ES2379776T3 - Genes y proteínas de oxidasa de alcohol graso de Cándida Tropicalis y métodos relacionados con los mismos - Google Patents

Abstract

Una oxidasa de alcohol graso o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior al 90% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

Description

Genes y proteínas de oxidasa de alcohol graso de Candida tropicalis y métodos relacionados con los mismos

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

La presente invención reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos con Serial No. 60/374.021, presentada el 19 de abril de 2002, la cual se incorpora aquí como referencia.

Antecedentes de la invención

Diferentes cepas modificadas por ingeniería genética de Candida tropicalis han sido utilizadas en fermentaciones para la bioconversión del ácido graso de 18 carbonos como ácido oleico en ácido dicarboxílico de 18 carbonos. Cuando se cultiva sobre ácidos grasos, C. tropicalis de tipo silvestre convierte ácidos grasos de cadena larga en acetil CoA por medio de un proceso conocido como oxidación en �, que es el catabolismo secuencial de fragmentos de 2 carbonos de longitud de un ácido graso en acetil CoA. La oxidación en � es por lo tanto llamada así debido a que se presenta el ataque oxidativo inicial en el segundo átomo de carbono del grupo carboxílico. C. tropicalis puede catabolizar también ácidos grasos a través de una ruta de oxidación en w en la cual únicamente el carbono del metilo terminal es oxidado hasta un ácido carboxílico, produciendo un ácido dicarboxílico. En la oxidación en w, el ácido graso es convertido en ácido dicarboxílico a lo largo de una ruta de tres etapas comenzando con la oxidación del grupo metilo terminal hasta un alcohol. Esta etapa es catalizada por el complejo hidroxilasa que contiene tanto las proteínas citocromo P450 monooxigenasa (CYP) como la citocromo P450 reductasa (NCP). El alcohol es luego convertido en un aldehído por medio de la alcohol graso oxidasa (FAO) luego en el ácido dicarboxílico por medio de una aldehído deshidrogenasa. El producto deseado es el ácido dicarboxílico de cadena larga. Una oxidasa de alcohol graso se diferencia de una alcohol oxidasa en su especificidad por una cadena larga. Las alcohol oxidasas son en general específicas para metanol pero algunas veces pueden oxidar alcoholes hasta de C4. Las oxidasas de alcohol graso generalmente no oxidan alcoholes con longitudes de cadena menores de ocho.

En la Candida tropicalis de tipo silvestre, la oxidación en � consume ácidos grasos mucho más rápido de lo que la ruta de la oxidación en w puede oxidarlos. Sin embargo, por medio de la inactivación de los genes POX 4 y POX 5, cuyos productos génicos son responsables por la iniciación de la oxidación en �, tales cepas modificadas por medio de ingeniería genética de C. tropicalis preferencialmente desvían los ácido grasos dentro de la ruta de la oxidación en w. La cepa base utilizada para el desarrollo de diversas cepas amplificadas por el gen es H5343, que es la cepa 20336 de C. tropicalis (American Type Culture Collection) tanto con los genes POX 4 como POX 5 inactivados por medio de inactivación por inserción. La cepa primaria utilizada en fermentaciones de producción a gran escala es HDC23-3, que se deriva de H5343, pero también tiene al gen CYP52A2 (una citocromo P450 monooxigenasa) amplificado. El complejo de hidroxilasa es responsable por catalizar la primera etapa en la oxidación en w, que es considerada la etapa limitante de la velocidad. La amplificación de los genes CYP52A2 y NCP ayuda a superar esta limitación de la velocidad, pero luego el siguiente cuello de botella vuelve la conversión del alcohol en el aldehído por medio de la enzima FAO. Durante las fermentaciones con HDC23-3, se ha descubierto que una pequeña cantidad (aproximadamente 0,5% p/p en el caldo) del ácido graso w-hidroxi (HFA) se acumula durante la fermentación. Este producto de oxidación parcial interfiere con las etapas de purificación posteriores y provoca rendimientos totales menores. Existe por lo tanto la necesidad adicional, de reductor el cuello de botella en la conversión del alcohol en un aldehído durante la segunda etapa de la ruta de oxidación en w.

Un pequeño número oxidasas de alcohol graso ha sido descrito en la literatura científica en diversas levaduras, ejemplos de las cuales son Candida tropicalis (1,2,3,4), Candida maltosa (5,6), Candida cloacae (4), Torulopsis candida (7), Candida (Torulopis) bombicola (8), y Candida (Torulopsis) apicola (9). La FAO fue purificada a partir de la levadura cultivada en hexadecano, T candida (7) y descrita como un tetrámero (pm 290 kD) con un peso molecular por subunidad de 75 ID. Tiene un pH óptimo de 7,6 y oxida alcoholes superiores con una cadena carbonada de C4 a C16. C. bombicola (8) cultivada en hexadecano tiene aparentemente dos diferentes actividades como alcohol oxidasa, una con una especificidad óptima de longitud de cadena de 10 para n-alcoholes y otra con una especificidad óptima de longitud de cadena de 14. La FAO de C. maltosa (6) cataliza la oxidación de 1-alcanoles (C4 a C22) con la actividad más alta utilizando 1-octanol. También oxida 2-alcanoles (C8 a C16). Se encontró que los a,w-alcanodioles, el ácido w-hidroxipalmítico, los fenilalcanoles y los alcoholes terpénicos, todos eran sustratos para la FAO, pero con muy bajas tasas de oxidación. La oxidación de 2-alcanoles es estereoselectiva únicamente para los R(-) enantiómeros.

La FAO de C. tropicalis (ATCC 20336) cultivada sobre hexadecano fue descrita primero por Kemp et al. en 1988 (1). Se encontró que oxida 1-alcanoles de C4 a C18, pero tiene una actividad máxima con dodecanol. Se encontró que oxida 16-hidroxipahnitato pero no 12-hidroxilaurato. La FAO fue posteriormente purificada (3) y se demostró que era un dímero (pm = 145 kD) con un peso molecular por subunidad de 68 - 72 kD. La enzima purificada mostró especificidad similar por el sustrato como se describió anteriormente, pero demostró actividad adicional con 12hidroxilaurato y 2-dodecanol. Se encontró que la enzima era una flavoproteína sensible a la luz, pero la identidad de

la flavina no se conocía (10).

Recientemente se clonaron dos genes FAO de C. cloacae y un gen FAO de C. tropicalis y se determinaron las secuencias de ADN (4, 12). Las identidades del marco de lectura abierto (ORF) y 74,8% y 76,2% similitudes de la secuencia de aminoácidos con la FAO1 y FAO2 de C. cloacae, respectivamente. El gen FAO1 pero no el gen FAO2 ha sido exitosamente clonado y expresado en Escherichia coli.

WO 99/47685 divulga secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene actividad de FAO, constructos de supresión de ácido nucleico, células mutantes que suprimen FAO, y usos de los mismos.

La presente invención proporciona genes FAO de C. tropicalis y composiciones y métodos que emplean los genes FAO. Las composiciones y los métodos son útiles para incrementar la actividad de la FAO durante la segunda etapa de oxidación en omega de ácido grasos y en última instancia en un incremento en productividad de diácido.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un mapa de restricción de FAO1jf que es la región de codificación del gen para FAO1 ligado dentro del vector de expresión pJF118EH.

La Figura 2 es un mapa de restricción de FAO2jf que s la región de codificación del gen para FAO2 ligado dentro del vector de expresión pJF118EH.

La Figura 3 describe gráficamente la actividad típica de la alcohol oxidasa en fermentaciones a escala de laboratorio con ácido oleico como sustrato.

La Figura 4 describe gráficamente la actividad de FAO1, FAO2a, y FAO2a’ sobre 1-alcanoles.

La Figura 5 describe gráficamente la actividad de FAO 1, FAO2a y FAO2a’ sobre 2-alcanoles.

La Figura 6 describe gráficamente la actividad de FAO1, FAO2, y FAO2a’ sobre otros alcanoles.

La Figura 7 describe gráficamente una comparación de productividad en fermentaciones con cepas amplificadas por la FAO o una cepa base, H5343.

La Figura 8 describe gráficamente una comparación de la concentración del ácido graso T-hidroxi en fermentaciones con la cepa amplificada por la FAO, HDC40-7, o la cepa base, H5343.

La Figura 9 describe gráficamente una comparación de la actividad de la alcohol oxidasa entre la cepa amplificada por FAO1, HDC40-7, y la cepa base, H5343.

La Figura 10 describe gráficamente una comparación de la concentración del ácido graso T-hidroxi en fermentaciones con la cepa amplificada por la FAO, HDC40-1, HDC40-5, o HDC40-7, utilizando ácido ricinoleico como sustrato.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona una oxidasa de alcohol graso o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos una superior a NO: 2, o superior al 95% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, esta oxidasa de alcohol graso incluye además un péptido firma que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona también una molécula aislada de ácido nucleico que contiene un marco de lectura abierto (ORF) para un gen para la oxidasa de alcohol graso (FAO) de Candida tropicalis en donde el ORF está operativamente enlazado a un promotor que s capaz de afectar la expresión del ORF. Preferiblemente, la FAO incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

Se proporcionan también vectores que contienen las moléculas aisladas de ácido nucleico descritas aquí. Tales vectores incluyen pero no se limitan a vectores plásmidos, fagémidos, fagos, cósmidos, o de ADN lineal. Además, también se proporcionan células huésped las cuales contienen un vector objetivo o una molécula aislada de ácido nucleico. Los ejemplos de células huésped incluyen células bacterianas, células de hongos, células de insecto, células de animales o células de plantas. Los ejemplos de células de hongos incluyen a aquellas de Yarrowia sp.,

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Bebaromyces sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. y Candida sp. Se prefieren especialmente las células huésped de Candida tropicalis.

Descripción detallada de la invención

La productividad del diácido se mejora de acuerdo con la presente invención incrementando selectivamente las enzimas que se sabe que son importantes para la oxidación de sustratos orgánicos tales como ácidos grasos o compuestos alifáticos, por ejemplo alcanos. De acuerdo con la presente invención, se han identificado y caracterizado dos genes para oxidasa de alcohol graso (FAO) de C. tropicalis. Los genes FAO codifican las enzimas oxidasa de alcohol graso, que catalizan la conversión de un alcohol en un aldehído durante la segunda etapa de la ruta de oxidación en w. La amplificación del número de copias del gen FAO y/o la actividad transcripcional en una célula huésped da como resultado una mayor actividad de la alcohol oxidasa, una mayor productividad de diácido, y, cuando se utilizan sustratos de ácido graso, menores niveles de ácido graso w-hidroxi.

La presente invención provee secuencias de nucleótidos de C. tropicalis que codifican dos diferentes oxidasas de alcohol graso, cada una de las cuales tiene una especificidad diferente del sustrato. En una modalidad, se provee una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a la enzima oxidasa de alcohol graso FAO1, que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de tal molécula aislada de ácido nucleico incluye al gen FAO1 que tiene la secuencia de nucleótidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto de la invención, se proveen moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican a la enzima oxidasa de alcohol graso FAO2. De acuerdo con la presente invención, se han identificado y aislado dos alelos que codifican a la enzima FAO2. Los dos alelos, FAO2a y FAO2b, son 95% idénticos por la secuencia de ADN y tienen 98% de similitud por la secuencia de aminoácidos. La enzima FAO2a incluye la secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 4. Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima FAO2a es expuesta en la SEQ ID NO: 3. La enzima FAO2b incluye la secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 6. Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima FAO2b es expuesta en la SEQ ID NO: 5.

