CN1301299A - 转基因动物中生物纤丝的生产 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用转基因动物和转基因细胞重组生产生物纤丝如蜘蛛丝或昆虫丝心蛋白的方法,所述转基因动物在其乳汁和/或尿液中分泌生物纤丝,所述转基因细胞将生物纤丝分泌入培养基。这种方法可用于生产大量生物纤丝材料。本发明还公开了用于产生如此转基因动物的核酸分子。

Description

转基因动物中生物纤丝的生产
发明背景
蜘蛛丝蛋白作为“超级纤丝”的用途已导致尝试去生产重组蜘蛛拖丝(Prince等，生物化学34:10879-10885,1995；Fahnestock和Irwin，应用微生物学生物技术学47:23-32,1997；Fahnestock和Bedzyk，应用微生物学生物技术学47:33-39,1997)。尽管在E.coli中已证实蜘蛛丝的成功表达，但仍存在明显问题，如由于在基因重复区内的重组和重排所致序列的不稳定性，非有效转录，翻译终止及合成提前中止，导致可高效生产的丝长度受限(少于或等于1000个氨基酸)，低蛋白质产量(4-300mg/l)，及所生产纤维的低溶解性。
在甲基营养酵母巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中比在E.coli中生产合成蜘蛛拖丝蛋白要优越，在其中可有效地生产长度至少为1600个氨基酸的较长蛋白质，并且没有由于合成的提前终止及被表达的基因中重复序列的稳定性导致的大小不均一性。蛋白质在Pichia系统中产量为663mg/l；而在酵母细胞裂解物中溶解形式仅占蛋白质的15％。
蜘蛛产生液态晶体蛋白的“丝前体”，通过一系列吐丝机制拉长此可溶丝，结成纤丝。
以下实施例例证了我们已经在真核细胞及转基因鼠的乳汁中生产和分泌丝分子的可溶亚单位。这些可溶亚单位可被纯化并用于结丝网目的，以生产纤丝。
发明概述
我们已经揭示一种在转基因动物中生产生物纤丝(如蜘蛛丝蛋白)的方法。此方法极大地促进了这些用作“超级纤丝”的蛋白质的生产。
第一方面，本发明揭示了一核酸分子，其包括(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)指导多肽在产乳细胞或产尿细胞中表达的启动子，其中此启动子可操纵地与核酸序列连接，和(ⅲ)前导序列，其能通过产乳细胞或产尿细胞将生物纤丝分别分泌入哺乳动物的乳汁或尿液中。
第二方面，本发明揭示了其细胞核含有一核酸分子的哺乳动物胚胎，该核酸分子包括(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)指导多肽在产乳细胞或产尿细胞中表达的启动子，其中此启动子可操纵地连于核酸序列，和(ⅲ)前导序列，其能通过产乳细胞或产尿细胞将生物纤丝分别分泌入由含此核酸分子的所述胚胎发育成的哺乳动物的乳汁或尿液中。优选地，此核酸分子是通过人工插入的。
第三方面，本发明揭示了一雌性哺乳动物，其中此雌性哺乳动物的乳腺组织的基因组中含有一核酸分子，此分子包括(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)指导多肽在产乳细胞中表达的启动子，其中此启动子可操纵地连于核酸序列，和(ⅲ)前导序列，其能通过产乳细胞将生物纤丝分泌入雌性哺乳动物的乳汁中。优选地，此雌性哺乳动物是啮齿动物，反刍动物，或山羊。
第四方面，本发明揭示了一种动物，其中在动物尿液产生中起作用的细胞的基因组中含有一核酸分子，该分子包括(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)指导多肽在产尿细胞中表达的启动子，其中启动子可操纵地连于核酸序列，和(ⅲ)前导序列，其能通过产尿细胞将生物纤丝分泌入动物尿液中。优选地，此动物是哺乳动物。
在本发明所有以上方面的一实施方案中，此生物纤丝是蜘蛛丝(如拖丝)。在本发明的另一实施方案中，此核酸分子包括一内含子。在一优选的实施方案中，当分泌物经剪切力作用及机械延伸而进行分泌时，所述生物纤丝具有多丙氨酸区段，其螺旋为β片层过渡物，所述过渡物形成β-结晶，稳定所述生物纤丝的结构。
在本发明的另一优选实施方案中，此生物纤丝具有一非晶体结构域，形成β-折叠片，如此β片层间间距规格在3和8埃之间。在另一优选的实施方案中，此生物纤丝具有含一非晶体结构域和一晶体形成结构域的C-末端氨基酸基序，其中此基序具有至少50％相同于SEQ ID NO:2的序列。在另一优选实施方案中，此生物纤丝具有至少50％相同于SEQ ID NO:3的共有序列。
第五方面，本发明揭示了一种生产生物纤丝的方法，包括以下步骤：(a)提供用编码生物纤丝的核酸分子转染的胚胎细胞，其在衍生自转染的胚胎细胞的细胞中表达并引起生物纤丝分泌；(b)培养此胚胎细胞，以产生含有表达和分泌生物纤丝的细胞的动物；和(c)从该动物表达和分泌生物纤丝的细胞中分离生物纤丝。
第六方面，本发明揭示了一种生产生物纤丝的方法，包括以下步骤：(a)提供用核酸分子转染的动物细胞，此核酸分子含有(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)指导多肽在动物细胞中表达的启动子，和(ⅲ)前导序列，其能使细胞分泌生物纤丝；(b)培养此转染的细胞；和(c)从培养的转染细胞的培养基中分离生物纤丝。在其它实施方案中，此生物纤丝具有至少50％相同于SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ IDNO:11,SEQID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的序列。
在本发明第五和第六方面的一个实施方案中，此生物纤丝是蜘蛛丝(如拖丝)。在另一实施方案中，此核酸分子含有内含子。在另一实施方案中，此动物是哺乳动物。在一优选的实施方案中，当分泌物经剪切力作用及机械延伸而进行分泌时，所述生物纤丝具有多丙氨酸区段，其螺旋为β片层过渡物，所述过渡物形成β-结晶，稳定所述生物纤丝的结构。
在本发明第五和第六方面的另一优选实施方案中，此生物纤丝具有一非晶体结构域，形成β-折叠片，如此β片层间间距规格在3和8埃之间。在另一优选的实施方案中，此生物纤丝具有含非晶体结构域和晶体形成结构域的C-末端氨基酸基序，此基序具有至少50％相同于SEQ ID NO:2的序列。在另一优选的实施方案中，此生物纤丝具有至少50％相同于SEQID NO:3的共有序列。在另一实施方案中，此生物纤丝具有50％相同于SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ IDNO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQIDNO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQIDNO:19,或SEQ ID NO:20的序列。
