，可产生十分可观的效益。(4)缩短新药开发周期，降低新药研发成本。传统药物研发到药审，直到上市，整个过程需要10-15年，如果利用本发明方法进行新药研发周期仅需3-5年。大大降低了药物研发成本，特别是人类昂贵药物蛋白研发，可产生巨额经济利润。

附图说明

图1重组hLTF基因腺病毒载体限制性酶切图谱

泳道0为标准DNAMaker λ/EcoR I+Hind III，片断大小依次为：21226bp、5148bp、4973bp、4268bp、3530bp、2027bp、1904bp、1584bp、1357bp、947bp、831bp、564bp、125bp；

泳道1、3、5、7、9为腺病毒基因组DNA限制性内切酶切片断作为对照；所用内切酶分别为：EcoR V、KpnI、Sal I、Sph I、Pac I；

泳道2、4、6、8、10为重组hLTF腺病毒载体限制性内切酶切片断；所用内切酶同上分别为：EcoR V、KpnI、Sal I、Sph I、Pac I；

图2重组腺病毒基因组琼脂糖电泳图

泳道M为标准DNAMaker Lambda DNA/Hind III酶切片断大小依次为：27491bp、9416bp、6557bp、2322bp、2027bp、564bp；

泳道1、2、3、4均为含重组正确的目标基因腺病毒载体质粒；

图3乳腺表达hLTF羊乳清样SDS-PAGE蛋白电泳及Western免疫印迹结果

左边泳道为标准蛋白Maker，其大小依次为83KD、62KD；

泳道S为hlTF标准品；泳道0为正常未转病毒的羊乳清，为阴性对照；泳道A为2号产目标蛋白羊乳清样；

图4乳腺表达hLTF兔乳清样SDS-PAGE蛋白电泳及Western免疫印迹结果

左边泳道为标准蛋白Maker，其大小依次为25KD、15KD；

泳道S为hGH标准品；泳道1、2、3分别为1、2、3号兔表达有hGH的乳清样；

图5双标记选择载体pGFP--neo质粒结构图

pCMV为病毒启动子，IRES为核糖体内部进入位点序列，Neomycin为Neo-即新霉素抗性基因；GFP基因插入MCS A位点，表达绿色荧光蛋白基因。

图6腺病毒骨架载体pAdeasy结构图

pBR322ori为原核复制子，AD5为腺病毒骨架基因组DNA，其上下游为2个同源臂序列，即left arm和right arm。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明

实施例1

以腺病毒为载体导入羊乳腺表达生产人乳铁蛋白。

(一)分离、克隆目标药物蛋白基因序列

1.人乳腺组织总RNA的提取

(1)切取一小块冷冻的乳腺组织，快速称量后即移入新鲜配制的裂解缓冲液中，按每50mg组织加裂解缓冲液1ml量。

(2)对乳腺组织进行匀浆破细胞，预过滤离心一次，收集虑出液。

(3)加入等体积氯仿，振荡混匀，离心后吸取上清。

(4)加入等体积70％乙醇，轻轻混匀，离心获得总RNA。

(5)用0.01％DEPC处理过的无Rnase的水溶解沉淀，常规方法进行含量测定。

2.反转录法合成总cDNA

(1)取1-2ug乳腺总RNA，加入DEPC处理的水至9.5ul，70℃，5-10min，放于冰上。

(2)50uL反应体系：2.5ul OligodT(20pmol/L)，5uL 10×RNA PCRbuffer，10ul MgCl₂(25mmol/L)，5uL dNTP(各10mmol/L)，1.25uL Rnase抑制剂(40U/uL)，2.5uL AMV反转录酶(5U/uL)，加入9.5uL处理后的总RNA。

(3)反应条件：先放于30℃保温10min，然后于42℃保温15min，再于99℃保温5min，然后于4℃保温10min，最后将产物保存于-70℃备用。

3.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增hLTF cDNA

(1)设计如下特异引物用于PCR扩增，使引物终浓度为20uM。

(2)hLTF上游引物：atgaaacttgtcttcctcgtcctg

   hLTF下游引物：ttacttcctgaggaattcacagg

(3)100uL反应体系中连续加入：10×PCR buffer 10uL，dNTP(各2.5mmol/L)16uL，上游引物1ul，下游引物1ul，取2中合成的cDNA产物2uL，补加dH₂O至100uL。

(4)PCR反应条件：94℃预变性5min，97℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，72℃再延伸10min。产物保存于-70℃备用。