Recientemente se ha determinado que ciertos eucariotas, por ejemplo, ciertas levaduras, no se adhieren, en algunos aspectos, al código genético "universal" que establece que codones particulares (tripletes de ácidos nucleicos) codifican para aminoácidos específicos. En realidad, el código genético es "universal" debido a que es virtualmente el mismo en todos los organismos vivientes. Se sabe que ciertos Candida sp. traducen el codón CTG (que, de acuerdo con el código "universal" designa leucina), como serina. Ver, por ejemplo, Ueda et al., Biochemie (1994) 76, 1217 - 1222, donde se demuestra que C. tropicalis, C. cylindracea, C. guilliermodii y C. lusitaniae se adhieren al código "no universal" con respecto al codón CTG. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico pueden codificar para una secuencia de aminoácidos en organismos del código "universal" y una variante de esa secuencia de aminoácidos en organismos de código "no universal" dependiendo de la presencia de codones CTG en la secuencia de codificación de ácido nucleico. La diferencia puede llegar a ser evidente cuando, en el transcurso de la modificación por ingeniería genética, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína es transferida de un organismo de código "no universal" a un organismo de código "universal".

Por lo tanto, la presente invención también provee una secuencia de aminoácidos (expuesta en la SEQ ID NO: 10) para una enzima FAO2a cuando FAO2a es expresada en una especie de Candida por ejemplo C. tropicalis.

La presente invención también provee proteínas FAO. Por ejemplo, se provee una proteína FAO1 que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2 o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos al menos superior al 90% cuando se compara con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO : 2. Como se utiliza aquí, "fragmento enzimáticamente activo" se refiere a una porción de la secuencia de aminoácidos de FAO como la expuesta en la SEQ ID NO: 12 o se provee un fragmento enzimáticamente activo de la misma. Como se utiliza aquí, "fragmento enzimáticamente activo" se refiere a una porción de la enzima FAO que es suficiente para retener actividad enzimática en la conversión de un alcohol en un aldehído.

De acuerdo con la presente invención, las proteínas FAO1 y FAO2 pueden ser preparadas por medio de métodos familiares para aquellos capacitados en el arte tales como por medio de clonación de los genes FAO1 y FAO2 (incluidos los alelos FAO2a y/o FAO2b) en un vector de expresión apropiado seguido por expresión en una célula huésped adecuada. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.331.420, incorporada aquí como referencia como si estuviera expuesta en su totalidad. La enzima relevante o fragmento de la misma, puede ser también generada por medio de amplificación directa de la correspondiente secuencia de codificación a través de PCR, seguido por procedimientos recombinantes estándar y expresión en una célula huésped adecuada. Con respecto a análogos de FAO, derivados, moléculas tipo FAO, porciones o fragmentos enzimáticamente activos de la misma (como se define aquí), se pueden diseñar iniciadores de PCR para permitir amplificación directa de secuencias de codificación para la correspondiente inserción, supresión o sustitución de aminoácidos de las variantes de aminoácidos (como se define aquí). Los iniciadores para uso en PCR pueden ser oligonucleótidos

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sintéticos preparados en un sintetizador automatizado de oligonucleótidos tal como un sintetizador de ADN ABI de Perkin-Elmer Corporation. Además, los oligonucleótidos pueden ser adquiridos a fabricantes comerciales, por ejemplo, a Synthetic Genetics (San Diego, Calif.). Las proteínas FAO1 y FAO2 pueden también ser sintetizadas químicamente utilizando metodologías bien conocidas.

La secuencia apropiada de ADN puede ser insertada en un vector por medio de una variedad de procedimientos que se considera que están dentro del alcance de aquellos capacitados en el arte, que pueden incluir inserción del ADN en un(os) sitio(s) apropiado(s) de endonucleasa de restricción o clonación de la secuencia de ADN en los vectores de expresión utilizando reacción en cadena de la polimerasa de alta fidelidad. Las técnicas estándar para la construcción de tales vectores son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en el arte y pueden encontrarse en referencias tales como Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, o cualquiera entre la gran cantidad de manuales de laboratorio sobre tecnología de ADN recombinante que se encuentran fácilmente disponibles. Una variedad de estrategias se encuentran disponibles para ligar fragmentos de ADN, cuya escogencia dependen de la naturaleza de los terminales de los fragmentos de ADN. El vector puede incluir también secuencias apropiadas para la expresión de la amplificación, o secuencias que facilitan la clonación, expresión o procesamiento.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de células huésped transformadas tales como resistencia a la dihidrofolato reductasa o neomicina para cultivo de células eucariotas, o de resistencia a la tetraciclina o a la ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia apropiada de ADN como se describió aquí anteriormente, así como un promotor apropiado o secuencia de control, puede ser empleado para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la enzima. “Transformación” incluye todas las formas que causan la incorporación de ADN foráneo por una célula huésped. Las células transformadas son luego seleccionadas por aquellas que contienen el ADN deseado y se cultivan los transformantes exitosos bajo condiciones que afecten la expresión de las secuencias de codificación.

Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como E. coli y Streptomyces; células de hongos, tales como levadura; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de animales; adenovirus; células de plantas, etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado se encuentra dentro del alcance de aquellos capacitados en el arte a partir de las enseñanzas expuestas aquí y pueden incluir a la cepa huésped para expresión BL21 o BL21 CodonPlus RIL (Stratagene, La Jolla, CA).

Después de la transformación de la cepa huésped, se induce la enzima por los medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un periodo de tiempo adicional. Si la secuencia que codifica a la FAO está bajo el control de su promotor nativo, se puede utilizar ácido oleico para inducir expresión. Si la FAO está operativamente enlazada a un promotor heterólogo, se pueden utilizar otros inductores. Un método preferido de inducción es a través del uso de IPTG (Isopropil--D-tiogalactopiranosido).

Típicamente se rompen las células por medios físicos o químicos conocidos por aquellos capacitados en el arte, se centrifugan, y se retiene el extracto crudo resultante para purificación adicional.

La purificación de FAO1 o FAO2 o de un fragmento de las mismas se puede llevar a cabo a través de cualquier medio conocido por aquellos capacitados en el arte y puede incluir técnicas cromatográficas, tales como cromatografía de afinidad con etiqueta de histidina y cromatografía de afinidad con níquel. Los kits comercialmente disponibles para esta purificación pueden ser adquiridos a los proveedores (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA; Novagen, CA, EUA). Se puede utilizar luego un inmunoensayo, tal como un ensayo de transferencias tipo Western, para verificar la presencia de la enzima recombinante.

También de acuerdo con la presente invención, se han descubierto tres diferentes secuencias de péptidos firma que son únicas para las proteínas FAO1 y FAO2 de la presente invención. El primer péptido firma tiene la secuencia de aminoácidos: CGFCYLGC (SEQ ID NO: 13). Este primer péptido firma se encuentra tanto en proteínas FAO1 como FAO2 de la presente invención pero no en otras proteínas FAO de levadura previamente caracterizadas. Con referencia a la SEQ ID NO: 2 (proteína FAO1), la SEQ ID NO: 4 (proteína FAO2a), y las posiciones de los aminoácidos 355 a 362 de la SEQ. Un segundo péptido firma tiene la secuencia de aminoácidos IIGSGAGAGVMA (SEQ ID NO: 14). Este segundo péptido firma está presente en las proteínas FOA2a y FAO2b de la presente invención pero no en la proteína FAO1 de la presente invención, ni en las proteínas FAO de levadura, previamente caracterizadas. Con referencia a las SEQ ID Nos: 4 y 6, el segundo péptido firma se localiza en las posiciones de los aminoácidos 198 a 209. Un tercer péptido firma se encuentra en las proteínas FAO2a y FAO2b de la presente invención pero no en otras proteínas FAO de levadura previamente caracterizadas. El tercer péptido firma tiene la secuencia de aminoácidos AGSTLGGG (SEQ ID NO: 19). Con referencia a las SEQ ID Nos: 4 y 6, este tercer péptido firma se localiza en las posiciones de los aminoácidos 262 a 269.

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Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: CGFCYLGC (SEQ ID NO: 13). Estos péptidos son útiles, por ejemplo, en la producción de anticuerpos que se enlazan específicamente con una FAO de levadura que contiene la secuencia de aminoácidos de los péptidos firma. Tales anticuerpos son útiles en inmunoensayos por ejemplo radioinmunoensayos, ensayos por inmunoabsorción

5 ligados a enzimas (ELISA), transferencias tipo Western, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de quimioluminiscencia y ensayos de bioluminiscencia. Estos tipos de ensayos son útiles para monitorear los niveles de enzima FAO en diferentes momentos durante un procedimiento de fermentación y pueden ayudar a resolver problemas que puedan surgir durante la fermentación.

Las secuencias de aminoácidos estructuralmente relacionadas pueden ser sustituidas por las secuencias divulgadas

10 expuestas en las SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 10, 12, 13, 14, ó 19 en la realización de la presente invención. Los derivados por inserción de aminoácidos de las proteínas y péptidos de la presente invención incluyen fusiones en el terminal amino y/o carboxilo así como inserciones dentro de la secuencia de un solo o de múltiples aminoácidos. Las variantes por inserción en la secuencia de aminoácidos son aquellas en las cuales se introducen uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína o péptido FAO objetivo aunque también es posible una

15 inserción al azar con una selección adecuada del producto resultante. Las variantes por supresión se pueden elaborar removiendo uno o más aminoácidos de la secuencia de un péptido objetivo. Las variantes por sustitución de aminoácidos son aquellas en las cuales se ha removido al menos un residuo en la secuencia y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Las sustituciones típicas son aquellas elaboradas de acuerdo con la Tabla 1 siguiente:

Tabla 1

Residuos adecuados para sustituciones de aminoácidos

Residuo Original

Ejemplos de Sustituciones

Ala (A)

Ser

Arg (R)

Lys

Asn (N)

GIn; His

Asp (D)

Glu

Cys (C)

Ser

Gln (Q)

Asn

Glu (E)

Asp

Gly (G)

Pro

His (H)

Asn; Gln

Ile (I)

Leu; Val

Leu (L)

Ile; Val

Lys (K)

Arg; Gln; Glu

Met (M)

Leu; Ile

Phe (F)

Met; Leu; Tyr

Ser (S)

Thr

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(continuación)

Residuos adecuados para sustituciones de aminoácidos

Residuo Original

Ejemplos de Sustituciones

Thr (T)

Ser

Trp (W)

Tyr

Tyr (Y)

Trp; Phe

Val (V)

Ile; Leu

Cuando una proteína o péptido FAO objetivo se obtiene por derivación a partir de sustitución de aminoácidos, los aminoácidos son generalmente remplazados por otros aminoácidos que tienen propiedades tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas y similares. Como se utiliza aquí, los términos “derivado”, “análogo”, “fragmento”, “porción” y “moléculas similares” se refieren a una proteína FAO objetivo que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID No: 2 y que tiene una sustitución, inserción, adición, o supresión de aminoácidos con tal de que dicho derivado, análogo, fragmento, porción, o molécula similar retenga la habilidad para actuar como una oxidasa de alcohol graso, es decir, que retenga la capacidad para convertir un alcohol en un aldehído. Igualmente, los términos “derivado”, “análogo”, “fragmento”, “porción” y “moléculas similares” "pueden referirse también a un péptido firma FAO objetivo que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las SEQ ID Nos: 13, 14, ó 19 y que tiene una sustitución, inserción, adición, o supresión de aminoácidos, con tal de que dicho derivado, análogo, fragmento, porción, o molécula similar de un péptido firma FAO, cuando se incorpora dentro de una proteína FAO mayor, derivado, análogo, fragmento, porción,

o molécula similar, no disminuya la actividad de FAO.