在本发明所有以上方面的一优选实施方案中，其中生物纤丝是拖丝，优选地细胞(或从此细胞发育的动物(如哺乳动物))产生生产拖丝所需的二种多肽(如ADF-3和ADF-4)，其量至少为这些多肽在天然源料(如蜘蛛)中产生的量的40％。
“生物纤丝”意为一种纤维状蛋白，其通常由许多昆虫和蛛形纲动物之任一产生和分泌。生物纤丝由交替晶体和非晶体区组成。生物纤丝例如包括蜘蛛丝，一种在许多蛛形纲动物(如Nephila clavipes)中发现的吐丝于体外的纤维状蛋白质分泌物，和丝心蛋白，一种在许多昆虫(如Bombyx mori)中发现的吐丝于体外的纤维状蛋白质分泌物。当分泌物经剪切力作用及机械延伸而进行分泌时，所述生物纤丝优选具有多丙氨酸区段，其螺旋为β片层过渡物，所述过渡物形成β-结晶，稳定所述生物纤丝的结构。优选地，生物纤丝的非晶体结构域形成β-折叠片，如此内β片层间距规格在3-8埃之间，优选在3.5-7.5埃之间。
优选地，生物纤丝具有一个有氨基酸重复基序和共有序列的C-末端部分，该基序长度在20～40个氨基酸之间，优选长度为34个氨基酸，且共有序列长度在35～55个氨基酸之间，优选长度为47个氨基酸。优选地，生物纤丝具有一氨基酸重复基序(产生非晶体结构域和晶体形成结构域)，该基序具有至少50％，优选至少70％，更优选至少90％相同于SEQ ID NO:2的序列。优选地，生物纤丝具有一共有序列，其至少50％，优选至少70％，更优选至少90％相同于SEQID NO:3的序列。
“启动子”意为能指导转录的核酸序列。本发明也包括那些启动子元件，其能有效地使依赖于启动子的基因表达呈由细胞类型特异性、组织特异性调控，或由外在信号或制剂诱导；这种元件可位于天然基因的5’或3’区。本发明的优选启动子指导在产乳细胞中转录蛋白质；这种启动子包括但非限于以下基因的启动子：乳清酸性蛋白，αS1-酪蛋白，αS2-酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。本发明的其它优选启动子指导在产尿细胞中转录蛋白质(如尿道上皮细胞或肾细胞)；这种启动子包括但非限于uroplakin基因的启动子。本发明的其它优选启动子还在真核细胞中直接转录蛋白质。
“前导序列”或“信号序列”意为一核酸序列，当可操纵地连于核酸分子时，可使核酸分子分泌产物。此前导序列优选位于核酸分子的5’位。优选地，前导序列得自与用于指导转录核酸分子的启动子相同的基因，或得自核酸分子衍生自其中的基因。
“培养基”意为包绕细胞的基质，其中细胞已存活。如果细胞分泌一种蛋白质(如生物纤丝)，细胞的培养基将含有由此细胞分泌的蛋白质。
“转染的细胞”，或“转化的细胞”意为一种细胞，其中通过重组DNA技术，已向其中(或其祖代中)导入编码本发明多肽的核酸分子。优选地，此细胞是多细胞动物(如哺乳动物)的真核细胞。
“胚胎细胞”意为能作为生物体所有体细胞和种系细胞的祖细胞的一种细胞，例如是胚胎干细胞(ES细胞)和受精卵细胞。优选地，本发明的胚胎细胞是哺乳动物胚胎细胞。
本文所用的关于基因或多肽的“内源性”是指正常存在于动物体内的基因或多肽。
“种系细胞”是指是减数分裂细胞分裂产物的真核细胞，祖细胞，或其子代。
“可操纵地连接”是指一核酸分子与一或多个调节序列(如启动子)以如下方式连接：当适当分子(如转录激活蛋白)与调节序列结合时，使核酸分子产物(即多肽)表达和/或分泌。
“转基因”是指人工插入细胞或其祖代中，并成为由此细胞发育的动物的基因组的一部分的任何核酸片段。这种转基因可包括部分或完全异源(即外源)于转基因动物的基因，或可代表与动物内源基因同源的基因。
“转基因的”是指包括一种核酸序列的任何细胞，该序列已被人工插入细胞或其祖代中，并成为由此细胞发育的动物的基因组的一部分。优选地，转基因动物是转基因哺乳动物(如啮齿动物或反刍动物)。优选地此核酸(转基因)经人工插入核基因组中。
附图简要描述
图1A是含β-酪蛋白启动子和信号序列，1.5kb NcDS-1cDNA，和β-酪蛋白3’UTR的山羊β-酪蛋白/NcDS-1构建体的示意图。
图1B是含有WAP基因启动子，WAP信号序列，编码拖丝的1.5kbcDNA(NcDS-1)，和WAP基因3’末端的乳清酸性蛋白(WAP)/NcDS-1构建体的示意图。
图1C是含有uroplakin Ⅱ基因的启动子和信号序列，NcDS-l cDNA插入物，和小鼠精蛋白-1(Mp-1)基因的3’UTR区的uroplakinⅡ/NcDS-1构建体的示意图。
图2是本发明表达载体的图示。
详细描述
生物纤丝，如蜘蛛丝，具有与“超级纤丝”SpectraTM(购自Alliedsignal)或KevlarTM(购自DuPont)可比的许多高效机械性质。尤为重要的是破坏生物纤丝的能量，其意味着当伸展时，生物纤丝能吸收能量，且当除去压力时散发热能。另外，生物纤丝对蛋白酶消化有抗性，并不溶于稀酸和碱。
生物纤丝是可更新物质的天然源料。表达生物纤丝的转基因动物如本文所述动物，可用适当饲料与正常家畜一样饲养。这样，此产品的生产是驯养的并可更新的。真正的天然源料，蜘蛛自身，则太小而不适宜生产足够量的这种物质。另外，由于蜘蛛的地域行为，它们不能为了大量生产而密集型饲养。
生物纤丝的重量对冲击强度防护应用是重要的。现代冲击强度防护中要求保留其独特机械性能的柔韧且轻的材料。生物纤丝比KevlarTM轻，且比SpectraTM更柔韧。
Ⅰ、蜘蛛丝编码基因
天然拖丝蛋白的大小还未最终确定，但已观测到在274～750KDa范围内。N-末端氨基酸序列和5’末端核酸序列还未阐明。已分离Nephilia clavpes(发现于巴西和南佛罗里达的金色球织者)和Araneusdiadematus(Guerette等，科学272:112～115,1996)的部分cDNA克隆(spidroin 1和2)，并发现是其相应基因的3’末端的一部分。分离自Araneus的克隆，及衍生它们的腺体，示于下表1。
表1Araneus diadematus基因(文库用来自N.clavipes的spidroin-1,2筛选)特异丝类型的分布一表达(由Northem印迹测定)
克隆的基因 主要壶胶腺(产生拖丝) 次要壶胶腺(产生辅助纤维) 鞭毛状腺(产生胶丝) 聚集腺(产生胶丝) 圆柱腺(产生茧丝)
ADF-1   -   主要   -   -   -
ADF-2   -   -   -   -   次要
ADF-3   主要   -   次要   次要   -
ADF-4   主要   -   -   -   -
ADF-1的序列(Araneus diadematus丝心蛋白)是68％聚(A)5(即：AAAAA；SEQ ID NO:9)或(GA)2-7(SEQ ID NO:10)，和32％GGYGQGY(SEQ ID NO:11)；ADF-2是19％聚(A)8(SEQ ID NO:12)和81％[GGAGQGGY(SEQ ID NO:13)和GGQGGQGGYGGLGSQGA(SEQ ID NO:14)]；ADF-3是21％ASAAAAAA(SEQ ID NO:15)和79％[(GPGQQ)n’其中n=1-8(SEQ IDNO:16)和GPGGQGPYGPG(SEQ ID NO:17)]；ADF-4是27％SSAAAAAAAA(SEQ ID NO:18)和73％[GPGSQGPS(SEQ ID NO:19)和GPGGY(SEQ ID NO:20)]。
