BRPI0905122A2

BRPI0905122A2 - processo de produção de lipases por meio de modificação genética de levedura

Info

Publication number: BRPI0905122A2
Application number: BRPI0905122-8A
Authority: BR
Inventors: Castro Alyne Machado De; Bevilaqua Juliana Vaz; Freire Denise Maria Guimaraes; Torres Fernando Araripe Goncalves; Santa Anna Lidia Maria Melo; Estrada Gutarra Melissa Limoeiro; Barbosa Caroline Alexandre; Almeida Rodrigo Volcan; De Menezes Reginaldo Ramos; Cunha Aline Gomes
Original assignee: Petroleo Brasileiro Sa
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-08-09
Also published as: US20110183400A1

Abstract

<B>PROCESSO DE PRODUçãO DE LIPASES POR MEIO DE MODIFICAçãO GENéTICA DE LEVEDURA <D>A presente invenção trata de um processo para a construção de genes sintéticos a partir de genes de expressão de lipase, sua inserção em um vetor comercial e subsequente inserção no genoma da levedura Píchia pastoris. A obtenção de tais enzimas tem por objetivo viabilizar uma rota enzimática para produção de biodiesel.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DEMODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um processo para a construção degenes sintéticos e sua inserção no genoma da levedura Pichia pastoris,passando essa a produzir Iipases em elevados níveis de expressão e comalta produtividade. A invenção consiste na manipulação genética dalevedura Pichia pastoris, de forma que adquira a capacidade de produçãode lipases, utilizando processo de fermentação submersa.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Lipases (triglicerol ester hidrolases - EC 3.1.1.3 ) são enzimas quecatalisam a quebra de gorduras e óleos, liberando ácidos graxos,diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. São eficientes em váriasreações, como por exemplo, esterificação, transesterificação einteresterificação em meio de solventes orgânicos. São encontradas emvários tecidos animais, vegetais e em microrganismos, tendo papelfundamental no metabolismo de lipídios desses seres vivos. Embora aIipase pancreática tenha sido a mais estudada, lipases de origemmicrobiana têm despertado maior interesse industrial, visto que permitemprodução em larga escala.

Enzimas em sua forma nativa, enzimas livres, vêm sendo usadasatravés dos séculos na indústria de alimentos, e mais recentemente, nasindústrias farmacêuticas . e químicas. Modernas metodologias deengenharia genética possibilitaram a produção em larga escala dessasenzimas, assim como a modificação de sua estrutura primária, visandoalteração de algumas de suas características físico-químicas e biológicas.A manipulação via modificação do DNA, permite a preparação de enzimasespecialmente dirigidas para uma determinada finalidade.

Atualmente, as lipases respondem por cerca de 5% do mercadomundial de enzimas; entretanto, existe uma forte tendência de crescimentopor conta do seu vasto campo de aplicação. Estas enzimas apresentamuma grande versatilidade de propriedades, tais como termoestabilidade,resistência a solventes orgânicos, especificidade, regioseletividade eestereoseletividade, razão pela qual sua participação no mercado mundialde enzimas industriais vem crescendo significativamente.

TÉCNICA RELACIONADA

A função biológica das Iipases é primordialmente a de catalisarreações de hidrólise para liberar ácidos graxos e glicerol. Entretanto, emcondições em que a água é restrita no meio, a maioria das Iipases é capazde exercer sua atividade catalítica em reações de alcoólise etransesterificação, de grande interesse para a indústria do petróleo, taiscomo para a produção de biolubrificantes e biodiesel.

A técnica de manipulação genética tem sido largamente empregadapara desenvolver sistemas enzimáticos dos mais variados tipos. Odocumento de patente WO 03068926, citado como referência, descrevedetalhadamente o processo de manipulação genética para obtenção decélulas recombinantes e hospedeiras.

A levedura P. pastoris tem se revelado como um dos maispoderosos sistemas de expressão eucarióticos graças a característicascomo: expressão em altas densidades celulares, secreção de proteínasheterólogas e processo fermentativo de produção bem conhecido (Daly eHea, 2005). Além disso, este hospedeiro vem sendo utilizado com sucessopara a produção heteróloga de Iipases como pode ser comprovado pelaextensa literatura disponível (Rotticci-Mulder et al. Protein Expression andPurification. 21 (3), 386, 2001; Minning et al. Journal of Biotechnology. 66(2-3), 147, 1998; Jiang et al. BMC Biotechnology. 8, 4, 2008).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata de um processo para a construção degenes sintéticos a partir de genes de expressão de lipase, sua inserçãoem um vetor comercial e subsequente inserção no genoma da leveduraPichia pastoris. A obtenção de tais enzimas tem por objetivo viabilizar umarota enzimática para produção de biodiesel.

Foram construídos três genes sintéticos com base nos genes quecodificam para as Iipases de Candida antarctica, Thermomyceslanuginosus e Pseudomonas cepacia. Esses genes apresentam seqüênciainédita, e foram utilizados para a construção de vetores de expressão, queforam inseridos no genoma da levedura. Com base em ensaios descreening, o clone mais promissor da levedura recombinante foiselecionado para produção de Iipase por fermentação submersa embiorreator instrumentado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta uma representação esquemática daconstrução do vetor para manipulação genética de Pichia pastoris.

A Figura 2 apresenta o gráfico de produção de Iipases por P.pastoris recombinante utilizando glicerina bruta de soja como fonte decarbono.