Los péptidos sintéticos de la presente invención pueden ser sintetizados por medio de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden ser preparados utilizando la técnica en fase sólida inicialmente descrita por Merrifield (1963) in J. Am. Chem. Soc. 85:2149 - 2154. Otras técnicas de síntesis de péptidos pueden ser encontradas en M. Bodanszky et al. Peptide Synthesis, John Wiley and Sons, 2d Ed., (1976) y otras referencias fácilmente disponibles para aquellos capacitados en el arte. Un resumen de las técnicas de síntesis de péptidos puede ser encontrado en J. Sturart y J.S. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, III., (1984). Los péptidos también pueden ser sintetizados por medio de métodos en solución como se describe en The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath, H. et al., Eds., pp. 105 - 237, Academic Press, New York, N.Y. (1976). Los grupos de protección apropiados para uso en diferentes síntesis de péptidos están descritos en los textos enlistados anteriormente así como en J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973). Los péptidos de la presente invención pueden ser preparados también por medio de escisión química o enzimática de porciones mayores de una proteína FAO objetivo o a partir de una proteína FAO de longitud completa.

Adicionalmente, las proteínas y péptidos FAO de la presente invención pueden ser preparados también por medio de técnicas de ADN recombinante. Para la mayoría de los aminoácidos utilizados para construir proteínas, más de una tripleta de nucleótidos de codificación (codón) pueden codificar para un residuo aminoácido particular. Esta propiedad del código genético es conocida como redundancia. Por lo tano, una cantidad de secuencias diferentes de nucleótidos pueden codificar para una proteína o péptido FAO particular.

De este modo, otras proteínas FAO o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas, que comparten suficiente identidad de aminoácidos con la FAO1, FAO2a, y FAO2b de la presente invención (SEQ ID Nos: 2, 4, y 6) se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

En una modalidad, una enzima FAO objetivo tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior al 90% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos de FAO1 como la expuesta en la SEQ ID NO: 2. En esta modalidad, es preferible que una enzima FAO objetivo que tiene una identidad de aminoácidos superior al 90% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos de FAO1 como la expuesta en la SEQ ID NO: 2 también incluya el motivo firma GGFCYLGC (SEQ ID NO: 13). En una modalidad más preferida, la enzima FAO tiene una identidad de secuencia superior al 95% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos de FAO1 como la expuesta en la SEQ ID NO: 2. En esta modalidad, es preferible que la enzima FAO objetivo tenga una identidad de aminoácidos superior al 95% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos de FAO1 como la expuesta en la SEQ ID NO: 2 también incluya el motivo firma GGFCYLGC (SEQ ID NO: 13).

La presente invención también provee moléculas de ácido nucleico que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para el motivo firma de una FAO1 y FAO2 objetivo. Por ejemplo, una secuencia de ncleótidos que codifica al motivo firma CGFCYLGC (SEQ ID NO: 13) se presenta como:

TGY GGN TTY TGY TAY YTN GGN TGY (SEQ ID NO: 32) en donde:

R es A o G, Y es C o T, M es A o C, K es G o T, S es G o C, W es A o T, H es A o T o C, B es G o T o C, D es G o A

o T, N es A o G, o C o T.

Además, se presenta una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el motivo firma IIGSGAGAGVMA (SEQ ID NO: 14) de una FAO2 objetivo que tiene la siguiente secuencia:

ATH ATH GGN WSN GGN GCN GGN GCN GGN GTN ATG GCN (SEQ ID NO: 33) en donde:

R es A o G, Y es C o T, M es A o C, K es G o T, S es G o C, W es A o T,H es A o T o C, B es G o T o C, D es G o A

o T, N es A o G, o C o T.

Además, se presenta una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el motivo firma AGSTLGGG (SEQ ID NO: 19) como:

GCN GGN WSN ACN YTN GGN GGN GGN (SEQ ID NO: 34)

en donde R es A o G, Y es C o T, M es A o C, K es G o T, S es G o C, W es A o T, H es A o T o C, B es G o T o C, D es G o A o T, N es A o G, o C o T.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican a los motivos firma FAO1 y FAO2 son útiles para identificar y aislar genes que codifican proteínas FAO de Candida tropicalis.

Los métodos de alineación de nucleótidos y de secuencias de aminoácidos para comparación son bien conocidos en el arte. De este modo, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias cualesquiera se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Las implementaciones de ordenador de estos algoritmos matemáticos pueden ser utilizadas para comparación de las secuencias para determinar la identidad de la secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (de Genetics Computer Group (CGC), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA). FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (de Genetics Computer Group (CGC), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA). Las alineaciones que utilizan estos programas pueden ser llevadas a cabo utilizando los programas predeterminados. El programa CLUSTAL está bien descrito por Higns et al., 1988, Higgins et al., 1989, Corpet et al. 1958, Huang et al. 1992, y Pearson et al., 1994. El programa para realizar los análisis por BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (). Para los propósitos de la presente invención, la comparación de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de FAO1 y FAO2, se realiza preferiblemente utilizando el programa BlastN (versión 1.4.7 o posterior) con sus parámetros predeterminados o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se entiende cualquier programa de comparación de secuencia que, para dos secuencias cualesquiera en cuestión, genere una alineación que tenga correspondencias idénticas de nucleótidos o de residuos aminoácidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se la compara con la correspondiente alineación generada por el programa preferido.

Otra forma de describir moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican una FAO objetivo es en términos de hibridación con las secuencias de codificación (ORF) de los genes FAO1 (SEQ ID NO: 2) y FAO2a y FAO2b objetivo (SEQ ID Nos: 4 y 6, respectivamente). Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se provee una molécula de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones de rigurosidad media y alta con la secuencia de codificación del gen FAO1 objetivo, es decir, los nucleótidos 1941 - 4054 de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y que también codifica al motivo firma CGFCYLGC (SEQ ID NO: 13). Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que hibrida bajo rigurosidad media a alta en donde:

R es A o G, Y es C o T, M es A o C, K es G o T, S es G o C, W es A o T,H es A o T o C, B es G o T o C, D es G o A

o T, N es A o G, o C o T.

Como se utiliza aquí, la hibridación bajo condiciones de rigurosidad media o alta son como se describe en Maniatis et al. 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., en las páginas 387 - 389, y especialmente en el párrafo11 que se incorpora aquí como referencia como si estuviera expuesto en su totalidad. Una rigurosidad baja

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se define como si estuviera en 4-6 S X SSC/ 1% (p/v) SDS a 37 - 45 °C durante 2 - 3 horas. Las condiciones de rigurosidad media se considera aquí que son de 1-4X SSC / 0,5% - 1% (p/v) SDS a una temperatura igual o superios a 45 °C durante 2 - 3 horas. Las condiciones de alta rigurosidad se considera aquí que son de 0,1-1X SSC/0,1% - (% (p/v) SDS a una temperatura igual o superior a 60° C durante 1 - 3 horas. Como se utiliza aquí, el medio para condiciones de alta rigurosidad se refiere a condiciones que son ya sea condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad alta, o condiciones entre rigurosidad media y alta. Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida con el ORF de los genes FAO1 o FAO2 objetivo, hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad.

La presente invención provee además un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a FAO1 que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2. En una modalidad preferida, el vector incluye un gen FAO1 que tiene una secuencia de nucleótidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con la presente invención, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas aquí anteriormente puede ser incorporada dentro de un vector. Además, debe entenderse que un vector puede incluir también un marco de lectura abierto tanto en el gen FAO1 como en FAO2, así como fragmentos de los mismos.

Se provee también una célula huésped que es transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica una FAO1 y/o FAO2a y/o FAO2b objetivo. Por ejemplo, una célula huésped puede ser transfectada o transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID Nos: 2. Preferiblemente, la célula huésped es transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica un gen FAO1 que contiene la secuencia de nucleótidos descrita en la SEQ ID NO: 1. Debe observarse que la presente invención también abarca células huésped transfectadas o transformadas con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas aquí anteriormente.

Dependiendo de la célula huésped transformada con un de FAO2a o FAO2b objetivo, el codón CUG en el ARNm correspondiente a las posiciones de los nucleótidos 2049 - 2051 de las SEQ ID Nos: 3 y 5 será traducido en forma diferente. Por ejemplo, aunque los codones CUG sean traducidos como serina en C. tropicalis otros organismos huésped siguen el código universal y traducen a los codones CUG como leucina. Por lo tanto, con el propósito de garantizar que el codón de ARNm correspondiente a las posiciones de los nucleótidos 2049 - 2051 de la SEQ ID No: 3 y las posiciones de los nucleótidos 1627 - 1629 en la SEQ ID No: 5 en un gen FAO2 objetivo es traducido en serina en una célula huésped diferente a C. tropicalis, las posiciones de los nucleótidos 2049 - 2051 de la SEQ ID No: 3 y las posiciones de los nucleótidos 1627 - 1629 en la SEQ ID No: 5 en un gen FAO2 objetivo es traducida en serina en una célula huésped diferente a C. tropicalis, tal codón debe ser uno que es traducido en serina siguiendo el código universal. Los ejemplos de tales codones incluyen UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, y AGC. Los métodos para alterar la secuencia de ADN (y por lo tanto los codones en la correspondiente secuencia transcrita de ARNm) son bien conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, diversas técnicas de mutagénesis in vitro. Existen diversos kits comercialmente disponibles particularmente adecuados para esta aplicación tal como el kit de mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH). Alternativamente, se puede emplear tecnología de PCR para alterar la secuencia de nucleótidos. Si un gen FAO2 es sintetizado químicamente, se puede sintetizar la secuencia de nucleótidos correspondiente a las posiciones 2049 - 2051 de las SEQ ID Nos: 3 y 5 como ADN que transcribe un codón que puede ser traducido en serina de acuerdo con el código universal, por ejemplo, incorporando una secuencia de ADN correspondiente a aquellos codones enlistados anteriormente.