本领域熟知的许多方法中的任一种，都可用于用Nephila和Araneus的已知核酸序列克隆额外的生物纤丝编码基因，且技术人员将对这些方法加以常规利用以获得所需基因。可类似地分离Nephila和Araneus基因的全长克隆。
这种获得生物纤丝编码基因序列的方法之一是，用由Nephilaclavipes spidroin 1基因序列(Arcidiacono等，应用微生物学生物技术学49:31-38,1998)产生的寡核苷酸探针，去筛选蛛形纲或昆虫cDNA或基因组DNA文库以搜索与探针杂交的序列。本领域技术人员熟知杂交技术，并例如由Ausubel等及Sambrookt(如前)所述。制备cDNA或基因组DNA文库也为本领域技术人员所述。来自各种物种的大量制备cDNA核酸文库可商购。寡核苷酸探针是用本文所述序列及标准技术很容易地设计的。此寡核苷酸探针可基于编码spidroin 1基因产物的DNA任一链的序列。此寡核苷酸探针例如是简并探针(即编码N.clavipes spidroin 1蛋白的所有可能序列的混合物)。
Ⅱ、蜘蛛丝生成及吐丝
在蜘蛛腹部特异腺体内产生丝或丝心蛋白单体，并以20-30％浓度保存在腹腔内。当在干燥下应用张力时，此物质将聚合。由于此丝非常细，干燥过程迅速，丝由交替的晶体或非晶体区组成。主导晶体是β折叠片晶体，其与丝纤维的长轴平行排列。在Bombyx mori(蚕)中，形成晶体的结构域是六肽(GAGAGS(SEQ ID NO:1))结构域，其与非晶体结构域交替。
氨基酸G,A和S组成高于85％的蚕茧丝丝心蛋白。丝的交替Ala或Ser和Gly残基伸至所给定β片层的相反侧，如此伸自一个β片层的Ala侧链充分贴于那些相邻片层之间，Gly侧链也如此。相邻β片层的Gly侧链是相接触的，Ala和Ser的侧链也如此。结果，片层间间隔的交替值为3.5埃和5.7埃，如对Nephila拖丝的X光衍射研究所测定。此间隔等同于合成的聚L-丙氨酸肽在其β片层构象中的间隔。对Araneus diadematus拖丝的X射线衍射研究表明有大约7.5埃的较大片层间间隔(Gosline等，生物模拟物：材料的设计与加工，PP:237-261,eds.Sarikaya and Aksay,Amer,Inst.of Physics.1995)。
在Nephila中，主要壶腹腺(MA腺)产生拖丝。目前克隆的NephilaMA腺产生的基因(spidroin 1和spidroin 2)的C-末端部分具有以下序列：34个氨基酸长的重复基序(形成非晶体结构域和晶体生成结构域)；47个氨基酸长的共有序列(Xu和Lewis,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:7120-7124,1990；Beckwitt and Arcidiacono,J.Biol.Chem.269:6661-6663,1994)。
Nephila spidroin 1的34个氨基酸长的重复基序(形成非晶体结构域和晶体生成结构域)具有以下序列：AGQ GGY GGL GSQ GAG RGGLGG QGA GAA AAA AAG G(SEQ ID NO:2)。在SEQ ID NO:2的C-末端终端有聚丙氨酸区(AAAAAAA)，以及许多甘氨酸模序形成非晶体结构域(两个甘氨酸残基被3个氨基酸分隔；如GGLGG)。
Nephila spidroin 2的47个氨基酸长的共有序列具有以下序列CPGGYG PGQ QCP GGY GPG QQC PGG YGP GQQ GPS GPG SAA AAAAAA AA(SEQ ID NO:3)。
丝在单独的腺体内分泌，当对分泌进行剪切力及机械延伸时，聚丙氨酸(生成晶体)区段经过螺旋成为β-片层过渡物，形成β-晶体稳定其结构。甘氨酸模序列被称为形成非晶体多肽链部分，散布在晶体区之中。
生物纤丝在具有极特异解剖学适应性变化和基因进化的某些昆虫和蛛形纲动物中已进化。在蜘蛛中，丝由一系列腹部腺体产生。晶体的形成与大小可依于一级氨基酸序列的组成。大部分丝的产生和分泌发生在主要壶腹腺(MA腺)，鞭毛状(FL)腺，圆柱(CY)腺中，其分别产生拖丝，胶丝和茧丝。应知本文所述转基因动物，及用于产生这种动物的构建体，可产生任一这些生物纤丝，或其任何变体，如此产生的生物纤丝片层间间隔在3.5～7.5埃之间。
A．拖丝
MA腺以3∶2比率产生两种蛋白质，富含甘氨酸，丙氨酸和脯氨酸。这些蛋白质形成拖丝，其是生命线，支架丝，及蜘蛛网的框架，拖丝是高硬度纤维，并具有类似于尼龙的性质。拖丝含有20-30％(体积)晶体，并具有以下特性：坚硬(初始Young’s模数为10GPa)，牢固(抗张强度为1.5GPa)，和坚韧(所需破坏能量为150MJm-3)。
B．胶丝
由FL腺产生的胶丝形成蜘蛛网的粘性螺旋，目前还未鉴定出编码胶丝的基因。含有少于5％(体积)晶体的胶丝在其自然状态下是弹性的，并具有类似于Lycra的性质。其具有以下特性：类似于轻度交联的橡胶(如斯潘德克斯弹性纤维)的机械性，低硬度(初始Young’s模数为3MPa)，和高度可伸展性。
C．茧丝
CY腺产生茧丝，其类似于由蚕茧(B.mori)产生的茧丝。
Ⅲ．生物纤丝基因的合成
由于在克隆天然丝基因中遇到难度，合成的基因可被克隆及表达。目前克隆的cDNA序列在完整结构及序列保守区内共同具有相似性。共有重复富含甘氨酸和谷氨酸，聚(Ala)区整合入较大重复单位。
为论述之目的，候选基因将由N.clavipes主要拖丝基因之一，spidrion 1代表(Arcidiaocono等，微生物生物技术应用49:31-38,1998)。这些基因的高重复性提高了基因的稳定性及重组的可能性。基于例如由Arcidiacono等在应用微生物学生物技术学49:31-38,1998；Fahnestock和Irwin(如前)所提供的建议，此重复可被避免。另外，用相似策略(Fahnestock和Irwin，应用微生物学生物技术学47:23-32,1997)可产生一系列构建体，产生4～20(或更多)个连续重复，并可在转基因动物产生前在细胞系中测试。构建合成重复的模序，它们具有不同的大小并含有非编码序列(如酪蛋白或免疫球蛋白基因的内含子)，以促进编码的生物纤丝的转录及增强表达。此模序可用头-尾构建策略而交替(McGrath,K.P.,博士论文，University ofMassachusetts at Amherst,1991；Ferrari等,U.S.P.N.5,243,038)。
