ES2335385T3 - Biosintesis de sustratos de policetido sintasa. - Google Patents

Abstract

Célula huésped de E. coli recombinante que esta modificada genéticamente para la síntesis de 2S-metilmalonil CoA y un policétido, en la que dicha modificación comprende la incorporación de un sistema de expresión de propionil CoA carboxilasa (pcc); y la incorporación de al menos un sistema de expresión para la policétido sintasa modular (PKS).

Description

Biosíntesis de sustratos de policétido sintasa.

Declaración de derechos en relación a invenciones realizadas bajo investigación patrocinada por el gobierno federal

La presente invención fue realizada con la ayuda del gobierno de U.S. del National Institutes of Health y la National Science Foundation. El gobierno de U.S. puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

Campo técnico

La invención se refiere a procedimientos de adaptación de huéspedes procarióticos para la producción eficiente de policétidos. En un aspecto, los huéspedes son modificados para sintetizar las unidades iniciadoras y/o extensoras usadas por las policétido sintasas en la síntesis de policétidos. Pueden realizarse también otras modificaciones a los huéspedes. De esta manera, la invención incluye procedimientos para la producción de policétidos complejos en organismos tan diversos como Escherichia coli, Bacillus, Myxococcus y Streptomyces.

Técnica anterior

Los policétidos complejos, tales como 6-desoxieritronolida B (6-dEB), el núcleo macrocíclico de la eritromicina antibiótica, constituyen una clase importante de productos naturales. Estos son sintetizados mediante policétido sintasas "modulares", que se encuentran generalmente en actinomycetes. Por ejemplo, la policétido sintasa (PKS) que resulta en la síntesis de 6-dEB es producida en Sacromyces erythraea. Los policétidos producidos en estos huéspedes nativos son generalmente modificados subsiguientemente para obtener el antibiótico terminado mediante glicosilación, oxidación, hidroxilación y otras reacciones modificadoras. Trabajos recientes de este laboratorio han demostrado que es posible expresar módulos policétido sintasa en una forma funcional en Escherichia coli (Gokhale, R.S., et al., Science (1999) 284:482-485). Sin embargo, con el objetivo de aprovechar estas enzimas modulares para la biosíntesis de policétidos en E. coli, o en otros huéspedes que no los producen normalmente, también es necesario producir sus sustratos apropiados in vivo en una manera controlada. Por ejemplo, metabolitos, tales como acetil-CoA, propionil-CoA, malonil-CoA y metilmalonil-CoA son los sustratos más comunes de estas enzimas. E. coli tiene la capacidad para producir acetil-CoA, propionil-CoA y malonil-CoA; sin embargo, estos dos últimos sustratos están presentes solo en pequeñas cantidades en la célula, y su biosíntesis está estrictamente controlada. La capacidad de E. coli para sintetizar metilmalonil-CoA no se ha documentado hasta la fecha.

Prevalecen condiciones similares en otras células microbianas, especialmente las que no producen policétidos de manera nativa, tales como varias especies de Escherichia, Bacillus, Pseudomonas y Flavobacterium. De esta manera, en general, es posible que las unidades iniciadoras y/o extensoras requeridas no se produzcan en las cantidades adecuadas en un huésped particular. Además, mediante una selección apropiada de los dominios de acil transferasa (AT) de la PKS en cuestión, pueden emplearse sustratos más complejos que los indicados anteriormente. Como ejemplo, la PKS para la síntesis de FK506 comprende un dominio de acil transferasa que incorpora sustratos tales como propil malonil-CoA con preferencia sobre malonil-CoA o metilmalonil-CoA. Sería útil disponer de un procedimiento que proporcione este intervalo de sustratos en niveles apropiados en cualquier organismo huésped elegido
arbitrariamente.

Problemas adicionales que puede ser necesario superar al realizar la producción de policétidos en huéspedes procarióticos, especialmente los que no producen policétidos de manera nativa, incluyen la presencia de enzimas que catabolizan las unidades iniciadoras y/o extensoras requeridas, tales como enzimas codificadas por el operón prp de E. coli, que son responsables del catabolismo del propionato exógeno, como una fuente de energía y carbono en este organismo. Con el fin de optimizar la producción de un policétido que utiliza propionil CoA como unidad iniciadora y/o utiliza su producto de carboxilación, metilmalonil CoA, como una unidad extensora, este operón debería ser inutilizado, excepto por esa porción (el sitio E) que codifica un propionil CoA sintetasa. Cualquier sitio adicional que codifica enzimas catabolizantes para unidades iniciadoras o extensoras es inutilizado también ventajosamente.

Además, un huésped procariótico particular, tal como E. coli, puede carecer de la fosfopanteteinil transferasa requerida para la activación de la policétido sintasa. Puede requerirse la modificación del huésped para contener también dicha transferasa.

El documento WO98/27203 describe un sistema vector múltiple, en el que se prevén sistemas de expresión para los propios genes policétido sintasa y opcionalmente cofactores para activar las proteínas codificadas. El documento WO95/08548 describe la preparación de plásmidos que contienen genes que codifican proteínas policétido sintasa y su transfección en células huésped. También describe células huésped en las que sus propias células policétidas han sido eliminadas.

Stassi, PNAS (1998) 95 describe el reemplazo de un dominio acil transferasa (AT) de una policétido sintasa de eritromicina con un dominio AT etil malonato específico de la policétido sintasa de nidamicina. Tang J. Bacteriology (1994) describe manipulaciones relacionadas con las unidades iniciadoras y/o extensoras. El artículo describe la inhabilitación de una ruta para la síntesis de las unidades iniciadoras/extensoras en vez de para su catabolismo. Kao, Science (1994) 265, describe plásmidos que contienen la policétido sintasa para GdEB y células eliminadas para genes PKS.

En resumen, sería ventajoso realizar la producción de policétidos en huéspedes microbianos, especialmente huéspedes procariotas en general, y particularmente, en huéspedes que no producen policétidos de manera nativa. Frecuentemente, estos huéspedes tienen ventajas sobre los productores nativos de policétidos, tales como Streptomyces, en términos de facilidad de transformación, capacidad para crecer rápidamente en cultivo y similares. Estas ventajas son particularmente útiles en la valoración de los resultados de mutagénesis aleatoria o transposiciones genéticas de policétido sintasas. De esta manera, la invención proporciona una multiplicidad de enfoques para adaptar huéspedes microbianos para la producción de policétidos.

Divulgación de la invención

La invención ha conseguido, por primera vez, la producción de un producto policétido completo, 6-dEB, en el organismo huésped E. coli, universalmente útil. Los procedimientos usados para conseguir este resultado son adaptables a huéspedes microbianos en general, especialmente procarióticos. Pueden usarse para adaptar huéspedes microbianos, que no producen policétidos de manera nativa, a dicha producción y para mejorar la producción de policétidos en huéspedes que los producen normalmente. Dependiendo del huésped elegido, las modificaciones requeridas pueden incluir la incorporación en el organismo de sistemas de expresión para los propios genes policétido sintasa; inhabilitación de los genes endógenos que codifican para enzimas catabólicas para las unidades iniciadoras y/o extensoras; incorporación de sistemas de expresión para enzimas requeridas para la modificación post-translacional de las sintasas, tales como fosfopanteteinil transferasa; e incorporación de enzimas que mejoran los niveles de las unidades iniciadoras y/o extensoras. La combinación particular de modificaciones requeridas para adaptar el huésped variará dependiendo de la naturaleza del policétido deseado y de la naturaleza del propio huésped.

La presente invención proporciona un célula huésped E. coli recombinante que es modificada genéticamente para la síntesis de 2S-metilmalonil CoA y un policétido, en la que dicha modificación comprende la incorporación de un sistema de expresión de propionil CoA carboxilasa (pcc); y la incorporación de al menos un sistema de expresión para la policétido sintasa (PKS) modular.

En la presente memoria se describen células microbianas que son modificadas genéticamente para la síntesis mejorada de al menos un policétido, en las que dicha modificación comprende la incorporación de al menos un sistema de expresión para producir una proteína que cataliza la producción de unidades iniciadoras y/o extensoras y/o para inhabilitar al menos una ruta endógena para el catabolismo de las unidades iniciadoras y/o extensoras.

Pueden realizarse también modificaciones adicionales, tales como la incorporación de al menos un sistema de expresión para una proteína policétido sintasa y, si es necesario, la incorporación de al menos un sistema de expresión para una fosfopanteteinil transferasa.

En otros aspectos, la invención está dirigida a procedimientos de preparación de policétidos, incluyendo policétidos completos, en las células modificadas de la invención. Una realización preferente es un procedimiento para sintetizar 6-dEB u otros policétidos completos en E. coli.

En todavía otro aspecto, la invención está dirigida a un procedimiento para valorar los resultados de transposiciones genéticas o mutagénesis aleatoria de genes de policétido sintasa, tomando ventaja de la alta eficiencia de transformación en E. coli.