En una modalidad preferida de la invención, una molécula aislada de ácido nucleico que codifica FAO1 es manipulada de tal manera que el promotor del gen nativo FAO1 es removido y se enlaza operativamente un promotor de otro gen con la secuencia que codifica al gen FAO1. En forma similar, se manipula preferiblemente una molécula aislada de ácido nucleico que codifica FAO2 de tal manera que se remueve el promotor del gen nativo FAO2 y se enlaza operativamente un promotor de otro gen con la secuencia que codifica al gen FAO2. El término "operativamente enlazado" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico de tal manera que la función de una es afectada por la otra. Un promotor está operativamente enlazado con un marco de lectura abierto de un gen, cuando es capaz de afectar la expresión del marco de lectura abierto (ORF) (es decir, el ORF está bajo el control transcripcional del promotor). A pesar de la presencia de otras secuencias entre el promotor y el ORF, debe entenderse que un promotor puede aún estar operativamente enlazado con el ORF.

Los promotores deseables para sustitución dentro de un gen FAO1 o FAO2 incluyen a los promotores que pueden ser inducidos en diferentes momentos durante la bioconversión en respuesta a ciertos estímulos (por ejemplo, estrés, sustrato, muerte celular) conduciendo por lo tanto a una mayor producción de aldehído y a una mayor producción de ácido dicarboxílico en momentos definidos durante el bioproceso. Los ejemplos de promotores adecuados para enlazar operativamente con los marcos de lectura abiertos de FAO1 o FAO2 incluyen por ejemplo, CYP52A2A, CYP52A5A, y CYP52AlA (ver la patente de los Estados Unidos No. 6.331.420, cuya divulgación se incorpora aquí como referencia como si estuviera expuesta completamente). Con respecto al uso del promotor CYP52A2A, ver también la solicitud de patente en trámite junto con la presente de Serial No. 09/911.781, cuya divulgación se incorpora aquí como referencia como si estuviera expuesta completamente. El gen CYP52A2A de C.

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tropicalis 20336 es un gen de una familia de genes involucrados en el metabolismo del ácido oleico para producir ácido oleico dicarboxílico. El nivel de inducción transcripcional de este gen en una fermentación de ácido oleico está muchas veces (>25) por encima de otros miembros de la misma familia. El ejemplo 6 describe aquí la elaboración de fusiones entre el promotor del gen CYP52A2A y el ORF de los genes FAO1 y FAO2. Los promotores de los genes para oxidación en � de Candida tales como POX 4 o POX 5 pueden estar también operativamente enlazados con un marco ORF de un gen FAO1 o FAO2. Preferiblemente, se utiliza un promotor del gen CYP52A2A para dirigir la expresión de un gen FAO1 o FAO2.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos para un marco de lectura abierto (ORF) de un gen que codifica una FAO que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, en donde el ORF está operativamente enlazado con un. Preferiblemente, una secuencia de nucleótidos para un ORF que codifica una FAO operativamente enlazada con un promotor heterólogo incluye ya sea los nucleótidos 1521 - 3635 de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o los nucleótidos 1099 3213 de la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. Como se utiliza aquí, el término "promotor heterólogo" significa que incluye a un promotor diferente del promotor nativo asociado con una secuencia que codifica una FAO particular . Estas secuencias de nucleótidos pueden ser descritas por lo tanto también como genes quiméricos.

En otro aspecto de la invención, se provee un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen FAO1 o FAO2 operativamente enlazado con una secuencia del promotor heterólogo. El término “vector de expresión” es utilizado aquí ampliamente y se pretende que abarque cualquier medio que incluya una molécula de ácido nucleico y que puede ser utilizada para transformar una célula objetivo. Los vectores de expresión abarcan por lo tanto todos los ejemplos de vectores enlistados aquí incluidos los vectores de integración. Los ejemplos de vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, vectores plásmidos, fagémidos, fago, cósmidos, cromosomas artificiales de levadura o de ADN lineal. Los ejemplos de plásmidos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, plásmidos episomales de levadura o plásmidos de replicación de levadura.

Además, para amplificar los genes FAO para mejorar la productividad de diácido y disminuir la formación de ácido graso T-hidroxi, se pueden utilizar los genes FAO para crear construcciones desactivadas para romper los genes FAO nativos en Candida tropicalis. Los métodos para elaborar construcciones desactivadas y utilizar las mismas para romper los genes son bien conocidos en el arte. La ruptura de genes FAO nativos en C. tropicalis bloquea la ruta del diácido en esa etapa y permite la construcción de , compuestos T-dihidroxi cuando se utilizan sustratos de alcano y ácidos grasos T-hidroxi cuando se utilizan sustratos de ácido graso.

La producción de un aldehído a partir de un alcohol durante la segunda etapa de la ruta de oxidación en w de ácidos grasos se puede incrementar por: (a) aislamiento de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de codificación para un gen FAO2; (b) aislamiento de una secuencia del promotor de un gen que transcribe a una velocidad más alta que el gen FAO2, (c) enlazamiento operativo de la secuencia del promotor con el marco de lectura abierto (ORF) del gen FAO2 para crear un gen de fusión; (d) inserción del gen de fusión dentro de un vector de expresión; (e) transformación de una célula huésped con el vector de expresión y (f) cultivo de la célula huésped transformada en un medio que contiene un sustrato orgánico que puede ser biooxidado a un ácido mono o policarboxílico. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico FAO2 codifica una proteína FAO2 que contiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las SEQ ID Nos: 4 ó 6.

La producción de una cetona a partir de un alcohol durante la segunda etapa de la ruta de oxidación en w de ácidos grasos se puede incrementar por: (a) aislamiento de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de codificación para un gen FAO2; (b) aislamiento de una secuencia del promotor de un gen que transcribe a una velocidad más alta que el gen FAO2, (c) enlazamiento operativo de la secuencia del promotor con el marco de lectura abierto (ORF) del gen FAO2 para crear un gen de fusión; (d) inserción del gen de fusión dentro de un vector de expresión; (e) transformación de una célula huésped con el vector de expresión y (f) cultivo de la célula huésped transformada en un medio que contiene un sustrato orgánico que puede ser biooxidado a un ácido mono o policarboxílico. Preferiblemente, el sustrato orgánico es un 2-alcanol. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína FAO2 que contiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las SEQ ID Nos: 4 ó

6.

La producción de ácido dicarboxílico se puede incrementar por: (a) aislamiento de una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de codificación para un gen FAO2; (b) aislamiento de una secuencia del promotor de un gen que transcribe a una velocidad más alta que el gen FAO2, (c) enlazamiento operativo de la secuencia del promotor con el marco de lectura abierto (ORF) del gen FAO2 para crear un gen de fusión; (d) inserción del gen de fusión dentro de un vector de expresión; (e) transformación de una célula huésped con el vector de expresión y (f) cultivo de la célula huésped transformada en un medio que contiene un sustrato orgánico que puede ser biooxidado a un ácido mono o policarboxílico. Preferiblemente, el ORF del gen FAO2 incluye los nucleótidos 1521 - 3635 de una secuencia de nucleótidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 3 o los nucleótidos 1099 - 3213 de una secuencia de nucleótidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 5.

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Se entiende que, en cualquiera de los métodos divulgados aquí, FAO1 y FAO2 pueden ser producidas separadamente en una célula huésped. Alternativamente, tanto FAO1 como FAO2 pueden ser producidas en la misma célula huésped. De este modo, por ejemplo, se puede transformar una célula huésped con: un vector de expresión que contiene un gen FAO1 o un fragmento del mismo, un vector de expresión que contiene un gen FAO2a

o un fragmento del mismo, un vector de expresión que contiene un gen FAO2b o un fragmento del mismo, un vector de expresión que contiene tanto un FAO1 y/o un vector de expresión que contiene un gen FAO1 o un fragmento del mismo, un vector de expresión que contiene un gen FAO2a o un fragmento del mismo, un vector de expresión que contiene un gen FAO2b o un fragmento del mismo, un vector de expresión que contiene tanto un FAO1 y/o y un gen FAO2a o un fragmento del mismo y/o un gen FAO2b o un fragmento(s) del mismo, o cualquier combinación de tales vectores.

Debe entenderse que las células huésped dentro de las cuales se han introducido una o más copias de los genes FAO1 y/o FAO2 deseados (incluyendo genes quiméricos FAO que contienen un gen FAO1 o FAO2 operativamente enlazados con un promotor heterólogo) pueden ser elaboradas para incluir tales genes por medio de cualquier técnica conocida por aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, las células huésped adecuadas incluyen procariotas tales como Bacillus sp., Pseudomous sp., Actinomycetes sp., Eschericia sp., Mycobacterium sp., y eucariotas tales como levaduras, algas, células de insectos, células de plantas y hongos filamentosos. Las células huésped adecuadas son preferiblemente células de levadura tales como Yarrowia, Bebaromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, y Pichia y más preferiblemente aquellas del género Candida. Las especies preferidas de Candida son tropicalis, maltosa, apicola, paratropicalis, albicans, cloacae, guillermondii, intermedia, lipolytica, parapsilosis y zeylenoides. Los huéspedes particularmente preferidos incluyen cepas de C. tropicalis que han sido genéticamente modificadas de tal manera que uno o más de los genes cromosómicos POX4A, POX4B y ambos genes POXS han sido rotos como se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.254.466 y 5.620.878, cada una incorporada aquí como referencia como si estuvieras expuestas en su totalidad. Tal ruptura bloquea la ruta de oxidación en �. Los ejemplos de cepas bloqueadas para oxidación en� de C. tropicalis incluyen H41, H41B, His1, H45, H43, H53, H534, H534B, H435 y H5343 (ATCC 20962) como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.254.466 mencionada anteriormente.

Vectores tales como plásmidos, fagémidos, fagos o cósmidos pueden ser utilizados para transformar o para transfectar células huésped adecuadas. Las células huésped pueden también ser transformadas por medio de la introducción dentro de una célula de un(os) vector(es) lineal(es) de ADN que contienen la secuencia del gen deseado. Tal ADN lineal puede ser conveniente cuando se desea evitar la introducción de un ADN no nativo (foráneo) dentro de la célula. Por ejemplo, el ADN que consiste de un gen(es) objetivo deseado(s) flanqueado(s) por secuencias de ADN que son nativas para la célula puede ser introducido en la célula por medio de electroporación, transformación con acetato de litio, esferoplastia y similares. Las secuencias de flanqueo de ADN pueden incluir marcadores seleccionables y/o otras herramientas para ingeniería genética.

Un sustrato orgánico adecuado para uso en los métodos descritos aquí puede ser cualquier compuesto orgánico que pueda ser biooxidado hasta un ácido mono o policarboxílico (o cualquier compuesto que pueda ser biooxidado hasta un grupo cetona por los métodos descritos aquí dirigidos a la producción de una cetona). Tal compuesto puede ser cualquier compuesto alifático saturado o insaturado o cualquier compuesto aromático carboxcíclico o heterocíclico que tenga al menos un grupo terminal metilo, un grupo terminal carboxilo y/o un grupo terminal funcional que pueda ser oxidado hasta un grupo carboxilo por medio de biooxidación. Un grupo terminal funcional que es un derivado de un grupo carboxilo puede estar presente en la molécula sustrato y puede ser convertido en un grupo carboxilo por medio de una reacción diferente a la biooxidación. Por ejemplo, si el grupo terminal es un éster que no es de C. tropicalis de tipo silvestre ni las modificaciones genéticas descritas aquí permitirá la hidrólisis de la función éster hasta un grupo carboxilo, entonces se puede añadir una lipasa durante la etapa de fermentación para liberar ácidos grasos libres. Los sustratos orgánicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, alcanos, alquenos, alquinos y combinaciones de los mismos.

