BRPI1006650A2 - Ácidos desoxiribonucléicos sintéticos otimizados para produção de lipases, plasmídeos e leveduras recombinantes e processo de produção de lipases por meio de levedura geneticamente modificada - Google Patents

Abstract

Ácidos desoxiribonucléicos sintéticos otimizados para produção de lipases, plasmídeos e leveduras recombinantes e processo de produção de lipases por meio de levedura geneticamente modificada. A presente invenção trata de um processo para a construção de genes sintéticos a partir de genes de expressão de lipase, sua inserção em um vetor comercial e subsequente inserção no genoma da levedura pichia pastoris. A obtenção de tais enzimas tem por objetivo viabilizar uma rota enzimática para produção de biodiesel.

Description

ÁCIDOS DESOXIRIBONUCLÉICOS SINTÉTICOS OTIMIZADOS PARA PRODUÇÃO DE LIPASES, PLASMÍDEOS E LEVEDURAS RECOMBINANTES E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES POR MEIO DE LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção trata de um processo para a construção de genes sintéticos e sua inserção no genoma da levedura Pichia pastoris, passando essa a produzir lipases em elevados níveis de expressão e com alta produtividade. A invenção consiste na manipulação genética da levedura Pichia pastoris, de forma que adquira a capacidade de produção de lipases, utilizando processo de fermentação submersa.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Lipases (triglicerol ester hidrolases - EC 3.1.1.3 ) são enzimas que catalisam a quebra de gorduras e óleos, liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. São eficientes em várias reações, como por exemplo, esterificação, transesterificação e interesterificação em meio de solventes orgânicos. São encontradas em vários tecidos animais, vegetais e em microrganismos, tendo papel fundamental no metabolismo de lipídios desses seres vivos. Embora a lipase pancreática tenha sido a mais estudada, lipases de origem microbiana têm despertado maior interesse industrial, visto que permitem produção em larga escala.

Enzimas em sua forma nativa, enzimas livres, vêm sendo usadas através dos séculos na indústria de alimentos, e mais recentemente, nas indústrias farmacêuticas e químicas. Modernas metodologias de engenharia genética possibilitaram a produção em larga escala dessas enzimas, assim como a modificação de sua estrutura primária, visando alteração de algumas de suas características físico-químicas e biológicas. A manipulação via modificação do DNA, permite a preparação de enzimas especialmente dirigidas para uma determinada finalidade.

Atualmente, as lipases respondem por cerca de 5% do mercado mundial de enzimas; entretanto, existe uma forte tendência de crescimento por conta do seu vasto campo de aplicação. Estas enzimas apresentam uma grande versatilidade de propriedades, tais como termoestabilidade, resistência a solventes orgânicos, especificidade, regioseletividade e estereoseletividade, razão pela qual sua participação no mercado mundial de enzimas industriais vem crescendo significativamente.

TÉCNICA RELACIONADA A função biológica das lipases é primordialmente a de catalisar reações de hidrólise para liberar ácidos graxos e glicerol. Entretanto, em condições em que a água é restrita no meio, a maioria das lipases é capaz de exercer sua atividade catalítica em reações de alcoólise e transesterificação, de grande interesse para a indústria do petróleo, tais como para a produção de biolubrificantes e biodiesel. A técnica de manipulação genética tem sido largamente empregada para desenvolver sistemas enzimáticos dos mais variados tipos. O documento de patente WO 03068926, citado como referência, descreve detalhadamente o processo de manipulação genética para obtenção de células recombinantes e hospedeiras. A levedura P. pastoris tem se revelado como um dos mais poderosos sistemas de expressão eucarióticos graças a características como: expressão em altas densidades celulares, secreção de proteínas heterólogas e processo fermentativo de produção bem conhecido (Daly e Hea, 2005). Além disso, este hospedeiro vem sendo utilizado com sucesso para a produção heteróloga de lipases como pode ser comprovado pela extensa literatura disponível (Rotticci-Mulder et al. Protein Expression and Purification. 21 (3), 386, 2001; Minning et al. Journal of Biotechnology. 66 (2-3), 147, 1998; Jiang et al. BMC Biotechnology. 8, 4, 2008).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção trata de um processo para a construção de genes sintéticos a partir de genes de expressão de lipase, sua inserção em um vetor comercial e subsequente inserção no genoma da levedura Pichia pastoris. A obtenção de tais enzimas tem por objetivo viabilizar uma rota enzimática para produção de biodiesel.

