CN1744814A - 从非转基因哺乳动物乳腺生产重组蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从非转基因动物乳腺生产用于生物医药目的蛋白质的方法。编码所述蛋白质的基因通过腺病毒载体转移到乳腺上皮细胞内。这种载体可利用复制缺陷型腺病毒制备，如ΔE1ΔE3，或利用辅助依赖性腺病毒制备，在这种腺病毒内所有或几乎所有的腺病毒编码序列都被除去。使用该方法，可以在乳汁中生产高水平的重组蛋白，从而可以大规模生产用于医药生物目的的生物活性形式的蛋白质。

Description

从非转基因哺乳动物乳腺生产重组蛋白质的方法
发明概述
本发明涉及使用乳腺作为生物反应器，使用重组腺病毒作为基因转移的载体，生产具有药用价值的生物活性蛋白质的方法。
许多疾病的治疗需要施用生物活性蛋白。这些药物可以从血液或组织中纯化，纯化过程除了耗时、昂贵之外，还有传播感染性物质的危险，如引发艾滋和肝炎的那些传染性物质。
DNA重组技术的发展使得人们可以使用细菌和酵母作为宿主体系相对廉价地生产药用蛋白质。但在许多情况下由于这些体系的翻译后加工效率很低，影响了这些蛋白质的生物活性。因此，许多生物活性蛋白质的生产需要较高的真核生物的生物合成机制。从这一点而言，基于杆状病毒和哺乳动物细胞的体系都是可行的策略。但是动物细胞的发酵是高投资、高技术含量的过程。
利用转基因动物的乳腺作为生物反应器已被认为是解决上述问题的一种有力方案。基因转移的主要优点在于可以通过自然繁殖从起始动物(founder animal)创造新的转基因种群。尽管这项技术的前景很有希望，但是目前还存在缺陷，限制了该技术的广泛应用。特别是当在大型家畜中产生转基因动物时，需要花费大量时间和精力产生极为有限数目的G0，转基因代。只有一小部分的转基因G0能够在乳汁中表达适当水平的目的蛋白，获得经济效益。还额外需要很长时间通过使高表达水平的G0代杂交而进行繁殖，直到获得适当的生产能力，可以进入市场。在这个放大(scale-up)的过程中，还存在风险，有可能转基因后代不再以起始第一代的水平表达外源基因。
体细胞克隆作为一种替代手段可以克服上述一些缺陷，但是这项技术投入高，效率低，使其难以成为常规手段进行广泛应用。
使用转基因哺乳动物作为生物反应器意味着构建复杂的表达序列盒，在该序列盒中外源基因与调控序列相连，而调控序列可以使其仅在哺乳期的乳腺上皮腺组织内表达。在多数情况下，这些调控序列不会有效地工作，导致在其他组织内合成了少量重组蛋白，而对该动物的健康造成危害。
将乳腺上皮细胞(MGE)的基因直接转移到成年动物是一种很有希望的策略。该技术不仅能降低生物医药类药品的生产成本，还能极大地减少获得这些药物的必要时间。MGE的体内转化可以在任何动物中进行，不必考虑其遗传背景，所需的技术含量也最低。
在一项早期研究中，Archer等(Proc Natl Acad Sci USA.1994，91(15)：6840-4)评价了使用逆转录病毒载体将人生长激素基因(hGH)转移到山羊乳腺上皮细胞的可行性。可以在乳汁中检测到hGH，虽然浓度极低，并且该表达在第一天之后降至基础水平。
在专利文献US 5,215,904和WO99/43795中也提及了一些方法，其中作者使用逆转录病毒载体转化MGE。EP 725141，A4中的受体介导内吞作用和US 5,780,009中基于多聚阳离子(polication)和/或脂质复合物的应用也都描述了导入MGE基因的替代手段。尽管这些工作能够在处理的动物乳汁中获得目的蛋白，但是目前所报道的效率都很低，获得的蛋白水平在纳克每毫升范围内，这极大地阻碍着该方法在生产过程中的应用。