Los alcanos son un tipo útil aquí de sustrato orgánico saturado. Los alcanos pueden ser de cadena recta o ramificada, lineal o cíclica, sustituidos o no sustituidos. Los alcanos particularmente preferidos son aquellos que tienen aproximadamente desde 4 hasta aproximadamente 25 átomos de carbono, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, butano, hexano, octano, nonano, dodecano, tridecano, tetradecano, octadecano y similares.

Los ejemplos de sustratos orgánicos no saturados que pueden ser utilizados aquí incluyen, pero no se limitan a, olefinas internas tales como 2-penteno, 2-hexeno, 3-hexeno, 9-octadeceno y similares; olefinas alfa tales como 1dodeceno, 1-octadeceno, 1-tetradeceno, y similares; ácidos carboxílicos no saturados tales como ácido 2-hexenóico y ésteres del mismo, ácido oleico y ésteres del mismo incluyendo trigliceril ésteres que tienen un contenido relativamente alto de ácido oleico, ácido erúcico y ésteres de los mismos incluyendo trigliceril ésteres que tienen un contenido relativamente alto de ácido erúcico, ácido ricinoleico y ésteres del mismo incluyendo trigliceril ésteres que tienen un contenido relativamente alto de ácido ricinoleico, ácido linoleico y ésteres del mismo incluyendo trigliceril ésteres que tienen un contenido relativamente alto de ácido linoleico; alcoholes insaturados tales como 3-hexen-1-ol, 9-octadecen-1-ol, alcoholes saturados tales como 2-decanol, 2-undecanol, 2-dodecanol, 2-hexadecanol, 10

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undecen-1-ol; 1,2-octanodiol; 1,10-decanodiol; 1,2-dodecanodiol; 1,16-hexadecanodiol; ácido 10-hidroxidecanoico; ácido 12-hidroxidodecanoico; ácido 16-hidroxidodecanoico y similares; aldehídos no saturados tales como 3-hexen1-al, 9-octadecen-1-al y similares. Además de lo anterior, un sustrato orgánico que puede ser utilizado aquí incluye compuestos alicíclicos que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo terminal etilo, y/o un grupo terminal funcional que puede ser oxidado hasta un grupo carboxilo por medio de biooxidación.

El sustrato orgánico puede contener también otros grupos funcionales que pueden ser biooxidados hasta grupos carboxilo tales como un grupo aldehído o un grupo alcohol. El sustrato orgánico puede contener también otros grupos funcionales que no puedan ser biooxidados hasta grupos carboxilo y no interfieran con la biooxidación tales como halógenos, éteres, y similares.

Los ejemplos de ácidos grasos saturados que pueden ser aplicados a las células que incorporan los presentes genes FAO1 y FAO2 incluyen a los ácidos caproico, enántico, caprílico, pelargónico, cáprico, undecílico, láurico, mirístico, pentadecanoico, palmítico, margárico, esteárico, araquídico, behénico y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de ácidos grasos insaturados que pueden ser aplicados a células que incorporan los presentes genes FAO1 y FAO2 incluyen ácidos palmitoleico, oleico, erúcico, linoleico, linolénico y combinaciones de los mismos. Se pueden aplicar alcanos y fracciones de alcanos que incluyen enlaces de cadena de C12 hasta C24 en cualquier combinación. Un ejemplo de una mezcla preferida de ácidos grasos es el ácido graso de girasol con alto contenido de ácido oleico (HOSFFA por sus siglas en inglés). HOSFFA es una mezcla de ácidos grasos que contiene aproximadamente 80% de ácido oleico y se encuentra comercialmente disponible de Cognis Corporation como Edenor®. Emersol® es otro HOSFFA comercialmente disponible de Cognis Corporation.

La invención es ilustrada adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos específicos que no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención.

EJEMPLO 1

Materiales y Métodos

Transformación de C. tropicalis utilizando acetato de litio

Se utilizó el siguiente protocolo para transformar C. tropicalis de acuerdo con los procedimientos descritos en Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 5, 13.7.1 (1989) Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, and Kevin Struhl, eds., John Wiley and Sons, Hoboken, NJ. Se inocularon 5 ml de YEPD con C. tropicalis H5343 ura- y se incubó durante la noche sobre un agitador New Brunswick a 30 °C y 170 rpm. Al día siguiente, se utilizó el cultivo de la noche anterior para inocular 50 ml de YEPD a una OD600 de 0,2 y se continuó el cultivo a 30 °C, 170 rpm. Se recolectaron las células a una OD600 de 1,0. Se transfirió el cultivo a un tubo de polipropileno de 50 ml y se centrifugó a 1000 X g durante 10 min. Se resuspendió el precipitado de células en 10 ml de TE estéril (Tris-Cl 10 mM y EDTA 1 mM, pH 8,0). Se centrifugaron nuevamente las células a 1000 X g durante 10 min y se resuspendió el precipitado celular en 10 ml de una solución estéril de acetato de litio (LiAc (acetato de litio 0,1 M, Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Después de centrifugación a 1000 X g durante 10 min., se resuspendió el precipitado en 0,5 ml de LiAc. Se incubó esta solución durante 1 h a 30°C mientras se agitaba suavemente a 50 rpm. Se incubó una alícuota de 0,1 ml de esta suspensión con 15 - 20 μg de ADN de transformación a 30°C sin agitación durante 30 min. Se añadió e incubó una solución de 0,7 ml de PEG (40 % en peso/vol. de polietilén glicol 3340, acetato de litio 0,1 M, Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) a 30°C durante 45 min. Se colocaron luego los tubos a 42°C durante 10 min. Se sembró en placa una alícuota de 0,2 ml sobre medio completo sintético menos uracilo (SC - uracilo) (Kaiser et al. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA, 1994). Se monitoreó el crecimiento de los transformantes durante 5 días. Después de tres días, se recolectaron varios transformantes y se los transfirió a placas de SC-uracilo para la preparación y selección del ADN genómico.

Fermentaciones

Las fermentaciones fueron realizadas utilizando ácido graso de girasol con alto contenido de ácido oleico (HOSFFA como el sustrato, utilizando glucosa como el co-sustrato). El HOSFFA utilizado era aproximadamente 85% de ácido oleico (84,45% de ácido oleico, 5,24% de ácido linoleico, 4,73% de ácido esteárico y 3,87% de ácido palmítico, 1,71% de otros ácidos grasos). El procedimiento de fermentación tenía tanto una fase de crecimiento como una de bioconversión. Se cultivaron las células sobre glucosa a 35 °C hasta una absorbancia a 600 nm de 50 a 60. Cuando se completó la fase de crecimiento de acuerdo a lo determinado por medio de un fuerte aumento en oxígeno disuelto, las células fueron inmediatamente pasadas a la fase de bioconversión, la cual fue realizada a una temperatura de 30 °C. Se utilizó una alimentación lenta de glucosa (0,87 g/L/h desde 0 hasta 42 h y 0,7 g/L/h después de eso) para suministrar energía. Al mismo tiempo se añadió una pequeña carga de HOSFFA (0,55% v/v) a la fermentación. Se continuó la alimentación de sustrato (velocidad promedio de alimentación de 1,6 g/L/h) durante el resto de la fermentación. H5343 es la cepa base derivada de Candida tropicalis (ATCC 20336) bloqueada para

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oxidación en �, que ha tenido los genes POX4 y POX5 rotos por medio de mutagénesis de inserción. La cepa HDC23-3 es una cepa base de H5343 que es amplificada por un gen para la citocromo P450 monooxigenasa, CYP52A2, y el gen para la citocromo P450 reductasa (NCP), habiendo sido clonados ambos genes a partir de C. tropicalis ATCC 20336.

Perfil de actividad de FAO durante fermentaciones con HOSFFA

Lavado de células

Se prepararon y ensayaron células HDC23-3 a partir de diferentes procedimientos de fermentación, y tomadas en diferentes momentos durante los procesos de fermentación, por la actividad de FAO. Debido a los altos niveles de diácido sólido en el caldo, particularmente en muestras tomadas después en la fermentación, las muestras tuvieron que ser lavadas extensivamente para remover el diácido antes de elaborar los extractos. Ya que se encontró que las muestras congeladas pierden una cantidad de actividad enzimática (después del lavado y preparación de los extractos), se colocó caldo fresco de fermentación sobre hielo hasta que estuviera listo para lavado. Se mezcló perfectamente esta muestra y se removió una muestra de 20 ml. Se centrifugó esta muestra (centrífuga refrigerada Sorvall RT6000B) aproximadamente a 1.500 x g (rotor H1000B a 2500 rpm) durante 5 minutos para precipitar las células. Se decantó el sobrenadante, y se resuspendieron las células en 40 ml de amortiguador HEPES 50 mM, pH 7,6. Se centrifugó la muestra a 1.500 x g únicamente durante un minuto, que precipitó las células de levadura, pero permitió que el producto diácido menos denso “flotara” en el sobrenadante. Se decantó el sobrenadante y se lavaron las células nuevamente en 40 ml de amortiguador. Después de la segunda etapa de lavado, se examinó el precipitado celular por cualquier signo de diácido residual, evidenciado por un precipitado de color blanco en la parte superior del precipitado celular, o parches de color blanco en el mismo precipitado celular. Se repitió el lavado hasta que el precipitado estaba completamente libre de todo el diácido y el precipitado celular era completamente de un color café claro. Durante el transcurso de la fermentación, a medida que las células producían más diácido, fueron necesarias más etapas de lavado para liberar al precipitado celular del diácido.

Preparación de extractos libres de células

Después de retirar por medio de lavado el diácido, se resuspendió el precipitado celular en 10 ml de amortiguador de fosfato de potasio 50 mM con 20% de glicerol, pH 7,6 (amortiguador de fosfato-glicerol) para una concentración dos veces mayor de enzimas celulares. Se añadieron 100 μl de una solución 100 mM del inhibidor de serina-proteasa, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF por sus siglas en inglés) en isopropanol, para una concentración final de 1 mM. Se rompieron luego las células pasando la muestra tres veces a través de una celda a presión francesa refrigerada (SLM Instruments, Inc. French Pressure Cell Press) aproximadamente a 20.000 psig. Se almacenó la muestra sobre hielo antes, durante y después del rompimiento de las células para evitar la pérdida de actividad de la enzima. Esta suspensión de células rotas fue luego centrifugada aproximadamente a 37,000 x g durante 30 minutos para precipitar los residuos celulares, dejando las enzimas celulares en el sobrenadante. Se removió el sobrenadante (extracto libre de células) y guardó para llevar a cabo los ensayos de la enzima. Durante los ensayos, se mantuvo siempre sobre hielo este extracto celular, y fue almacenado a -20°C entre los grupos de ensayos para preservar la actividad de la enzima.