Foram construídos três genes sintéticos com base nos genes que codificam para as lipases de Candida antarctica, Thermomyces lanuginosus e Pseudomonas cepacia. Esses genes apresentam sequência inédita, e foram utilizados para a construção de vetores de expressão, que foram inseridos no genoma da levedura. Com base em ensaios de screening, o clone mais promissor da levedura recombinante foi selecionado para produção de lipase por fermentação submersa em biorreator instrumentado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 representa a digestão do vetor pBSKLIPB com as enzimas de restrição Xho\ e Not\. M- Marcador AEcoRI/Hindlll, 1-pBSKLIPB intacto, 2- pBSK LIPB digerido com as enzimas Xho\ e Not\. A seta indica o fragmento de -980 pb correspondente ao gene LIPB. A Figura 2 representa o mapa físico do vetor pPIC9. Extraído do manual Pichia Expression kit (Invitrogen). A Figura 3 representa o mapa físico do vetor pPICJJPB. A Figura 4 representa a análise de restrição de 3 clones de Escherichia coli transformados com o vetor pPIC__LIPB. M1- Marcador AEcoRI/Hindlll, M2- Marcador ABstEII. i-Vetor intacto; d-Vetor digerido com as enzimas de restrição Xho\ e Not\. As setas indicam fragmento do gene LIPB (0,98 kb) e fragmento do vetor pPIC9 (8 kb). A Figura 5 representa o mapa físico do vetor pPGKA3_LIPB. A Figura 6 representa a análise de restrição de seis clones de Escherichia coli transformados com o vetor pPGKA3_LIPB. M - Marcador AEcoRI/Hindlll. i- intacto; d- digerido. As setas indicam fragmentos correspondentes ao gene LIPB (0,98 kb) e ao vetor pPGKA3 (2,9 kb). A Figura 7 representa o mapa físico do vetor pPGKA3_PRO_LIPB. A Figura 8 representa a análise de restrição de 6 clones de Escherichia coli transformados com o vetor pPGKA3_PRO_LIPB. M-Marcador AEcoRI/Hindlll; i-Vetor intacto; d-Vetor digerido com as enzimas de restrição Xho\ e Not\. As setas indicam fragmentos correspondentes ao gene LIPB (0,98 Kb) e ao vetor pPGKA3_PRO (3,4 Kb). A Figura 9 representa o ensaio enzimático em placa para os clones de P. pastoris transformados com os vetores de expressão constitutiva pPGKA3_PRO_LIPB e pPGKA3_LIPB foram incubados em placas contendo tributirina por 20 ou 40 horas. As setas indicam as posições dos controles negativos. A Figura 10 representa o ensaio enzimático em placa para seleção de clones produtores de lipase com vetor de expressão induzida. As setas indicam os controles negativos. A Figura 11 representa a análise em SDS-PAGE 12% dos sobrenadantes de culturas de Pichia transformadas com o vetor pPGKA3_PROJJPB. Clone pPZa - controle negativo. A seta indica a Banda provável referente à lipase CALB. M- marcador de fermentas (Unstained Protein Molecular Weight Marker). A Figura 12 representa a análise em SDS-PAGE 12% dos sobrenadantes de culturas de Pichia transformadas com o vetor pPGKA3_LIPB. Clone pPZa - controle negativo. A seta indica a Banda provável referente à lipase CALB. M- marcador de fermentas (Unstained Protein Molecular Weight Marker). A Figura 13 apresenta o gráfico de produção de lipases por P. pastoris recombinante utilizando glicerina bruta de soja como fonte de carbono. A Figura 14 apresenta o gráfico de produção de lipases por P. pastoris recombinante utilizando glicerina bruta de mamona como fonte de carbono.