Modos de realizar la invención

En el ejemplo ilustrativo siguiente, E. coli es modificada para realizar la producción de 6-dEB, el policétido precursor de eritromicina. Las tres proteínas requeridas para esta síntesis, DEBS1, DEBS2 y DEBS3 son conocidas y los genes que las codifican han sido clonados y secuenciados. Sin embargo, una multiplicidad de genes PKS adicionales han sido también clonados y secuenciados, incluyendo los que codifican enzimas que producen los policétidos precursores de avermectina, oleandomicina, epotilona, megalomicina, picromicina, FK506, FK520, rapamicina, tilosina, espinosad y muchos otros. Además, se han descrito procedimientos para modificar genes PKS nativos para alterar la naturaleza de los policétidos producidos. La producción de proteínas PKS híbridas modulares y sistemas de síntesis se describe y reivindica en la patente U.S. 5.962.290. Procedimientos para modificar enzimas PKS para permitir la incorporación eficiente de dicétidos se describen en la patente U.S. 6.080.555. Procedimientos para modificar enzimas PKS mezclando y emparejando dominios individuales o grupos de dominios se describen en el documento U.S. No de serie 09/073.538. Procedimientos para alterar la especificidad de módulos de PKS modulares para incorporar unidades iniciadoras o extensoras particulares se describen en el documento U.S. No de serie 09/346.860, ahora admitido. Procedimientos mejorados para preparar dicétidos para la incorporación en policétidos se describen en el documento U.S. No de serie 09/492.733. Procedimientos para mediar la síntesis de la cadena policétida entre módulos se describen en el documento U.S. No. de serie 09/500.747. Los contenidos de las patentes y solicitudes de patente anteriores se incorporan a la presente memoria por referencia.

De esta manera, un huésped seleccionado puede ser modificado para incluir cualquiera de entre muchas policétido sintasas mediante la incorporación en el mismo de sistemas de expresión apropiados para las proteínas incluidas en dichas sintasas. Pueden suministrarse o bien sintasas completas o sintasas parciales, dependiendo del producto deseado. Si el huésped produce policétido sintasa nativamente, y se desea un policétido diferente del producido de manera ordinaria, puede ser deseable eliminar los genes que codifican la PKS nativa. Procedimientos para dicha eliminación se describen en la patente U.S. 5.830.750, que se incorpora a la presente memoria por referencia.

Para los huéspedes que no producen policétidos de manera nativa, las enzimas que adaptan las policétido sintasas pueden estar ausentes o ser deficientes, de manera que además de suministrar los sistemas de expresión para las propias policétido sintasas, puede ser necesario suministrar un sistema de expresión para estas enzimas. Una enzima que es esencial para la actividad de PKS es una fosfopanteteinil transferasa. Los genes que codifican estas transferasas han sido clonados y están disponibles. Estos se describen en la solicitud de patente U.S. 08/728.742, que está publicada en la actualidad, por ejemplo, en la solicitud canadiense 2.232.230. Los contenidos de estos documentos se incorporan a la presente memoria por referencia.

Dependiendo del huésped seleccionado, dichos huéspedes pueden incluir, de manera nativa, genes que producen proteínas que catabolizan las unidades iniciadoras y/o extensoras deseadas. Un ejemplo incluye el operón prp, en el que las proteínas codificadas por las subunidades A-D catabolizan propionato exógeno. Sin embargo, la enzima codificada por prp E es deseable, ya que es una propionil CoA sintetasa. Las porciones del operón que codifican enzimas catabolizantes son inhabilitadas ventajosamente modificando la E. coli. Operones similares en otros huéspedes pueden ser inhabilitados según sea necesario.

En general, en todos los casos, las enzimas que mejoran la producción de unidades iniciadoras y/o extensoras, y cualquier enzima requerida para la activación de estas enzimas de producción deben ser incorporadas en las células, modificándolas para que contengan sistemas de expresión para estas proteínas.

En una realización de este aspecto, se toma ventaja del operón matABC, que ha sido clonado recientemente de Rhizobium trifoli (An, J.H., et al., Eur. J. Biochem. (1988) 15:395-402). Hay tres proteínas codificadas por este operón.

MatA codifica una malonil-CoA descarboxilasa, que normalmente cataliza la reacción: malonil-CoA \rightarrow acetil-CoA \rightarrowCO_{2}.

MatB codifica una malonil-CoA sintetasa que cataliza la reacción: ácido malónico + CoASH \rightarrow malonil-CoA (en una reacción dependiente de ATP).

MatC codifica un transportador de malonato que se cree que es responsable del transporte de ácido malónico a través de la membrana celular.

En la presente memoria se demuestra que estas enzimas son algo promiscuas con respecto al sustrato en su capacidad de catalizar las reacciones mostradas. De esta manera, además de malonil-CoA y ácidos malónicos (para MatA y MatB respectivamente) como sustratos, estas enzimas pueden utilizar también metilmalonil-CoA y ácido metilmalónico; etilmalonil-CoA y ácido etilmalónico; propilmalonil-CoA y ácido propilmalónico y similares. De esta manera, estas enzimas pueden ser usadas para proporcionar una variedad de unidades iniciadoras y extensoras para la síntesis de policétidos deseados.

En otra realización de este aspecto, pueden usarse homólogos de matB y matC, derivados de S. coelicolor (No. De acceso al GenBank AL 163003).

También útil en el suministro de sustratos para unidades extensoras es el gen que codifica propionil CoA carboxilasa. Esta enzima carboxilasa es un dímero codificado por los genes pccB y accA2, que han sido caracterizados partiendo de Estreptomyces coelicolor A3 por Rodríguez, E., et al., Microbiology (1999) 145:3109-3119. Se necesita una biotina ligasa para la activación de estas proteínas. El sustrato típico para esta enzima es propionil-CoA, que a continuación es convertido en metilmalonil-CoA, una reacción que se resume como propionil-CoA+CO_{2} \rightarrow metilmalonil-CoA (una reacción dependiente de ATP).

Otros sustratos acil-CoA pueden ser convertidos también a los productos malonil-CoA correspondientes.

Además de proporcionar células huésped modificadas que son eficientes produciendo policétidos, las policétido sintasas, sus enzimas de activación, y enzimas que proporcionan unidades iniciadoras y/o extensoras pueden ser usadas en sistemas in vitro para producir los policétidos deseados. Por ejemplo, las enzimas malonil-CoA descarboxilasa y/o malonil-CoA sintetasa, tales como las codificadas por el operón matABC, y/o propionil-CoA carboxilasa, tales como las codificadas por los genes pccB y accA2, pueden ser usadas en cultivos in vitro para convertir precursores en unidades iniciadoras y extensoras adecuadas para que una PKS deseada realice la síntesis de un policétido en un sistema de cultivo celular in vitro o libre de células. El MatB purificado es usado de manera particularmente ventajosa para la producción preparativa, libre de células, de policétidos, ya que los tioésteres de CoA son los componentes más caros en dichos sistemas de síntesis libres de células. Como alternativa, tal como se ha expuesto anteriormente, estos genes se usan (en cualquier combinación adecuada) en una estrategia general para la producción mediante células en un cultivo de estos sustratos. Pueden usarse MatB y MatC para realizar la producción de cualquier tioéster de CoA alfa carboxilado en el que el ácido libre correspondiente puede ser reconocido como un sustrato por MatB. La proteína MatA puede ser usada también para suplementar niveles in vitro o in vivo de unidades iniciadoras, tales como acetil-CoA y propionil-CoA. Los genes que codifican propionil-CoA carboxilasa pueden ser usados también para proporcionar la enzima para sintetizar unidades extensoras adecuadas in vivo.

De esta manera, la invención incluye un procedimiento para mejorar la producción de un policétido, incluyendo un policétido completo en un huésped microbiano, cuyo procedimiento comprende proveer dicho huésped con un sistema de expresión para una enzima que mejora la producción de unidades iniciadoras y/o extensoras usadas en la construcción del policétido. Un policétido "completo" es un policétido que forma la base para un antibiótico, tal como los policétidos que son precursores de eritromicina, megalomicina y similares. Las enzimas incluyen las codificadas por el operón matABC y sus homólogos en otros organismos, así como los genes pccB y accA2 que codifican proprionil carboxilasa y sus homólogos en otros organismos. En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para mejorar la producción de policétidos en sistemas libres de células, proporcionando una o más de estas enzimas al sistema libre de células.

La invención se refiere también a células modificadas para producir las enzimas y a procedimientos de producción de policétidos usando estas células, así como a procedimientos de producción de policétidos usando sistemas libres de células.

La invención incluye también un procedimiento para mejorar la producción de policétidos en un sistema microbiano, suplementando el medio con un sustrato para una enzima endógena que convierte este sustrato en una unidad iniciadora o extensora.

La invención incluye también un procedimiento de producción de policétidos en huéspedes microbianos que contienen modificaciones para ayudar a la producción de policétidos, tales como la desactivación de los genes endógenos que codifican proteínas para el catabolismo de los sustratos requeridos, suministrando a estas células precursores sintéticos, tales como precursores de dicétidos.

El policétido producido puede ser uno producido normalmente por la PKS y puede existir en la naturaleza; en este caso, la presencia del gen que codifica la enzima mejoradora de la producción de iniciador/extensor in vivo o la propia enzima en sistemas libres de células puede simplemente mejorar el nivel de producción. Además, la PKS puede ser una PKS modificada, diseñada para producir un nuevo policétido, cuya producción puede ser mejorada en una manera similar. Debido a la capacidad de las enzimas descritas en la presente memoria para aceptar un amplio intervalo de sustratos, pueden proporcionarse unidades extensoras y unidades iniciadoras basadas en un amplio intervalo de reactivos fácilmente disponibles. Tal como se ha expuesto anteriormente, pueden suministrarse también materiales de inicio dicétidos.