4.hLTF基因的纯化

将hLTF PCR产物纯化，使用商用试剂盒，如BIOTECH公司或V-GENE公司的PCR产物快速纯化KIT。

(1)标准琼脂电泳分离上述PCR产物，琼脂糖浓度为1％，100V稳压状态，电泳40min。

(2)在紫外灯下，切取凝胶上DNA约2.2K大小的片断，并称重。

(3)按试剂盒说明要求，一定比例加入溶胶缓冲液，于37-55℃溶胶，期间不停晃动。

(4)添加溶胶后样品于吸附柱子上，吸附DNA，用Washing Buffer漂洗2次。

(5)加入dH₂O于吸附柱子中，离心洗脱DNA，于-20℃保存。

5.hLTF cDNA的克隆、扩增

将PCR纯化产物用适当酶切后，同时用将PUC18克隆载体用相同酶切后进行连接反应。

(1)连接反应：1uL PCR纯化产物，0.5uLPUC18质粒，0.5uL T4DNALigase酶，1uL 10×T4DNA Ligase Buffer，7uL dH₂O。16℃过夜孵育。

(2)细菌转化：取5-10ul上述连接反应产物，用常规CaCL₂化学法，热刺激转化感受态DH_5a。

(3)转化菌铺板于氨苄抗性(100ug/mLAmp+)的固体细菌培养板，37℃培养。

(4)次日，挑取单菌落，接种于3-5mL液体LB培养液中，37℃保温10-15h。

(5)常规碱裂解法小提质粒，限制性酶切分析重组质粒。

6.hLTF基因序列测定

将限制性酶切分析正确的重组阳性质粒，纯化后送至基因测序公司进行基因序列测定。本基因序列在上海INVITROGEN生物公司完成了测序，应用国际上通用BLAST基因序列软件对测序分析结果表明，所克隆的序列与国际GENE BANK中目标蛋白序列完全一致，其完整的基因序列如下：

atgaaacttg tcttcctcgt cctgctgttc ctcggggccc tcggactgtg tctggctggc

cgtaggagaa ggagtgttca gtggtgcacc gtatcccaac ccgaggccac aaaatgcttc

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gttaggagat cagacactag ccttacctgg aactctgtga aaggcaagaa gtcctgccac

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gacgttgcat ttgtgaaaga tgtcactgtc ttgcagaaca ctgatggaaa taacaatgac

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cccctcctgg aagcctgtga attcctcagg aagtaa

(二)将所克隆目标蛋白基因与单标记筛选载体或双标记选择载体构成融合真核表达载体，体外真核细胞表达检测目标蛋白，获得体外表达正确的药物蛋白基因

(1)用限制性内切酶Kpn1和Xho1双酶切hLTF cDNA序列，同样酶切载体质粒pcDNA3.1，按(一)5步骤连接、转化，获得重组子p3.1-hLTF。

(2)按照上述方法，将目标基因片断hLTF cDNA接入pGFP-NEO双选择表达载体，获得质粒载体质粒重组子pGFP-hLTF。

(3)分别将融合表达载体p3.1-hLTF与pGFP-hLTF，脂质体法转染CHO细胞、Cos7细胞，G418抗性筛选获得阳性细胞克隆。

(4)Western Blotting检测分析hLTF在细胞中的表达，验证了hLTF基因编码蛋白的正确性。

(三)、将所需目标蛋白基因与腺病毒基因组骨架分子重组，获得含重组目标药物蛋白基因的腺病毒载体：

(1)将hLTF cDNA接入穿梭载体，与含有腺病毒基因组的骨架质粒一起构建获得重组人乳铁蛋白腺病毒载体AdhLTF。

(2)用重组人蛋白基因腺病毒载体AdhLTF在HEK293、911细胞系中生产病毒载体以及大量扩增。

(3)重组人蛋白基因腺病毒载体进行两轮氯化铯密度梯度离心，获得纯化的重组人乳铁蛋白腺病毒，存于-70℃备用。

(四)将该重组目标药物蛋白基因腺病毒载体导入羊乳腺

实验用羊只来自附近山海关地方农户，将重组腺病毒注入羊乳腺，每侧乳头注射量根据羊乳房生理容量。

(五)乳汁中分泌获得所需目标药物蛋白，获得高表达目标蛋白药物的羊

(1)每日收集羊乳，1000rpm离心，15min，取乳清存于-70℃备后面检测。

(2)常规SDS-PAGE蛋白电泳、Western Blotting蛋白免疫印迹、ELASA酶联免疫法检测乳汁中重组hLTF蛋白的表达。所用一抗为鼠抗人乳铁蛋白单克隆抗体(Sigma公司产品)，二抗为HRP辣根过氧化酶标记抗鼠Ig(北京中山公司)，人乳铁蛋白标准品为Sigma产品。