腺病毒载体能够独立地影响许多细胞类型，如果它们活性分裂或反之。一般地说，腺病毒内所含转基因的表达是强有力的。感染之后，病毒维持游离状态，因此，表达并不会被位置效应所影响。但是腺病毒载体的转基因表达在大约10天后消失。这主要是由于有机体对表达的病毒蛋白产生了很强的免疫应答。
为使基因表达的时间更长，发展了新的腺病毒载体，这些载体内所有或几乎所有的病毒编码序列已被除去(Robin J.Parks等，Proc NatlAcad Sci USA.1996，93(24)：13565-70)。与能以反式(in“trans”)提供所有需要的腺病毒蛋白的第二种载体共转染生产细胞从而使这些载体复制。这种新一代的载体被称为辅助依赖型(Helper-dependent)或Gutless，他们仅保留了复制和包装所需的元件，分别是反向末端重复(ITR)和包装序列。这些载体的克隆容量高达36Kb，在体内基因治疗试验中显现出很高的稳定性。
Yang和同事们表明了腺病毒载体将基因体内转移到小鼠乳腺上皮细胞的能力(Cancer Lett.1995，98(1)：9-17)。从那时到现在已经发表了许多利用腺病毒将基因转移到MGE的工作，但是这些工作中均没有将目的基因靶向乳汁内表达。
专利文献WO97/17090中公开了使用腺病毒作为工具生产生物活性化合物的可能性。尽管该文献提及了转化MGE的可能性，但是，列出的试验数据和结果都是针对体外转化组织培养样品，这些样品都不是由乳腺上皮细胞构成。
只有WO97/17090实现了这种发明，其描述用腺病毒感染EGM，揭示了用重组腺病毒注射哺乳期母牛的乳腺；但是根据该方法，感染的水平和所获的重组蛋白产量都非常低，因此没有提供证据证明：用腺病毒载体转化MGE能够构建一种可行性的替代手段，用于在乳汁内生产生物活性药物。
发明详述：
本发明涉及在非转基因哺乳动物的乳汁内高水平生产异源蛋白的方法。更具体而言，本发明涉及应用△E1△E3辅助依赖型腺病毒载体将外源基因转移到MGE细胞。通过这种方法转化的细胞合成并向乳汁内分泌生物活性蛋白。
因此，本发明一方面提供一种简单有效的方法用于在非转基因哺乳动物的乳汁中生产大量复杂的生物活性蛋白。
本文所述方法能够有效地体内转化乳腺上皮细胞。所述细胞能够接受所有所需的遗传物质，这样它们能够在接受处理的动物乳汁中分泌生物医药蛋白。具体而言，在本发明中，腺病毒载体被用于将外源基因转移到MGE细胞内部。感染之后，病毒DNA在感染细胞的核中仍维持游离，使得病毒载体所含的转基因可以表达。
本发明方法包括将含腺病毒载体的溶液通过乳头的通道直接注入。动物应优选反刍动物(如牛，绵羊或山羊)。动物可接受乳腺发育和乳生成的激素诱导，或者可使用天然的哺乳期动物。感染后，转基因被转移到乳腺分泌细胞内，转录、翻译并在分泌到乳汁之前接受必要的翻译后加工过程。通过挤奶，所述被感染的动物变为一个活的工厂，可以生产生物医药目的的外源蛋白。
病毒载体应该含有表达序列盒，该盒包括目的蛋白编码DNA、保证有效分泌的信号肽序列(该信号肽可以与编码的基因同源或异源)、启动子序列(不一定是乳腺上皮细胞特异性的)、裂解序列和多聚腺苷化信号。
病毒载体优选基于2和5型人腺病毒。或者可以使用缺乏E1和E3基因的腺病毒载体，甚至可以使用缺乏所有腺病毒编码序列的腺病毒载体(辅助依赖型或gutless)。