De esta manera, la invención incluye también otras modificaciones diferentes de los huéspedes microbianos descritos anteriormente para permitir o mejorar su producción de policétidos y procedimientos de producción de policétidos usando dichos huéspedes.

La capacidad para modificar huéspedes, tales como E. coli y otros procariotas, tales como Bacillus, para permitir la producción de policétidos en dichos huéspedes tiene numerosas ventajas, muchas de las cuales residen en la naturaleza inherente de E. coli. Una importante ventaja reside en la facilidad con la que E. coli puede ser transformada, comparada con otros microorganismos que producen policétidos de manera nativa. Una importante aplicación de esta facilidad de transformación es en la valoración de resultados de transposiciones genéticas de policétido sintasas. De esta manera, un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para valorar los resultados de transposiciones genéticas de policétido sintasa, cuyo procedimiento comprende transfectar un cultivo de E. coli, modificado según la invención, con una mezcla de policétido sintasas transpuestas y cultivar colonias individuales. Estas colonias, que producen policétidos, contienen genes transpuestos exitosamente.

Además de modificar huéspedes microbianos, especialmente huéspedes procariotas, para producir policétidos, estos huéspedes pueden ser modificados adicionalmente para producir las enzimas que "adaptan" los policétidos y realizan su conversión en antibióticos. Dichas reacciones de adaptación incluyen glicosilación, oxidación, hidroxilación y similares.

Para realizar la producción de los policétidos en un huésped microbiano, es preferente permitir un crecimiento sustancial del cultivo previamente a inducir las enzimas que realizan la síntesis de los policétidos. De esta manera, en huéspedes que no producen policétidos de manera nativa, los sistemas de expresión requeridos para los genes PKS son colocados bajo control de un promotor inducible, tal como el promotor T7, que es inducido mediante IPTG. Hay una plétora de promotores adecuados que son inducibles en una variedad de dichos huéspedes microbianos. Otras características ventajosas del huésped modificado, tales como la capacidad de sintetizar iniciadores o extensores, pueden estar también bajo control inducible. Finalmente, los precursores de los materiales de inicio para las policétido sintasas pueden ser retenidos hasta que se desee realizar la síntesis. De esta manera, por ejemplo, si los materiales de inicio se derivan de propionato, el propionato puede ser suministrado en cualquier punto deseado durante el cultivo de las células. Si se usa un material de inicio dicétido o tricétido, éste puede ser retenido también hasta el momento apropiado. Previamente a la adición del precursor, puede usarse un medio mínimo y pueden emplearse fuentes de carbono alternativas para suministrar energía y materiales para el crecimiento.

\newpage

Tal como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona procedimientos para la síntesis, tanto in vitro como in vivo, de cualquier policétido elegido arbitrariamente, en el que la síntesis in vivo puede ser conducida en cualquier huésped microbiano, especialmente un huésped procariótico. El huésped procariótico es típicamente del género Bacillus, Pseudomonas, Flavobacterium o más típicamente, Escherichia, particularmente, E. coli. Independientemente de si se emplea síntesis in vitro o in vivo, puede ser necesario suministrar una o más policétido sintasas adecuadas (que puede ser nativa o modificada); una o más enzimas para producir unidades iniciadoras y/o extensoras, típicamente incluyendo la conversión del ácido libre en derivado CoA, y, si las enzimas indicadas anteriormente se producen en un huésped, adaptar las enzimas para activarlas. Además, para la síntesis in vivo, puede ser necesario desactivar las enzimas catabólicas que, de otra manera, destruirían los materiales de inicio apropiados.

Con respecto a la producción de materiales de inicio, los genes del operón matABC y los genes que codifican propionil carboxilasa pueden ser empleados para producir sus proteínas codificadas para su uso en síntesis de policétidos libre de células y también para modificar huéspedes recombinantes para la producción de policétidos en cultivo celular. Estos genes y sus productos codificados correspondientes son útiles para proporcionar niveles óptimos de sustratos para policétido sintasa en cualquier huésped en el que dicha síntesis debe ser realizada. El huésped puede ser uno que produce un policétido de manera nativa y su antibiótico correspondiente o puede ser un huésped modificado recombinantemente que, o bien no produce ningún policétido de manera nativa o bien ha sido modificado para producir un policétido que no produce normalmente. De esta manera, los microorganismos huéspedes que pueden usarse para la síntesis de policétidos incluyen varias cepas de Streptomyces, particularmente S. coelicolor y S. lividans, varias cepas de Myxococcus, huéspedes industrialmente favorables, tales como E. coli, Bacillus, Pseudomonas o Flavobacterium, y otros organismos, tales como la levadura. Estos genes y sus proteínas correspondientes son útiles en el ajuste de los niveles de sustrato para la síntesis de policétidos, en general.

Especificidad para sustrato y diseño de policétido

Estos genes y sus productos son particularmente útiles debido a la capacidad de las enzimas para utilizar un intervalo de materiales de inicio. De esta manera, en general, propionil carboxilasa convierte un tioéster de fórmula R_{2}-CH-CO-SCoA, en el que cada R es H o un alquilo opcionalmente sustituido u otro grupo hidrocarbilo opcionalmente sustituido al tioéster de ácido malónico correspondiente de fórmula R_{2}C(COOH)COSCoA. Pueden usarse otros tioésteres, a parte del tioéster de co-enzima A natural, tales como los tioésteres de N-acil cisteamina. De manera similar, el producto del gen matB puede convertir derivados de ácido malónico de fórmula R_{2}C(COOH)_{2} al tioéster de acilo correspondiente, en el que cada R es independientemente H o hidrocarbilo opcionalmente sustituido. Un material de inicio preferente es aquel en el que R es alquilo (1-4 Carbonos), preferentemente RCH(COOH)_{2}. Para sistemas in vivo, puede ser ventajoso incluir el gen matC para asegurar el transporte de membrana del material relacionado con el ácido malónico inicial. El gen matA codifica una proteína que convierte sustratos malonil-CoA de fórmula R_{2}C(COOH)COSCoA al acil-CoA correspondiente de fórmula R_{2}CHCOSCoA, en el que R se ha definido anteriormente, para su uso como una unidad iniciadora.

Típicamente, los grupos hidrocarbilo indicados anteriormente son grupo alquilo de 1-8 carbonos, preferentemente de 1-6 carbonos y más preferentemente de 1-4 carbonos. Los grupos alquilo pueden ser de cadena lineal o de cadena ramificada, pero son preferentemente de cadena lineal. Los grupos hidrocarbilo pueden incluir también insaturación y pueden contener adicionalmente sustituyentes, tales como halo, hidroxil, metoxil o amino o metil o dimetil amino. De esta manera, los grupos hidrocarbilo pueden ser de fórmula CH_{3}CHCHCH_{2}; CH_{2}CHCH_{2}; CH_{3}OCH_{2}CH_{2}CH_{2}, CH_{3}CCCH_{2;} CH_{3}CH_{2}CH_{2}CH_{2}CH_{2}; y similares.

Los grupos alquilo sustituidos son también de 1-8 carbonos en la cadena esqueleto, preferentemente de 1-6 carbonos y más preferentemente de 1-4 carbonos. Los grupos hidrocarbilo alquenilo y alquinilo contienen 2-8 carbonos, preferentemente 2-6 carbonos y más preferentemente 2-4 carbonos y pueden ser también de cadena ramificada o lineal, preferentemente de cadena lineal.

Puede obtenerse una variabilidad adicional suministrando, como material de inicio, un dicétido adecuado. Generalmente, el dicétido es de una fórmula tal como las expuestas en el documento US No de serie 09/311.756, presentado el 14 de Mayo de 1999 e incorporado a la presente memoria por referencia. A continuación, pueden introducirse una variedad de sustituyentes. De esta manera, el dicétido será de fórmula general R'CH_{2}CHOHCR_{2}COSNAc, en la que R se define como anteriormente, y R' pueden ser alquilo, de 1-8 carbonos, arilo, aril alquilo y similares. SNAc representa un tioéster de N-acetil cisteamina, pero podrían usarse también tioésteres alternativos.

Para cualquiera de entre una producción in vivo o in vitro de policétidos, dominios de acil transferesa con especificidades deseadas pueden ser incorporados en la PKS relevante. Los procedimientos para asegurar una especificidad apropiada de los dominios AT se describen en detalle en la solicitud de patente U.S. 09/34.860, presentada el 2 de Julio de 1999, cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria por referencia, para describir de qué manera pueden crearse y emplearse dichos dominios de especificidad deseada. También relevantes para el uso de estas enzimas in vitro o los genes in vivo son procedimientos para mediar la efectividad del módulo policétido sintasa asegurando una transferencia apropiada de la cadena policétida en crecimiento de un módulo al siguiente. Dichos procedimientos se describen en detalle en el documento U.S. No de serie 09/500.747, presentado el 9 de Febrero de 2000, cuyos contenidos se incorporan a la presente memoria por referencia para esta descripción.