密码子选择也可被设计以使表达最大化，因为如果基因含有较多由细胞中低丰度存在的tRNA物种识别的密码子则可发生提前终止(Rosenberg等，J.Bacteriol,175？716-722,1993,Manley,J.Mol.Biol,125:406-432,1978)。设计要表达的基因，并用被表达组织中有利的密码子合成(即乳腺中酪蛋白基因；膀胱中uroplakins)。
鉴于生物纤丝蛋白中高频率的丙氨酸残基，希望的是用额外的丙氨酸和/或甘氨酸补加细胞系的细胞培养基，以防止AlatRNA和/或GlytRNA集合体在生产生物纤丝蛋白的限速步骤中耗竭。
Ⅳ、表达载体组装
可产生真核表达载体，其驱动在转基因动物的乳汁或尿液中合成和分泌蛋白质(如生物纤丝蛋白)，此动物用编码这种蛋白的核酸分子转基因。根据标准分子生物学技术制备这些载体。
合成的核酸分子可具有编码附着的附加表位的序列，以易于鉴别和/或纯化编码的多肽。这种纯化可通过如附加表位的亲和层析而完成。可在序列中加入位点特异性蛋白酶解或化学试剂，以在已附加表位的多肽纯化后促进附加表位的除去(Saitot，生物化学101:123,1987)。优选地，在附加表位与生物纤丝蛋白的连接处或其附近，位点特异性蛋白酶解剂进行裂解。
本领域已知许多化学切割剂及其识别位点(以单辽字母密码表示)，并包括以下所示：羟胺(N或G)；甲酸(D或P)，溴化氰(M)；或乙酸(D或P)。例如溴化氰(CNBr)可用于切割在附加表位与生物纤丝蛋白之间导入的Met(M)残基。
或者，可使用天然或合成的蛋白酶。这些酶(及其识别位点)例如包括肠激酶(DDDK；SEQ ID NO:5)；因子Xa(IEGR；SEQ IDNO:6)；糜蛋白酶(W和Y和F)；肾素(YIHPFHLL；SEQ ID NO:7)；胰蛋白酶(R和K)；凝血酶(RGPR；SEQ ID NO:8)。例如附加表位可通过凝血酶识别位点附着于生物纤丝。在含有附加表位的蛋白质亲和层析纯化之后，由于生物纤丝一般对蛋白酶解有抗性，附加表位用凝血酶经蛋白酶切割可轻易除去。
表达盒包括在所需真核细胞中适当转录，翻译，及分泌所必需的元件(即：启动子，分泌信号序列，内含子序列及聚腺苷酸化信号)，许多乳汁或尿液特异性启动子可与其信号序列或与丝和/或丝心蛋白基因信号序列一起使用。在前者情况中，编码生物纤丝的核酸分子应不含有其自身翻译起始密码子，更确切地应与信号序列的3’末端同一读框。编码生物纤丝的核酸分子的3’末端可含有其自身聚腺苷酸化信号，或可含有通常在用作启动子和/或信号序列的基因上发现的3’未翻译序列。例如编码生物纤丝的核酸分子可以包括在具有均来自同样酪蛋白基因的启动子，信号序列，和3’未翻译序列的表达载体盒中。
所使用的真核表达构建体可包括一或多种以下基本组分。
A)转录起始调节区的启动子
这些序列可异源于待修饰的细胞，并可包括合成及天然病毒序列(如人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子；猴病毒40(SV40)早期启动子；Rous肉瘤病毒(RSV)；或腺病毒主要晚期启动子)，其赋予它们可操纵连接的核酸分子以强转录水平。也可通过非重要序列的缺失，和/或加入序列如增强子(例如增强子元件CMV,SV40或RSV)，或串联重复这种序列，对启动子加以修改，加入强增强子元件可将转录提高10-100倍。从以上鉴别的病毒启动子中的表达是组成性的(即在没有明显外部刺激下发生表达)。
或者，为在乳汁中表达，例如启动子区可以是反刍动物乳腺特异性基因天然存在的。例如包括αS1-酪蛋白(PCT申请WO91/08216和WO93/25567),αS2-酪蛋白，β-酪蛋白(Rosen,J.M.,U.S.P.N.5,304,489；Lee等，核酸研究16:1027-1041,1988)，k-酪蛋白，β-乳球蛋白，和α-乳白蛋白(Vilotte等,Eur.J.Biochem.186:43-48,1989；PCT申请WO88/01648)。这些启动子可驱动许多蛋白以组织和哺乳特异性方式高水平表达。
B)内含子包涵
含有内含子(即基因组克隆)的基因比不含内含子的基因表达水平高。由此，内含子位于转录起始位点和翻译起始密码子之间位于翻译终止密码子的3’，或位于编码生物纤丝基因的编码区内，可引起更高水平的表达。
内含子序列包括5’剪接位点(供体位点)和3’剪接位点(受体位点)。在这两个位点之间发现至少100碱基对的序列。这些内含子序列的起源将衍生自所用启动子，或衍生白天然基因(Ichimura和Mita,J.Mol.Evol.35:123-130,1992)并位于丝或丝心蛋白基因编码序列的5’。由于构建体的高重复性提高了基因的稳定性及重复序列重组的可能性问题，它们可通过插入来自使用启动子的基因的内含子而被破坏。此内含子可以类似于在Bombyx mori的丝心蛋白中存在的方式而定位。(Tsujimoto和Suzuki，细胞18:591-600,1979；Tsujimoto和Suzuki，细胞16:425～436,1979)。此策略除提高基因稳定性外，还提高表达水平。
C)信号(前导)序列
每个表达载体都将含有信号序列，其引导乳腺或尿道上皮细胞分泌表达的基因产物。此信号序列存在于任何天然分泌的基因中。可使用相关丝心蛋白基因的信号序列(如：B.mori重及轻丝心蛋白基因，P25和ssp160)，特异于表达组织的基因的信号序列(如酪蛋白或uroplakin基因)，或一般信号序列(如人碱性磷酸酶，mellitin和CD33信号肽的信号序列)。另外，用于分泌的信号序列可在哺乳动物/昆虫基因之间互换；例如可使用mellitin，酪蛋白的信号序列，或天然丝(来自蛛形纲动物)或丝心蛋白(来自昆虫)基因的序列。
D)终止区
核酸构建物的转录终止区可含有衍生5’启动子区的基因的3’末端和聚腺苷酸化信号。例如，牛αS1酪蛋白基因。或者，核酸构建物的3’末端将包含转录终止和聚腺苷酸化信号，已知其调节转录后mRNA稳定性，如那些衍生自牛生长激素，β-球蛋白基因或SV40早期区的转录终止和聚腺苷酸化信号。
E)表达载体的其它特征
为转移基因而设计的表达载体还包含一为在E-coli中增殖的复制起点，SV40复制起点，氨苄青霉素抗性基因，为在真核细胞中选择的新霉素抗性基因，和/或扩增显性可选择标记的基因(即二氢叶酸还原酶基因)，加上相应基因。另外，表达载体在其5’和3’末端可含有适当侧翼序列，其增强转导细胞中整合率(ITR序列：Lebkowski等，Mol,Cell,Biol,8:3988-3996,1988)。另外，通过使用自主复制序列(转导的，环形核酸在哺乳动物中作为质粒复制)(即，Epstein-Barr病毒的EBNA-1和oriP)，可达到体外丝或丝心蛋白的延长表达。
为克隆与增殖DNA的大区段，选择粘粒载体。尽管质粒载体在理论上可携带大插入体，但所得重组子转化E-coli非常低效。粘粒具有增殖大外源DNA片段的能力(Royal等，自然279:125,1979)。
用于生产转基因动物的表达载体可在转化细胞之前，通过限制性内切核酸酶消化而线性化。在此方法的一种变化方案中，只有例如来自牛酪蛋白或生长激素序列的包括编码5’末端调节序列(如启动子)和3’末端调节序列(如3’未翻译区)的消化片段，将用于转化细胞。因此，用这种片段转化的细胞将不含有任何只为质粒在细菌中增殖所必需的序列(如，细胞不含E.coli复制起点，或编码用于选择原核细胞的抗生素抗性蛋白(如氨苄青霉素抗性蛋白)的核酸分子。
