JP4156666B2 - ポリペプチド変異体を調整するための方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体内組換えによりポリペプチド変異体を調製するための方法に関する。
発明の背景
組換えDNA技術を用いて真菌生物及びバクテリアのような微生物からの天然のDNA配列をクローニングすることにより生物学的に活性なポリペプチドを生産する利点はここ数年周知である。
新規のポリペプチド変異体及び突然変異体、例えば特徴、例えば特異活性、基質特異性、pH至適性、pI,Km,Vmax等の変化した新規の改良型酵素の調製は、改良された特性を有するポリペプチドを得るために、特に近年、熱心かつ成功して用いられている。
例えば、酵素の技術分野内では、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼの洗浄及び/又は皿洗い能力が大きく改良された。
ほとんどの場合、これらの改良は、それらのタイプ、又は成熟酵素の二次もしくは三次構造におけるそれらの位置のいずれかに基づいて選択された特定のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入において生ずる部位特異的変異誘発によって得られた(例えばUS特許第4,518,584号)。
タンパク質及び酵素を改良するための他の一般的な試みは、例えばUS 4,894,331及びWO93/01285に開示されるランダム変異誘発に基づく。
改良された機能的特性を有するポリペプチド変異体又は空燃変異体を得ることは厄介で時間を浪費する過程であるので、改良されたポリペプチドの迅速な調製のためのいくつかの他の方法が示唆されている。
Weberら(1983)(Nucleic Acids Research,Vol 11,5661〜5661)は、相同な遺伝子間への生体内組換えにより遺伝子を改良するための方法を記載する。5’末端においてα−1ヒトインターフェロンをコードするDNA配列に、そして3’末端においてα−2ヒトインターフェロンをコードするDNA配列に隣接するプラスミドベクターを含む直鎖DNA配列が作製され、大腸菌のrecA陽性株に移される。耐性マーカーを用いて組換え体が同定され、単離される。
Pomponら(1989)(Gene 83,p.15〜24)は、充填された(filled−in)端を有する直鎖プラスミド及び該プラスミドの端に部分的に相同であるDNAフラグメントでサッカロマイセス・セルビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)を形質転換することによるサッカロマイセス・セレビシアエにおける部分的に相同な配列の生体内組換えによる哺乳動物シトクロムP−450の遺伝子ドメインをシャッフリングするための方法を記載する。
Stemmer(1994)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.91,10747〜10751)及びStremmer(1994)(Nature,vol.370,389〜391)は、試験管内PCR法により相同なDNA配列をシャッフリングするための方法に関する。シャッフリングの1サイクルは、DNaseIで相同な遺伝子のプールを消化することからなる。結果として生ずる小さなフラグメントは全長の遺伝子に再アセンブルされる。シャッフリングされたDNA配列を含む陽性組換え遺伝子が、それらの改良された機能に基づいてDNAライブラリーから選択される。他のシャッフリング回のための出発材料として陽性組換え体が用いられ得る。
US特許第5,093,257号(譲渡人:Genencor Int.Inc.)は、生体内組換えによりハイブリッドポリペプチドを生産するための方法を開示する。ハイブリッドDNA配列は、複製配列を含む環状ベクター、そのハイブリッドポリペプチドのアミノ末端部分をコードする第1のDNA配列、そのハイブリッドポリペプチドのカルボキシ末端部分をコードする第2のDNA配列を形成することによって作られる。その環状ベクターは、その環状ベクターが増幅されるrec陽性微生物内に導入される。これは、原核生物、例えばバチルス(Bacillus)及び大腸菌、並びに真核生物、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)を含むrec陽性微生物の天然の組換えメカニズムによって媒介される前記環状ベクターの組換えを生ずる。
先の方法があるにかかわらず、新規の陽性ポリペプチド変異体を調製するための更により優れた繰り返しの生体内組換え法についての必要性がある。
発明の概要
本発明の目的は、生体内組換え法によって陽性のポリペプチド変異体を調製するための改良された方法を提供することである。
本発明の発明者は、驚くことに、このような陽性ポリペプチド変異体が、
a)ポリペプチドをコードするDNA配列を含む少くとも1の環状プラスミドを形成し、
b)前記ポリペプチドをコードするDNA配列内で前記環状プラスミドを開環し、
c)該環状プラスミドの少くとも1つ上のそのポリペプチドコード化領域の少くとも1部分に相同なDNA配列を含む少くとも1のDNAフラグメントを調製し、d)前記ポリペプチドをコードする全長のDNA配列又はその一部分を覆う前記相同なDNAフラグメントの少くとも1つと一緒に、前記開環したプラスミドの少くとも1つを、組換え宿主細胞に導入し、
e)前記組換え宿主細胞を培養し、そして
f)陽性ポリペプチド変異体についてスクリーニングするステップを含む生体内組換えにより相同なDNA配列の異なるヌクレオチド配列をシャッフリングすることにより、有利に調製され得ることを見い出した。
図面の簡単な記載
図1は、ヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼ遺伝子をコードするDNA配列を含むイースト発現プラスミドpJSO26を示す。
図2は、12の更なる制限部位を含むヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子をコードするDNA配列を含むイースト発現プラスミドpJSO37を示す。
図3は、プラスミドpJSO26を示す。
図4は、プラスミドpJSO37を示す。
図5は、(実施例1に記載される)組換え宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビシアエを用いる、pJSO37での0.9kb合成野生型ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼの生体内組換えを示す。
図6は、(実施例2に記載される)組換え宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビシアエを用いる、プラスミド内に含まれるヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体(d)でのヒュミコラ・ラヌギノサ変異体(y)が、調製されたDNAフラグメントの生体内組換えを示す。
図7は、ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子の不活性化部位の位置及びクローンの数(表で“ブルー数”と言及される)の全体像を示す。制限酵素部位の位置及びクローン数はリパーゼ遺伝子の開始コドンに対する。全ての場合、停止コドンはフレームシフトから新しい読み枠10〜50bpに位置した。
図8は、“モザイクメカニズム”による表2A及びBの組換えからの活性ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子の作製の全体像を示す。線はベクター内へのフラグメント配列の導入を示し、xの線は活性なリパーゼコロニー内に導入されない配列を示す。PCRフラグメントに用いられるプライマーを、(その作製のために用いた制限部位によってマークした)フレームシフト変異の位置と一緒に示す。
図9は、ギャップベクターへの2つの部分的オーバーラッピングフラグメントの組換えに用いたフラグメントの全体像を示す。PCRフラグメントに用いたプライマーをフレームシフト変異体(野生型でない)の位置と一緒に示す。
図10は、ギャップベクターへの3の部分的オーバーラッピングフラグメントの組換えに用いたフラグメントの全体像を示す。PCRフラグメントに用いたプライマーが示される。PCR353と355との間のオーバーラップは10bpのみである。
発明の詳細な記載
本発明の目的は、繰り返しの生体内組換え法により陽性ポリペプチド変異体を調製するための改良された方法を提供することである。
本発明の発明者は、驚くことに、組換え宿主細胞として真核細胞を用いる生体内組換えシステムにおいて相同的DNA配列をシャッフリングするための有効な方法を見い出した。
“組換え宿主細胞”とは、本発明の文脈においていくつかの相同なDNA配列のシャッフリングを媒介することができる細胞である。
用語“シャッフリング”とは、入力DNA配列(即ち出発点の相同なDNA配列)と比較して、いくつかの交換されたヌクレオチドを有する出力DNA配列(即ちシャッフリングサイクルにかけたDNA配列)を生ずる2又はそれ超の相同なDNA配列間のヌクレオチド配列の組換えを意味する。
本発明の重要な利点は、Pompon’s法において発見されない開環部位に関連しない多重置換点又は置換を有するモザイクDNA配列が形成されることである。
本発明の他の重要な利点は、(スクリーニングセットアップにおいて)フラグメント及び開環したベクターの混合物を用いる場合、それは、多くの異なるクローンが(以下の一対の実施例において見られ得るように)2つ組様に又は3つ組様に組換わる可能性を供する。
本発明の生体内組換え法は簡単に行うことができ、高レベルの相同な遺伝子又は変異体の混合を生ずる。多数の変異体又は相同な遺伝子を1の形質転換で混合することができる。スクリーニングの前の改良された変異体又は野生型遺伝子の混合は、ランダム変異誘発のみを行うのに比べて数倍も、更なる改良された変異体の数を増加させる。
多重オーバーラッピングフラグメントの組換えは、生体内組換え法を用いて変異体又は相同な遺伝子の混合を増加させる高い効能で可能である。10bpの少いオーバーラップは、更に離して関連した遺伝子の極めて容易なドメインシャッフリングのために利用され得る組換えのために十分である。
本発明は、
a)ポリペプチドをコードするDNA配列を含む少くとも1の環状プラスミドを形成し、
b)前記ポリペプチドをコードするDNA配列内で前記環状でプラスミドを開環し、
c)前記環状プラスミドの少くとも1つ上の前記ポリペプチドコード化領域の少くとも一部分に相同なDNA配列を含む少くとも1のDNAフラグメントを調製し、d)前記ポリペプチドをコードする全長のDNA配列又はその一部分をカバーする前記相同なDNAフラグメントの少くとも1つと一緒に、前記開環したプラスミドの少くとも1つを導入し、