\newpage

Las secuencias nucleótidas que codifican una multiplicidad de PKS permiten su uso en procedimientos recombinantes para producir una PKS deseada y para la producción de las proteínas útiles en conversiones post-macrólido, así como sus formas modificadas. Por ejemplo, las secuencias nucleótidas de genes relacionados con la producción de eritromicina se divulgan en U.S. 6.004.787 y U.S. 5.998.194; para avecmectina en U.S. 5.252.474; para FK506 en U.S. 5.622.866; para rifamicina en WO98/7868; para espiramicina en U.S. 5.098,837. Estos son meramente ejemplos. Porciones, o la totalidad, de las secuencias codificadoras deseadas pueden ser sintetizadas usando procedimientos de síntesis de fase sólida estándares, tales como los descritos por Jaye et al., J Biol Chem (1984) 259:6331 y que están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Applied Biosystems, Inc.

Una porción de la PKS que codifica una actividad particular puede ser aislada y manipulada, por ejemplo, usándola para remplazar la región correspondiente en una PKS modular diferente. Además, los módulos individuales de la PKS pueden ser ligados en sistemas de expresión adecuados y pueden ser usados para producir la porción de la proteína codificada por el marco de lectura abierto y entonces la proteína puede ser aislada y purificada, o puede ser empleada in situ para realizar una síntesis de policétido. Dependiendo del huésped para la producción recombinante del módulo o un marco de lectura abierto completo, o una combinación de marcos de lectura abiertos, secuencias de control adecuadas, tales como promotores, secuencias de terminación, mejoradores y similares son ligadas a la secuencia nucleótida que codifica la proteína deseada. Las secuencias de control deseadas para una variedad de huéspedes son bien conocidas en la técnica.

La disponibilidad de estas secuencias nucleótidas expande la posibilidad para la producción de nuevos policétidos y sus correspondientes antibióticos usando células huésped modificadas para contener sistemas de expresión adecuados para las enzimas apropiadas. Manipulando las diversas regiones codificadoras de actividad de una PKS donante remplazándolas en un andamiaje de una PKS diferente o formando híbridos, en vez de o además de dichos reemplazos, u otras alteraciones mutagenizantes, puede obtenerse una gran variedad de policétidos y antibióticos correspondientes. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en el documento U.S. No. de serie 09/073.538, presentado el 6 de Mayo de 1998 e incorporado a la presente memoria por referencia.

Puede obtenerse una policétido sintasa que produce un nuevo policétido, por ejemplo, usando el andamiaje codificado por la totalidad, o la porción empleada, de un gen de sintasa natural. La sintasa contendrá al menos un módulo que es funcional, preferentemente dos o tres módulos, y más preferentemente cuatro o más módulos y contendrá mutaciones, eliminaciones y reemplazos de una o más actividades de estos módulos funcionales, de manera que la naturaleza del policétido resultante es alterada. Esta descripción se aplica tanto al nivel de proteína como al nivel genético. Las realizaciones particularmente preferentes incluyen aquellas en las que KS, AT, KR, DH o ER ha sido eliminado o remplazado por una versión de la actividad de una PKS diferente o de otra posición dentro de la misma PKS. También son preferentes los derivados en los que al menos una actividad enzimática de ciclo de no-condensación (KR, DH o ER) ha sido eliminada o en los que cualquiera de estas actividades ha sido mutada para cambiar el policétido final sintetizado.

De esta manera, con el fin de obtener secuencias nucleótidas que codifican una variedad de derivados de PKS natural, y una variedad de policétidos, puede obtenerse un número deseado de construcciones "mezclando y emparejando" actividad enzimática-porciones codificadoras, y pueden introducirse mutaciones en el clúster de genes PKS del huésped nativo o sus porciones.

Pueden realizarse mutaciones a las secuencias nativas usando técnicas convencionales. Los sustratos para mutación pueden ser un clúster entero de genes o solo uno o dos de ellos; el sustrato para mutación puede ser también porciones de uno o más de estos genes. Las técnicas para mutación incluyen preparar oligonucleótidos sintéticos que incluyen las mutaciones e insertar la secuencia mutada en el gen que codifica una subunidad de PKS usando digestión con endonucleasa de restricción (véase, por ejemplo, Kunkel, T.A. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. Bio-Techniques (1987) 5:786.), o mediante una variedad de otros procedimientos conocidos en la técnica.

Una mutagénesis aleatoria de porciones seleccionadas de las secuencias nucleótidas que codifican las actividades enzimáticas puede conseguirse también mediante varias técnicas diferentes conocidas en la técnica, por ejemplo, insertando aleatoriamente un enlazador de oligonucleótidos en un plásmido, mediante irradiación con rayos X o luz ultravioleta, incorporando los nucleótidos incorrectos durante una síntesis de ADN in vitro, mediante mutagénesis mediante PCR con predisposición a errores, preparando mutantes sintéticos o dañando el ADN plásmido in vitro con sustancias químicas.

Además de proporcionar formas mutadas de regiones que codifican actividad enzimática, las regiones que codifican actividades correspondientes de diferentes sintasas PKS o de diferentes posiciones en la misma sintasa PKS, pueden ser recuperadas, por ejemplo, usando técnicas de PCR con cebadores apropiados. La expresión de regiones que codifican actividad "correspondiente" se refiere a aquellas regiones que codifican el mismo tipo general de actividad, por ejemplo, una actividad cetoreductasa en una posición de un clúster de genes "correspondería" a una actividad codificadora de cetoreductasa en otra posición en el clúster de genes o en un clúster de genes diferente; de manera similar, un ciclo reductasa completo podría ser considerado correspondiente, por ejemplo, KR/DH/ER correspondería a solo KR.

Si se debe realizar un reemplazo de una región objetivo particular en una policétido sintasa huésped, este reemplazo puede ser conducido in vitro usando enzimas de restricción adecuadas o puede ser realizado in vivo usando técnicas recombinantes que implican secuencias homólogas que engloban en una trama el gen de reemplazo en un plásmido donante y una región receptora en un plásmido receptor. Dichos sistemas, que implican ventajosamente plásmidos de diferentes sensibilidades a la temperatura, se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT WO 96/40968.

Finalmente, los genes de la policétido sintasa, como las secuencias de ADN en general, además de los procedimientos para la alteración sistemática y la mutagénesis aleatoria detallada anteriormente, pueden ser modificados mediante la técnica de "transposiciones genéticas", tal como se describe en la patente U.S. 5.834.458, concedida a Maxygen, y las patentes U.S. 5.830.721, 4.811.238 y 5.605.793, concedidas a Affymax. En esta técnica, las secuencias de ADN que codifican bPKS son cortadas con enzimas de restricción, son amplificadas y a continuación son re-ligadas. Esto resulta en una mezcla de genes reordenados que puede ser valorada para su capacidad de producir policétidos. La capacidad de producir policétidos en huéspedes transformados fácilmente, tales como E. coli, lo convierte en un enfoque práctico.

Hay cinco grados de libertad para construir una policétido sintasa, en términos del policétido que se producirá. Primero, la longitud de la cadena de policétido estará determinada por el número de módulos en la PKS. Segundo, la naturaleza del esqueleto de carbono de la PKS estará determinada por las especificidades de las acil transferasas que determinan la naturaleza de las unidades extensoras en cada posición, por ejemplo, malonil, metil malonil o etil malonil, etc. Tercero, la especificidad del dominio de carga tendrá también un efecto sobre el esqueleto de carbono resultante del policétido. De esta manera, el dominio de carga puede usar una unidad iniciadora diferente, tal como acetil, propionil, butiril y similares. Cuarto, el estado de oxidación en varias posiciones del policétido se determinará por las porciones de reductasa y deshidratasa de los módulos. Esto determinará la presencia y la posición de cetona, alcohol, enlaces dobles o simples en el policétido. Finalmente, la estereoquímica del policétido resultante es una función de tres aspectos de la sintasa. El primer aspecto está relacionado con la especificidad AT/KS asociada con manolil sustituidos como unidades extensoras, que afecta la estereoquímica solo cuando el ciclo reductivo está ausente o cuando contiene solo una cetoreductasa, ya que la deshidratasa aboliría la quiralidad. Segundo, la especificidad de la cetoreductasa determinará la quiralidad de cualquier \beta-OH. Finalmente, la especificidad de enoil reductasa para malonil sustituidos como unidades extensoras influenciará el resultado cuando haya disponible un KR/DH/ER completo.

Un enfoque útil es modificar la actividad KS en el módulo 1, lo que resulta en la capacidad de incorporar unidades iniciadoras alternativas, así como unidades extensoras del módulo 1. Este enfoque fue ilustrado en la solicitud PCT US/96/11317, incorporada a la presente memoria por referencia, en la que la actividad KS-I fue inactivada mediante mutación. A continuación, la síntesis de policétido es iniciada alimentando análogos sintetizados químicamente de los productos dicétidos del módulo 1. A continuación, pueden usarse los procedimientos de la invención para proporcionar una cantidad mejorada de unidades extensoras.

Las PKSs modulares tiene una especificidad relajada para sus unidades iniciadoras (Kao et al. Science (1994), supra). Las PKSs modulares exhiben también una variedad considerable en relación a la elección de unidades extensoras en cada ciclo de condensación. Se ha demostrado que el grado de \beta-cetoreducción que sigue a una reacción de condensación puede ser alterado mediante manipulación genética (Donadio et al. Science (1991), supra; Donadio, S. et al. Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 7119-7123). De la misma manera, el tamaño del producto policétido puede ser variado diseñando mutantes con el número de módulos apropiado (Kao, C. M. et al. J Am Chem Soc (1994) 116:11612-11613). Por último, estas enzimas son particularmente bien conocidas para generar un intervalo impresionante de centros asimétricos en sus productos en una manera altamente controlada. Los policétidos y los antibióticos producidos mediante los procedimientos de la presente invención son formas típicamente estereoisoméricas individuales. Aunque los compuestos de la invención pueden presentarse como mezclas de estereoisómeros, es más práctico generar estereoisómeros individuales usando los sistemas PKS.