Ensayo de enzimas FAO

El procedimiento del ensayo utilizado es una modificación de un ensayo utilizado por Kemp et al (1). El ensayo es una reacción acoplada de doble enzima. Se utilizó dodecanol como el sustrato para la FAO, que oxida el dodecanol hasta dodecanal. Al mismo tiempo este reduce el oxígeno molecular hasta peróxido de hidrógeno. Una segunda enzima en la mezcla de reacción, peroxidasa derivada de rábano picante (HRP), utiliza electrones obtenidos por oxidación con peróxido de hidrógeno para reducir al ácido 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) en la mezcla de reacción. El ABTS reducido absorbe fuertemente a 405 nm. La calidad de la HRP es importante, ya que se ha observado que las preparaciones obtenidas comercialmente varían en calidad. Es necesario, por lo tanto, obtener preparaciones de alta pureza. La HRP (Sigma #P8415) fue elaborada en una concentración de 2 mg/ml (=250 unidades/mg) en amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 7.6. En experimentos en los cuales se varió la cantidad de peroxidasa de rábano en la mezcla de reacción, se encontró que 5 μl de esta solución en una mezcla de reacción de un ml era suficiente para obtener velocidad máxima.

La mezcla final de reacción (1,0 ml) para el ensayo general de alcohol oxidasa de: 500 μl de amortiguador HEPES 200 mM, pH 7,6; 50 μl de una solución de ABTS de 10 mg/ml en agua desionizada; 10 μl de una solución 5 mM de dodecanol in acetona; y 5 μl de una solución de peroxidasa de rábano de 2 mg/ml en amortiguador de fosfato de potasio 50 mM, pH 7,6. Después de añadir el extracto, se leyó generalmente la actividad a 405 nm durante un minuto a temperatura ambiente. La cantidad de extracto que se añadió a la mezcla de reacción fue variada de tal manera que la actividad cayó dentro del rango de 0,2 a 1.0 1A405 nm/min. Se reportó la actividad de la alcohol oxidasa como unidades de actividad específica/mg de proteína (1 unidad = μmoles de sustrato oxidado/min). Se utilizó un coeficiente de extinción a 405 nm de 18,4 para ABTS y era equivalente a sustrato oxidado 0,5 mM. En

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ciertos experimentos de especificidad de sustrato, se utilizó amortiguador HEPES 200 mM, pH 7,6, que contenía 0,5% de Triton X100 en lugar del amortiguador HEPES 200 mM en la mezcla de reacción descrita anteriormente. El detergente ayudó en la solubilización de algunos de los sustratos más insolubles en agua analizados.

Preparación de microsomas

Los microsomas fueron preparados a partir de extractos libres de células de Candida tropicalis por medio de centrifugación a 100.000 x g durante una hora a 4°C. Se encontró la FAO dentro de los microsomas precipitados. La catalasa, una enzima soluble, permaneció en el sobrenadante, lo que permitió la separación de estas dos enzimas. El sobrenadante fue removido y analizado por la actividad de FAO y de la catalasa. Se resuspendió el precipitado microsomal en una cantidad equivalente de amortiguador de fosfato-glicerol, después de lo cual también fue analizado por la actividad de la catalasa y de FAO. Se prepararon microsomas de Escherichia coli en la misma forma.

Determinación de proteína

Se determinó la concentración de proteína en los extractos. El método de Lowry para determinación de concentración de proteína produjo resultados mucho más altos de lo esperado, y fueron inconsistentes entre las determinaciones de proteína de las mismas muestras. Por esta razón, se llevó a cabo un nuevo procedimiento utilizando el Reactivo de Bradford (Sigma, #B6916) y siguiendo el protocolo suministrado por el proveedor.

EJEMPLO 2

Clonación de genes para la oxidasa de alcohol graso

Preparación de ADN genómico

Se inocularon 50 ml de caldo YPD (Difco) con una sola colonia de C. tropicalis 20336 a partir de una placa de agar YPD (Difco) y se desarrolló durante la noche a 30°C. Se inocularon 5 ml del cultivo durante la noche en 100 ml de caldo YPD fresco y se incubó a 30°C durante 4 a 5 h con agitación. Se recolectaron las células por medio de centrifugación, se lavó dos veces con agua destilada estéril y se resuspendió en 4 ml d amortiguador de esferoplastia (Sorbitol 1 M, EDTA 50 mM, mercaptoetanol 14 mM) y se incubó durante 30 min a 37°C con agitación suave. Se añadieron 0,5 ml de zimoliasa de 2 mg/ml (ICN Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA) y se incubó a 37°C con agitación suave durante 30 a 60 min. Se monitoreó la formación de esferoplastos por medio de lisis con SDS. Se recolectaron los esferoplastos por medio de una breve centrifugación (4.000 rpm, 3 min) y fueron lavados una vez con el amortiguador de esferoplastos sin mercaptoetanol. Los esferoplastos recolectados fueron luego suspendidos en 4 ml de amortiguador de lisis (Tris 0,2 M /pH 8.0, EDTA 50 mM, 1% de SDS) que contenía 100 mg/ml de ARNasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) y se incubó a 37°C durante 30 a 60 min.

Se desnaturalizaron y extrajeron las proteínas dos veces con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico

(24:1) mezclando suavemente las dos fases por medio de inversión manual. Se separaron las dos fases por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min y se recuperó la fase acuosa que contenía el ADN de alto peso molecular. Se añadió NaCl a la capa acuosa hasta una concentración final de 0,2 M y se precipitó el ADN por medio de la adición de 2 volúmenes de etanol. Se enrolló el ADN precipitado con una varilla de vidrio limpia y se resuspendió en amortiguador TE (Tris 10 mM /pH 8.0, EDTA 1 mM) y se permitió que se disolviera durante la noche a 4°C. Al ADN disuelto, se le añadió ARNasa libre de cualquier actividad de ADNasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) hasta una concentración final de 50 mg/ml y se incubó a 37°C durante 30 min. Se añadió luego la proteasa (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) hasta una concentración final de 100 mg/ml y se incubó a 55 - 60°C durante 30 min. Se extrajo la solución una vez con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y una vez con un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). A la fase acuosa se le añadieron 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol enfriado con hielo (absoluto) y se enrolló el ADN de alto peso molecular con una varilla de vidrio y se disolvió en 1 a 2 ml de amortiguador TE.

Preparación de la biblioteca

Se construyó una biblioteca genómica utilizando el vector A ZAP Express™ (Stratagene, La Jolla, CA). Se digirió parcialmente ADN genómico con Sau3A1 y se purificaron fragmentos en el rango de 6 a 12 kb a partir de un gel de agarosa después de electroforesis del ADN digerido. Estos fragmentos de ADN fueron luego ligados a los brazos del vector A ZAP Express™ digerido con BamHI de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se establecieron tres ligaciones para obtener aproximadamente 9,8 x 105 clones independientes. Todas las tres bibliotecas fueron reunidas y amplificadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para obtener un patrón de título alto (>109 unidades formadoras de placa/ml) para almacenamiento durante un largo tiempo. El título de la biblioteca empacada de fagos fue comprobada después de la infección de células XL1Blue-MRF’ de E. coli. Se cultivaron las células

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XL1Blue-MRF’ de E. coli durante la noche ya sea en medio LB (Difco) o NZCYM (Difco) que contenía MgSO4 10 mM y 0,2% de maltosa a 37°C ó 30°C, respectivamente con agitación. Las células fueron luego centrifugadas y resuspendidas en 0,5 a 1 volúmenes de MgSO4 10 mM. 200 μl de este cultivo de E. coli fueron mezclados con diferentes diluciones de la biblioteca empacada de fagos e incubados a 37°C durante 15 min. A esta mezcla se le añaden 2,5 ml de agarosa de superficie LB o agarosa de superficie NZCYM (mantenida a 60°C) y se siembran en placa sobre agar LB (Difco) o agar NCZYM (Difco) presente en cajas Petri de 82 mm. Se permitió que se propagaran los fagos durante la noche a 37 °C para obtener placas discretas y se determinó el título del fago.

Selección de bibliotecas genómicas (Formadoras de placa)

Siembra en placas de la biblioteca A

Se cultivaron células XL1Blue-MRF’ de E. coli durante la noche en medio LB (25 ml) que contenía MgSO4 10 mM y 0,2% de maltosa a 37 °C, 250 rpm. Se centrifugaron luego las células (2200 x g durante 10 min) y se las resuspendió en 0,5 volúmenes de MgSO4 10 mM. Se mezclaron 500 μl de este cultivo de E. coli con una suspensión de fagos que contenía 25.000 partículas de fagos lambda amplificados y se incubó a 37°C durante 15 min. A esta mezcla se le añadieron 6,5 ml de agarosa de superficie NZCYM (mantenida a 60°C) y se sembraron en placa sobre 80 - 100 ml de agar NCZYM presente en una caja de Petri de 150 mm. Se permitió que se propagaran los fagos durante la noche a 37 °C para obtener placas discretas. Después de crecimiento durante la noche, se almacenaron las placas en un refrigerador durante 1 - 2 h antes de recoger las placas.

Recolección de las placas

Se colocaron membranas de nylon Magna Lift™ (Micron Separations, Inc., Westbrough, MA) sobre la superficie de agar en contacto completo con las placas y se permitió que se llevara a cabo la transferencia de las placas a membranas de nylon durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Después de la transferencia de las placas se colocó la membrana sobre 2 hojas de papel filtro Whatman 3M™ (Whatman, Hillsboro, OR) saturado con una solución de NaOH 0,5 N, NaCl 1,0 M y se dejó durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para desnaturalizar el ADN. Se removió el exceso de solución de desnaturalización por medio de transferencia brevemente sobre papel Whatman 3M™ seco. Se transfirieron luego las membranas a 2 hojas de papel Whatman 3M™ saturado con Tris-HCl 0,5 M (pH 8,0), NaCl 1,5 M y se dejó durante 5 min hasta neutralización. Se lavaron luego las membranas durante 5 min en 200 - 500 ml de 2 X SSC, se secó al aire y luego en horno durante 30 - 40 min a 80°C. Las membranas fueron luego sondadas con ADN marcado.

Hibridaciones de ADN

Se lavaron previamente las membranas con una 200 - 500 ml de una solución de 5 X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1 mM (pH 8,0) durante 1 - 2 h a 42°C con agitación (60 rpm) para remover los restos de las bacterias de las membranas. Se hibridaron previamente las membranas durante 1 - 2 h a 42°C (en un volumen equivalente a 0,125 0,25 ml/cm2 de membrana) con amortiguador ECL Gold™ (Amersham) que contiene NaCl 0,5 M y 5% de reactivo de bloqueo. Lo fragmentos de ADN utilizados como sondas fueron purificados a partir del gel de agarosa utilizando un kit de extracción del gel QIAEX II™ (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante y marcados utilizando un kit de marcación directa de ácido nucleico ECL™ de Amersham (Amersham). Se añadió ADN marcado (5 - 10 ng/ml de solución de hibridación) a las membranas previamente hibridadas y se permitió que procediera la hibridación durante la noche. Al día siguiente se lavaron las membranas con agitación (60 rpm) dos veces a 42°C durante 20 min cada vez en (en un volumen equivalente a 2 ml/cm2 de membrana) un amortiguador que contenía ya sea 0,1 (alta rigurosidad) o 0,5 (baja rigurosidad) X SSC, 0,4% de SDS y 360 g/l de urea. Esto fue seguido por dos lavados de 5 min a temperatura ambiente en (en un volumen equivalente a 2 ml/cm2 de membrana) 2 X SSC. Se generaron las señales utilizando el reactivo de detección de ácido nucleico ECL™ y se hizo la detección utilizando Hyperfilm ECL™ (Amersham).