e)前記組換え宿主細胞を培養し、そして
f)陽性ポリペプチド変異体についてスクリーニングするステップを含む生体内組換えにより相同なDNA配列の異なるヌクレオチド配列をシャッフリングすることにより、ポリペプチド変異体を調製するための方法に関する。
本発明によれば、1超のステップa)〜f)のサイクルを行うことができる。
ステップb)におけるプラスミドの開環は、そのプラスミドのポリペプチドコード化領域内のいずれの部位に対しても行うことができる。そのプラスミドは、当該技術で周知であるいずれかの適切な方法によって開環することができる。そのプラスミドの開環した端は、Pomponら(1989、前掲)に記載されるようにヌクレオチドで充填され得る。フレームシフトを形成し得るように開環した端は充填されないのが好ましい。
そのポリペプチドコード化DNA配列の中央周辺のプラスミドを開環することが好ましい。それは、このことがDNAフラグメントと開環したプラスミドとの間により有効な組換えを生ずると信じられるからである。
本発明の一実施形態において、そのDNAフラグメントは、低い、中位の又は高いランダム変異誘発頻度を生ずる条件下で調製される。
低い変異誘発頻度を得るためには、(DNAフラグメントを含む)DNA配列に普通のPCR増幅法によって調製され得る(US 4,683,202又はSaikiら(1988)、Science 239,487〜491)。
中位又は高い変異誘発頻度は、例えばDeshler(1992)(GATA 9(4),103〜106),Leungら(1989)(Technique,Vol.1,No.1,11〜15)により記載されるように、ヌクレオチドの誤った組込みを増加させる条件下でPCR増幅を行うことによって得ることができる。
適切な物理的又は化学的変異誘発剤、例えばトランジション、トランスバージョン、反転、スクランブリング、欠失、及び/又は挿入を誘導するものを用いる変異誘発ステップと、PCR増幅を(即ちこの実施形態によれば、DNAフラグメント突然変異も)組合わせることも本発明により考慮される。
本発明の文脈において、用語“陽性ポリペプチド変異体”は、対応するインプットDNA配列から生産され得るポリペプチドと比較して改良されている機能特性を有する結果として生ずる変異体を意味する。例えばこのような改良された特性のものは、例えば生物活性、酵素洗浄能力、抗生物質耐性等で異なり得る。
結果として、陽性変異体を同定するために用いられるスクリーニング法は、問題のポリペプチド変異体の要求される改良された特性による。
例えば問題のポリペプチドが酵素であり、要求される改良された機能特性が洗浄能力であるなら、ステップf)のスクリーニングは、便利にして、以下の原理に基づくフィルターアッセイの使用により行うことができる。
組換え宿主細胞は、酵素が分泌される適切な条件下で適切な培地上でインキュベートされ、ここでその培地には、第1のタンパク質結合フィルター及びその頂部の低タンパク質結合能を示す第2のフィルターを含む二重フィルターが供される。組換え宿主細胞はその第2のフィルター上に位置する。インキュベーションの後、組換え宿主細胞から分泌された酵素を含む第1のフィルターは、前記細胞を含む第2のフィルターが分泌される。第1のフィルターは、要求される酵素活性についてスクリーニングにかけられ、第2のフィルター上に存在する対応する微生物のコロニーが同定される。
酵素活性に結合するのに用いられるフィルターは、いずれかのタンパク質結合フィルター、例えばナイロン又はニトロセルロースであり得る。発現生物のコロニーを有する頂上のフィルターは、結合するタンパク質についてのアフィニティーがないか低いアフィニティーを有するいずれかのフィルター、例えばセルロースアセテート又はDurapore Oであり得る。そのフィルターは、スクリーニングに用いられるいずれかの条件でプレ処理され又は酵素活性の検出の間に処理され得る。
酵素活性は、染料、蛍光、沈殿、pH指示体、IR−吸光度又は酵素活性の検出のためのいずれかの他の周知の技術によって検出することができる。
検出化合物は、いずれかの固定化剤、例えばアガロース、寒天、ゼラチン、ポリアクリルアミド、スターチ、ろ紙、布;又はいずれかの固定化剤の組合わせにより固定化され得る。
ポリペプチドの改良された機能的特性が、1サイクルのシャッフリングの後で十分に優れたものでないなら、そのポリペプチドは他のサイクルにかけることができる。
本発明の実施形態において、少くとも1つのシャッフリングは、野生型DNAフラグメントであり得る最初に用いたDNAフラグメントで戻し交差(backcrossing)サイクルである。これは、本質的でない突然変異を除去する。非本質的な突然変異は、最初に用いた入力DNA材料として野生型DNAフラグメントを用いることによっても除去することができる。
本発明の方法は、酵素、例えばプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ及びオキシダーゼを含む全ての型のポリペプチドに適していることが理解されるはずである。
また、本発明によれば、生物活性を有するポリペプチド、例えばインスリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、キモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、エリトロポイエチン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、レラキシン、インターフェロン、トロンボポイエチン(TPO)及びプロラクチンが考慮される。
特に、本発明によれば、野生型、変異又は改変されたDNA配列のいずれか、例えば各々野生型、変異又は改変酵素、特に脂肪分解活性を示す酵素である入力DNA配列を最初に用いることが考えられる。
本発明の一実施形態において、脂肪分解活性は、ヒュミコラ(Humicola)種の糸状菌、特にヒュミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)由来のリパーゼ活性である。
本発明の特定の実施形態において、相同なポリペプチドでシャッフルされる最初に用いられる入力DNAフラグメントはEP305216(Novo Nordisk A/S)に記載されるヒュミコラ・ラヌギノサDSM4109由来のヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼをコードする野生型DNA配列である。
また特に、後の材料及び方法セクションのリストからのヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体をコードするベクター(a)〜(f)及び/又はDNAフラグメント(g)〜(aa)から選択される入力DNA配列が本発明の範囲内に包含される。
本願全体を通して、1つの好ましい親酵素、即ち上述のものを同定するのに名前ヒュミコラ・ラヌギノサが用いられる。しかしながら、近年、その真菌がサーモマイセス・ラヌギノスス(Thermomyces lanuginosus)に対して形態学的及び生理的類似性を示すので、H.ラヌギノサはサーモマイセス・ラヌギノスス(Thermomyces lanuginosus)(1989年にTsiklinskyにより最初に導入された種)とも呼ばれている。従って、引用がH.ラヌギノサについて行われる限り、この用語はサーモマイセス・ラヌギノススに置換することができると理解されよう。サーモマイセス・ラヌギノスス(又はH.ラヌギノサ)からの18Sリボソーム遺伝子のDNAコード化部分を配列決定した。結果として生ずる18S配列をGenBankデータベースにおいて他の18S配列と比較し、パルシモニー(parsimony)(PAUP,Version 3.1.1,Smithsonian Institution,1993)を用いる系統発生的分析も行った。これは、明らかに、サーモマイセス・ラヌギノススをプレクトマイセーテス(Plectomycetes)の綱に、おそらくユーロチアレス(Eurotiales)の目に割り当てる。NCBI(National Center for Biotechnology Information)のEntrez Browserによれば、これは、サーモマイセス・ラヌギノススをエレマスカセアエ(Eremascaceae)、モノアスカセアエ(Monoascaceae)、シュードユーロチアセアエ(Pseudoeurotiaceae)及びトリココマセアエ(Trichocomaceae)の様な属に関連づける。ここでその後者はエメリセラ(Emericella)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、ユーペニシリウム(Eupenicillium)、パエシロマイセス(Paecilomyces)、タラロマイセス(Talaromyces)、サーモアスクス(Thermoascus)及びスクレロクレイスタ(Sclerocleista)のような属を含む。
結果として、エメリセラ、アスペルギルス、ペニシリウム、ユーペニシリウム、パエシロマイセス、サーモアスクス及びスクレロクレイスタの糸状菌の脂肪分解酵素をコードするこのような遺伝子も、特に本発明により考慮される。
脂肪分解酵素をコードする関連する糸状菌遺伝子の他の例は、アブシジア種(Absidia sp.)の株、例えば引用により本明細書に組込まれるWO96/13578(Novo Nordisk A/S)に列記される株を含む。WO96/13578に列記されるアブシジア種は、アブシジア・ブラケスレエアナ(Absidia blakesleeana)、アブシジア・コリンビフェラ(Absidia corymbifera)及びアブシジア・レフレキサ(Absidia reflexa)を含む。
リゾプス種(Rhizopus sp.)の株、特にRh.=ベウス(Rh.niveus)及びRh.オリゼア(Rh.oryzea)も本発明に従って考慮される。