Los productos policétidos de la PKS pueden ser modificados adicionalmente, típicamente mediante hidroxilación, oxidación y/o glicosilación, para exhibir actividad antibiótica.

Los procedimientos para glicosilar los policétidos son, en general, conocidos en la técnica; la glicosilación puede ser realizada intracelularmente, proporcionando las enzimas de glicosilación apropiadas, o puede ser realizada in vitro, usando medios químicos sintéticos, tal como se describe en el documento U.S. No de serie 09/073.538, incorporado a la presente memoria por referencia.

Los policétidos modulares antibióticos pueden contener cualquier número de azúcares diferentes, aunque la D-desosamina, o un análogo cercano de la misma, es la más común. Por ejemplo, eritromicina, picromicina, narbomicina y metimicina contienen desosamina. La eritromicina contiene también L-cladinosa (3-O-metil micarosa). La tilosina contiene micaminosa (4-hidroxi desosamina), micarosa y 6-desoxi-D-alosa. Se ha usado 2-acetil-1-bromodesosamina como un donante para glicosilar policétidos por Masamune et al. J Am Chem Soc (1975) 97:3512, 3513. Otros donantes, aparentemente más estables, incluyen fluoruros de glicosilo, tioglicósidos y tricloroacetimidatos; Woodward, R.B. et al. J Am Chem Soc (1981) 103:3215; Martin, S.F. et al. Am Chem Soc (1997) 119:3193; Toshima, K. et al. J Am Chem Soc (1995) 117: 3717; Matsumoto, T. et al. Tetrahedron Lett (1988) 29:3575. La glicosilación puede ser realizada también usando los macrólidos como materiales de inicio y usando mutantes de S. erytraea que son incapaces de sintetizar los macrólidos para realizar la conversión.

En general, los enfoques para realizar la glicosilación imitan los descritos anteriormente con respecto a la hidroxilación. Las enzimas purificadas, aisladas de fuentes nativas o producidas recombinantemente, pueden ser usadas in vitro. Como alternativa, la glicosilación puede ser realizada intracelularmente usando glicosilasas intracelulares endógenas o producidas recombinantemente. Además, pueden emplearse procedimientos químicos sintéticos.

Si los huéspedes producen policétidos normalmente, puede ser deseable modificarlos para prevenir la producción de policétidos endógenos por estos huéspedes. Dichos huéspedes se han descrito, por ejemplo, en la patente U.S. No 5.672.491, incorporada a la presente memoria por referencia, que describe S. coelicolor CH999 usada en los ejemplos siguientes. En dichos huéspedes, puede no ser necesario proporcionar actividad enzimática para la modificación post-translacional de las enzimas que conforman la policétido sintasa producida recombinantemente; generalmente, estos huéspedes contienen enzimas adecuadas, denominadas holo-ACP sintasas, para proporcionar un residuo panteteinilo necesario para la funcionalidad de la sintasa. Sin embargo, en huéspedes tales como la levadura, plantas o células de mamífero que normalmente no producen policétidos, puede ser necesario proporcionar, también típicamente mediante medios recombinantes, holo-ACP sintasas adecuadas para convertir la PKS producida recombinantemente en funcionalidad. La provisión de dichas enzimas se describe, por ejemplo, en la solicitud PCT WO98/27203, incorporada a la presente memoria por referencia.

De nuevo, dependiendo del huésped, y de la naturaleza del producto deseado, puede ser necesario proporcionar "enzimas adaptadoras" o genes que las codifican, en las que estas enzimas adaptadoras modifican los macrólidos producidos mediante oxidación, hidroxilación, glicosilación y similares.

Las secuencias nucleótidas codificadoras se enlazan operativamente a promotores, mejoradores, y/o secuencias de terminación que operan para realizar la expresión de la secuencia nucleótida codificadora en células huésped compatibles con estas secuencias; células huésped modificadas para contener estas secuencias, bien como elementos extracromosomales o vectores o integrados en el cromosoma, y procedimientos para producir PKS y enzimas post-PKS, así como policétidos y antibióticos usando estas células huésped modificadas.

Los vectores usados para realizar las diversas operaciones para remplazar la actividad enzimática en los genes PKS huésped o para soportar mutaciones en estas regiones de los genes PKS huésped pueden ser elegidos para contener secuencias de control enlazadas operativamente a las secuencias codificadoras resultantes en una manera en la que la expresión de las secuencias codificadoras pueda ser realizada en un huésped apropiado. Sin embargo, pueden usarse también vectores de clonación simples.

Secuencias de control particularmente útiles son aquellas en las que ellas mismas, o usando sistemas reguladores adecuados, activan la expresión durante la transición de la fase de crecimiento a la fase estacionaria en el micelio vegetativo. El sistema contenido en el plásmido ilustrativo pRM5, es decir, el par actI/actIII promotor y el actII-ORF4, un gen activador, es particularmente preferente. Los huéspedes particularmente preferentes son los que carecen de medios propios para producir policétidos, de manera que se obtiene un resultado más claro. Células huésped ilustrativas de este tipo incluyen el cultivo de S. coelicolor CH999 modificado descrito en la solicitud PCT WO 96/40968 y cepas similares de S. lividans.

Los procedimientos para introducir los vectores recombinantes de la presente invención en huéspedes adecuados son conocidos por las personas con conocimientos en la técnica e incluyen, típicamente, el uso de CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes, lipofección, DMSO, transformación de protoplastos y electroporación.

Tal como se divulga en el documento con No de serie 08/989.332, presentado el 11 de Diciembre de 1997, incorporado a la presente memoria por referencia, puede usarse una amplia variedad de huéspedes, incluso cuando algunos huéspedes no contienen, de manera nativa, los mecanismos post-translacionales apropiados para activar las proteínas portadoras de acilo de las sintasas. Estos huéspedes pueden ser modificados con enzimas recombinantes apropiadas para realizar estas modificaciones.

Variación y mejora del material de inicio

De esta manera, proteínas (y sus secuencias codificadoras) en las que las proteínas catalizan la producción de las unidades iniciadoras y/o extensoras pueden ser usadas para mejorar la producción de policétidos, proporcionando una variedad considerable de estas unidades iniciadoras y extensoras a niveles más altos de los que se producirían ordinariamente. Debido a que las proteínas catalizan las reacciones usando una variedad de sustratos, éstas son herramientas versátiles en la mejora de la disponibilidad de unidades iniciadoras y extensoras para una amplia variedad de PKS, tanto modificadas como no modificadas. Tal como se ha indicado anteriormente, son particularmente útiles los productos del operón matABC (u operones análogos de otras especies) y la carboxilasa propiónica codificada por los genes pccB y accA2 (o sus análogos en otras especies). Estas enzimas y sus secuencias codificadoras son útiles en vista del descubrimiento de los presentes solicitantes de que el operón matABC y los genes codificadores de carboxilasa propiónica proporcionan enzimas que no solo llevan a cabo las reacciones requeridas en una variedad de sustancias, si no que lo hacen también con la producción de los productos con la estereoquímica requerida para su uso en síntesis de policétidos.

La capacidad de los genes descritos en la presente memoria para proporcionar unidades iniciadoras y extensoras apropiadas fue establecida como se describe más adelante.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Ejemplo 1 Producción de malonil CoA y 2S-metilmalonil CoA usando la sintetasa CoA

La cepa L8 de E. coli tiene una mutación sensible a la temperatura en el gen acetil-CoA carboxilasa, de manera que no puede producirse malonil-CoA partiendo de acetil-CoA a 37ºC. Sin embargo, el producto génico es capaz de realizar esta conversión a 30ºC. Véase Harder, M.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1972) 69:3105-3109. Debido a que la conversión acetil-CoA carboxilasa de acetil-Coa en malonil-CoA es la única ruta conocida para la producción de malonil-CoA en E. coli, y debido a que malonil-CoA es esencial para la biosíntesis de ácidos grasos, esta cepa mutante de E. coli puede crecer a 30ºC, pero no a 37ºC. Un transformante de L8 que presenta el operón matABC es producido mediante transformación con el plásmido pMATOP2 que contiene los genes matA, matB y matC bajo control de su promotor nativo y se describe en An, J.H., et al., Eur. J. Biochem. (1998) 257: 395-402. Este transformante todavía es incapaz de crecer a 37ºC en ausencia de ácido malónico; sin embargo la adición de 15 mM ácido malónico al medio le permite crecer a esta temperatura. (En ausencia del plásmido, el ácido malónico es incapaz de soportar el crecimiento a 37ºC). La concentración del ácido malónico extracelular es importante, sin embargo, ya que el incremento de la concentración a 40 mM resulta en una ausencia de crecimiento, posiblemente debida a un desequilibrio metabólico causado por la sobreproducción de malonil CoA en comparación con la cantidad de coenzima A disponible. La letalidad fue también inducida en XL1-Blue (una cepa de tipo salvaje de E. coli) en presencia del plásmido que presenta el operón matABC y altas concentraciones de ácido metilmalónico.