本发明所述的复制缺陷型腺病毒载体(△E1△E3)的应用，在免疫活性动物中大约10天后，可以在乳汁中高水平表达重组蛋白。所述载体特别适于需求量小的蛋白，用于物理和化学表征或治疗性疗法。例如促红细胞生成素和组织纤溶酶原激活剂。
或者，当期望获得大量蛋白质时，在该方法中辅助依赖型腺病毒是最佳选择。这些载体已显示在MGE中非常稳定，可以在长达五个月时间内在免疫活性动物乳汁内表达重组蛋白。Gutless载体的稳定性可以根据重组蛋白的免疫原性或使用免疫抑制的动物进行改进。另外Gutless载体的克隆容量更大(高达36Kb)，可以插入多元表达盒。
表达盒
本发明的腺病毒载体含有一个表达盒，其由启动子(该启动子并不一定是MGE特异性的)、目的基因编码序列，裂解和多聚腺苷化序列构成。
为构建所述表达盒，可使用组成型启动子；所述启动子可以是与转化细胞异源的。这种启动子的例子包括立即早期(early immediate)人巨细胞病毒，肌动蛋白，早期SV40，肌球蛋白和Roux Sarcoma Virus。天然引导蛋白在乳腺表达的启动子是特别期望的。这种启动子的实例包括αS1酪蛋白，αS2酪蛋白，β乳球蛋白，κ-酪蛋白，乳清酸性蛋白和α-乳清蛋白。
编码序列可以是互补DNA(cDNA)，可含有用于提高表达水平的内含子或不含内含子。或者，根据载体的克隆容量，可使用来自基因的含内含子的基因组DNA。优选该构建体，因为与cDNA引导的表达相比，其表达水平更高。
实际上使用本文所述系统可以在乳汁中表达任何异源蛋白。特别实用的是在人或动物中具有治疗或预防价值的蛋白。可使用本发明获得的蛋白的实例包括，但不限于抗原(B型肝炎表面抗原)，生长因子(如人生长激素，表皮生长因子，胰岛素样生长因子，集落刺激因子，粒细胞巨嗜细胞刺激因子，神经生长因子，促红细胞生成素)，抗体，细胞因子(如白细胞介素6或白细胞介素2)，α-1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)，人血清白蛋白，β珠蛋白，组织纤溶酶原激活剂，肿瘤抑制蛋白(如p53)蛋白C和干扰素。
由本发明生产的这些异源蛋白必须与引导其分泌到乳汁内的信号肽相连。所述信号肽可以来自异源蛋白，如果该蛋白是天然分泌型的。如果蛋白是不可分泌的，该基因构建体应该含有能够使所述蛋白分泌的异源信号肽。
信使RNA的稳定性在很大程度上是由位于基因3′末端的区域控制。该区域含有裂解和多聚腺苷化序列。这些序列可以是异源的，但通常都是用来自珠蛋白基因，牛生长激素，单纯疱疹tymidine激酶或SV40病毒早期区域的序列。
腺病毒载体
已经显示人源的腺病毒载体能够有效感染反刍动物物种的乳腺上皮细胞，他们在分泌型上皮细胞中的稳定性很大程度上依赖于从病毒基因组表达的蛋白的免疫原性程度，这包括病毒来源的蛋白和生物医药蛋白。复制缺陷型腺病毒载体(如△E1△E3)能够促进重组蛋白高水平表达，但是由于病毒蛋白针对被感染细胞诱导了很强的免疫应答，因此其稳定性降低。
辅助依赖型或gutless载体在其基因组内不含有病毒基因，因此针对被感染细胞的免疫应答就弱很多，只是由重组蛋白本身的免疫原性决定。我们已经证明这些载体非常稳定，可以在被处理动物的乳汁内表达生物医药蛋白。