脂肪分解遺伝子は、バクテリア、例えばシュードモナス種の株、特にPs.フラジ(Ps.fragi)、Ps.スツットゼリ(Ps.stutzeri)、Ps.セパシア(Ps.cepacia)、及びPs.フルオレセンス(Ps.fluorescens)(WO89/04361)、又はPs.プランタリイ(Ps.plantarii)もしくはPs.グラジオリ(Ps.gladioli)(US 4,950,417)もしくはPs.アルカリゲネス(Ps.alcaligenes)及びPs.シュードアルカリゲネス(Ps.pseudoalcaligenes)(Ps.シュードアルカリゲネス脂肪分解酵素の変異体を開示するEP218272,EP331376、又はWO94/25578)、EP407225に開示されるシュードモナス種変異体、又はシュードモナス種脂肪分解酵素、例えばWO88/09367及びUS 5,389,536に記載されるPs.メンドシナ(Ps.mendocina)(Ps.プチダ(Ps.putida)とも呼ばれる)脂肪分解酵素もしくはUS 5,352,594に記載されるその変異体、又はPs.アウロギノサ(Ps.auroginosa)もしくはPs.グルマエ(Ps.glumae)、又はPs.シリンガエ(Ps.syringae)、又はPs.ウィスコンシネンシス(Ps.wisconsinensis)(SolvayからのWO96/12012)又はバチルス種の株、例えばDartoisら(1993)(Biochemica et Biophysica acta 1131,253〜260)により記載されるB.サブチリス(B.subtilis)、もしくはB.ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)(JP64/7744992)もしくはB.プミルス(B.pumilus)(WO91/16422)又はストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)の株、例えばS.スカビエス(S.scabies)、又はクロモバクテリウム種(Chromobacterium sp.)の株、例えばC.ビスコスム(C.viscosm)からも得ることができる。
シュードモナス種リパーゼに関して、次に生物:Ps.ATCC 21808,Liposum▲C▼として市販されるシュードモナス種リパーゼ、Ps.アエルギノサ(Ps.aeruginosa)EF2,Ps.アエルギノサPAC1R,Ps.アエルギノサPA01,Ps.アエルギノサTE3285,Ps.種109,Ps.シュードアルカリゲネスM1,Ps.グルマエ、Ps.セパシアDSM3959,Ps.セパシアM−12−33,Ps.種KWI−56,Ps.プチダIFO3458,Ps.プチダIFO12049(Gilbert,E.J.,(1993),Pseudomonas lipases:Biochemical properties and molecular cloning Enzyme Microb.Technol.,15,634〜645)が高い相同性、例えば少くとも60%の相同性、少くとも80%の相同性又は少くとも90%の相同性を有することが見い出されており、これにより同じ種のリパーゼに属すると考えられている。シュードモナス・セパシア種はブルクホルデリア・セパシア(Burkbolderia cepacia)として現在再分類されているが、本願ではPs.セパシアと呼ぶ。
また、イーストからの脂肪分解酵素をコードする遺伝子も関連し、カンジダ種(Candida sp.)特にカンジダ・ルゴサ(Candida rugosa)、又はゲオトリクム種(Geotrichum sp.)、特にゲオトリクム・カンジジウム(Geotrichum candidium)からの脂肪分解遺伝子も含む。
市販の製品のために用いられる脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含み、本発明によりシャッフルされる遺伝子のドナーとして機能し得る微生物の特定の例は、Lipolase▲R▼、Lipolase▲R▼ Ultraに用いられるヒュミコラ・ラヌギノサ、Lumafast▲R▼に用いられるPs.メンドシナ(Ps.mendocina)、Lipomax▲R▼に用いられるPs.アルカリゲネス(Ps.alcaligenes)、フサリウム・ソラニ(Fusarium solani)、バチルス種(US5427936,EP528828)、Liposum▲R▼に用いられるPs.メンドシナ(Ps.mendocina)を含む。
また、配列番号:14に示されるシュードモナス種リパーゼ遺伝子が本発明により特に考慮される。
本発明に従ってシャッフルされる脂肪分解酵素をコードする遺伝子は、脂肪分解酵素の上述の遺伝子のいずれか及びその変異体、改変体、又はトランケーション体のいずれかであり得ることが強調されるべきである。特に考慮される上述の遺伝子の例は、WO92/05249,WO94/01541,WO94/14951,WO94/25577,WO95/22615に記載される酵素及びEP407225に記載されるようなタンパク質工学処理されたリパーゼ変異体;US 5,352,594に記載されるようなタンパク質工学処理されたPs.メンドシナリパーゼ;WO94/14964に記載されるようなクチナーゼ変異体;EP特許167,309に記載されるようなアスペルギルス脂肪分解酵素の変異体;並びにWO95/06720に記載されるシュードモナス種リパーゼを含む。
シャッフルされるポリペプチドをコードするDNA配列に対する要求は、それらが少くとも60%、好ましくは少くとも70%、より好ましくは80%超、特に90%超、更に好ましくはほぼ100%までの相同性を有することである。より少い相同性を有するDNA配列は、より相互作用及び組換えしにくい傾向を有するだろう。
異なる属の親の(相同な)野生型生物をシャッフルすることも本発明により考慮される。
更に、シャッフルされるDNAフラグメントは、開環したプラスミドと最適に相互作用することができるために、好ましくは、約20bp〜8kb、好ましくは約40bp〜6kb、より好ましくは約80bp〜4kb、特に約100bp〜2kbの有さを有し得る。
本発明の方法は、直鎖DNAフラグメント/配列を形質転換することを含む先行技術の方法と比べて、ポリペプチド変異体を調製するために極めて有効である。
本発明者は、開環したプラスミド及びDNAフラグメントの混合物の形質転換頻度が、同部位のみでプラスミド切断物を形質転換する場合よりかなり高いことを見い出した。開環したプラスミド及びDNAフラグメントの形質転換頻度は、未切断プラスミドと同程度に高かった。
いずれの理論にも限定しないが、プラスミドの開環は、少くとも1のDNAフラグメントと相互作用しない場合、(開環した)プラスミドの複製を制限すると信じられる。このために、1回のシャッフリングサイクルのみの後で組換わったDNA配列の数の増加が見られた。
実施例1に記載されるように、結果として生じた形質転換体の50%が両方の入力DNA配列の組換わったDNA配列を含んでいた。組換わったDNA配列の総数の20%程度高くが“ランダム”混合物(即ち1超の交換されたヌクレオチドの領域を有するもの)であった。
入力DNA配列は、野生型DNA配列、その変異体もしくは突然変異体又は修飾体をコードするDNA配列、例えば伸長され又は延長されたDNA配列を含むいずれかのDNA配列であり得、そして本発明の方法又はいずれかの他の方法(例えば先行技術セクションに記載される方法のいずれか)に従う1又は複数のシャッフリングのサイクルにかけられているDNA配列の結果物(即ち出力DNA配列)でもあり得る。
本発明の方法を用いる場合、出力DNA配列(即ちシャッフリングされたDNA配列)は交換されたいくつかのヌクレオチドを有している。これは、それを親ポリペプチドと比較した場合、ポリペプチド変異体内に少くとも1のアミノ酸の置換を生ずる。サイレント変異(即ちアミノ酸配列の変化を生じないヌクレオチド交換)も考慮されることが理解されるはずである。
しかしながら、本発明の方法は、ほとんどの場合、かなりの数のアミノ酸の置換を導き、特定の場合には1又は複数のポリペプチドドメイン(即ちポリペプチド構造のホールディングした単位)の構造さえ変化させ得る。
本発明によれば、2超のDNA配列が同時にシャッフリングされる。実際に適切なプラスミド内に含まれるいずれかの数の異なるDNAフラグメント及び相同なポリペプチドを同時にシャッフリングすることができる。これは、莫大な数の全く異なる変異体を多数の反復手順なく直ちに行うことができる時に有利である。
本発明者は、有意な2超の相同なDNA配列を用いて本発明のヌクレオチドシャッフリング法をテストした。実施例2に記載されるように、驚くことに、本発明の方法は2超のDNA配列を組換えるのに有利に用いることができることが見い出された。
本発明の方法によるシャッフリングの1サイクルは、問題のポリペプチドをコードする開環したプラスミドDNAに1〜1000ヌクレオチドの交換を生じ得る。その交換されたヌクレオチド配列は連続的であり得、又は全長の配列内にいくつかのサブ配列として存在し得る。
本発明を支持するために、本発明者は本発明の方法での異なる態様でのいくつかの更なる実験を行った。その実験は以下に記載され、以下の実施例3〜6に示される。
不活性化された合成ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子を含むいくつかのベクター及びフラグメントを、種々の位置においてリパーゼ遺伝子中にフレームシフト/停止コドン変異を導入することによって作製した。これらは、開環したベクター及びDNAフラグメントの異なる組合わせの生体内組換えをモニターするのに用いた。活性リパーゼコロニーの数を実施例3に記載されるように評価した。コロニーの数は、開環ベクター及びフラグメント組換えの効能を決定する。
その開環ベクター中の前記ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子中の1のフレームシフト変異及びその開環部位の反対側上のフラグメント中の他のものは、その位置及び組合わせにより3〜32%の活性リパーゼコロニーを供した。変異がベクターの末端に近い程、混合がより高くなると結論づけられた。
開環ベクター中の1のフレームシフト変異及びその開環部位の各々の側上のフラグメント内の2つは、その位置及び組合わせにより4〜42%の活性コロニーを供した。これらの活性コロニーのいくつかは、その開環部位に関連するばかりでなくモザイクであると考えられ得る。
開環部位の各々の側上の開環ベクター内の2のフレームシフト変異及びフラグメント内の1つはその位置及び組合わせにより0.5〜3.1%の活性コロニーを供した。これらの活性コロニーのほとんどは“親”DNAのモザイクである。
開環部位の各々の側上の開環ベクター中の2のフレームシフト変異及び野生型フラグメントは、その位置により7.7〜10.7%の活性コロニーを供した。
フラグメントに対するベクターの量及びそのフラグメントの大きさも結果に影響を与えることも見い出された。
組換え宿主細胞としてのS.セレビシアエrad52変異体の使用は、rad52変異体は野生型プラスミドで極めてよく形質転換し、ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子を発現したが、開環ベクター及びフラグメントでは全く形質転換しなかった。
開環ベクター及びフラグメントの組換えが古典的な組換えメカニズムに関することを示す“古典的組換え(classical recombination)”のため(しかし不等姉妹鎖分裂組換えのためでない)にはRAD52機能が要求される。