De todas maneras, los resultados expuestos anteriormente demuestran que la proteína codificada por matB produce malonil-CoA in vivo bajo condiciones fisiológicas mientras haya ácido malónico libre disponible; y es transportada al interior de las células por la proteína codificada mediante matC. De esta manera, los genes matBC pueden ser usados para suplementar la disponibilidad de malonil-CoA en una célula de E. coli en la que deben producirse policétidos complejos alimentando ácido malónico.

Además de convertir ácido malónico en malonil-CoA, se ha mostrado también que MatB convierte ácido metilmalónico en metilmalonil-CoA. Sin embargo, no se ha informado acerca de la estereoquímica del producto resultante. Esto es importante, ya que se conoce que las sintasas policétidas modulares solo aceptan un isómero de metilmalonil-CoA, particularmente 2S-metilmalonil-CoA (Marsden, A.F., et al., Science (1994) 263:378-380). Para investigar si MatB puede tener o no el isómero correcto de metilmalonil-CoA, se usó una construcción que codifica una fusión glutatión-S-transferasa (GST-MatB) para producir esta proteína. Véase An, J.H., et al., Biochem. J. (1999) 344: 159-166. La proteína GST-MatB fue purificada según protocolos estándar, según se ha descrito, y fue mezclada con (módulo 6 + TE) de la policétido sintasa de eritromicina, también expresada en E. coli, tal como se describe en Gokhale, R.S., et al., Science (1999) 284:482-485.

En estudios anteriores, los presentes solicitantes han establecido la actividad de (módulo 6 +TE) demostrando su capacidad para catalizar la reacción siguiente in vitro.

Tioéster de N-acetilcisteamina de ácido (2S, 3R)-2-metil-3-hidroxi-pentanóico + 2 (RS)-metilmalonil-CoA + NADPH \rightarrow ácido (2R, 3S, 4S, 5R)-2,4-dimetil-3,5-dihidroxi-n-heptanóico \delta-lactona+NADP^{+}.

El producto tioéster metilmalónico obtenido usando ácido metilmalónico como sustrato para GST-MatB proporciona la estereoquímica correcta para servir como fuente de la unidad extensora en esta reacción. Más específicamente, para generar el sustrato para la síntesis de policétido anterior in situ, la mezcla de reacción siguiente (que contiene 6+TE y GST-MatB) fue preparada en un tampón de reacción de 100 mM de tampón de fosfato de Na (pH 7), 1 mM EDTA, 2,5 mM DTT y 20% de glicerol:

40 mM de ácido metilmalónico (pH 6)

16,6 mM MgCl_{2}

5 mM ATP

5 mM CoASH

13,3 mM NADPH

1 mM tioéster de N-acetilcisteamina de ácido (2S, 3R)-2-metil-3-hidroxipentanóico (preparado en forma radioactiva)

Después de 4 horas, la reacción fue detenida y fue extraída con acetato de etilo (extraída dos veces con tres veces el volumen de reacción). Las muestras fueron secadas en vacío y sometidas a un análisis mediante cromatografía en capa fina.

Se realizó un control positivo bajo condiciones idénticas a las descritas anteriormente, es decir, condiciones en las que (RS)-metilmalonil-CoA fue sustituido por la combinación de ácido metilmalónico, MgCl_{2}, ATP, CoA SH y GST-MatB. Un control negativo incluía todos los componentes expuestos anteriormente excepto la proteína de fusión GST-MatB. Los resultados demostraron que el sistema de dos enzimas descrito anteriormente es capaz de producir el producto esperado en cantidades comparables a la reacción del control positivo. Esto confirma que MatB sintetiza el isómero correcto de metilmalonil-CoA.

\global\parskip1.000000\baselineskip

De esta manera, MatB/MatC es útil para sintetizar tanto malonil-CoA como 2S-metilmalonil-CoA in vivo para la biosíntesis de policétidos. Este es el primer ejemplo de modificación de E. coli con la capacidad de producir 2S-metilmalonil-CoA in vivo bajo condiciones fisiológicas. Además, la co-expresión de matA in vivo debería permitir la conversión de metilmalonil-CoA en propionil-CoA, suplementando, de esta manera, las fuentes disponibles de esta unidad iniciadora.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Capacidad de propionil CoA carboxilasa para generar 2S-metilmalonil CoA

Para utilizar el gen propionil carboxilasa de S. coelicolor descrito anteriormente, se preparó un huésped de expresión de E. coli (BL-21 (DE3)) usando el procedimiento desarrollado por Hamilton, C.M., et al., J. Bacteriol. (1989) 171:4617-4622. La nueva cepa (BAP1) contiene un gen fosfopantetieno-transferasa (el gen sfp) de Bacillus subtilis integrado en el operón prp de E. coli. El promotor T7 dirige la expresión de sfp. En el procedimiento de recombinación, el gen prpE fue colocado también bajo control del promotor T7, pero el resto del operón fue retirado. Esta alteración genética proporcionaría idealmente tres características: 1) la expresión de la proteína sfp necesaria para la modificación post-translacional de la DEBS y potencialmente otras policétido sintasas (PKSs); 2) la expresión de la proteína prpE, una propionil-CoA sintetasa putativa capaz teóricamente de ligar CoASH a propionato; y 3) un entorno celular que ya no es capaz de metabolizar propionil-CoA como una fuente de carbono/energía.

Primero, se verificó que la cepa BAP1, en virtud de su producción del producto del gen sfp era capaz de realizar la fosfopanteteinilación de una PKS producida en estas células. BAP1 fue transfectado con un plásmido que comprendía un sistema de expresión para módulo 6+TE y la actividad del módulo producido fue comparada con la actividad del módulo producido recombinantemente en células BL-21 (DE3) en las que el gen sfp estaba soportado en plásmido. Estos niveles eran comparables. Por el contrario, cuando se expresa solo en BL-21 (DE3), módulo 6 + TE no mostró ninguna actividad. Además, BAP1 fue confirmado para su incapacidad de crecer en propionato como única fuente de carbono (una propiedad exhibida por las cepas de E. coli, tales como BL21 (DE3)). BAP1 es un huésped preferente para la expresión heteróloga de policétido sintasas en conjunción con enzimas tales como MatBC y propionil-CoA carboxilasa.

La enzima propionil-CoA carboxilasa fue expresada en E. coli bajo el promotor T7. La enzima producto fue capaz de suministrar sustrato para módulo 6+TE in vitro. Esto se demostró usando el acoplamiento del producto tioéster de metilmalonil-CoA de la enzima propionil CoA carboxilasa al tioéster de N-acetil cisteamina de ácido (2S,2R)2-metil-3-hidroxipentanóico. Los genes pccB y accA2, descritos anteriormente, que codifican los componentes de la propionil-CoA carboxilasa, fueron expresados y los productos fueron purificados individualmente según procedimientos estándar. Inicialmente, se permitió que las subunidades pccB y accA2 formaran complejos en hielo en 150 mM fosfato (pH 7) y 300 \mug de BSA. Después de 1 hora, se añadieron los siguientes sustratos a un volumen de 100 \mul y se incubaron durante 30 minutos adicionales a 30ºC:

1 mM propionil-CoA

50 mM de bicarbonato de sodio

3 mM ATP

5 mM de MgCl_{2}

A continuación, se añadió módulo 6+TE con el conjunto final de reactivos siguiente para proporcionar 200 \mul en total y se permitió reaccionar durante una hora adicional a 30ºC:

10% glicerol

1,25 mM DTT

0,5 mM EDTA

4 mM NADPH

2 mM tioéster de N-acetilcisteamina de ácido (2S,3R)-2-metil-3-hidroxipentanóico (preparado en forma radioactiva).

La reacción fue detenida y fue extraída tal como se ha descrito anteriormente, y mostró formación de producto esperado. Un control positivo incluía malonil-CoA racémico. Cuando se retiro cualquiera de entre ATP y bicarbonato de sodio de la reacción, no se formó producto. De esta manera, la propionil-CA carboxilasa produce un sustrato adecuado para la actividad policétido sintasa. Esto es particularmente útil para la producción de policétidos, especialmente en conjunción con el nuevo huésped de expresión indicado anteriormente, BAP1.

La proteína DEBS DEBS1-TE es producida mediante pRSG32. DEBS1 muestra la expresión más débil de las tres proteínas DEBS y, hasta fechas recientes, la enzima no había mostrado actividad in vitro. Sin embargo, cultivando E. coli que contiene pRSG32 en medio mínimo M9, e induciendo la expresión de proteína a 22ºC, se observa ahora, de manera reproducible, actividad DEBS1-TE.

Los plásmidos pRSG32 (DEBS1+TE) y p132 (un plásmido que contiene los componentes \alpha y \beta de propionil-CoA carboxilasa) fueron cotransfectados en BAP1. Los cultivos de 10 ml de medio mínimo M9 fueron cultivados a niveles de fase semilogarítmica y fueron concentrados a 1 ml para inducción con IPTG y la adición de 0,267 mM ^{14}C-propionato. A continuación, las muestras fueron incubadas a 22ºC durante 12-15 horas. A continuación, el sobrenadante del cultivo fue extraído con acetato de etilo para TLC analítica. Un ensayo de producto con el control positivo esperado y este mismo producto era indetectable cuando se usó o bien el tipo salvaje BL-21 (DE3) o retirando p132. De esta manera, la carboxilasa forma el estereoisómero correcto.