在此方法的另一种变化方案中，用于转化细胞的消化片段将包括编码区，5’和3’调节序列，和编码能授与抗生素(如新霉素或嘌呤霉素)抗性用于选择真核细胞的蛋白质的核酸分子(包括启动子和3’未翻译区)。
对相应的生物纤丝基因的5’未翻译区(VTR)，其3’UTR，和/或其编码N-末端区可做修饰，以更优选地改进表达。或者，可使编码生物纤丝的核酸分子的编码序列内的序列缺失或突变，以由于例如存在内质网(ER)保留信号或其它分选抑制信号而在细胞内提高基因产物的分泌和/或避免基因产物的保留。另外，转基因构建体可含有具有染色质开放区活性的序列，如此它们授与连锁的转基因的组织特异性表达可重复活化。(Ellis等，PCT申请WO95/33841；Chung和Felsenfield,PCT申请WO96/04390)。
Ⅴ、表达载体的测试与定性
装配的构建体通过对二种DNA通过连接而融合在一起的区域测序而部分定性。部分限制酶谱将提供关于编码生物纤丝核酸分子的连接的调节序列的正确方向的信息。
装配的构建体的其它功能鉴定包括将其转染入建立的乳腺上皮细胞系(如MAC-Ts)(见Turner和Huyrh,U.S.P.N.5,227,301；Huynh等，Exp.Cell.Res.197:191-199,1991；Stampter等,U.S.P.N.4,423,145)，和鉴别分泌产物。
用于本发明的重组DNA法是分子生物学领域技术人员熟知的标准步骤，并例如由Sambrook,Fritsch和Maniatis，在分子克隆实验手册(2nded),Cold Spring Harbor Press,1989；Ausubel等在分子生物学通用方案，John Wiley & Sons,New York,NY,1994；和Perbal,B.V.,分子克隆实用指南(2nded)John Wiley & Sons,New York,NY,1988中所述。只为阐述之目的，以下实施例所用生物纤丝基因是由Arcidiaconot等在应用微生物学生物技术学49:31-38,1998中阐述并克隆的1.5kbNcDS-1插入体。
以下实施例以举例说明而非限制本发明。
实施例1：酪蛋白启动子
在以下实施例中，构建物的设计包括在酪蛋白基因5’和3’末端同一读框中使用山羊β-酪蛋白启动子(Ebert，生物/技术12:699-701,1993)，后接其自身表达信号序列，后接含丝克隆的1.5kb插入体(Arcidiancono等，如前)。此构建体的模式图如图1A所示。
将编码生物纤丝的核酸分子(如丝或丝心蛋白基因，或其片段)融入酪蛋白启动子，并通过来自衍生启动子的基因或被表达的生物纤丝核酸分子的信号序列驱动生物纤丝蛋白的分泌。终止序列可衍生自生物纤丝基因自身，或衍生自启动子基因。另外，可产生一杂合基因以提高表达水平。为此，可将丝或丝心蛋白基因(或其片段)插入山羊β-酪蛋白基因(Ebert等，生物/技术12:699-701,1993)的外显子2(ATG的上游)和外显子7(终止密码子的下游)之间。由于构建体的高重复性导致了基因的稳定性和重复序列的重组可能性的问题，通过插入酪蛋白的内含子(内含子3-7)将它们中断。由于终构建体的大规格，载体的构建可在粘粒载体(supercos)中进行，或质粒的骨架可由含有在E.coli宿主(Sambrook等，如前)扩增所必需序列的任何已知细菌载体(优选接受大规格DNA的载体)组成。
实施例2：乳清酸性蛋白(WAP)构建体
本实施例说明了杂合基因的产生，此杂合基因由WAP基因启动子，其信号序列，1.5kb编码拖丝的cDNA(Arcidiacono等，文献如前)，后接WAP基因的3’末端(Velander等，美国科学院院刊89:12003-12007,1992)组成。其构建详细过程参见以下描述和图1B。
乳清酸性蛋白(WAP)是啮齿类动物中的主要乳清蛋白，其在妊娠后期和哺乳期仅在乳腺中高水平表达(Hobbs等，J.Biol.Chem.257:3598-3605,1982)。基因组鼠WAP基因由2.6kbp(千碱基对)的5’侧翼启动子序列，3.0kbp编码序列(外显子和内含子)，和16kbp 3’侧翼DNA组成(见图1B)(Velander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:12003-12007,1992；Velander等，Ann.N.Y,Acad Sci.665-391-403.1992)。
在一实施例中，可构建由WAP基因启动子和编码拖丝的cDNA组成的杂合基因。通过将相应基因或核酸分子(此例为编码拖丝的cDNA)插入鼠WAP启动子和在5’末端的5’序列(核苷酸位-949～+33)，及在3’末端的WAP 3’序列(843bp；部分外显子3，后30个碱基及所有内含子C，外显子4，和70bp的3’UTR)之间，产生杂合的编码拖丝基因(Campbell等，核酸研究12:8685～8697,1984)。在此实施例中，信号序列来自天然丝基因。还可使用包括5’末端额外56bp的WAP基因信号序列(-949～+89位)。
在另一实施例中，通过插入编码鼠WAP基因的部分5’非翻译区和19个氨基酸信号序列(Hennighausen等，核酸研究10:3733-3744,1982)的核苷酸序列(核苷酸+1～+90)，并通过用含有编码侧翼为KpnJ限制酶识别位点的信号序列的90bp(碱基对)序列的引物，扩增1.5kb(千碱基)丝蛋白基因(NsDS-1；Arcidiacono等，文献如前)，而产生杂合基因。进行扩增以保持正确读框，3′引物在基因3’末端产生KpnI限制酶识别位点。然后在WAP第一个外显子的KpnI位点插入此PCR产物。此杂合基因可用EcoRI限制酶经消化而从载体切下(见图1B)，并纯化以微注射。
实施例3：Uroplakin启动子
在这些试验中，uroplakinⅡ启动子(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:679-683,1995；Sun,T.,PCT申请WO96/39494)用于驱动转基因动物尿道上皮中丝心蛋白或丝蛋白基因的表达。将丝心蛋白或丝蛋白基因插入鼠uroplakinⅡ(UPⅡ)基因的3.6kb 5’侧翼序列(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92:679-683,1995)的下游。将含有鼠精蛋白-1(Mp-1)基因的部分外显子1和所有内含子1和外显子2的序列，置于基因的3’末端，以提供外显子/内含子剪接位点和聚腺苷酸化信号。也可通过在外显子3的59位氨基酸读框中，插入编码丝或丝心蛋白的基因或其片段(仅成熟蛋白)，而使用uroplakinⅡ基因的信号序列。此构建体如图1C所示。
实施例4：DNA改组(shuffling)