古典的組換えは、例えばPetes TD,Malone RE及びSymington LS(1991)(“Recombination in Yeast”,page 407〜522,in The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces,Volume 1(eds,Broach JR,Pringle JR and Jones EW),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)に定義されるような相同な染色体の姉妹染色分体上に位置した遺伝子間の組換えに関連する組換えメカニズムである。
多重部分的オーバーラッピングフラグメント
本発明者は、本発明の方法を用いて、多重の部分的にオーバーラップするフラグメントの組換えもテストした。
ギャップのある(即ちその開環が遺伝子の小さな部分の切り出しを生ずる)ベクター内への2及び3の部分的オーバーラッピングフラグメントの組換えをテストし、それは組換わったヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子の高い回収率を供した。不活性化したヒュミコラ・ラヌギノサ遺伝子の異なる組合わせからの活性リパーゼ遺伝子の回収を、2の部分的にオーバーラップするフラグメントの組換えについてテストした。ベクター及びフラグメントオーバーラップにおけるより、ギャップのある領域中の2つのフラグメント間のオーバーラップする領域において高度に混合する傾向があった。
同じ領域からの多くのフラグメントを組換える場合、多重オーバーラッピングフラグメント技術は、それ自体によって混合を増加させるであろうが、接近して位置した変異体/差を混合するために、オーバーラッピング領域内に比較的高いランダム混合を有することも重要である。
2つのフラグメント間の10bp程度の小ささのオーバーラップが極めて有効な組換えを得るのに十分であることが見い出された。それゆえ、5〜5000bp、好ましくは10bp〜500bp、特に10bp〜100bpの範囲のオーバーラップが本発明の方法により適している。
本発明のこの実施形態によれば、2又はそれ超のオーバーラッピングフラグメント、好ましくは2〜6のオーバーラッピングフラグメント、特に2〜4のオーバーラッピングフラグメントがシャッフリングサイクルにおいて入力フラグメントとして有利に用いられ得る。
遺伝子の混合を増加させる他に、これは、異なるドメインからのDNAフラグメント間に小さなオーバーラップを形成し、その最も優れた組合わせについてスクリーニングすることによるドメインシャッフリングのための極めて有用な方法である。
例えば、3つのDNAフラグメントの場合、そのオーバーラッピング領域は次の通りであり得る。
− 第1のフラグメントの第1の端は開環したプラスミドの第1の端とオーバーラップし、
− 第2のフラグメントの第1の端は第1のフラグメントの第2の端とオーバーラップし、そして第2のフラグメントの第2の端は第3のフラグメントの第1の端とオーバーラップし、
− (上述のように)第3のフラグメントの第1の端は第2のフラグメントの第2の端とオーバーラップし、そして第3のフラグメントの第2の端に開環したプラスミドの第2の端とオーバーラップする。
出発材料として2又はそれ超のDNAフラグメントを用いる場合、プラスミドとDNAフラグメントの端の間に連続的なオーバーラップを有することが好ましい。
DNAフラグメント及び開環したプラスミドの形態において相同なDNA配列をシャッフリングすることが好ましいとしても、ポリペプチドをコードする相同なDNA配列を含む2又はそれ超の開環したプラスミドをシャッフリングすることも本発明により考慮される。しかしながら、このような場合、異なる部位においてプラスミドを開環することが必須である。
本発明の更なる実施形態において、2又はそれ超の開環したプラスミド及び1又はそれ超の相同なDNAフラグメントがシャッフリングされる出発材料として用いられる。開環したプラスミドと相同なDNAフラグメントとの間の比は、特定の濃度が1pM〜10MのDNAであるなら20:1〜1:50の範囲、好ましくは2:1〜1:10(molベクター:molフラグメント)の範囲にある。
組換えについて選択するためにベクター内で、フラグメント間のオーバーラップが削除されるように、開環したプラスミドは有利にはギャップ形成され得る。
DNAフラグメントの調製
開環したプラスミド内に含まれる相同なポリペプチドとシャッフリングされるDNAフラグメントは、いずれかの適切な方法により調製することができる。例えば、DNAフラグメントは、例えばUS 4,683,202又はSaikiら(1988),Science 239,487〜491に記載されるように、特定のプライマーを用いて、ポリペプチドの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの上述のようなPCR増幅(ポリメラーゼ鎖反応)によって調製することができる。そのDNAフラグメントは、制限酵素での消化、次の例えば電気泳動での単離により、要求されるDNA配列を含むベクター又はプラスミドから切り出すことができる。
問題の相同なポリペプチドをコードするDNAフラグメントは、確立された普通の方法、例えばBeaucage及びCaruthers(1981)(Tetrahedron Letters 22,1859〜1869)により記載されるホスホアミジト法又はMatthesら(1984)(EMBO Journal 3,801〜805)により記載される方法により、合成で択一的に調製することができる。ホスホアミジト法によれば、オリゴヌクレオチドは例えば自動DNAシンセサイザーで、合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして適切なベクター内にクローニングされる。
更に、そのDNAフラグメントは、普通の技術に従って、(適切には)合成、ゲノム又はcDNA源のフラグメントであって全体のDNA配列の種々の部分に相当するものを連結することによって調製された合成源とゲノム源との混合、合成源とcDNA源との混合又はゲノム源とcDNA源との混合のものであり得る。
プラスミド
問題のポリペプチドをコードするDNA配列を含むプラスミドは、該DNA配列を適切なベクターもしくはプラスミドに連結することにより、又はいずれかの他の適切な方法により調製することができる。
前記ベクターは、便利には組換えDNA手順にかけられ得るいずれかのベクターであり得る。ベクターの選択は、しばしば、それが導入される組換え宿主細胞によるであろう。
これにより、ベクターは、自己複製するベクター、即ちその複製が染色体の複製と独立している染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、組換え宿主細胞内に導入した時に宿主細胞ゲノム内に組込まれ、それが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。
スクリーニング過程を容易にするために、ベクターは、問題のポリペプチドをコードするDNA配列がDNAの転写のために要求される付加的なセグメントに作用的に結合されている発現ベクターである。一般に、発現ベクターは、プラスミド、コスミドもしくはバクテリオファージから得られるか、又はこれらのいずれかもしくは全ての要素を含み得る。
用語“作用的に結合”とは、そのセグメントが、それらの意図した目的に合わせて機能する、例えば転写がプロモーターで開始し、問題のポリペプチドをコードするDNA配列を通して進むように配置されることを示す。
プロモーターは、選択された組換え宿主細胞内で転写活性を示し、その宿主細胞に対して同種又は異種である酵素のようなタンパク質をコードする遺伝子から得られるいずれかのDNA配列であり得る。
イースト宿主細胞に用いるための適切なプロモーターの例は、イースト解糖遺伝子(Hitzemanら、(1980),J.Biol.Chem.255,12073〜12080;Alber and Kawasaki,(1982),J.Mol.Appl.Gen.1,419〜434)もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Youngら、Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaenderら、eds.),Plenum Press,New York,1982)、又はTPI1(US 4,599,311)もしくはADH2−4c(Russellら、(1983),Nature 304,652〜654)プロモーターからのプロモーターを含む。
糸状菌宿主細胞に用いるための適切なプロモーターの例は、例えばADH3プロモーター(McKnightら、(1985),The EMBO J.4.2093〜2099)又はtpiAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A.オリザエ(A.oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロティナーゼ、A.ニゲル(A.niger)中性a−アミラーゼ、A.ニゲル酸安定a−アミラーゼ、A.ニゲル又はA.アワモリ(A.awamori)グルコアミラーゼ(gluA)、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザサアルカリプロテアーゼ、A.オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ又はA.ニジュランス(A.nidulans)アセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。好ましいのは、TAKA−アミラーゼ及びgluAプロモーターである。
本発明の問題のポリペプチドをコードするDNA配列は、必要ならば、適切なターミネーター、例えばヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiterら、前掲)又は(真菌のための)TPI1(Alber及びKawasaki、前掲)もしくはADH)(McKnightら、前掲)ターミネーターに作用的に結合される。ベクターは、(例えばSV40又はアデノウィルスらE1b領域からの)ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列(例えばSV40エンハンサー)及び翻訳エンハンサー配列(例えばアデノウィルスVARNAをコードするもの)のような要素を更に含み得る。
ベクターは、そのベクターが問題の組換え宿主細胞内で複製するのを可能にするDNA配列を更に含み得る。宿主細胞がイースト細胞である場合、ベクターが複製するのを可能にする適切な配列はイーストプラスミド2m複製遺伝子REP 1〜3及び複製の源である。
プラスミドpY1は、組換え宿主細胞として糸状菌、例えばアスペルギルス種(Aspergillus sp.)及びイーストを用いて、有用なタンパク質及びペプチドの生産のために用いることができる。
ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が組換え宿主細胞における欠損を補足する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHER)をコードする遺伝子又は(P.R.Russell,(1985),Gene 40,125〜130に記載される)スキゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)TPI遺伝子も含み得る。
このような適切な選択マーカーの他の例は、例えばイースト株サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)YNG318の対応する欠損遺伝子を補足するura3及びleu2遺伝子である。
ベクターは、薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロランフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン又はメトトレキセートに耐性を与える選択マーカーも含み得る。糸状菌のために、選択マーカーは、amdS,pyrG,argB,niaD,sC,trpC,pyr4、及びDHFRを含む。
問題のポリペプチドを組換え宿主細胞の分泌経路に方向づけるために、(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られる)分泌シグナル配列が、組換えベクター内に供され得る。分泌シグナル配列は、正確な読み枠内の脂肪分解酵素をコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般に、ポリペプチドをコードするDNA配列に対して5’側に位置する。分泌シグナル配列は、通常問題のポリペプチドに関連するシグナルであり得、又は他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子からのものであり得る。
シグナルペプチドは天然のシグナルペプチドもしくはその機能的部分であり得、又はそれは合成ペプチドであり得る。イースト細胞からの分泌のために、適切なシグナルペプチドは、a−因子シグナルペプチド(例えばUS 4,870,008)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(例えばO.Hagenbuchleら、(1981),Nature 289,643〜646)、改変カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(例えばL.A.Vallsら(1987),Cell 48,887〜897)、ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼシグナルペプチド、イーストBAR1シグナルペプチド(例えばWO87/02670)、又はイーストアスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチド(例えばM.Egel-Mitaniら(1990),Yeast 6,127〜137)であることが見い出されている。
イーストにおける有効な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列も、シグナル配列の下流及び問題のポリペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入することができる。リーダーペプチドの機能は、発現されたポリペプチドが小胞体からゴルジ装置に、そして更に培養培地への分泌のための分泌小胞(即ち細胞壁を横切る、又は少くとも細胞膜を通してのイースト細胞の細胞周辺腔へのポリペプチドの送出)に方向づけられるのを許容することである。あるいは、リーダーペプチドは合成リーダーペプチド、即ち天然には見い出されないリーダーペプチドであり得る。合成リーダーペプチドは、例えばWO89/02463又はWO92/11378に記載されるように作製することができる。
糸状菌に用いるために、シグナルペプチドは、便利には、アスペルギルス種アミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼもしくはプロテアーゼをコードする遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼをコードする遺伝子から得られうる。シグナルペプチドは、好ましくは、A.オリザエTAKAアミラーゼ、A.ニゲル中性α−アミラーゼ、A.ニゲル酸安定アミラーゼ、又はA.ニゲルグルコアミラーゼをコードする遺伝子から得られる。
組換え宿主細胞
その中にプラスミド/フラグメントDNA配列の混合物が導入される組換え宿主細胞は、問題の相同なDNA配列を組換えることができるいずれかの真核細胞、例えば真菌細胞及び植物細胞であり得る。
先行技術によれば、原核細胞の微生物、例えばバクテリア、例えばバチルス及び大腸菌;真核生物、例えば糸状菌、例えばアスペルギルス及びイースト、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ;並びに鳥類又は哺乳動物源からの組織培養細胞が、生体内組換えのために示唆されている。前記の生物の全てを組換え宿主細胞として用いることができるが、一般に、原核細胞は工業的な使用のための組換え法に適するのに十分に有効でない(即ち十分な数の変異体を生じない)。
結果的に、本発明による好ましい組換え宿主細胞は、真菌細胞、例えばイースト細胞又は糸状菌である。
適切なイースト細胞の例には、サッカロマイセス種(Saccharomyces sp.)、特にサッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)もしくはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)又はスキゾサッカロマイセス種(Schizosaccharomyces sp.)の細胞を含む。イースト細胞を異種DNAで形質転換し、そしてそれから異種ポリペプチドを生産するための方法は、例えばその全てが引用により本明細書に組込まれるUS 4,599,311,US 4,931,373,US 4,870,008,5,037,743、及びUS 4,845,075に記載される。形質転換された細胞は、例えば選択マーカーにより決定される表現型、一般的な薬剤耐性又は特定の栄養素例えばロイシンの欠如下で増殖する能力により選択することができる。イーストに用いるための好ましいベクターはUS 4,931,373に開示されるPOT1ベクターである。ポリペプチドをコードするDNA配列は、上述の通り、その先にシグナル配列及び任意的にリーダー配列が存在し得る。適切なイースト細胞の更なる例は、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)の株、例えばK.ラクチス(K.lactis)、ハンセヌラ(Hansenula)、例えばH.ポリモルファ(H.polymorpha)、又はピキア(Pichia)、例えばP.パストリス(P.pastoris)である(例えばGleesonら(1986),J.Gen.Microbiol.132,3459〜3465;US 4,882,279)。
他の真菌細胞の例は糸状菌の細胞、例えばアスペルギルス種(Aspergillus sp.)、ニューロスポーラ種(Neurospora sp.)、フサリウム種(Fusarium sp.)又はトリコダーマ種(Trichoderma sp.)、特にA.オリザエ(A.oryzae)、A.ニジュランス(A.nidulans)又はA.ニゲル(A.niger)の株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用は、例えばEP272277,EP230023に記載される。F.オキシスポルム(F.oxysporum)の形質転換は、例えばMalardierら(1989),Gene 78,147〜156により記載されるように行うことができる。
本発明の好ましい実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にS.セレビシアエ(S.cerevisiae)の細胞である。
方法及び材料
DNA配列:
ヒュミコラ・ラヌギノサDSM4109由来リパーゼコード化DNA配列
ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体:
実施例2におけるNruIで開環されたベクターを調製するために用いた変異体:
実施例2における標準的なPCR増幅によりDNAフラグメントを調製するために用いた変異体
株:
発現システム宿主
サッカロマイセス・セレビシアエYNG318:MATa Dpep4[cir+]vra3-52,leu2-D2,his4-539
サッカロマイセス・セレビシアエRad52:Torsten Nilsson Tillgren,Institute of Genetics,University of Copenhagenから得られた株M1533=MaTa rad52 ura3
プラスミド:
pJSO26(図3を参照)
pJSO37(図4を参照)
pYES 2.0(Invitrogen)
形質転換選択マーカー
ura3
leu2
培 地
Sc-ura-:90mlの10×Basal塩、22.5mlの20%カザミノ酸、9mlの1%トリプトファン、H2Oを加えて806ml、オートクレーブ、3.6mlの5%トレオニン及び90mlの20%グルコース又は20%ガラクトースを加える。
LB−培地:1lの水中の10gのBacto−トリプトン、5gのBactoイーストエキス、10gのNaCl
Brilliant Green(BG)(Merck,art.No.1.01310)
BG−試薬:水に溶かした4mg/mlのBrilliant Green(BG)基質1:
10mlのオリーブ油(Sigma CAT No.0-1500)20mlの2%ポリビニルアルコール(PVA)
その基質は15〜20分、ホモジナイズする。
方 法:
イースト発現ベクターの作製
発現プラスミドpJSO26及びpJSO37はpYES 2.0から得られる。pYES 2.0の誘導性GAL1−プロモーターを、サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)からの構成的に発現されたTPI(トリオースリン酸イソメラーゼ)−プロモーターで置換し(Albert and Karwasaki,(1982),J.Mol.Appl.Genet.,1,419〜434)、そしてura3プロモーターを削除した。pJSO26及びpJSO37の制限マップを各々図3及び図4に示す。
野生型DNAフラグメントの調製