A Figura 15 apresenta o gráfico de produção de lipases por P. pastoris recombinante utilizando glicerol puro como fonte de carbono. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Para que a invenção possa ser mais bem compreendida e avaliada, a descrição detalhada do método empregado para a construção genética será descrito. Deve ficar claro que os exemplos a seguir não são limitativos da invenção e possuem caráter meramente ilustrativo.

Exemplo 1 - Síntese do gene LipB. O gene da lipase B (CALB) C. antarctica, descrito por Uppenberg et al. (1994), codifica para uma proteína de 317 resíduos de aminoácidos com massa molecular de 33273 Daltons. A lipase CalB é feita na forma de uma pré-proteína que é processada proteolíticamente no retículo endoplasmático para a remoção do peptídeo sinal e região “pró” antes de ser secretada. Neste exemplo não restritivo apenas a versão que codifica a versão madura da enzima será sintetizada quimicamente já que serão usados os sinais de secreção próprios de P. pastoris para otimizar a expressão do gene.

Antes da síntese do gene que codifica a lipase B de C. antartica uma otimização da seqüência foi efetuada. Nesta otimização foram levados em consideração os seguintes critérios: 1) códons preferenciais dos genes mais expressos em P. pastoris, 2) conteúdo de G+C em torno de 50%, 3) eliminação de possíveis estruturas secundárias e sítios de splicing crípticos, 4) eliminação de sítios de restrição indesejados, 5) adição de sítios de restrição nas extremidades do gene sintético para facilitar a clonagem em vetor de expressão de P. pastoris. 6) introdução de um His6 tag no C-terminal da proteína para facilitar a purificação em colunas de afinidade Ni-NTA.A seqüência protéica primária da versão madura da lipase CalB assim como o seu gene codificador está descrito em üppenberg et al. (1994). A seqüência, após todos processos de otimização, proposta do gene LipB é ilustrado na SEQ ID NO: 1. A seqüência otimizada SEQ ID NO: 1, cuja tradução conceptual está representada na SEQ ID NO: 2, apresentou os seguintes parâmetros: Conteúdo de G+C: 45,4% Codon usaae: Phe UOU 0 0.00 Ser UCU 31 6.00 Tyr UAU 0 0.00 Cys UGU 6 2.00 UUC 10 2.00 UCC 0 0.00 UAC 9 2.00 UGC 0 0.00 Leu UUA 0 0.00 OCA 0 0.00 TER UAA 1 3.00 TER UGA 0 0.00 UUG 31 6.00 OCG 0 0.00 UAG 0 0.00 Trp UGG 5 1.00 CUU 0 0.00 Pro CCU 0 0.00 His CAÜ 1 2.00 Arg CGü 0 0.00 CUC 0 0.00 CCC 0 0.00 CAC 0 0.00 CGC 0 0.00 COA 0 0.00 CCA 30 4.00 Gin CAA 18 2.00 CGA 0 0.00 CUG 0 0.00 CCG 0 0.00 CAG 0 0.00 CGG 0 0.00 Ile AUU 1 0.27 Thr ACÜ 27 4.00 Asn AAU 0 0.00 Ser AGÜ 0 0.00 AUC 10 2.73 ACC 0 0.00 AAC 14 2.00 AGC 0 0.00 AUA 0 0.00 ACA 0 0.00 Lys AAA 0 0.00 Arg AGA 8 6.00 Met AUG 4 1.00 ACG 0 0.00 AAG 9 2.00 AGG 0 0.00 Vai GUU 23 4.00 Ala GCU 36 4.00 Asp GAU 0 0.00 Gly GGU 26 4.00 GUC 0 0.00 GCC 0 0.00 GAC 14 2.00 GGC 0 0.00 GÜA 0 0.00 GCA 0 0.00 Glu GAA 0 0.00 GGA 0 0.00 GUG 0 0.00 GCG 0 0.00 GAG 4 2.00 GGG 0 0.00 O alinhamento do gene CALB (selvagem) x LipB (otimizado) usando o sofware CLUSTAL 2.0.1 Multiple Sequence Alignment mostrou que cerca de 8% dos nucleotídeos foram modificados na versão otimizada: CALB CTACCTTCCGGTTCGGACCCTGCCTTTTCGCAGCCCAAGTCGGTGCTCGATGCGGGTCTG 60 LipB TTGCCATCTGGTTCTGACCCAGCTTTCTCTCAACCAAAGTCTGTTTTGGACGCTGGTTTG 60 * * * * * ***** ***** ** ** ** ** ** ***** ** * ** ** *** ** CALB ACCTGCCAGGGTGCTTCGCCATCCTCGGTCTCCAAACCCATCCTTCTCGTCCCCGGAACC 120 LipB ACTTGTCAAGGTGCTTCTCCATCTTCTGTTTCTAAGCCAATCTTGTTGGTTCCAGGTACT 