(3)人乳铁蛋白生物活性检测，根据天然人乳铁蛋白具有的抗菌、抑菌、抗病等生物活性实验检测重组人乳铁蛋白的与功能。

抑菌圈法检测抗菌功能：菌板制作：20mL 2X LB培养基，加入0.2g低融点琼脂糖，高压灭菌，待温度降至37℃左右时加入20mL细菌培养物，充分混匀，倒入平板内使其凝固，用无菌剪头Tip在胶上打孔。按如下剂量向孔中加入测试物：

对照：人乳铁蛋白标准品(不含铁，抽滤除菌)，100uL(0.1ug/uL)。LB培养基，100uL。未转染乳清(抽滤除菌)，100uL。测试样品1-7(抽滤除菌)，100uL。37℃培养过夜，观察抑菌圈。

OD值法测抗菌活性：LB液体培养基培养E.Coli JM109菌10h，OD₆₀₀为1.4。取1mL培养物加到20mL新的LB培养基中，同时按下面剂量加入测试物：

对照：人乳铁蛋白标准品(不含铁，抽滤除菌)，100uL(o.1ug/uL)，补加400uL无菌水；LB培养基，500uL；未转染乳清(抽滤除菌)，500uL。测试样品1-7(抽滤除菌)，500uL。

37℃、150rpm培养15h。取400uL培养物，以无菌LB培养基为对照，测定OD₆₀₀值，每个样品测3次，取平均值。

本发明生产的重组人乳铁蛋白为711肽，其氨基酸序列如下：

MKLVFLVLLFLGALGLCLAGRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKRDSPIQCIQAIAENRADAVTLDGGFIYEAGLAPYKLRPVAAEVYGTERQPRTHYYAVAVVKKGGSFQLNELQGLKSCHTGLRRTAGWNVPIGTLRPFLNWTGPPEPIEAAVARFFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTGENKCAFSSQEPYFSYSGAFKCLRDGAGDVAFIRESTVFEDLSDEAERDEYELLCPDNTRKPVDKFKDCHLARVPSHAVVARSVNGKEDAIWNLLRQAQEKFGKDKSPKFQLFGSPSGQKDLLFKDSAIGFSRVPPRIDSGLYLGSGYFTAIQNLRKSEEEVAARRARVVWCAVGEQELRKCNQWSGLSEGSVTCSSASTTEDCIALVLKGEADAMSLDGGYVYTAGKCGLVPVLAENYKSQQSSDPDPNCVDRPVEGYLAVAVVRRSDTSLTWNSVKGKKSCHTAVDRTAGWNIPMGLLFNQTGSCKFDEYFSQSCAPGSDPRSNLCALCIGDEQGENKCVPNSNERYYGYTGAFRCLAENAGDVAFVKDVTVLQNTDGNNNDAWAKDLKLADFALLCLDGKRKPVTEARSCHLAMAPNHAVVSRMDKVERLKQVLLHQQAKFGRNGSDCPDKFCLFQSETKNLLFNDNTECLARLHGKTTYEKYLGPQYVAGITNLKKCSTSPLLEACEFLRK

实施例2

以腺病毒为载体导入兔乳腺表达生产人生长激素。实验所用兔来自河北昌黎县，兔乳腺导入载体量根据动物本身乳房容量计算。其中步骤五中获得的目标蛋白人生长激素含量高于羊奶中重组蛋白的表达水平，为2-8g/L。其他操作方法同实施例1步骤(一)、(二)、(三)、(四)。

实施例3

以腺病毒为载体导入猪乳腺表达生产人生长激素。实验所用猪来自河北昌黎，猪乳腺导入载体量需要少量多乳头注入，其他操作方法同实施例1步骤(一)、(二)、(三)、(四)。其中步骤五中所获的目标蛋白hGH表达量0.3g-0.4g/L。

实施例4

以腺病毒为载体导入羊乳腺表达表达生产人生长激素。实验所用羊来自河北山海关县，具体操作方法同实施例1步骤(一)、(二)、(三)、(四)、(五)。其中步骤五中所获的目标蛋白hGH表达量0.5g-3.4g/L。