Además, cultivos de 100 ml de medio mínimo M9 que contenían BAP1 transformado con pRSG32, p132 y pCY214 (una biotina ligasa incluida para ayudar la fijación de biotina a la subunidad \alpha de la propionil-CoA carboxilasa) fueron cultivados a fase semilogarítmica para inducción con IPTG y la adición de 100 mg/L de ^{13}C-propionato. Tras la extracción del sobrenadante del cultivo y concentración de la muestra, ^{13}C-NMR confirmó la posición de los picos esperados de producto enriquecido. Un control negativo subsiguiente usando BL-21 (DE3) no proporcionó el mismo espectro. Además de demostrar la capacidad de E. coli para realizar policétidos complejos in vivo, estos resultados sugieren también que la proteína prpE programada para la expresión en BAP1 está activa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Producción mejorada de 6-dEB en S. coelicolor

La presencia de los genes matB y matC fue capaz también de mejorar la producción recombinante de 6-dEB en S. coelicolor que había sido modificada recombinantemente para producir este policétido mediante inserción del complejo génico DEBS en el vector pCK7. Los genes matB y matC fueron expresados en una cepa recombinante de Streptomyces coelicolor que produce 50 mg/L de 5-desoxieritronolida B en virtud de los genes DEBS soportados en plásmido. Los genes matB y matC fueron insertados inmediatamente aguas abajo de los genes DEBS en pCK7. Más detalladamente, la fuente de los genes matBC es pFL482, un derivado de PCR-Blunt (Invitrogen) que contiene un fragmento Bg/II/HindIII de 5 kb de pMATOP2 que porta los genes matBC. El fragmento Nsil de pFL482 que contiene los genes matBC fue clonado en el sitio único Nsil de pCK7 en la misma dirección que los genes DEBS para proporcionar pFL494. Tras la transformación del plásmido pFL494 en S. coelicolor CH999, se obtuvieron incrementos de titulación de macrólidos de 100-300% en presencia de metilmalonato exógeno (0,1-1 g/L).

Más detalladamente, los cultivos de S. coelicolor CH999, con o sin plásmido pCK7 o pFL494, fueron cultivados en matraces usando medio R6 (sucrosa, 103 g/L; K_{2}SO_{4}, 0,25 g/L; MgCl_{2} \cdot 6H_{2}O, 10,12 g/L; propionato de sodio, 0,96 g/L; ácidos casamino (Difco), 0,1 g/L; solución de elementos traza, 2 mL/L; extracto de levadura (Fisher), 5 g/L; pH7) suplementado con tampón bis-tris propano (28,2 g/L). La solución de elementos traza contenía ZnCl_{2}, 40 mg/L; FeCls \cdot 6H_{2}O, 200 mg/L; CuCl_{2} \cdot 2H_{2}O, 10 mg/L; MnCl_{2} \cdot 4H_{2}O, 10 mg/L; Na_{2}B_{4}O_{7} \cdot 10H_{2}O, 10 mg/L; (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24} \cdot 4H_{2}O. Todos los medios fueron suplementados con 50 mg/L de tiostrepton (Calbiochem) para seleccionar para células que contienen plásmido, y con 5 mL/L de Antiespumante B (JT Baker) para controlar la espuma. El tiostrepton fue disuelto en DMSO previamente a la adición a los cultivos, proporcionando una concentración de DMSO final de aproximadamente 1 mL/L de medio.

Los cultivos semilla para la fermentación fueron preparados inoculando 50 mL de medio, seguido por el cultivo durante dos días a 240 rpm y 30ºC en matraces con placas deflectoras (Bellco) de 250 mL. A continuación, estos cultivos fueron usados para inocular 50 mL de medio en presencia o en ausencia de 1 g/L de metilmalonato en matraces con placas deflectoras de 240 mL a 5% de volumen final. Todos los cultivos en matraces se realizaron por duplicado y se tomaron muestras diariamente. El experimento completo fue repetido una vez para asegurar la reproducibilidad lote a lote de los resultados.

La cuantificación de 6-dEB y 8,8a-desoxioleandolida fue llevada a cabo usando un Hewlett-Packard 1090 HPLC equipado con un detector evaporativo de luz dispersa Alltec 500. Las muestras de HPLC fueron primero centrifugadas durante 5 minutos a 12.000xg para retirar las partes insolubles. El sobrenadante (20 \muL) fue aplicado en una columna de 4,6 x 10 mm (Inertsil, C19 ODS3, 5 \mum), fue lavado con agua (1 ml/min durante 2 min) y finalmente fue eluído en la columna principal (4,6 x 50 mm, la misma fase estacionaria e índice de fluencia) con un gradiente de 6 min empezando con 100% de agua y terminando con 100% de acetonitrilo. A continuación, se mantuvo el 100% de acetonitrilo durante un minuto. Bajo estas condiciones, 6-dEB se eluyó en 6,2 minutos y 8.8a-desoxioleandolida en 5,8 minutos. Se prepararon estándares partiendo de 6-dEB purificado del caldo de fermentación. Se estimó que el error de la cuantificación era de \pm10%.

\newpage

Tal como se ha descrito anteriormente, S. coelicolor CH999, que contenía cualquiera de entre pCK7 o pFL494, fueron comparadas para su productividad de 6-dEB y 8,8a-desoxioleandolida.

Los resultados muestran lo siguiente:

1.

La densidad celular era sustancialmente la misma para ambas cepas.

2.

La producción tanto de 6-dEB como de 8,8a-desoxioleandolida es mejorada dramáticamente en CH999/ pFL494 comparada con CH999/pCK7, independientemente de si se mide en términos de mg/litros/hora o en mg/litro como una titulación final después de seis días. (8,8a-desoxioleandolida es la misma que 6-dEB excepto que contiene metil en vez de etil como posición 12, ya que se usa acetil CoA en vez de propionil CoA como unidad iniciadora). Más específicamente, después de seis días, CH999/pFL494 más ácido metilmalónico produjo 180 mg/l de 6-dEB y aproximadamente 90 mg/l de 8,8a-desoxioleandolida. Si no se añadía ácido metilmalónico al medio, se producía 6-dEB a un nivel de 130 mg/l mientras que se producía 8,8a-desoxioleandolida a aproximadamente 40 mg/l. Para CH999 modificado para contener pCK7, en presencia de ácido metilmalónico en el medio, sólo se formaron 60 mg/l de 6-dEB junto con aproximadamente 20 mg/l de 8,8a-desoxioleandolida. Sin ácido metilmalónico, estas células produjeron ligeramente menos de cada uno de estos macrólidos.

3.

CH999/pFL494 consumió completamente el metilmalonato suministrado a 1 g/L para el día 6.

4.

El consumo de 1 g/L de metilmalonato resulta en un incremento acumulativo en macrólido de 200 m/L, representando una eficiencia de conversión del 35% de metilmalonato en productos.

5.

CH999/pFL494 muestra una producción mejorada de ambos macrólidos incluso en ausencia de metilmalonato exógeno (véase 2, anteriormente).

6.

Incluso CH999/pCK7 mostró una mejora del 20% en la producción de 6-dEB cuando se añadió metilmalonato exógeno (véase 2, anteriormente).

Además de mejorar la productividad de los policétidos conocidos en huéspedes naturales y heterólogos, MatB se usa también para producir policétidos nuevos. En contraste con otras enzimas que producen los bloques de construcción de tioéster CoA alfa-carboxilado para la biosíntesis de policétidos, tales como metilmalonil-CoA mutasa (que tiene un alto grado de especificidad para succinil-CoA) y acetil/propionil-CoA carboxilasa (que prefiere acetil-CoA y/o propionil-CoA), MatB es activo con respecto a un amplio intervalo de sustratos. Además de malonato y metilmalonato, MatB es capaz de activar sustratos tales como etilmalonato, dimetilmalonato, isopropilmalonato, propilmalonato, alilmalonato, ciclopropilmalonato y ciclobutilmalonato en sus tioésteres CoA correspondientes.

La incorporación de estos sustratos en policétido sintasas requiere una aciltransferasa (AT) adecuada que pueda ser modificada en el módulo apropiado de una policétido sintasa, de manera que pueda aceptar el sustrato no natural. A pesar de que ninguno de estos ácidos dicarboxílicos proporciona cantidades detectables de nuevos compuestos cuando se alimentan a CH999/pFL494, ciertas enzimas PKS poseen naturalmente dominios AT con especificidad de sustrato ortogonal. Por ejemplo, la PKS FK506 contiene un dominio aciltransferasa que incorpora normalmente sustratos voluminosos, tales como propilmalonil-CoA en preferencia a sustratos tales como malonil-CoA o metilmalonil-CoA, y de esta manera, puede aceptar bloques de construcción no naturales generados mediante MatB sin ninguna modificación de PKS.