120 ** ** ** ******** ***** ** ** ** ** ** *** * * ** ** ** ** CALB GGCACCACAGGTCCACAGTCGTTCGACTCGAACTGGATTCCCCTCTCAACGCAGTTGGGT 180 LipB GGTACTACTGGTCCACAATCTTTCGACTCTAACTGGATCCCATTGTCTACTCAATTGGGT 180 ** ** ** ******** ** ******** ******** ** * ** ** ** ****** CALB TACACACCCTGCTGGATCTCACCCCCGCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACG 240 LipB TACACTCCATGTTGGATCTCTCCACCACCATTCATGTTGAACGACACTCAAGTTAACACT 240 ***** ** ** ******** ** ** ** ****** * ******** ** ** ***** CALB GAGTACATGGTCAACGCCATCACCGCGCTCTACGCTGGTTCGGGCAACAACAAGCTTCCC 300 LipB GAGTACATGGTTAACGCTATCACTGCTTTGTACGCTGGTTCTGGTAACAACAAGTTGCCA 300 *********** ***** ***** ** * *********** ** ********* * ** CALB GTGCTTACCTGGTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTCTTCCCCAGT 360 LipB GTTTTGACTTGGTCTCAAGGTGGTTTGGTTGCTCAATGGGGTTTGACTTTCTTCCCATCT 360 AA A AA AAAAA AA A Ar A A -A- * A A A A A A A Ar Ar A- A Ar Ar A Ar A A A A AAAAAAAA A CALB ATCAGGTCCAAGGTCGATCGACTTATGGCCTTTGCGCCCGACTACAAGGGCACCGTCCTC 420 LipB ATCAGATCTAAGGTTGACAGATTGATGGCTTTCGCTCCAGACTACAAGGGTACTGTTTTG 420 -Ar ★ * -Ar ★ Ar Ar + Ar Ar A- A- Ar A A A A AAAAA A A -Ar·* A A AAAAAAAAAAA A A A A A CALB GCCGGCCCTCTCGATGCACTCGCGGTTAGTGCACCCTCCGTATGGCAGCAAACCACCGGT 480 LipB GCTGGTCCATTGGACGCTTTGGCTGTTTCTGCTCCATCTGTTTGGCAACAAACTACTGGT 480 A A A A A A A A A k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k CALB TCGGCACTCACCACCGCACTCCGAAACGCAGGTGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACCACC 540 LipB TCTGCTTTGACTACTGCTTTGAGAAACGCTGGTGGTTTGACTCAAATCGTTCCAACTACT 540 kk kk k kk kk kk k kkkkkkk kkkkkk kkkk kk kkkkk kk kk kk CALB AACCTCTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCAGCCTCAGGTGTCCAACTCGCCACTCGAC 600 LipB AACTTGTACTCTGCTACTGACGAGATCGTTCAACCACAAGTTTCTAACTCTCCATTGGAC 600 kkk k kkkkk kk kk kkkkkkkkkkkkkk kk kk kk kk kkkkk kkk k kkk CALB TCATCCTACCTCTTCAACGGAAAGAACGTCCAGGCACAGGCCGTGTGTGGGCCGCTGTTC 660 LipB TCTTCTTACTTGTTCAACGGTAAGAACGTTCAAGCTCAAGCTGTTTGTGGTCCATTGTTC 660 -*· *· ·*· A kkk k kkkkkkkk kkkkkkkk kk kk kk kk kk kkkkk kk kkkkk CALB GTCATCGACCATGCAGGCTCGCTCACCTCGCAGTTCTCCTACGTCGTCGGTCGATCCGCC 720 LipB GTTATCGACCATGCTGGTTCTTTGACTTCTCAATTCTCTTACGTTGTTGGTAGATCTGCT 720 AA AAAAAAAAAAA A* AA A A* AA AA ***** ***** AA A A A AAAA AA CALB CTGCGCTCCACCACGGGCCAGGCTCGTAGTGCAGACTATGGCATTACGGACTGCAACCCT 780 LipB TTGAGATCTACTACTGGTCAAGCTAGATCTGCTGACTACGGTATCACTGACTGTAACCCA 780 k k k k k kk k k kk k k kkk k kkk kkkkk k k k k k k kkkkk kkkkk CALB CTTCCCGCCAATGATCTGACTCCCGAGCAAAAGGTCGCCGCGGCTGCGCTCCTGGCGCCG 840 LipB TTGCCAGCTAACGACTTGACTCCAGAGCAAAAGGTTGCTGCTGCTGCTTTGTTGGCTCCA 840 * k k k k k k k k kkkkkkk kkk kkkkkkkk kk k k kkkkk k kkkk k k CALB GCAGCTGCAGCCATCGTGGCGGGTCCAAAGCAGAACTGCGAGCCCGACCTCATGCCCTAC 900 LipB GCTGCTGCTGCTATCGTTGCTGGTCCAAAGCAAAACTGTGAGCCAGACTTGATGCCATAC 900 kk kkkkk kk kkkkk kk kkkkkkkkkkk kkkkk kkkkk kkk k kkkkk kkk CALB GCCCGCCCCTTTGCAGTAGGCAAAAGGACCTGCTCCGGCATCGTCACCCCC 951 LipB GCTAGACCATTCGCTGTTGGTAAGAGAACTTGTTCTGGTATCGTTACTCCA 951 kk k kk kk kk kk kk kk kk kk kk kk kk kkkkk kk kk Além das otimizações descritas acima para a clonagem em vetores de expressão de P. pastoris, serão adicionadas as seguintes sequências. 1) na porção 5' do gene, e em fase com o gene LipB, uma sequência correspondente ao sítio de KEX2 e STE13 de Saccharomyces cerevisiae e um síito para XhoV, 2) na porção 3' será adicionado o códon de terminação TAA e um sítio de restrição para a enzima Not\.