产生编码生物纤丝基因盒的另一方法是通过DNA改组。DNA改组是一种重组和突变法，其通过随机片段化相关基因的集合体，随后再通过无引物PCR将片段再装配而进行(Stemmer,W.P.,自然370:389～391,1994；Stemmer,W.P.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:10747-10751,1994)。DNA改组的目的是使基因的功能最佳化，而不用首先测定哪种基因产物是速率限制的。基因可自身“改组”或来自不同物种(即spidroin1和2及ADF1-4)。另外，一个物种内的不同重复(如ADF3的GGAGQGGY(SEQ ID NO:4))可被“改组”(例如用ADF 1,2和4的重复)，并表达以测定产生有利特征的组合。除点突变之处，应用许多突变机制如多核苷酸缺失，插入，和倒位以及整合与切除可产生多样性。一旦由此产生了多样性，可将编码生物纤丝的核酸分子插入在乳汁或尿液中分泌的表达盒中，并用于转化哺乳动物细胞。
实施例5：表达二个基因的构建体
为表达二种基因(如拖丝由ADF3和4按比例组成)，可产生二个分离的构建体，或将二个基因克隆入具有间插核糖体进入位点(IRES)插入体的相同表达盒中(Jang等,J.Virol.62:2636-2643,1988)。将二个基因克隆入相同表达盒的优点是只需一个构建体就可以产生转基因动物。
实施例6：嵌合或杂合生物纤丝的合成
合成嵌合分子，其包括与胶原或原纤蛋白的一或多个结构域同框的丝的融合体(含有晶体或非晶体结构域)，这可提高交联，稳定性或弹性。这种嵌合体特别用作外科生物材料。
实施例7：乳腺上皮或尿道上皮细胞系中生物纤丝的产生
在同源的生物学相关细胞培养系统中，产生本发明编码生物纤丝的合成的核酸分子。在对转基因动物的研究开始之前，合成基因的遗传稳定性，分泌能力，及产生的生物纤丝的性质可非常有效地评估。
根据标准技术(参见Ausubel等，文献如前)，用各自质粒转染乳腺上皮及产尿细胞系(如将含有乳汁特异性启动子的表达构建体转染乳腺上皮细胞)。在一实施例中，为证实产生的蜘蛛丝的分泌，从稳定细胞系(分化24-96小时后的乳腺上皮细胞)中收获培养基，并经SDS-PAGE解离，用抗蜘蛛丝抗体(商购自Monsanto,St.Louis.MO)，或用抗具有同源于SEQ ID NOS:1-4的序列的肽的抗体进行Western印迹分析。
在MAC-Ts中表达和分泌可溶的ADF-3单体或亚单位
进行以下处理以在MAC-T细胞中表达和分泌ADF-3。用构建体特异性引物(引物1：CGTACGAAGCTTACGCACGAGCCGGATCTG，引物2：ATTAACTCGAGCAGCAAGGGCTTGAGCTACAGA)，经PCR扩增ADF-3的2.0kb cDNA克隆(Guerette等，1996，科学vol.272；112)。然后将PCR产物用SfiI和XhoI限制，并与哺乳动物表达载体pSecTag(Invitrogen；图1)连接，该载体也用SfiⅠ和XhoⅠ限制。此表达载体含有一强启动子(CMV，巨细胞病毒)，一信号序列(鼠Ig-kappa)和在构建体3’末端的“TAG”(myc和His序列)。由SV40启动子驱动的潮霉素B抗性基因存在于构建体的骨架中。表达自pSecTag的蛋白在N末端融合用于蛋白质分泌鼠Ig-kappa链前导序列，在C-末端融合用于检测及纯化的含c-myc表位及6个串联组氨酸残基的肽。通过脂转染将表达构建体(pSecTag/ADF-3)转染入MAC-T(乳腺上皮细胞，专利号5,227,301)，并用“TAG”特异性抗体(抗myc抗体，Invitrogen)测试条件培养基中ADF-3存在与否。
简而言之，将牛乳腺上皮细胞以5×105个细胞/100mm盘的密度种植。在第二天，将细胞用pSecTag/ADF-3质粒，或用不含ADF-3cDNA的对照载体转染。将10μg的质粒DNA稀释入0.25ml DMEM中，并与等体积的脂转染胺(0.25ml DMEM中20μg脂质)混合。将混合物旋转10秒钟，并在室温下30分钟以形成复合物。用DMEM将体积增至4ml，将脂质-DNA混合物施用于细胞，并在37℃培养16-20小时。然后将细胞在含10％FCS和5μg/ml胰岛素的新鲜培养基中再培养24小时。随后，在含50μg/ml潮霉素B的相同培养基中选择细胞。14天后分离抗性克隆。在无血清培养基中培养24小时后，从MAC-T/ADF-3转染物中收获条件培养基，与Ni-NTi琼脂糖珠(Qiagen)保温，其选择性地结合于在蛋白质COOH端的(His)6’并从培养基中纯化蛋白质。将洗脱自琼脂糖珠的蛋白质物质加样于10％SDS-PAGE凝胶，电泳，转移至硝基纤维素膜上，并用单克隆抗myc抗体(1∶5000稀释度)印迹。
结果：
用pSecTag/ADF-3转染的MAC-T培养基的Western印迹分析揭示：存在与myc抗体强交叉反应的条带，正好迁移在78KDa分子量的标记之下。这是ADF-3融合蛋白的期望大小(677a；60.8KDa)。myc抗体的应用也揭示了用myc表位标记的阳性对照蛋白质(阳性对照；2泳道)期望大小条带在～40KDa。未交叉反应条带如期在用作阴性对照(3泳道)的携带载体(pSecTag)的细胞的培养基的泳道中观测到。
大规模生产可溶的ADF-3亚单位
为生产重组ADF-3蛋白质，将上述实施例1稳定细胞系通过Western分析筛选最高表达子。选择最高表达子克隆并用于接种二个中空纤维生物反应器。一个是0.5m2中空纤维反应器，另一个是具有3.25m2反应器的Cell-Pharm System 2000。简而言之，将含70％铺满率MAC-T/ADF-3细胞的102三联烧瓶胰蛋白酶化，并用于接种3.25m2反应器(8×108个细胞)。以相似方式但用2×108个细胞接种0.5m2反应器。通过Western印迹分析5μl体积的培养基并示出存在ADF-3蛋白条带，我们已示出在每天连续从0.5m2反应器收获的物质中ADF-3的产生与分泌稠度。这些培养基可用于纯化至少mg量的可溶亚单位。
用Ni-NTA柱从细胞培养基中纯化ADF-3蛋白质
亲和纯化：
将衍生自分泌ADF-3物质的MAC-T细胞的培养基，通过在BioRad Biologic LP机器上的Ni-NTA Suplerflow树脂纯化。简而言之，将培养基结合于柱上以捕捉ADF-3蛋白质。用缓冲液A(Tris-HCl50mM pH8.0和NaCl 0.3M)冲洗此树脂。用另加入250mM或100mM咪唑的缓冲液A洗脱结合蛋白质。
纯化的ADF-3物质的鉴定：
银染色：
将洗脱自Ni-NTA柱的蛋白质组分在4～20％Tris-甘氨酸凝胶(Novex)上分离，并随后用衍生自Merril等(1981)的方法的Bio-Rad银染试剂盒染色。通过混合1μg此物质与12M尿素至终浓度为6M，及含10％β-疏基乙醇的加样缓冲液，在加样之前在95℃加热5分钟。分子量为～61KDa的ADF-3纯化物纯度为80％以上。
Western印迹：