复制缺陷型腺病毒载体可根据文献所述的常规技术构建(Tong-Chuan He等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1998，95(5)：2509-14)。病毒粒子的包装和扩增均在HEK-293细胞或在能够互补腺病毒缺陷的其他细胞内进行。辅助依赖型腺病毒载体可根据Robin J.Parks等构建(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93(24)：13565-70)。为此，需要与辅助腺病毒共感染，这种辅助病毒能够以反式(in trans)提供载体正确包装所需要的一切蛋白质。在这两种情况下，通过三轮冻融从细胞中提取载体。腺病毒载体中所含的表达盒的功能性可以通过感染培养的上皮乳腺细胞体外测试。根据感染，目的蛋白可以在培养基内检测到。在这方面鼠源的乳腺上皮细胞HC11或KIM2和牛源的MAC-T特别有用。
最好在CsCl梯度中双离心纯化病毒颗粒，以除去细胞碎片和损坏的颗粒，因为它们可能影响乳腺上皮细胞的感染效率。为纯化辅助依赖型腺病毒载体，必须进行CsCl梯度离心，以除去可能的辅助腺病毒污染源。透析该方法纯化的腺病毒，因为高浓度的CsCl会影响病毒感染细胞和组织。透析之后可将腺病毒储藏在-80度，其滴度没有显著改变。
动物
本发明可应用于所有哺乳动物，但是优选反刍动物，因为其乳产量更高。可使用性成熟早期阶段的动物。这些动物要接受激素疗法，以诱导乳腺发育和泌乳。一般来说，天然泌乳的动物的乳产量更高，因此，转基因的表达水平也高于激素诱导的泌乳动物。
注入
在注入含有腺病毒载体的溶液之前，必须对该动物进行挤奶，以除去乳池内的乳汁。然后通过乳头的通道将等渗溶液注入乳腺，通过按摩，直到腺体被充满，溶液充满了整个腔体(alveoli)，然后挤奶去除溶液。重复该步骤两到三次，确保乳腺被彻底清洗且腔体和管道组织均膨胀。等渗溶液可以是PBS，NaCl 0.9％，葡萄糖5％，HBS组织培养基。
直接通过乳头的通道注入含有病毒颗粒的溶液。承载液体可使用等渗溶液，如葡萄糖5％，PBS，NaCl 0.9％，HBS或组织培养基(如DMEM)。注入溶液的病毒浓度可以不同，不过优选1×109PFU/ml或更高。注入的最佳体积可根据乳腺的大小而不同，例如对山羊而言，体积可以在50到300ml/乳腺范围内变化。
为通过乳头通道注入，可以使用注射器和套管。注入应该缓慢进行，在注入时和注入后都需要按摩，以确保溶液在整个乳腺细胞内均匀分布。
收集异源蛋白
通过手挤或自动挤奶的常规方法可以获得处理动物的乳汁。将酪蛋白及脂类与乳清分离，绝大多数乳清保藏在-20℃，一小部分用于通过公知的分析技术(如ELISA，Western印记和生物活性)检测并定量目的蛋白。将含有大量目的蛋白的乳清混合，用作纯化异源蛋白的活性原材料。纯化的过程极大程度上依赖于指定的蛋白。
通过这种方法，本发明在乳汁中高水平生产重组蛋白的方法需要下述步骤：
1.构建含有表达盒的重组腺病毒，所述表达盒带有目的基因。该步骤包括：
a)-构建重组腺病毒基因组
b)-在293细胞系中生产病毒颗粒
c)-扩增并纯化腺病毒载体
2.感染乳腺上皮细胞。该步骤包括：
a)-如果使用的动物并非天然泌乳动物，则诱导乳腺发育和泌乳。
b)-将含有病毒颗粒的溶液注入乳腺
3.回收重组蛋白。该步骤包括：
a)-对被处理动物进行挤奶
b)-检测并定量收集的乳汁中的异源蛋白
c)-纯化异源蛋白。
下面给出的说明性实施例用于更好地理解本发明：
实施例
实施例1.构建含有hGH和hEPO基因的腺病毒载体(△E1△E3)。