Apartir destas modificações obteve-se a SEQ ID NO: 3 cuja respectiva tradução conceptual está representada na SEQ ID NO: 4.

Após todo este processo de otimização a síntese do gene, chamado de LipB, foi realizada pela empresa Epoch Biolabs (EUA).

Exemplo 2 - Construção de vetores para expressão do gene LipB em Pichia pastoris. O gene LipB (versão do gene CALB de Candida antartica — SEQ ID NO: 3) sintetizado quimicamente pela empresa Epoch Biolabs (EUA) foi clonado pela empresa no vetor pBluescript II SK resultando no vetor pBSKLIPB. Este vetor foi usado para transformar Escherichia coli XL10-Gold termo-competente para amplificação e manutenção do mesmo. Para a subclonagem do gene LipB em vetor de expressão de Pichia, foi realizada a divagem do vetor com as enzimas de restrição Xho\ e Not\ e o produto da digestão foi aplicado em gel de agarose 0,8%. O fragmento correspondente ao gene LipB (~1000 pb) (Figura 1) foi eluído do gel utilizando-se o kit QIAquick Gel Extraction, conforme as especificações do fabricante. O gene LipB purificado do gel foi então clonado no vetor de expressão induzida pPIC9 (Figura 2) digerido com as mesmas enzimas de restrição (.Xho\ e Notl). O vetor resultante foi chamado pPICJJPB (Figura 3), representato pela SEQ ID NO: 5, foi digerido com as enzimas Xhol e Notl confirmando a clonagem (Figura 4). Também foi realizada a clonagem do gene LipB no vetor de expressão constitutiva pPGKA3 digerido com as enzimas de restrição Xho\-Not\ e o vetor resultante foi denominado pPGKA3_LIPB (Figura 5), representado pela SEQ ID NO: 6, o qual foi confirmado pela restrição com as mesmas enzimas (Figura 6). Uma terceira construção foi realizada que é uma variante do vetor pPGKA3 na qual o peptídeo-sinal foi reconstruído com códons otimizados para Pichia e o vetor resultante foi denominado pPGKA3_PRO_LIPB (Figura 7), representado pela SEQ ID NO: 7, o qual foi confirmado também com as ezimas Xhol e Notl (Figura 8).