通过在8～16％Tris-甘氨酸凝胶(Novex)上分离洗脱自亲和柱的物质，随后经电转移至Hybond ECL硝基纤维素膜(Amersham)，并与抗myc肽的单克隆抗体(1/5000稀释度；Invitrogen,cat.no.R950-25)反应，以进行Western印迹分析。用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗鼠IgG显示免疫复合物。具有分子量为～61KDa的强交叉反应条带显而易见。这与由ADF-3的cDNA序列推导的分子量相一致。
实施例Ⅴ 由乳汁特异启动子鼠乳清酸性蛋白(WAP)驱动的ADF-3的表达
使ADF-3乳汁特异表达的表达载体已经被构建。此表达由乳清酸性启动子(WAP,4.4KB；Dr.L.Henninghausen)驱动。此表达盒还包括绝缘子元件的二个拷贝(来自鸡β球蛋白基因座；自然1990,Vol.348pg.749；)。为产生表达载体，进行以下步骤：
步骤1：绝缘子序列的PCR扩增：用绝缘子特异引物(引物1：TTTTGCGGCCGCTCTAGACTCGAGGGGACAGCCCCCCCCCAAAG，引物2：TTTTGGATCCGTCGACGCCCCATCCTCACTGACTCCGTCCTGGAGTTG)，经鸡DNA的PCR扩增，衍生绝缘子片段。将PCR产物在二个独立反应中加以限制，一是用NotⅠ和XhoⅠ，另一是用BamHⅠ和SalⅠ。然后将此二个限制的片段连接一起，产生在每个末端具有NotⅠ和BamHⅠ位点的2kb绝缘子片段。
步骤2：WAP 3’非编码序列的PCR扩增：用鼠DNA及以下引物将WAP 3’末端进行PCR扩增：引物1：TTTCTGATAACCCTTCAGTGAGCAGCCGGC；引物2：AATTGGTACCAGCGGCCGCTCTAGAGGAACTGAAGCAGAGACCATGC。然后将PCR产物用PmeⅠ和NotⅠ加以限制。
步骤3：连接WAP4.4kb启动子序列与绝缘子片段：将bluescript质粒中4.4kb WAP启动子用SacⅡ和NotⅠ限制，并插入接头(引物1：ggactagttgatcagcggccgctataggatcc；引物2：ggcctggatcctatagcggccgctgatcaactagtccgc)，产生具有4.4kb WAP启动子及额外限制位点(SacⅡ,SpeⅠ,BclⅠ,NotⅠ和Bam HⅠ)的载体。然后将此新载体用NotⅠ和BamHⅠ限制，并与绝缘子片段(见步骤1)连接。
步骤4：连接WAP 3’非编码序列与ADF-3序列：将bluescript载体用KpnⅠ和SacⅡ限制，并插入接头(引物1：ggacgcggtgttaacgatatctctagagcggccgct，引物2：ccggagcggccgctctagagatatcgttaacaccggtccgc)，以产生额外的限制位点(KpnⅠ,NotⅠ,XbaⅠ,EcoRⅤ,HpaⅠ,AgeⅠ,和SacⅡ)。然后将此载体用EcoRV限制，并将ADF-3片段(图1，用NcoI限制的pSecTag/ADF-3)进行平端化，并连于此载体。随后将新载体用PmeⅠ和NotⅠ限制，并插入1.6kb 3’WAP基因的PCR产物(见步骤2)。然后将此载体用SacⅡ和AgeⅠ限制，以线性化ADF-3基因的上游，与含绝缘子和WAP启动子的6.8kb片段连接在一起，此6.8kb片段是通过用SacⅡ和AgeⅠ限制步骤3的载体而产生的。最终构建体含有二聚化的鸡β球蛋白绝缘子，后接WAP4.4kb启动子，ADF-3基因和WAPl.6kb 3’非编码区(pWAP/ADF-3)。通过转染及在HCll细胞(鼠乳腺上皮细胞)中诱导，已示出此构建体的功能。简而言之，将HCll细胞以5×105个细胞/100mm培养盘的密度种植。在第二天，用WAP/ADF-3质粒或用无ADF-3 cDNA的载体转染此细胞。将10μg WAP/ADF-3质粒DNA稀释入0.25mlDMEM中，并与等体积的脂转染胺(0.25ml DMEM中20μg脂质)混合。将此混合物旋转10秒钟，并在室温下30分钟以形成复合物。用DMEM将体积增至4ml，并将此脂质-DNA施用于细胞，并在37℃培养16～20小时。然后将细胞在含10％FCDS和5μg/ml胰岛素和10ng/ml鼠EGF的新鲜培养基(培养基A)中再培养24小时。随后，在含50μg/ml潮霉素B的相同培养基中选择细胞。7天后集合抗性克隆。为从WAP启动子中诱导表达，细胞需分化。接着进行以下步骤。将细胞的稳定集合以3×105个细胞/6孔培养盘的密度铺板于覆盖一薄层matrigel的培养盘中。在培养基A中达到铺满度后(2天后)，通过从培养基中移出EGF将细胞引发，并在48小时后向培养基中加入催乳素(即0.1μM地塞米松和1μg/ml绵羊泌乳刺激素)。48小时后，移出激素处理的培养基，用Ni-NTA琼脂糖珠(Qiafen)保温，此珠选择性地与蛋白质COOH末端的(His)6结合，并从培养基中纯化蛋白质。将洗脱自琼脂糖珠的蛋白质物质加样于8～16％Tris-甘氨酸凝胶(NOVEX)上，电泳，转移至硝基纤维素膜上，并用单克隆抗myc抗体(1∶5000稀释液)印迹。将所有试验以一式三份进行。作为对照，相似孔在没有催乳素的相同条件下培养。另外，将用无ADF-3的WAP载体转染的细胞用作阴性对照。催乳素的存在刺激ADF-3在matrigel上从WAP启动子表达，并增进乳腺特异表达盒的功能。阴性对照组如期观测到无交叉反应条带。
实施例8．产生在乳汁或尿中表达生物纤丝的转基因动物
WAP/ADF-3转基因小鼠的产生
根据标准技术，将上述构建体用于产生转基因小鼠。经PCR分析7只创始者(3只雌性，4只雄性)被鉴别为阳性。用AmersharmPharmalia Ready-to-Go PCR珠，将10μl每种引物(引物1：GTTGTATCGGCCCTGGTATCTAT，引物2：ATGTTCTCTCTGGATCCAGGAGTGAGAGG)以1μM浓度与5μ1 DNA(含100ng)混合，并置于模块温度为10℃的PCR机上。在每个试管中加入一个Ready-to-Go PCR珠，将试管盖帽并开始循环、，循环如下：步骤l：95℃10秒钟；步骤2：60℃30秒钟；步骤3：72℃ 30秒钟；步骤4：重复步骤1～3,34个循环。步骤5：72℃ 7分钟。步骤6：4℃。在PCR循环末期，将样本在2％琼脂糖凝胶上电泳，分析309 bp PCR产物的存在与否。
在一些转基因方法中，将转基因导入受精卵细胞的前核中。对一些动物如小鼠而言。受精是在体内进行的，且受精卵是经外科手术取出的。在其它动物中，卵细胞可移自活的或刚刚死去(如屠宰场)的动物，并体外受精。一般通过微注射(Ogata等，U.S.P.N.4,873,292)导入转基因。将微注射的受精卵转移至适当雌性动物，当转基因是整合的时，依于发育时期，得到转基因或嵌合动物。嵌合动物可被繁殖以形成真正种系转基因动物。