根据Adeasy系统构建复制缺陷型腺病毒载体(Tong-Chuan He等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 1998，95(5)：2509-14)，使用质粒pAdTrack-CMV作为转移载体(图1)。基于Adeasy的系统提供了一种快速简易制备重组腺病毒的方法。需要两步法，其中第一步是将表达盒克隆到转移载体内，随后在细菌菌株BJ5183内通过异源重组转移到病毒基因组。然后用PacI内切酶消化腺病毒基因组并转染293或911细胞系。在本发明中，感染性病毒粒子的形成和最后的扩增都是通过共表达转移载体pAdTrack-CMV中所含的绿色荧光蛋白(GFP)进行监测。
实施例2：构建辅助依赖型腺病毒载体
将含有促红细胞生成素基因的表达盒克隆到pSH-1质粒的多克隆位点，构建辅助依赖型腺病毒载体。为使所获的质粒具有适当的大小进行包装，通过在细菌菌株BJ5183中进行异源重组，将其转移到pStuffer-26载体(图2)。异源重组产生了大于28Kb的质粒。用PacI内切酶消化后，将质粒转染到293-Cre细胞系中，随后用辅助腺病毒AdInvLψL-GFP感染。Cre重组酶在293-Cre细胞系内的表达促进了辅助腺病毒中包装序列侧翼的Lox p位点之间的重组，这会丧失包装能力，但保留复制能力，因此可反式提供形成含有辅助依赖型腺病毒载体基因组的病毒粒子所需要的病毒蛋白。
实施例3：从腺病毒感染的初级乳腺上皮培养细胞中表达人生长激素(hGH)和人促红细胞生成素(hEPO)
为测试腺病毒载体中构建的hGH和hEPO表达盒的正确功能，感染乳腺上皮HC11细胞。在补充有EGF(10ηg/ml)和胰岛素(10μg/ml)的DMEM中培养细胞。达到80％融合时，以20粒子/细胞的比率向细胞培养物中加入腺病毒载体。24小时后，将培养基变为补充有EGF和胰岛素但不含有FCS的相同培养基。48小时后，收集培养基，用三氯乙酸沉淀1ml内所含的蛋白，并重悬于40μl水中，其中20μl用于电泳和随后的Western印记试验。
实施例4：人生长激素(hGH)和人促红细胞生成素(hEPO)在小鼠乳汁中的表达
在小鼠中测试腺病毒载体感染MGE以及进一步促进目的蛋白在乳汁中分泌的能力。准备3个实验组，每组5只老鼠。根据实验组的不同，向妊娠17天的B6D2F1雌性小鼠注入100μl含有病毒的制剂：I-2.5×107GTU/ml含有hGH基因的腺病毒(△E1△E3)；II-1×109GTU/ml含有hEPO基因的腺病毒(△E1△E3)；III-盐溶液。
产后第2天开始对处理小鼠挤奶。收集的乳汁在分离缓冲液中(10mMTris-HCl pH8，10mM CaCl2)1∶5稀释，4℃，15000g冷冻离心30分钟，使乳清与酪蛋白分离。
Western印记检测和ELISA定量(hGH ELISA，Boehringer Mannheim，Cat.No.1 585 878)乳汁样品中hGH的含量(图3)。同样用Western印记检测和ELISA定量(CIGB制造的ELISA)hEPO的含量(图4)。
实施例5：诱导山羊泌乳。
用于将基因转移到乳腺的重组腺病毒载体基本上可应用于所有哺乳动物，但是优选反刍动物，因为其乳产量更高。可使用性成熟早期阶段的动物，可通过激素诱导其乳腺发育和泌乳。也可使用天然泌乳的动物。例如如果使用山羊，可以这样进行激素诱导：在1，3，5，7，9，11，13天施用雌二醇(0.25mg/kg，i.m)和黄体酮(0.75mg/kg，i.m.)，而脱氢皮质甾醇(0.4mg/kg，i.m)应该在第14到16天使用，并从第5天开始对乳房进行按摩。