Um clone de cada construção foi selecionado para realização de extração plasmidial em larga escala. Foram utilizados aproximadamente 10 pg de DNA plasmidial de cada construção para transformação em P. pastoris.

Exemplo 3 - Transformação em Pichia pastoris.

Para transformação em P. pastoris, os vetores de expressão constitutiva pPGKA3_PRO_LIPB e pPGKA3_LIPB foram linearizados com a enzima de restrição Sac I, que cliva dentro da sequência do promotor PGK a fim de dirigir a integração ao locus PGK1 do genoma de P. pastoris. O vetor de expressão induzida pPICJJPB foi linearizado com a enzima de restrição Dra I para dirigir a integração para o locus AOX de P. pastoris.

Após a linearização, os vetores concentrados por precipitação foram usados para transformar P. pastoris por eletroporação. Os vetores constitutivos foram usados para transformar a linhagem selvagem X-33 de P. pastoris sendo que as células foram plaqueadas em meio YPDS contendo lOOpg/mL zeocina para seleção de clones transformados. O vetor de expressão induzida foi usado para transformar a linhagem GS115 (mutante auxotrófico his4) para a seleção de clones prototróficos His+ em placas de meio mínimo sem histidina.

Exemplo 4 - Ensaio enzimãtico em placa.

Para avaliar a expressão de lipase, alguns clones resultantes da transformação de P. pastoris foram analisados quanto à atividade em placa. Os clones transformados com vetores de expressão constitutiva foram testados em meio YPD ágar com 1% de tributirina (emulsionada) e seguindo-se incubação a 28°C até o aparecimento de halos de hidrólise. Como controle negativo foi utilizado o vetor pPZa que não contém o gene da lipase (Figura 9). Todos os clones transformantes apresentaram halos correspondentes à atividade lipásica.

Os clones transformados com o vetor de expressão induzida foram transferidos para uma placa contendo meio YPM-ágar (extrato de levedura 1%, peptona 2% e metanol 0,5%, ágar 2%) contendo 1% de tributirina (Figura 10).

Os clones transformantes com os vetores constitutivos que apresentaram maiores halos de hidrólise foram selecionados para crescimento em meio líquido e os transformantes com o vetor induzido com os maiores halos de hidrólise foram selecionados e congelados no freezer - 80°C para posterior análise.

Exemplo 5 - Análise da expressão da lipase em meio líquido.

Para o crescimento em meio líquido uma colônia isolada de cada transformante selecionado foi inoculada em 50 mL de YPD correspondente (D060o inicial de 0,09) em frasco Erlenmeyer de 250 mL. O cultivo foi realizado em frascos agitados a 28°C sob agitação de 200 rpm por até 96 horas. Em intervalos de 24 horas, alíquotas de 1 mL foram retiradas e estocadas em tubos Eppendorff de 1,5 mL. O sobrenadante foi utilizado para análise da proteína secretada em gel de poliacrilamida. Um mililitro do sobrenadante das culturas foi precipitado com 250 pL de TCA 10% e o pellet ressuspendido em 20 pL do tampão de amostra 2X. Como controle negativo foi utilizado o clone pPZa (Figura 11).