或者，转基因可被导入胚胎干细胞(ES细胞)。可通过电穿孔，微注射，或任何其它本领域已知转染细胞的技术，将转基因导入这种细胞中。将转化的细胞与其所起源的动物的胚泡组合。此细胞定居胚胎，且在一些胚胎中，这些细胞形成所得嵌合动物的种系(Jaenisch,R,科学240:1468-1474,1988)。或者，ES细胞可用作核源，以移植入去核的受精卵，这样产生转基因动物。
乳汁中生物纤丝的产生
在一实施例中，将蜘蛛丝基因亚克隆入含有酪蛋白基因启动子的表达载体中，由此蜘蛛丝基因的表达由酪蛋白基因启动子控制。这种表达载体之一是基于Rosen,J.M.(U.S.P.N.5,304,489)及Meade和Lonberg(U.S.P.N.4,873,316)所述载体的酪蛋白表达载体。
在另一实施例中，将WAP/丝蛋白基因杂合片段(EcoRⅠ)片段，如实施例2所述)纯化，并微注射入受精小鼠卵细胞中，其然后被植入养母中。根据本领域熟知方法，通过对尾DNA(分离自尾组织的DNA)的Southem印迹分析，鉴定WAP/丝基因的存在。然后将阳性创始动物回交，以产生用于研究转基因表达的半合动物。
尿中生物纤丝的产生
蜘蛛丝基因，例如可被亚克隆入表达载体中，由此蜘蛛丝基因在uroplakin启动子的转录控制下(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:679,1995)。
尿液具有附加优势，即其PH值及盐组分可通过掺入某些组分而被调节，可影响在最天然结构中丝的形成。
实施例9在乳汁及尿液中均产生生物纤丝的“双转基因”动物的产生
可产生在其尿液和乳汁中均产生生物纤丝蛋白(如蜘蛛丝)的转基因动物。构建这种动物的一种方法是用二种构建体转化动物胚胎细胞，一构建体中，编码生物纤丝的核酸分子的表达由一能从产乳细胞中表达和分泌生物纤丝的启动子驱动；另一构建体中，编码生物纤丝的核酸分子的表达由另一启动子引导，此启动子能从产尿细胞中表达和分泌生物纤丝。在此方法中，将双转化的细胞用于产生转基因动物。
这样，用两种核酸片段微注射(或共微注射)哺乳动物(如反刍动物)受精卵：一种片段在乳汁启动子控制下表达生物纤丝蛋白，另一种片段在尿液特异启动子影响下表达生物纤丝蛋白。所产生的转基因动物将在其乳汁及尿液中均分泌/产生生物纤丝。这将提高每单位转基因动物生产生物纤丝的总产量。
生产这种在其乳汁和尿液中均能产生生物纤丝的动物的第二种方法是：分别产生携带能在产乳细胞中表达和分泌生物纤丝的构建体的胚胎干细胞，和携带能在产尿细胞中表达和分泌生物纤丝的构建体的胚胎干细胞。然后将此二种转化的ES细胞与起源它们的动物的胚泡组合，以产生嵌合动物，然后可将其繁殖至纯合性。
这类双表达的动物有许多优点。首先，两种性别的动物从其出生即持续在其尿中生产生物纤丝，且雌性动物然后在成熟后哺乳时，在其乳汁中还能生产生物纤丝蛋白。其次，由任何单独雌性动物生产的生物纤丝的数量，根据生物纤丝变化所需，可提高(通过诱导哺乳)或降低(不诱导哺乳)。
实施例10共表达且可从二单体中装配生物纤丝蛋白的转基因动物的产生
可生产一种转基因动物，其产生二种蛋白质，这二种蛋白质均为在其乳汁，尿液或二者中正确装配生物纤丝蛋白之所需。例如，Araneusdiadematies拖丝由ADF3和4组成。构建这种动物的一种方法是用二种构建体转化动物胚胎细胞，每个构建体表达两种蛋白之一。这些蛋白质可在尿液或乳汁，或二者中表达。
另一种方法可应用实施例5中所述的编码多顺信息的构建体。此构建体可在乳汁，尿液或二者中分泌其产物。一旦在相同液体中存在二种蛋白(即均在乳汁中或均在尿液中)，可将它们正确装配并纯化。

Claims (21)

1、一种核酸分子，包括(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)在产乳细胞或产尿细胞中指导多肽表达的启动子，所述启动子可操纵地与所述序列连接，及(ⅲ)前导序列，其使得能通过所述产乳或产尿细胞分别在哺乳动物乳汁或尿液中分泌所述生物纤丝。
2、哺乳动物胚胎，其细胞核包括权利要求1的核酸分子。
3、一种雌性哺乳动物，其中所述雌性哺乳动物乳腺组织的基因组包括权利要求1的核酸分子，其中所述启动子是产乳细胞特异的。
4、权利要求3的哺乳动物，其中所述哺乳动物选自啮齿动物，反刍动物，及山羊。
5、一种动物，其中在所述动物中产生尿液的细胞的基因组包括权利要求1的核酸分子，其中所述启动子是产尿细胞特异的。
6、权利要求5的动物，其中所述动物是哺乳动物。
7、权利要求1的核酸分子，其中所述生物纤丝是蜘蛛丝。
8、权利要求7的核酸分子，其中所述蜘蛛丝是拖丝。
9、权利要求1的核酸分子，当分泌物经剪切力作用及机械延伸而进行分泌时，所述生物纤丝具有多丙氨酸区段，其螺旋为β片层过渡物，所述过渡物形成β-结晶，稳定所述生物纤丝的结构。
10、权利要求1的核酸分子，其中所述生物纤丝具有一非晶体结构域，形成β-折叠片，由此β片层间间隔在3和8埃之间。
11、权利要求1的核酸分子，其中所述生物纤丝具有包括非晶体结构域和晶体形成结构域的C末端氨基酸基序，所述基序具有至少50％相同于SEQ ID NO:2的序列。
12、权利要求1的核酸分子，其中所述生物纤丝具有至少50％相同于SEQ ID NO:3的共有序列。
13、一种生产生物纤丝的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供一种用编码生物纤丝的核酸分子转染的胚胎细胞，其表达所述生物纤丝并引起所述生物纤丝从衍生自所述转染的胚胎细胞的细胞中分泌；
(b)培养所述胚胎细胞，以产生一种含有生物纤丝表达和分泌细胞的动物；
(c)从所述动物的生物纤丝表达和分泌细胞中分离所述生物纤丝。
14、一种生产生物纤丝的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供一种用核酸分子转染的动物细胞，此核酸分子包含(ⅰ)编码生物纤丝的核酸序列，(ⅱ)在动物细胞中指导多肽表达的启动子，(ⅲ)能导致通过所述细胞分泌所述生物纤丝的前导序列；
(b)培养所述转染的细胞；
(c)从所述培养的转染细胞的培养基中分离所述生物纤丝。
15、权利要求13或14的方法，其中所述生物纤丝是蜘蛛丝。
16、权利要求15的方法，其中所述蜘蛛丝是拖丝。
17、权利要求13或14的方法，其中当分泌物经剪切力作用及机械延伸而进行分泌时，所述生物纤丝具有多丙氨酸区段，其螺旋为β片层过渡物，所述过渡物形成β-结晶，稳定所述生物纤丝的结构。
18、权利要求13或14的方法，其中所述生物纤丝具有形成β折叠片的非晶体结构域，由此，β片层间间隔在3和8埃之间。
19、权利要求13或14的方法，其中所述生物纤丝具有包括非晶体结构域和晶体形成结构域的C末端氨基酸基序，所述基序具有至少50％相同于SEQ ID NO:2的序列。
20、权利要求13或14的方法，其中所述生物纤丝具有至少50％相同于SEQ ID NO:3的共有序列。
21、权利要求13或14的方法，其中所述动物是哺乳动物。
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