A Figura 3 apresenta o gráfico de produção de Iipases por P.pastoris recombinante utilizando glicerina bruta de mamona como fonte decarbono.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para que a invenção possa ser mais bem compreendida e avaliada,a descrição detalhada do método empregado para a construção genéticaserá descrito tomando-se como referência o mapa ilustrado na Figura 1.

Deve ficar claro que o exemplo a seguir não é Iimitativo da invenção epossui caráter meramente ilustrativo.

Como mostrado esquematicamente na Figura 1, o gene sintético(LipB)1 que codifica para a Iipase de C. antartica, foi clonado no vetorpPGKA3 para expressão constitutiva em Pichia pastoris gerando o vetorpPGKA3-LIPB. Este vetor foi ainda modificado pela substituição dopeptídeo-sinal original por uma variante reconstruída com códonsotimizados para Pichia. O vetor resultante foi denominadopPGKΔ3_PRO_LIPB.

Células de P. pastoris (cepa X-33) transformadas com este vetorforam conservadas em glicerol (25%) e congeladas em freezer a -80°C ou em nitrogênio líquido.

Para o preparo do pré-inóculo, uma única colônia crescida em placacom meio de cultura sólido YPD1 largamente conhecido e empregadopelos especialistas na matéria, foi transferida para 10 mL de YPD. O meiofoi incubado em agitador rotatório a 30°C com agitação de 250 rpm por 16 horas. Foi realizado um inóculo de 1% - 5%, a partir do pré-inóculo, em200 mL de meio YPD em Erlenmeyer haletado de 1 L. O meio foi incubadoem agitador rotatório a 30°C com agitação de 250 rpm por 12 - 24 h. Apóso devido tempo, foi medida a densidade ótica do inóculo, e o meiofermentado foi centrifugado a 5.000 rpm por 5 minutos utilizando um volume de cultura suficiente para inocular 1,5 L de meio YPD obtendo-seuma densidade ótica inicial entre 1 e 3, no biorreator.

Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as célulasnovamente suspensas em meio estéril contendo entre 1% e 8% (v/v) deglicose, glicerol puro ou glicerina residual da produção de biodiesel como substrato, e inoculadas no biorreator. A fermentação foi conduzida a 30°Csob agitação de 300 rpm - 800 rpm. O pH da fermentação foi mantido em6,0.

Os genes foram inseridos com sucesso na levedura, de forma queessa passou a excretar atividades da ordem de 12910 U/L de Iipases ousuperior.

Comparado à produção convencional das enzimas por fungosfilamentosos nativos, não recombinantes, o tempo de processo foisignificativamente mais curto.

A Tabela 1 compara os resultados de produtividade de enzima, obtida com P. pastoris modificada com o gene sintético de C. antarctica dapresente invenção, e a produtividade obtida por organismo nativo(,Penicillium simplicissimum), conforme processo de fermentação em meiosólido descrito no pedido brasileiro Pl 0703290-0, de propriedade dadepositante.

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Um outro aspecto examinado durante os ensaios está relacionadoao emprego da glicerina como substrato. Nos experimentos foi utilizadaglicerina obtida a partir de diferentes fontes, como por exemplo, soja,mamona, pinhão manso, girassol, macaúba e óleo de fritura.

A levedura obtida por modificação genética foi capaz de crescer eproduzir Iipases a níveis expressivos, utilizando-se glicerina loira (glicerinabruta) residual da produção de biodiesel. Os resultados obtidos estãomostrados nos gráficos das Figuras 2 e 3.

A Tabela 2 abaixo apresenta o resultado comparativo do rendimento(Yp/S) em produto, lípase, com base na concentração de substratoadicionada. Os valores comprovam que as fontes provenientes deprocessos de produção de biodiesel foram metabolizadas com eficiênciasuperior ao substrato puro.

TABELA 2

<table>table see original document page 6</column></row><table>A descrição que se fez até aqui do processo de produção deIipases por meio da construção de genes sintéticos e sua inserção nogenoma da levedura Pichia pastoris, objeto da presente invenção, deveser considerada apenas como uma possível ou possíveis concretizações,e quaisquer características particulares nelas introduzidas devem serentendidas como ilustrativa, visando apenas facilitar a compreensão.Desta forma, não podem de forma alguma ser consideradas comoIimitantes da invenção, a qual está limitada ao escopo das reivindicaçõesque seguem.

Claims

1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DEMODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA, caracterizado porcompreender a construção de genes sintéticos a partir de genes deexpressão de Iipase e sua inserção no genoma da levedura Pichiapastoris, de modo que esta passe a produzir Iipases em elevados níveisde expressão e com alta produtividade.

2. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DEMODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por os genes sintéticos seremconstruídos com base nos genes que codificam para as Iipases deCandida Antarctica, Thermomyces Ianuginosus e Pseudomonascepacia.

3. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DEMODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por os genes sintéticos inseridos nalevedura P. pastoris passarem a excretar atividades da ordem de 12910U/L de lipases.

4. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por empregar como substrato glicerinaobtida a partir de diferentes fontes, que podem ser selecionadas entresoja, mamona, pinhão manso, girassol, macaúba, óleo de fritura.

5. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DEMODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por empregar como substrato glicerinaresidual da produção de biodiesel.

6. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DEMODIFICAÇÃO GENÉTICA DE LEVEDURA, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por a fermentação ser conduzida a 30°Csob agitação de 400 rpm e pH da fermentação mantido em 6,0.