实施例6：将含有人生长激素hGH基因的重组腺病毒(△E1△E3)注入山羊乳腺。
对泌乳期的山羊肌肉内给药10mg安定，以降低处理过程中的应激反应。彻底地对动物挤奶以尽量去除乳池中的乳汁；将200ml 37℃的盐水溶液注入乳腺然后挤出，对乳腺进行两次清洗。所有的注入都是用50ml注射器和导管直接通过乳头的通道。注入要缓慢进行，并且同时按摩被注入的乳房。山羊的乳头被平均分成独立的两部分；一部分用含有腺病毒载体的溶液注入，另一部分只注入盐水，用作阴性内部对照。每个乳腺注入200ml含有109GTU/ml病毒量的盐溶液，也就是说每个乳腺接受总共2×1011个病毒粒子。注入后，按摩乳房，促进溶液均匀分布并使其充满每个管道和腔。第二天挤奶除去注入的溶液。
实施例7：将含有促红细胞生成素基因的重组辅助依赖型腺病毒注入山羊乳腺。
对泌乳期的山羊肌肉内给药10mg安定，以降低处理过程中的应激反应。彻底地对动物挤奶以尽量去除乳池中的乳汁；将200ml 37℃的盐水溶液注入乳腺然后挤出，对乳腺进行两次清洗。所有的注入都是用50ml注射器和导管直接通过乳头的通道。注入要缓慢进行，并且同时按摩被注入的乳房。山羊的乳头被平均分成独立的两部分；一部分用含有腺病毒载体的溶液注入，另一部分只注入盐水，用作阴性内部对照。每个乳腺注入200ml含有109GTU/ml病毒量的盐水，也就是说每个乳腺接受总共2×1011个病毒粒子。注入后，按摩乳房，促进溶液均匀分布并使其充满每个管道和腔。第二天挤奶除去注入的溶液。
实施例8：检测注入了腺病毒载体的山羊乳汁中的hGH和hEPO
注入后48小时开始人工挤奶收集被注入动物的乳汁。每天进行两次挤奶，一次在上午，另一次在下午晚些时候。多数收集的乳汁都保藏在-70℃用于进一步纯化蛋白质，而使用少量样品检测及定量各批样品中的hGH和hEPO含量。
按下述进行hGH和hEPO的检测。向150μl乳汁样品中加入4倍体积的分离缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM CaCl2)，4℃，15000g离心30分钟使乳清蛋白与脂类及酪蛋白分离。收集乳清蛋白组分，在12.5％丙烯酰胺凝胶上SDS-PAGE分离10μl中所含的蛋白。将蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上并用抗hGH的多克隆抗体标记(1/500)。用AmershamPharmacia Biotech 的化学发光系统(ECL)显现免疫反应性条带(图5B)。
利用Boehringer Mannheim(Cat.No.1 585 878)的hGH ELISA定量hGH。所有的操作都根据制造商的说明书进行。利用Center forGenetic Engineering and Biotechnology，Havana，Cuba制造的夹心ELISA定量hEPO。
在注入了△E1△E3型腺病毒载体的动物中，直到注入后11天持续检测到hGH，在最初的三天中达到0.3mg/ml(图5C)。
注入了辅助依赖型腺病毒载体的动物中，hEPO的水平也非常高(图6)。使用这些载体在最初的5个星期内获得了高于0.2mg/ml的表达水平，随后略微下降，直到注入后第145天才降到5ng/ml。
本方法的优点