Foi observada uma banda protéica de ~37 kDa que refere-se a lipase, pois a mesma banda está ausente no controle negativo. O tamanho predito para a lipase CALB é de 33 kDa. Foi observado que o clone pPGKA3_PRO__LIPB, que possui um peptídeo sinal otimizado com códons preferenciais para P. pastoris, apresentou uma expressão de CALB maior que o clone pPGKA3_LIPB como observado na Figura 12.

Os resultados mostram que o gene LipB correspondente à lipase CALB de Candida antartica foi expresso com grande sucesso de forma constitutiva e induzida em P. pastoris.

Exemplo 6 - Produção da lipase em biorreator.

Para o preparo do pré-inóculo, uma única colônia crescida em placa com meio de cultura sólido YPD, largamente conhecido e empregado pelos especialistas na matéria, foi transferida para 10 ml_ de YPD. O meio foi incubado em agitador rotatório a 30°C com agitação de 250 rpm por 16 horas. Foi realizado um inóculo de 1% - 5%, a partir do pré-inóculo, em 200 mL de meio YPD em Erlenmeyer haletado de 1 L. O meio foi incubado em agitador rotatório a 30°C com agitação de 250 rpm por 12 horas - 24 horas. Após o devido tempo, foi medida a densidade ótica do inóculo, e o meio fermentado foi centrifugado a 5.000 rpm por 5 minutos utilizando um volume de cultura suficiente para inocular 1,5 L de meio YPD obtendo-se uma densidade ótica inicial entre 1 e 3, no biorreator.

Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as células novamente suspensas em meio estéril contendo entre 1% e 8% (v/v) de glicose, glicerol puro ou glicerina residual da produção de biodiesel como substrato, e inoculadas no biorreator. A fermentação foi conduzida a 30°C sob agitação de 300 rpm - 800 rpm. O pH da fermentação foi mantido em 6,0.

Os genes foram inseridos com sucesso na levedura, de forma que essa passou a excretar atividades da ordem de 12910 U/L de lipases ou superior, em termos de sua capacidade de hidrolisar tributirina em meio emulsionado e da ordem de 334 U/L de lipases ou superior, em termos de sua capacidade de hidrolisar o substrato sintético p-nitrofenil palmitato.

Comparado à produção convencional das enzimas por fungos filamentosos nativos, não recombinantes, o tempo de processo foi significativamente mais curto. A Tabela 1 compara os resultados de produtividade de enzima, obtida com P. pastoris modificada com o gene sintético de C. antarctica da presente invenção, e a produtividade obtida por organismo nativo (Penicillium simplicissimum), conforme processo de fermentação em meio sólido descrito no pedido brasileiro PI 0703290-0, de propriedade da depositante.

Exemplo 7 - Produção da lipase em biorreator utilizando fontes alternativas de carbono.

Um outro aspecto examinado durante os ensaios está relacionado ao emprego da glicerina como substrato. Nos experimentos foi utilizada glicerina obtida a partir de diferentes fontes, como por exemplo, soja, mamona, pinhão manso, girassol, macaúba e óleo de fritura. A levedura obtida por modificação genética foi capaz de crescer e produzir lipases a níveis expressivos, utilizando-se glicerina loira (glicerina bruta) residual da produção de biodiesel. Os resultados obtidos estão mostrados nos gráficos das Figuras 13 e 14. A Tabela 2 abaixo apresenta o resultado comparativo do rendimento (Yp/s) ern produto, lipase, com base na concentração de substrato adicionada. Os valores comprovam que as fontes provenientes de processos de produção de biodiesel foram metabolizadas com eficiência superior ao substrato puro. A descrição que se fez até aqui do processo de produção de lipases por meio da construção de genes sintéticos e sua inserção no genoma da levedura Pichia pastoris, objeto da presente invenção, deve ser considerada apenas como uma possível ou possíveis concretizações, e quaisquer características particulares nelas introduzidas devem ser entendidas como ilustrativa, visando apenas facilitar a compreensão. Desta forma, não podem de forma alguma ser consideradas como limitantes da invenção, a qual está limitada ao escopo das reivindicações que seguem.

Claims (1)

1. Claims missing in original document.