Usando una estrategia de modificación de proteínas descrita por Lau, J., et al., Biochemistry (1999) 38:1643-1651, el dominio AT del módulo 6 de DEBS en pFL494 fue modificado para incluir el segmento que determina la especificidad del dominio AT4 de nidamicina que incorpora etilmalonil-CoA. Véase: Kakavas, S.J., et al., J. Bacteriol (1997) 179:7515-7522. El plásmido pFL508 resultante fue transformado en CH999. Tras alimentar esta cepa con etilmalonato, una espectroscopia de masas fue capaz de detectar un producto correspondiente a 2-etil-6dEB en niveles comparables al de 6dEB. El nuevo compuesto era indetectable en ausencia de etilmalonato o en una cepa de control que carece de los genes matBC.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Producción de 6-dEB en E. coli

Los presentes inventores han demostrado la capacidad de E. coli de producir policétidos complejos completos, cuando es programada con la capacidad de expresar una PKS funcional, una panteteiniltransferasa y una o más rutas para producir unidades iniciadoras y extensoras. La cepa BL-21 de E. coli (DE) obtenida de Novagen fue modificada genéticamente insertando el gen fosfopanteteinil transferasa (el gen sfp) de Bacillus subtilis en el cromosoma bajo el control del promotor T7 de fago eliminando la porción prpA-D del operón prp, colocando también, de esta manera, el sitio prpE, que codifica una propionil-CoA sintetasa, bajo control del promotor T7. A continuación, esta cepa modificada genéticamente fue modificada para incluir sistemas de expresión para los tres genes que codifican las proteínas DEBS1, DEBS2 y DEBS3, también bajo control del promotor T7, así como los genes que codifican propionil CoA carboxilasa y un gen que codifica biotina ligasa, que es necesaria para la activación de la enzima propionil CoA carboxilasa. La E. coli resultante contiene una sintasa completa para 6-dEB, una fosfopanteteinil transferasa necesaria para la activación de esta PKS, las enzimas propionil CoA carboxilasa que suministran metilmalonil CoA de propionil CoA, y un medio inducible para producir la propionil CoA sintasa endógena capaz de convertir propionato exógeno en propionil CoA. Además, se desactivó el sistema endógeno para el catabolismo de propionato.

De esta manera, la E. coli es provista con enzimas para la síntesis de unidades tanto iniciadoras como extensoras bajo control de un promotor inducible, el mecanismo endógeno para la destrucción del precursor propionato de las unidades iniciadoras y extensoras ha sido desactivado; y los sistemas de expresión (también bajo promotores inducibles) ha sido proporcionado para las proteínas PKS necesarias junto con un sistema de expresión para la enzima para la activación de las proteínas PKS.

Más detalladamente, la cepa BL-21 (DE3) modificada genéticamente fue preparada según el procedimiento descrito en Hamilton, et al., J. Bacteriol (1989) 171: 4617-4622. Se preparó un derivado de pMAK705 descrito en esta publicación. En el vector derivado, un promotor T7 acoplado al gen sfp fue flanqueado por una secuencia de 1.000 pares de bases idéntica a la secuencia aguas arriba del sitio A del operón prp y una secuencia de 1.000 pares de bases idéntica a la secuencia aguas abajo del sitio E de este operón. El gen sfp fue obtenido de pUC8-sfp, un plásmido descrito por Nakano, et al., Mol. Gen. Genet. (1992) 232:313-321. La secuencia integrada resultante elimina los sitios A-D de prp e inserta el promotor T7 que controla el gen sfp en su lugar y resulta además en la colocación del sitio prpE bajo el control del promotor T7. El promotor T7 es inducible mediante IPTG.

A continuación, el huésped alterado genéticamente resultante, denominado BAP 1, fue transfectado con tres plásmidos, cada uno de ellos seleccionable para una resistencia a antibiótico diferente. Estos plásmidos son como se indica a continuación.

pBP130 es derivado de pET21 (Carb®) obtenido de Novagen y modificado para contener los genes DEBS2 y DEBS3 bajo control del promotor T7.

pBP144 es una forma modificada de pET28 (Kan®) disponible también en Novagen que contiene los genes pcc y DEBS1, también bajo control del promotor T7.

pCY214 (cm®) contiene el gen bira (biotina ligasa) de E. coli bajo el promotor ara y se describe en Chapman-Smith, et al., Biochem. J. (1994) 302:881-887. Este plásmido fue obtenido como un presente del Dr. Hugo Gramajo. La proteína PCC y el gen pcc se describen en Rodríguez, et al., Microbiol. (1999) 145:3109-3119.

Para la producción de 6-dEB, células BAP1 transformadas con pBP130, pBP144 y pCY214 fueron cultivadas en medio mínimo M9 con los antibióticos apropiados. El cultivo fue cultivado a fase semilogarítmica, seguido por inducción con IPTG y arabinosa y la adición concomitante de 250 mg/L de ^{13}C-1-propionato. Los cultivos inducidos fueron cultivados durante 12-24 horas a 22ºC. (Se descubrió que tanto el medio mínimo como las temperaturas más bajas eran beneficiosos para la expresión del gen DEBS. Este protocolo permitió la producción relacionada con el crecimiento de 6-dEB, ya que la glucosa proporcionó la fuente de energía y carbono para el metabolismo general, mientras que el propionato fue convertido en 6-dEB).

Después de 12-24 h, el sobrenadante del cultivo fue extraído con acetato de etilo. La fase orgánica fue secada en vacío, y fue re-disuelta en CDCl_{3} para análisis ^{13}C-NMR. El espectro acompañante mostró que 6-dEB era el producto etiquetado con ^{13}C principal. Otros compuestos etiquetados con ^{13}C principales con picos en el intervalo de 120-140 ppm no se derivan de la incorporación de propionato, tal como se confirma mediante un experimento separado en el que se usó ^{13}C-3-propionato en vez de ^{13}C-1-propionato. A partir de las intensidades de los picos correspondientes a 6-dEB, se estimó que al menos el 75% del propionato exógeno fue convertido en 6-dEB. Esto era consistente con la desaparición de la señal de propionato del espectro ^{13}C NMR del medio de cultivo al final de la fermentación. Las cepas de control negativo, que carecían de pBP130 o pBP144, no produjeron cantidades detectables de 6-dEB.

Los experimentos anteriores se realizaron a densidades celulares bajas (OD_{600} en el intervalo de 0,5-2,5); una ventaja principal de sintetizar productos recombinantes en E. coli es que esta bacteria puede cultivarse a densidades celulares extremadamente altas (OD_{600} de 100-200) sin pérdida considerable en su actividad catalítica específica.

El uso de los genes matB y matC o cualquier otro homólogo de otros organismos en un sistema de expresión no nativo es útil como una estrategia general para la producción in vivo de cualquier tioéster de CoA alfa-carboxilado en cualquier huésped microbiano. La producción in vivo de dichos tioésteres de CoA podría estar destinada a mejorar la productividad de policétidos naturales o a producir policétidos nuevos. El gen matA es también útil para suplementar niveles in vivo de sustratos, tales como acetil-CoA y propionil-CoA. El MatB purificado es usado también para la producción preparativa in vivo de policétidos, ya que los tioésteres de CoA son los componentes más caros en dichos sistemas de síntesis libres de células.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Incorporación de dicétidos

El organismo huésped de E. coli BAP1 descrito en el Ejemplo 4 fue transfectado con p132, que contiene un sistema de expresión para las subunidades PCCA y B, y con pRSG36, que contiene un sistema de expresión para módulo 6+TE de DEBS3. Los cultivos transfectados fueron cultivados en medios de selección mínimos para ambos plásmidos y a continuación fueron alimentados con dicétido etiquetado con ^{14}C. Cuando fueron inducidos y fueron provistos con propionato, se obtuvo tricétido etiquetado con ^{14}C.

Claims (12)

1. Célula huésped de E. coli recombinante que esta modificada genéticamente para la síntesis de 2S-metilmalonil CoA y un policétido, en la que dicha modificación comprende la incorporación de un sistema de expresión de propionil CoA carboxilasa (pcc); y la incorporación de al menos un sistema de expresión para la policétido sintasa modular (PKS).

2. Célula huésped según la reivindicación 1, en la que el sistema de expresión de pcc comprende los genes pccB y accA2 de S. coelicolor.

3. Célula huésped según la reivindicación 1 ó 2, en la que la modificación comprende además la incorporación de al menos un sistema de expresión para fosfopanteteinil transferasa.

4. Célula huésped según la reivindicación 3, en la que el sistema de expresión de fosfopanteinil transferasa comprende el gen sfp de Bacillus subtilis.

5. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la célula huésped comprende además un sistema de expresión para biotina ligasa.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, en la que el sistema de expresión para biotina ligasa es el gen birA de E. coli.

7. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el operón prpA-D de la célula esta eliminado.

8. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que la PKS es desoxieritronolida B sintasa (DEBS).

9. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el policétido es 6-desoxieritronolida B (6-dEB).

10. Procedimiento de producción de policétidos, cuyo procedimiento comprende el cultivo de células según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 bajo condiciones en las que dicho policétido es producido.

11. Procedimiento para valorar los resultados de un procedimiento que realiza una modificación de los genes policétido sintasa, resultando en una mezcla de dichos genes modificados, cuyo procedimiento comprende transfectar un cultivo de E. coli según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con dicha mezcla de genes modificados, cultivar colonias individuales de dicha E. coli transformada y valorar cada colonia para la producción de policétido.

12. Procedimiento para valorar la producción de policétido en una célula huésped que contiene un gen policétido sintasa (PKS) transpuesto, comprendiendo dicho procedimiento:

a)

transponer genes PKS para producir una mezcla de genes PKS reordenados,

b)

transformar un cultivo de E. coli según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 con dicha mezcla,

c)

cultivar colonias individuales de dicha E. coli transformada, y

d)

valorar cada colonia para la producción de policétido,

en el que las colonias, que producen policétidos, contienen genes transpuestos exitosamente.