Se tomaron tapones de agar que contenían placas correspondientes a señales positivas sobre la película de rayos X de las placas patrón utilizando el extremo abierto de una pipeta estéril Pasteur. Se seleccionaron las plaquetas alineando las placas con la película de rayos X. En esta etapa, se tomaron generalmente múltiples plaquetas. Se eluyeron las partículas de fago de los tapones de agar remojando en 1 ml de amortiguador SM (Sambrook et al., (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) durante la noche. El fago eluido fue luego diluido y sembrado en placa con células cultivadas en forma fresca XL1Blue-MRF’ de E. coli para obtener 100 - 500 plaquetas por placa de agar NCZYM de 85 mm. Se transfirieron las plaquetas a membranas de nylon Magna Lift como anteriormente y sondadas nuevamente utilizando la misma sonda. Se recolectaron las plaquetas aisladas de un solo pozo correspondientes a señales sobre la película de rayos X por remoción de los tapones de agar y eluyendo el fago por remojo durante la noche en 0,5 ml de amortiguador SM.

Conversión de clones A en un plásmido

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Para convertir el vector A ZAP Express™ en un plásmido, se utilizaron cepas de E. coli XLlBlue-MRF’ y XLOR. La conversión se realizó de acuerdo con los protocolos del fabricante (Stratagene) por escisión de una sola plaqueta.

Generación de una sonda para biblioteca

Selección del iniciador

5 La sonda para la biblioteca fue preparada a partir de un fragmento de reacción en cadena de polimerasa (PCR) del genoma ATCC 20336 de C. tropicalis que se sabe que representa al gen o genes FAO. Por medio de la comparación de regiones de homología entre dos genes FAO publicados de C. cloacae y un gen FAOT publicado de

C. tropicalis (NCYC 470) (4), se desarrollaron dos iniciadores no degenerativos por la PCR: dos iniciadores hacia adelante denominados como (FAO-F1) y (FAO-F2) y un iniciador inverso denominado como (FAO-R1) (ver la Tabla

10 I). Estos iniciadores fueron anticipados para amplificar una región en el gen en el marco de lectura abierto (ORF) del gen FAO.

Tabla 1. Comparación de la secuencia del iniciador con la secuencia correspondiente en Candida cloacae.

Gen

Comparación de la secuencia Iniciador

C. t. FAOT C. c. FAO1 C. c. FAO2 C. t. FAOT C. c. FAO1 C. c. FAO2 C. t. FAOT C. c. FAO1 C. c. FAO2

352 5’ TCG TGG CGT GAC TCT CCT 3’ 369 (SEQ ID NO: 35) 340 5’ TCA TGG AGA GAC TCT CCT 3’ 357 (SEQ ID NO: 36) 340 5’ TCA TGG AGA GAC TCT CCA 3’ 357 (SEQ ID NO: 37) 608 5’ CTG GTG CTG GTG TAG T 3’ 623 (SEQ ID NO:38) 593 5’ CAG GAG CAG GTG TGG T 3’ 608 (SEQ ID NO:39) 593 5’ CGG GAG CAG GAG TGG T 3’ 608 (SEQ ID NO:40) 1780 5’ TTG GTA CCC ATG CTT GTG G 3’ 1762 (SEQ ID NO:41) 1762 5’ TTG GTA CCC AAG CTT GTG G 3’ 1744 (SEQ ID NO:42) 1762 5’ TTG GTA CCC AAG CTT GTA G 3’ 1744 (SEQ ID NO:43) FAO-F1 FAO-F2 FAO-R1

Condiciones de la PCR

15 Los iniciadores seleccionados fueron utilizados en una reacción PCR con las siguientes condiciones: 5 μl de amortiguador 10X PCR, 5 μl ya sea del patrón del iniciador FAO-F1 o de FAO-F2 (20 μM), 5 μl del patrón del iniciador 30R1 (20 μM), 1 μl de la mezcla de nucleótidos, 0,5 μl de Taq polimerasa, y 1 μl de ADN genómico de la cepa ATCC 20336 de Candida tropicalis, todo en un volumen de reacción de 50 μl. Las condiciones de reacción fueron: 95 °C durante 2 min, seguido por 35 ciclos de 95 °C durante 30 s, 53 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min.

20 El par de iniciadores, FAO-F1 y FAO-R1, que deben haber producido un fragmento esperado de 1429 pb, nunca produjeron un producto PCR. El par de iniciadores, FAO-F2 y FAO-R1, que deben haber producido un fragmento esperado de 1173 pb, generaron un fragmento de aproximadamente 1200 pb de longitud.

Clonación del producto PCR con TOPO TA

El producto PCR fue clonado utilizando un kit de clonación TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, Ca., TOPO TA Cloning

25 Kit, Versión K2, #25-0184) en células de la cepa Top10F’. El producto PCR fue primero purificado por electroforesis en agarosa de bajo punto de fusión (1%) seguido por escisión de la banda apropiada. La rebanada de gel fue colocada en una tubo de una micrófuga e incubada a 65 °C hasta que fundió el gel, después de lo cual fue colocada a 37 °C. En un tubo nuevo se combinaron 4 μl de la agarosa fundida que contenía al producto PCR con 1 μl del vector de clonación TOPO TA y se incubó a 37 °C durante 10 minutos. Se logró la transformación mezclando 2 - 4 μl

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de esta mezcla de reacción con un vial (50 μl) de células competentes de E. coli suministradas con el kit. Estas fueron incubadas sobre hielo durante 30 min. Las células fueron sometidas a choque térmico a 42 °C durante 30 segundos sin agitación. Se transfirió inmediatamente el vial a hielo y se añadieron 250 μl de medio SOC a temperatura ambiente. Se agitó luego este tubo en forma horizontal a 37 °C durante 30 min. Se esparcieron alícuotas sobre placas de LB + 100 μg/ml de ampicilina después de lo cual se habían esparcido 25 μl de isopropiltiogalactósido (IPTG, 100 mM) + 40 μl de Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil �-D-galactopiranósido, 40 mg/ml) al menos 30 minutos antes. Se determinaron los transformantes que contenían insertos por selección azul/blanco, indicando el azul una transformación exitosa que contenía un inserto.

Las colonias blancas que eran positivas para la presencia de un inserto fueron inoculadas en medio LB que contenía 100 μg/ml de ampicilina y se desarrollaron durante la noche. Se obtuvo el ADN del plásmido a partir de estos cultivos utilizando el método del kit Qiaprep (Qiagen, Qiaprep Spin Miniprep Kit #27106), y se analizó la presencia del inserto por restricción con EcoRI. En el vector PCR 2.1, el inserto está flanqueado por cualquier lado por sitios EcoRI, de tal manera que cortando con EcoRI se liberará lo que se ha insertado dentro del plásmido. Diferentes clones mostraron el tamaño correcto del inserto de aproximadamente 1200 pb. Dos de los clones fueron secuenciados y la secuencia de ADN fue comparada con la secuencia publicada para FAOT (12). Ya que el grado de homología para ambos clones fue muy alto (79% de coincidencia de las bases 608-1199 del ORF de FAOT), uno de ellos fue seleccionado para preparar la sonda de ADN.

Preparación de la sonda de ADN

Se obtuvieron varios microgramos de ADN del plásmido de un clon positivo y se digirió el ADN con EcoRI para liberar al inserto. La electroforesis del digerido sobre 1,2% de un gel de agarosa de bajo punto de fusión permitió la separación del fragmento de FAO del vector PCR 2.1. Se extrajo el ADN apropiadamente dimensionado del gel (Qiaprep, QIAquick Gel Extraction Kit, #28706) y fue cuantificado con un fluorómetro. El fragmento de ADN de FAO fue luego marcado utilizando el método ECL (Amersham, ECL kit, #RPN 3001).

EJEMPLO 3

Clonación de genes FAO de ATCC 20336 de Candida tropicalis

Se elaboraron placas de la biblioteca del fago A de C. tropicalis y el levantamiento de estas placas sobre filtros de membrana de nitrocelulosa se llevó a cabo, de acuerdo al procedimiento descrito en Materiales y métodos (Ejemplo 1). Se identificaron clones positivos putativos como se indica en Materiales y Métodos (Ejemplo 1). Se cultivaron las células XLOLR que contienen estos fragmentos de biblioteca y se obtuvo el ADN del plásmido utilizando el kit Qiaprep. La digestión de restricción y los análisis por PCR confirmaron la presencia de un gen FAO en estos clones de biblioteca de C. tropicalis. Era conocido a partir de la información de la secuencia del ADN de la sonda que al menos algunos de los clones deben cortarse con PvtuII y KpnI. Por lo tanto, los clones de la biblioteca fueron digeridos con EcoRI, PvuII, y KpnI en digestiones simple, y con PvuII y KpnI en una digestión doble. Esto permitió determinar el direccionamiento del gen FAO y estimar su posicionamiento dentro del inserto del vector PBK-CMV. Los iniciadores iniciales utilizados en la preparación de la sonda de ADN, FAO-F2 y FAO-R1, fueron utilizados para selección por PCR los clones de la biblioteca utilizando ADN de plásmido purificado de estos clones como el molde. Se utilizó ADN genómico de ATCC 20336 de C. tropicalis como molde para la reacción PCR en el control. Ocho clones de la biblioteca de FAO, denominadas A1, A4, A5, A6, A8, A9, B5, y B6, fueron identificados como clones positivos putativos y fueron enviados a la Sequetech Corporation para secuenciación.

Cuando las secuencias de ADN de los clones fueron comparadas con la secuencia publicada de FAOT, los clones cayeron en dos grupos. El grupo 1 estaba compuesto de los clones A4, A8, B5, y B6. El grupo 2 estaba compuesto de A1, A5, A6, y A9.

4297 pb del gen del clon AS, que fue denominado FAO1, fue secuenciado bicatenario (SEQ ID No: 1). Además del marco de lectura abierto (ORF), que tenía 2112 pb de longitud, había un ADN secuenciado de 1940 pb secuencia arriba y 242 pb secuencia abajo. 4158 pb del gene del clon A9, que fue denominado FAO2a, fue secuenciado bicatenario (SEQ ID No: 3). Además del marco de lectura abierto (ORF), que tenía 2112 pb de longitud, había un ADN secuenciado de 1520 pb secuencia arriba y 523 pb secuencia abajo. Existe un codón CTG en los pb 2049 - 2051 en la secuencia de FAO2 presentada en la SEQ ID NO: 3 (pb 529 - 531 del ORF). Este CTG es denominado como leucina en el código universal, pero el análisis de la secuencia (14) ha confirmado que CTG realmente codifica para serina en ATCC 20336 de Candida tropicalis.