リパーゼ野生型DNAフラグメントは、pJSO26プラスミドの(低、中又は高変異誘発を生ずる)PCR増幅、又は適切な制限酵素で消化することによりDNAフラグメントを切除することのいずれかによって調製することができる。
イーストにおけるヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体の発酵
10mlのSc-ura-培地にS.セレビシアエコロニーを接種し、2日間、30℃で増殖させる。その10mlを300mlのSc-ura-培地を接種するのに用い、それを30℃で3日、増殖させる。その300mlを次のG−基質5lの接種するのに用いる:
400 g アミカーゼ(Amicase)
6.7 g イースト抽出液(Difco)
12.5g L−ロイシン(Fluka)
6.7 g (NH4)2SO4
10 g MgSO4・7H2O
17 g K2SO4
10 ml Trace化合物
5 ml ビタミン液
6.7 ml H3PO4
25 ml 20%Pluronic(antifoam)
全量5000ml中:
イースト細胞を30℃で5日間、発酵させる。それらに開始投与量100mlの70%グルコースを供し、400mlの70%グルコース/日を加える。10%NH3溶液を加えることによりpH=5.0を維持する。最初の22時間、300rpmで、次に発酵の残りを900rpmで撹拌を行う。最初の22時間、1lの空気/l/分で、次に発酵の残りを1.5lの空気/l/分で空気を供する。
Trace化合物:
6.8 g ZnCl2
54.0 g FeCl2・6H2O
19.1 g MnCl2・4H2O
2.2 g CuSO4・5H2O
2.58 g CoCl2
0.62 g H3BO3
0.024g (NH4)6Mo7O24・4H2O
0.2 g KI
100 ml HCl(濃縮)
全量1l
ビタミン溶液:
250mg ビオチン
3 g チアミン
10 g カルシウムパンテトネート(D-Calciumpanthetonat)
100g ミオイノシトール
50 g コリンクロリド
1.6g ピリドキシン
1.2g ナイアシンアミド
0.4g 葉酸
0.4g リボフラビン
全量1l
イーストの形質転換
サッカロマイセス・セレビシアエを、普通の方法により形質転換する(例えばSambrooksら(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor)。
イースト形質転換頻度の決定
形質転換頻度を、3日間、Sc-ura-プレート上で形質転換体を培養し、現れたコロニーの数を計数することにより測定する。開環したプラスミドのmg当りの形質転換体の数が形質転換頻度である。
改良された洗浄能力での陽性変異体についてのスクリーニング
改良された洗浄能力で陽性変異体をスクリーニングするために以下のフィルターアッセイを用いることができる。
低カルシウムフィルターアッセイ
1)第1のタンパク質結合フィルター(Nylon膜)及び頂面の第2の低タンパク質結合フィルター(Celluloseアセテート)を有する(発現ベクターを有する株を選択するのに役立つ)Sc Ura-レプリカプレートを供する。
2)二重フィルター上に親リパーゼ遺伝子又は変異遺伝子を含むイースト細胞を広げ、30℃で2又は3日、インキュベートする。
3)頂面のフィルターを新しいプレートに移すことにより頂面フィルター上にコロニーを維持する。
4)タンパク質が結合しているフィルターを除去してペトリ皿を空にする。
5)オリーブ油懸濁液(2%PVA:オリーブ油=3:1)、Brilliantグリーン(指示体、0.004%)、100mMトリス緩衝液pH9及びEGTA(最終濃度5mM)を含むアガロース溶液を、青−緑スポットの形態においてリパーゼ活性を発現するコロニーを同定するために、底のフィルターに注ぐ。
6)親リパーゼと比較して少いカルシウム依存性を有するステップ5)で見い出されたコロニーを同定する。
DNA配列決定を、ABI Dye Terminator Cycle Sequencingキットにおいてプロトコルに従って、applied Biosystens ABI DNA配列モデル373Aを用いることによって行った。
組換え体の効能の評価
コロニーの数は、開環したベクター及びフラグメント組換えの効能を決定する。活性なリパーゼ活性を有するコロニーの割合は、活性及び不活性遺伝子の混合の評価を供する−理論的には、野生型及びフレームシフトの等しい見込みなら、1のフレームシフトについて50%に近づけばより優れた混合で、2のフレームシフトでは25%、3のフレームシフトでは12.5%と計算することができる。
フレームシフト変異
dNTPあり又はなしでのT4 DNAポリメラーゼにより、(5’オーバーハングの場合)制限部位を充填すること、又は(3’オーバーハングの場合)“粘着末端”を削除することのいずれかによりフレームシフト変異を形成した(デオキシヌクレオチド=等量のdATP,dTTP,dCTP及びdGTP)。(図7に“F”で示される制限部位の充填及び(図7に“(D)”で示される)粘着末端を削除するための方法は当該技術で公知である。
リパーゼ活性でコロニーを評価するための方法
コロニー及び陽性(即ちリパーゼ活性を有するもの)の数を3のプレートの平均として計算する。
用いた培養条件及びスクリーニング条件は次の通りである:
1)タンパク質結合フィルター(Nylonフィルター)をSc Ura-プレートを、そのプレート上に供する。
2)そのフィルター上に、親リパーゼ遺伝子又は変異リパーゼ遺伝子を含むイースト細胞を広げ、30℃で3又は4日、インキュベートする。
3)そのコロニーを有するタンパク質結合フィルターを、次のもの:オリーブ油懸濁液(2%PVA:オリーブ油=2:1)、Brilliantグリーン(指示体、0.004%)、100mMトリス緩衝液pH9を含むアガロース溶液を含むペトリ皿に移す。
4)青−緑スポットの形態においてリパーゼ活性を示すコロニーを同定する。
実施例
実施例1
2の相同な遺伝子の生体内組換えのテスト
サッカロマイセス・セレビシアエ発現プラスミドpJSO26を“材料及び方法”セクションに記載されるように作製した。
12の付加的制限部位(図4を参照のこと)を含む(pJSO37内の)合成ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子を各々NruI,PstI、並びにNruI及びPstIで切断してリパーゼをコードするDNA配列のほぼ真ん中で遺伝子を開環した。
その開環したプラスミド(pJSO37)を、PCR増幅によりpJSO26から調製した約0.9kb野生型ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼDNAフラグメント(図1を参照のこと)と一緒に、サッカロマイセス・セレビシアエYNG318内に形質転換した。
更に、その開環したプラスミドのみもイースト組換え宿主細胞に形質転換した(即ち0.9kb合成リパーゼDNAフラグメントのないもの)。
その形質転換したイースト細胞を、上述の“材料及び方法”セクションに記載されるように増殖させ、そしてその形質転換頻度を上述のように測定した。
開環したプラスミドのみでの形質転換頻度(開環したプラスミドのmg当り10の形質転換体)は、前記プラスミド/フラグメントの形質転換頻度(開環したプラスミドのmg当り50,000の形質転換体)と比較して極めて低いことが見い出された。
プラスミド/フラグメントをPCR増幅して、組換えたプラスミド/フラグメントのリパーゼ遺伝子領域を覆うフラグメントを含む20の形質転換体を生じさせた。その20の形質転換体の組換え混合物を、普通の方法を用いる制限部位消化により分析した。その結果を表1に示す。
表1から見ることができるように、(50%に等しい)10の形質転換体が組換えDNA配列を含んでいた。(20%に等しい)これらの10のDNA配列は、合成遺伝子に組換えられた野生型遺伝子の領域又は野生型フラグメントに組込まれた合成遺伝子の領域のいずれかを含んでいた。
実施例2
ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体の生体内組換え
ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼの20の変異体のDNA配列を同じ混合物中で生体内組換えを行った。
イースト発現ベクターpJSO37への連結により、リパーゼ変異体(a)〜(f)(上述のリストを参照のこと)から6のベクターを調製した。全てのベクターをNruIで切って開環した。
全部で20の相同なDNA配列(g)〜(aa)(上述のリストを参照のこと)のDNAフラグメントを普通の方法を用いてPCR増幅により調製した。
20のDNAフラグメント及び6の開環したベクターを混合し、普通の方法によりイーストサッカロマイセス・セレビシアエYNG318に形質転換した。その組換え宿主細胞を上述のように培養し、上述の通りスクリーニングした。約20の形質転換体を単離して、“材料及び方法”セクションに記載されるフィルターアッセイ法を用いて改良された洗浄能力についてテストした。
2の陽性形質転換体(A及びB)を、フィルターアッセイを用いて同定した。
野生型アミノ酸配列との比較において、その2つの組換えられた陽性形質転換体に以下の変異を有していた。
Aは2の変異体の組換えである。
---- はベクター(d)起源である。
==== は変異体(y)から調製されたDNAフラグメント起源である。
Bはベクター(c)、DNAフラグメント(n)及び(u)の組換えである。
---- はベクター(c)起源である。
<<<< は変異体(u)から調製されたDNAフラグメント起源である。
==== は変異体(n)から調製されたDNAフラグメント起源である。
???? 組換えの結果でないアミノ酸変異。
見ることができるように、結果として生ずる陽性変異体を、2又はそれ超の変異体の組換えにより形成した。“?????”で示されるアミノ酸変異は、シャッフリングしたリパーゼ変異体(上述のリストを参照)のいずれもが前記変異のいずれをも含まないことから、生体内組換えの結果ではない。結果として、これらの変異は、普通のPCR増幅によるDNAフラグメントの調製の間に生じたランダム変異誘発の結果である。
実施例3
1のフレームシフトの変異体での組換え
(ベクターJSO37内の)合成ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子を、制限酵素部位を削除し(位置184/385)もしくはそれに充填する(位置290/317/518/746)ことにより又は停止コドンの部位特異的導入により、種々の位置で不活性化した。900bpの全ての不活性化合成リパーゼ遺伝子は、図7から予測することができる。
いくつかの異なる900bpのDNAフラグメントを、普通のPCR技術を用いてプライマー4699及びプライマー5164を用いて上述のベクターから作った。プライマー8487及びプライマー4548(260bp)、プライマー2843及びプライマー4548(488bp)を用いてより小さなフラグメントを作った。