实施例5

以腺病毒为载体导入牛乳腺表达表达生产人乳铁蛋白。实验所用牛来自河北昌黎县，牛乳腺导入载体量5倍于羊的载体量，其他操作方法同实施例1步骤(一)、(二)、(三)、(四)。其中步骤五中所获的牛乳腺中目标蛋白hGH表达量0.5g-4g/L。

Claims (10)

1、一种以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

(1)、分离、克隆目标药物蛋白基因序列：

以pUC18、pUC19、pGEM-3ZF、pShuttle、pcDNA3系列质粒为克隆载体，将目标蛋白或细胞因子hLTF(人乳铁蛋白基因)、hGH(人生长激素基因)、hEPO(人促红细胞生成素)、t-PA(组织型纤溶酶原激活剂)、IL-15(白细胞介素-15)、human Protein C(人蛋白C)、IL-2(白细胞介素-2)、hVEGF(血管内皮细胞生长因子)、NKSF(自然杀伤细胞刺激因子)、HGF(肝细胞生长因子)10种蛋白药物基因通过分子克隆，分别获得了含有目标基因的质粒系列载体；

(2)、将所克隆目标蛋白基因与单标记筛选载体或双标记选择载体构成融合真核表达载体，体外真核细胞表达检测目标蛋白，获得体外表达正确的药物蛋白基因：

以COS7(非洲绿猴肾细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293(人胚胎肾细胞)为宿主细胞对所构建的真核融合蛋白表达载体进行体外表达；Western Blotting、ELASA检测目标基因表达水平，获得了体外表达正确的所需蛋白药物基因；

(3)、将所需目标蛋白基因与腺病毒基因组骨架分子重组，获得含重组目标药物蛋白基因的腺病毒载体：

将所需目标基因接入穿梭载体，再与腺病毒基因组骨架质粒在细菌或真核细胞中重组，并在腺病毒包装细胞系生产出含有重组目标蛋白基因的复制缺陷型腺病毒载体；

(4)、将该重组目标药物蛋白基因腺病毒载体导入动物乳腺：

以重组目标蛋白基因的复制缺陷型腺病毒为载体，直接导入动物乳腺，使目标蛋白基因在乳腺上皮细胞内表达，利用乳腺上皮细胞基本特性，将目标蛋白分泌到动物乳汁中；

(5)、乳汁中分泌获得所需目标药物蛋白，获得高表达目标蛋白药物的动物。

2、根据权利要求1所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：用腺病毒为载体，将目标蛋白基因和腺病毒基因组骨架构成融合基因，将该融合基因导入动物乳腺，从而在动物乳腺中获得目标蛋白基因高效表达，获得目标基因药物蛋白或分离纯化出表达的目标药物蛋白。

3、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：所述腺病毒骨架序列包含野生型腺病毒大部分基因组序列，删除了病毒E1区、E3区及IVa2，允许插入最大约14kb的目标蛋白药物核苷酸序列。

4、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：其中步骤一中克隆分离的上述10种目标蛋白基因大小范围在0.5kb-10Kb之间，乳汁中获得的重组目标蛋白具有与天然蛋白相同或相似的生物学功能。

5、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：其中步骤二所述具体实施，包含目标蛋白基因在宿主细胞COS7、CHO、HEK293中表达，用常规磷酸钙法或脂质体法作瞬时转染或稳定转染不同细胞，瞬时转染48-72h，或稳定转染经G418抗性筛选阳性细胞克隆，分别对转染细胞上清或细胞沉淀进行免疫印迹检测基因表达产物。

6、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：所用表达载体pCDNA3.1含有NEO(新霉素抗性基因)抗性标记，可进行抗性阳性细胞蛋白表达筛选；所用双标记选择载体为pGFP-NEO，增添了绿色荧光表达阳性细胞克隆筛选功能。

7、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：其中步骤四所述具体实施，包含将获得的重组腺病毒载体经两轮氯化铯密度梯度离心纯化后，PBS(pH7.2)溶解，滴度范围10⁶-10¹²PFU/ml，直接导入动物乳腺。

8、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：其中步骤五所述重组蛋白乳汁通过常规高速离心方法，从乳清中获得目标蛋白药物。

9、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：所述生产重组药物蛋白在动物乳汁中持续表达时间为10-20天，目标蛋白表达量为0.3g-8g/L。

10、根据权利1或2所述的以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征是：所述动物为牛、绵羊、山羊、猪和兔。

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