本发明提供的方法满足了对生物医药用蛋白制品的日益增长的需求。特别是本发明可以大规模地生产蛋白质，所述蛋白质的生物活性与复杂的翻译后加工过程紧密相连，因此依赖于高等生物的生物合成机制。该方法可以快速、简单且经济地生产这种蛋白。从这一点而言，利用本发明可以在短期内快速应对市场变化，其应用无需很高的技术要求，可以根据需求简易地调节反应产量。
另外，本发明可以节省时间和资源，是研究不同物种乳腺的翻译后修饰的一种替代手段。由于腺病毒载体包含了研究蛋白的编码序列，所以可以转移到各种物种的乳腺内，通过这种方法，根据生产该蛋白的不同物种，可以研究相同蛋白的不同修饰过程。
附图说明
图1：含有hGH和hEPO基因的腺病毒载体△E1△E3的构建策略。
图2：含有hEPO基因的辅助依赖型腺病毒载体的构建策略。
图3：测定每个乳腺注入了2.5×106GTU的腺病毒△E1△E3的小鼠乳汁中hGH的表达，所述腺病毒含有hGH基因，其处于人巨细胞病毒启动子的调控下。A)Western印记试验：阴性对照(C-)指注入了缺乏hGH表达盒的腺病毒的小鼠乳汁，2，3，4，5，6，7，8，9道含有相应泌乳天数收集的乳汁样品。B)乳汁中hGH的浓度与生产后天数的关系
图4：测定每个乳腺注入了1×108GTU的腺病毒△E1△E3的小鼠乳汁中hEPO的表达，所述腺病毒含有hEPO基因，其处于人巨细胞病毒启动子的调控下。A)Western 印记试验：阴性对照(C-)指注入了缺乏hEPO表达盒的腺病毒的小鼠乳汁，2，3，4，5，6，7，8，9道含有相应泌乳天数收集的乳汁样品。B)乳汁中hEPO的浓度与生产后天数的关系
图5：每个乳腺注入了2×1011GTU的腺病毒△E1△E3的山羊乳汁中存在hGH，所述腺病毒含有hGH基因，其处于人巨细胞病毒启动子的调控下。A)注入后最初10天收集的乳汁样品的电泳，阴性对照指注入了缺乏hGH表达盒的腺病毒载体的乳腺乳汁。B)Western印记显示山羊乳汁中hGH的表达；阴性对照指注入了缺乏hGH表达盒的腺病毒载体的乳腺乳汁；阳性对照指从细菌细胞纯化的重组hGH。C)乳汁中hGH的浓度与注入后天数的关系
图6：ELISA显示注入了辅助依赖型腺病毒载体的山羊乳汁中hEPO的水平，所述载体含有hEPO基因，其处于人巨细胞病毒启动子的调控下。

Claims (4)

1、在非人哺乳动物的乳汁内生产异源蛋白的方法，其由腺病毒载体转化乳腺上皮细胞(MGE)而介导，包括下述步骤：
a)在其性成熟早期诱导哺乳动物泌乳
b)在注入病毒前排出乳汁并彻底清洗乳腺的内部
c)通过乳头的通道注入含有腺病毒载体的溶液，直到充满整个乳腺，所述载体带有编码目的异源蛋白的基因
d)在注入后4-24小时之间排干乳腺
e)注入后48小时开始收集乳腺内所含的乳汁
f)从乳汁中纯化目的异源蛋白。
2、权利要求1的方法，其中腺病毒载体含有大部分腺病毒基因。
3、权利要求1的方法，其中腺病毒载体是缺乏大部分或全部腺病毒基因的腺病毒，并需要能够反式提供形成病毒粒子所需要的全部必要蛋白质的辅助腺病毒。
4、权利要求1的方法，其中目的异源蛋白选自：生长因子，如人生长激素，表皮生长因子，胰岛素样生长因子，粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子，神经生长因子，促红细胞生成素；凝集因子，如FVIII和FIX；抗体；细胞因子，如白细胞介素6或白细胞介素2；α1抗胰蛋白酶(α1-antitripsina)；人血清白蛋白；β珠蛋白；组织纤溶酶原激活剂；肿瘤抑制蛋白，如P53；蛋白C或干扰素。
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