PstI(即ち位置385)で開環したベクターBlue 425,Blue 426,Blue 428及びBlue 429並びにNruI(即ち位置464)で開環したベクターBlue 424及びBlue 425の0.5ml(約0.lmg)を、表1Aに示される100mlのサッカロマイセス・セレビシアエYNG318コンピテント細胞に形質転換した種々の組合わせにおいてフラグメント424,425,426,428,429 3ml(約0.5mg)と一緒にした。
コロニー及び陽性のもの(即ちリパーゼ活性を有するもの)の数を、材料及び方法セクションに記載されるように3のプレートの平均として計算した。
テストの結果を表1Aに示す。
表1Aの最初の2列は、PstI部位の各々の側上の1のフレーム
シフトのベクター及びフラグメントを示す。列1と比較した列2の“ミラーイメージ”実験は、再現性あるより少い数の活性なコロニーを供する。強調されないが、同じことが列3及び4について真実である。開環した部位をベクター内のフレームシフト近くに動かすことは、列5に見られるように活性なものの数を増加させる。これは、“ミラーイメージ”実験の差についての理由を説明することができる。両方の場合、陽性のものの数が多くなると、ベクター内のフレームシフトにより近い開環部位を有する。
それゆえ、変異がベクターの端に近くなると、混合の機会がより高くなることを結論づけることができる。これは、おそらく、遊離DNA端が高い組換え源、能力を有しているという公知の事実から生ずる。それゆえ、遺伝子の混合を増加させるためには可能な限り多くの遊離DNA端を有することが要求される。これは、例えば多重オーバーラップフラグメントの組換えでの後者の例で得られる。
列6は、おそらくベクターのPstI開環部位における正確なフラグメントのフレームシフトの位置のため、活性なものの数がかなり低い。
列7は、開環部位に近いベクターのフレームシフトを有し、多数の活性なものを供する。
1ステップコドン変異誘発での組換え
フレームシフト変異と比較して停止コドンの変異の組換え効率にいずれかの差があるか否かをテストするために、以下の実験を行った。
上述と同じ方法で、(部位特異的変異誘発により調製した)特定の位置(各々位置184,317及び746)に停止コドンを含むPstIで開環した0.5ml(約0.1mg)のベクターBlue 624,Blue 625及びBlue 626(表1Bを参照のこと)を、表1に示すような種々の組合わせにおいて100mlサッカロマイセス・セレビシアエYNG318コンピテント細胞に形質転換したフラグメント624,625及び626ml(約0.5mg)と一緒にした。
(表1Bの)列1及び2は、表1Aの列1及び2と同じ場所に位置した変異を有する。見ることができるように、リパーゼ活性を有するコロニーの数は、フレームシフト変異と比較して停止コドン変異について明らかに高いが、“ミラーイメージ”実験間の相対的な差は同じである。
これは、本方法の“適用”により近い停止コドン変異は、フレームシフト変異より優れた混合を供することを示し得よう。列3及び4は、ベクターの端により近い変異がより高い混合の機会を供することを確認する。
ベクター内での1又は2のフレームシフト変異及びフラグメント内での1又は2のフレームシフト変異での組換え
上述と同じ試みを用いて、ベクター内の1又は2のフレームシフト変異及びフラグメント内の1又は2のフレームシフト変異の影響を、ベクターBlue 425,426及び428(1の変異)並びにベクターBlue 442及びBlue 443(2の変異)、並びにフラグメント442及び443(2のフレームシフト変異)並びにフラグメント424,425,426,427,428(1の変異)及び野生型(変異なし)を用いてテストした。
ベクターBlue 442及び443は二重フレームシフト変異である:Blue 442=428+429及びBlue 443=427+429(図7を参照のこと)。
PstIで開環した0.5mlのベクター(約0.1mg)及び3mlのPCR−フラグメント(約0.5mg)を100mlのサッカロマイセス・セレビシアエYNG318コンピテント細胞に形質転換することによって組換えを行った。
テストの結果を表2A及び表2Bに示す。
表2Aは、ベクター上のフレームシフトが開環部位から離れて位置する最後の列を除いて、全部で3のフレームシフト(ベクター上には1のみのフレームシフト)でさえリパーゼ活性を有するかなり多数のコロニーがあることを示す。おそらくベクター上のフレームシフトが、開環部位に関連しない活性遺伝子モザイクを作るフラグメント上のフレームシフトより開環部位から更に離れているため、レーン4はレーン3より少い活性を有する(図2Aを参照のこと)。表2Bにおいて、ベクター上に2のフレームシフトが位置している場合に、極めて少い数の活性が観察される。これらの活性コロニーのほとんどは、その混合が開環部位に関連しないことを意味する“親”DNAのモザイクルである(図2Bを参照のこと)。
2の異なるベクター又はフラグメントでの組換え
2の異なるベクター又はフラグメントテストでの組換えの結果を表3に示す。
予想される通り、表3の列1において対照実験について少い数のコロニーが見られる。真ん中の列に添加されたフラグメントは、各々のベクター上のフラグメントに各々相当する2のフレームシフトを有する。3分割の組換えにより、4.2%の活性が形成される。各々1のフレームシフトを有する2のフラグメント及び同じく2のフレームシフトを有するベクターではほとんど活性は見られない。
異なる部位で開環したベクターでの組換え
ほぼまん中のかわりに一方の側でベクターを開環することは、表4に示すように、優れた組換えを供する。異なる部位で開環した2のベクターも(表1)のベクター対照と比べて)ある程度、組換わることができる。
ベクター及びフラグメントの異なる濃度での組換え
フラグメントに対するベクターの相対濃度は、表5に見ることができるように、陽性コロニーの割合に影響を与える。
異なる大きさのフラグメントでの組換え
フラグメントの大きさも、表6に見られるように、組換えに影響を与える。
開環していないベクターでの組換え
開環していないベクターでの形質転換は、極めて低い組換えを示す(表7)。
実施例4
組換えにおいて変化したS.セレビシアエ変異体のテスト
実施例3に記載されるのと同じ試みを用いて、開環した及び開環していないベクター及びフラグメントの組換えを、組換え宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビシアエrad52変異体を用いてテストした。結果を表8に示す。
rad52での結果は、その組換えが完全に廃止されたことを示した。RAD52機能が古典的組換えのために要求される(不等姉妹鎖分裂組換えのためには要求されない)ことは、開環したベクター及びフラグメントの組換えは古典的なメカニズムに関連し得ることを示す。
実施例5
多重の部分的なオーバーラッピングフラグメントの組換え
本発明の組換え法により変異体の混合を増加させるために、2のフラグメント及び1のギャップベクターの組換えを試みた。
表15から見ることができるように、ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ遺伝子は極めて有効である。表15の最後の5列は、開環したベクターのみ又は全体のギャップをカバーしない唯一のフラグメントと一緒の開環したベクター(図3を参照)が、極めて少いコロニーだけしか供さないことを示す。
第1の列は野生型フラグメントが100%の活性コロニーを供することを示す。
第2の列は各々1のフレームシフトを含む2のフラグメントでのものである。フラグメントPCR331フラグメントは、この組換えにおいて野生型フラグメントによりカバーされない(図3を参照)BglII部位に位置したフレームシフトを有し、それゆえ約0%の活性リパーゼを供する。列3及び6についても同じである。
列4においてはギャップベクター内で野生型配列によりオーバーラップされたSphI部位においてフレームシフトを含むフラグメントPCR386である。そのフレームシフトは10%未満の遺伝子に組換えられ、それは上述の表1Aの最後の列の1のフラグメントの組換えについての結果より低かった。
列5において、25%の活性及び75%の不活性リパーゼコロニーを供する各々フレームシフトを含む2のフラグメントと野生型ギャップベクターとの間にかなり高い混合が観察された。これはおそらく、フラグメントPCR321が2のフラグメント間のオーバーラップ及びベクターのギャップ領域内にフレームシフトを有するためである。フラグメントPCR386が列4のように10%の不活性に寄与するなら、フラグメントPCR321は残りの65%の不活性を供し、それゆえPCR386はオーバーラップにおいて35%wtを供する。
列7は、野生型フラグメントの、90%超のベクターへの組込みを供するベクター(図7を参照)及び2の野生型フラグメント上のSphI部位におけるフレームシフトを有する“鏡像(ミラーイメージ)”である。
列8は、列5と同様オーバーラップ及びギャップ領域内のPCR321のフレームシフトが極めて多数の不活性なものを供することを示す。
列9において、ベクターオーバーラップ内のフレームシフトを有するフラグメントPCR385は、極めて多数の不活性なものを引きおこす。
列10は、列7及び4と比較してかなり多数の不活性なものを供する。それは列11で増加されない。
列12は、ベクター上の2のフレームシフトが列7のものと比較して、より少い数の活性なものを供することを示す。
ギャップベクターへの3の部分的にオーバーラップするフラグメントの組換えも表16で見られるように極めて有効である。ベクターのみを有する最後の列は極めて少いコロニーを供する。図4から見ることができるように、用いた全てのフラグメントはwtである。表16の最初の列において、ベクターとフラグメントとの間にかなり長いオーバーラップがあるが、まん中の列においてはPCR353と355との間のオーバーラップはわずか10bpであり、それはなお極めて有効な組換えである!この驚くべき結果は、かなり離れて関連した遺伝子の極めて容易なドメインシャッフリングのために利用され得る。例えば、10の異なる遺伝子からの3の異なるドメインがPCRフラグメントとして作られ、プライマーデザインにより10〜20bpオーバーラップを有するようにデザインされ、そして一緒に組換えられ得、そして次に最も優れた組合わせ(1000の可能性ある組合わせ)についてスクリーニングされ得る。
配列表
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:20塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:1:
(2)配列番号:2の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:2:
(2)配列番号:3の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:3:
(2)配列番号:4の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:4:
(2)配列番号:5の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:60塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:5:
(2)配列番号:6の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:21塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:6:
(2)配列番号:7の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:19塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:7:
(2)配列番号:8の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:18塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:8:
(2)配列番号:9の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:64塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:他の核酸
(xi)配列の記載:配列番号:9:
(2)配列番号:10の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:876塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)分子の型:他の核酸
(vi)起源:
(B)株名:Humicola lanuginosa
(xi)配列の記載:配列番号:10:
(2)配列番号:11の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:292アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号:11:
(2)配列番号:12の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:876塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:環状
(ii)分子の型:他の核酸
(vi)起源:
(B)株名:Humicola lanuginosa
(xi)配列の記載:配列番号:12:
(2)配列番号:13の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:292アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号:13:
(2)配列番号:14の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:864塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:DNA(ゲノム)
(vi)起源:
(B)株名:Pseudomonas sp.
(xi)配列の記載:配列番号:14:
(2)配列番号:15の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:288アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号:15:
Claims (25)
- 生体内(in vivo)組換えにより相同なDNA配列の異なるヌクレオチド配列をシャッフリングすることによりポリペプチド変異体を調製するための方法であって、
a)ポリペプチドをコードするDNA配列を含む少なくとも1の環状プラスミドを形成するステップと、
b)該環状プラスミドを、前記ポリペプチドをコードするDNA配列内で開環するステップと、
c)少なくとも1の前記環状プラスミド上のポリペプチドコード化領域の少なくとも一部分に相同なDNA配列を含む少なくとも1のDNAフラグメントを調製するステップと、
d)前記ポリペプチドをコードする全長のDNA配列又はその一部をカバーする前記相同なDNAフラグメントの少なくとも1つと一緒に、前記開環したプラスミドの少なくとも1つを、組換え宿主細胞に導入するステップと、
e)該組換え宿主細胞を培養するステップと、
f)陽性ポリペプチド変異体についてスクリーニングするステップと、
を含み、
2又はそれ超の開環したプラスミドが、同じシャッフリングサイクル内で1又はそれ超の相同なDNAフラグメントと一緒にシャッフリングされることを特徴とする方法。 - ステップa)〜f)の1超のサイクルが行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記開環したプラスミドがギャップを有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記開環したプラスミドと相同なDNAフラグメントとの間の比率が、1pM〜10MのDNAである特定の濃度において20:1〜1:50(ベクターのmol:フラグメントのmol)の範囲である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 2又はそれ超の前記DNAフラグメントが部分的にオーバーラップする領域を有する、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記DNAフラグメントのオーバーラップする領域が10bp〜5000bpの範囲にある、請求項5に記載の方法。
- ステップa)〜f)の少なくとも1のサイクルが、最初に用いたDNAフラグメントで戻し交配(backcrossing)する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記プラスミドが、前記ポリペプチドをコードするDNA配列の中央周辺の領域で開環される、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記プラスミドが前記ポリペプチドをコードするDNA配列中の突然変異近くで開環される、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記ステップc)において調製されたDNAフラグメントが、高、中又は低変異誘発に適した条件下で調製される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 入力DNA配列から生産可能なポリペプチドが、酵素又は生物活性を有するタンパク質である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ及びフィターゼを含む群から選択される酵素である、請求項11に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、インスリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、キモシン、副甲状腺ホルモン、色素性(pigmentary)ホルモン、ソマトメジン、エリトロポイエチン、黄体形成ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、レラキシン、インターフェロン、トロンボポイエチン(TPO)及びプロラクチンを含む群から選択される生物活性を有するタンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 最初に用いられる入力DNA配列の少なくとも1つが、糸状菌由来の野生型DNA配列である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記入力DNA配列の少なくとも1つが、ヒュミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体をコードするベクター(a)〜(f)及び/又はDNAフラグメント(g)〜(aa)の群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 最初に用いられる入力DNA配列の少なくとも1つが、アブシジア、リゾプス、エメリセラ、アスペルギルス、ペニシリウム、ユーロペニシリウム、パエシロマイセス、タラロマイセス、サーモアスクス又はスクレロクレイスタ属由来の野生型DNA配列である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 最初に用いられる入力DNA配列の少なくとも1つが、バクテリア、ストレプトマイセス又はクロモバクテリウム由来の野生型DNA配列である、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 最初に用いられる入力DNA配列の少なくとも1つが、イースト由来の変異DNA配列である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記相同な入力DNA配列が、少なくとも60%までの相同性である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記組換え宿主細胞が、真核細胞である、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記真菌細胞が、サッカロマイセスの種、スキゾサッカロマイセスの種、クルイベロマイセスの種、ハンセヌラの種又はピキアの種の群からのイースト細胞、あるいはアスペルギルスの種、ニューロスポーラの種、フサリウムの種又はトリコダーマの種の群からの糸状菌である、請求項20に記載の方法。
- 前記ポリペプチドをコードするプラスミドDNA配列が複製配列に作用可能に結合されている、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリペプチドをコードするプラスミドDNA配列が機能的プロモーター配列に作用可能に結合されている、請求項22に記載の方法。
- 前記プラスミドが発現プラスミドである、請求項23に記載の方法。
- 前記発現プラスミドがpJSO26又はpJSO37である、請求項24に記載の方法。
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