La secuenciación adicional del clon A6 demostró una cercana homología con el clon A9. Hubo unas pocas diferencias en los pares de bases, sin embargo, se llevó a cabo tal secuenciación bicatenaria del gen. Los resultados (SEQ ID No: 5, Tabla 2 y Tabla 3) mostraron que el clon A6 era más probablemente un alelo del clon A9. Fue denominado FAO2b.

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Las regiones del ORF de FAO1, FAO2a y FAO2b fueron comparadas con regiones análogas del gen FAOT publicado (12) de Candida tropicalis (NCYC 470), los genes FAO1 y FAO2 de Candida cloacae y el gen FAO de Candida albicans (Tabla 2).

Tabla 2. Comparación de la secuencia de ADN entre los genes objetivo FAO1 o FAO2 de C. tropicalis y los datos de secuencia publicados para los genes NCYC 470 de C. tropicalis, FAO de C. cloacae, yde C. albicans

Secuencia #1 de ADN

Secuencia #2 de ADN % de identidad

FAO1 de C. tropicalis

FAO2a de C. tropicalis 82

FAO1 de C. tropicalis

FAOT de C. tropicalis 77

FAO1 de C. tropicalis

FAO de C. albicans 71

FAO1 de C. tropicalis

FAO1 de C. cloacae 62

FAO2a de C. tropicalis

FAOT de C. tropicalis 78

FAO2a de C. tropicalis

FAO de C. albicans 73

FAO2a de C. tropicalis

FAO1 de C. cloacae 63

FAO2b de C. tropicalis

FAO1 de C. tropicalis 81

FAO2b de C. tropicalis

FAO2a de C. tropicalis 95

FAO2b de C. tropicalis

FAOT de C. tropicalis 77

FAO2b de C. tropicalis

FAO de C. albicans 73

FAO2b de C. tropicalis

FAO1 de C. cloacae 62

FAOT de C. tropicalis

FAO1 de C. cloacae 62

FAOT de C. tropicalis

FAO de C. albicans 73

FAO1 de C. cloacae

FAO de C. albicans 59

FAO1 de C. cloacae

FAO2 de C. cloacae 79

Se compararon también las secuencias de aminoácidos, que se derivaron utilizando el código universal (Tabla 3).

Tabla 3. Comparación de la secuencia derivada de aminoácidos entre los genes objetivo FAO1 o FAO2 de C. tropicalis y los datos de secuencia publicados para los genes NCYC 470 de C. tropicalis, FAO de C. cloacae, yde C. 10 albicans

Proteína #1

Proteína #2 % de Identidad % de Similitud

FAO1 de Cognis

FAO2a de Cognis 81 92

FAO1 de Cognis

FAO de C. tropicalis 82 90

FAO1 de Cognis

FAO de C. albicans 74 88

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(continuación)

Proteína #1

Proteína #2 % de Identidad % de Similitud

FAO1 de Cognis

FAO1 de C. cloacae 60 76

FAO2a de Cognis

FAO de C. tropicalis 85 93

FAO2a de Cognis

FAO de C. albicans 78 88

FAO2a de Cognis

FAO1 de C. cloacae 59 76

FAO2b de Cognis

FAO1 de Cognis 80 91

FAO2b de Cognis

FAO2a de Cognis 97 98

FAO2b de Cognis

FAOT de C. tropicalis 85 93

FAO2b de Cognis

FAO de C. albicans 76 88

FAO2b de Cognis

FAO1 de C. cloacae 59 75

FAO de C. tropicalis

FAO1 de C. cloacae 60 77

FAO de C. tropicalis

FAO de C. albicans 76 87

FAO1 de C. cloacae

FAO de C. albicans 55 72

FAO1 de C. cloacae

FAO2 de C. cloacae 76 88

Los genes FAO2a y FAO2b son 95% idénticos por la secuencia de ADN y tienen 97% de identidad y 98% de 5 similitud por secuencia de aminoácidos.

Los genes FAO1 y FAO2a de la presente invención son 82 % idénticos por la secuencia de ADN (81% para FAO2b) y tienen 81 % de identidad y 92 % de similitud por secuencia de aminoácidos (80% de identidad y 91 % de similitud para FAO2b). En comparación, los genes FAO1 y FAO2 de C. cloacae son 79 % idénticos por secuencia de ADN y tienen 76 % de identidad y 88% de similitud por secuencia de aminoácidos. Estos resultados indican que lal igual

10 que C. cloacae, la cepa 20336 de C. tropicalis tiene dos diferentes genes para la oxidasa de alcohol graso.

En forma muy interesante, Vanhanen et al. (4) identificaron únicamente un gen FAO en su cepa NCYC 470 de C. tropicalis. La secuencia de ADN de FAOT era 77 % idéntica a los genes FAO1 y FAO2b de la presente invención y 78% idéntica al gen FAO2a de la presente invención. La comparación de la secuencia de aminoácidos mostró que FAOT tenía 82 % de identidad y 92 % de similitud con el gen FAO1 de la presente invención y tenía 85% de 15 identidad y 93% de similitud con los genes FAO2a y FAO2b de la presente invención. Aunque el gen FAOT era el más similar al gen FAO2a de la presente invención, la diferencia era aún equivalente a aproximadamente 49 aminoácidos de los 704. Estos datos demuestran que el gen FAOT publicado es ligeramente más similar a cualquiera de los genes FAO de la presente invención de lo que los genes FAO de la presente invención son entre sí. Estos datos indican además la probabilidad de que FAO1, FAO2 y FAOT son genes diferentes, en vez de alelos

20 entre sí.

Aunque se obtuvo un fragmento PCR de 1200 pb a partir de todos los clones utilizando iniciadores 30F2 y 30R1, la banda era generalmente muy débil, incluso después de haber realizado la optimización de las condiciones de la PCR. Cuando los iniciadores, que fueron diseñados a partir de la secuencia FAOT publicada, fueron alineados con los genes FAO1, FAO2a y FAO2b de la presente invención (Tabla 4), se observó una carencia significativa de

25 homología, particularmente con FAO-F1 y FAO-F2. Esto indica también que FAO1, FAO2 y FAOT son genes diferentes. Incluso aunque se utilizó la información publicada de la secuencia de Candida tropicalis para obtener los iniciadores de la PCR, el grado de variación de la secuencia hizo encontrar un inciertos par en funcionamiento del iniciador de la PCR.

19

Tabla 4. Comparación de la secuencia del iniciador con la secuencia correspondiente en FAO1 y FAO2 de Candida tropicalis.

Gen

Comparación de secuencia Iniciador

FAOT de C. t. FAO1 de C. c. FAO2a de C. c. FAO2b de C. t. FAOT de C. t. FAO1 de C. c. FAO2a de C. c. FAO2b de C. t. FAOT de C. t. FAO1 de C. c. FAO2a de C. c. FAO2b de C. t.

352 5’ TCG TGG CGT GAC TCT CCT 3’ 369 (SEQ ID NO: 35) 352 5’ TCG TGG CGT GAC TCC CCT 3’ 369 (SEQ ID NO: 44) 352 5’ TCT TGG CGT GAT TCC CCG 3’ 369 (SEQ ID NO: 45) 352 5’ GCC TGG CGT GAT TCC CCG 3’ 369 (SEQ ID NO: 46) 608 5’ CTG GTG CTG GTG TAG T 3’ 623 (SEQ ID NO: 38) 608 5’ CCG GTG CTG GTG TCG T 3’ 623 (SEQ ID NO: 47) 608 5’ CCG GTG CTG GTG TCA T 3’ 623 (SEQ ID NO: 48) 608 5’ CCG GTG CTG GTG TCA T 3’ 623 (SEQ ID NO: 49) 1780 5’ TTG GTA CCC ATG CTT GTG G 3’ 1762 (SEQ ID NO: 41) 1780 5’ TTG GCA CCC ATG GTT GGG G 3’ 1762 (SEQ ID NO: 50) 1780 5’ TTG GCA CCC ATG GCT GTG G 3’ 1762 (SEQ ID NO: 51) 1780 5’ TTG GCA CCC ATG CCT GTG G 3’ 1762 (SEQ ID NO: 52) FAO-F1 FAO-F2 FAO-R1

EJEMPLO 4

5 Subclonación y expresión de FAO1 y FAO2 en E. coli.

PCR de genes FAO1 y FAO2

Ya que los datos de homología de secuencia indican fuertemente que FAO1 y FAO2 eran genes diferentes, se investigó la unicidad de los dos genes por medio de clonación y expresión de FAO1 y FAO2a individualmente en E. coli para determinar la especificidad por el sustrato de los dos producto génicos.

10 Los marcos de lectura abiertos de estos dos genes fueron amplificados por medio de PCR y clonados (Argonne National Labs, Argonne, IL) en el vector de autorreplicación pJF 118EH (13). Este vector, que contiene ya sea al gen FAO1 o al gen FAO2, fue transformado en E. coli. La colocación de los genes para las enzimas FAO1 y FAO2 en E. coli permitió la sobreexpresión de las proteínas permitiendo así la generación de grandes cantidades de enzimas en un fondo limpio de tal manera que sus propiedades podrían ser más claramente definidas.

15 Inicialmente, se determinaron únicamente las propiedades de la enzima derivada de la secuencia nativa de FAO2a. Se sabe, sin embargo que FAO2a tiene un codón CTG, que es traducido como una serina en C. tropicalis pero como una leucina en E. coli. Debido a esto, se generó un constructo de FAO2a (denominado FAO2a’) que tiene un codón TCG, que codifica para serina tanto en C. tropicalis como en E. coli, en lugar del codón CTG. Las propiedades tanto de FAO2a como de FAO2a’ se determinaron como se describe en los siguientes ejemplos.

20 Los iniciadores utilizados para amplificar las regiones de codificación de los genes FAO1 y FAO2 por medio de PCR se muestran más adelante. Se añadieron los sitios de restricción (subrayados) EcoRI y BamHI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. El codón de inicio ATG en el iniciador hacia adelante y los codones de terminación duales en los iniciadores inversos se muestran en cursiva.

20

FAO1U 5’ -CCGAATTCGACATGGCTCCATTTTTG-3’ (SEQ ID NO: 53) FAO1L 5’-CCGGATCCATTACTACAACTTGGCCTTGGT -3’ (SEQ ID NO: 54) FAO2U 5’-CCAGTGAATTCAGATGAATACCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 55) FAO2L 5’-CCGGATCCCCGTCTCACTACAACTTG-3’ (SEQ ID NO: 56). PCR utilizó Platino Pfx ADN Polimerasa de Life Technologies, Inc. (Rockville, MD 20849 - 6482). Las condiciones de

reacción para cada reacción de 50 μl fueron: amortiguador 1X (suministrado por el fabricante) MgSO4 1.0, 1,5 ó 2,0 mM 1 μM cada iniciador 0,2 mM cada uno de los 4 dNTP 200 - 400 ng del plásmido FAO1 o FAO2 1 unidad de Platino Pfx Polimerasa Se incubaron las reacciones en un termociclador Robocycler Gradient 96 (Stratagene) durante un ciclo a 94°C por 2

minutos, seguido por 30 ciclos a 94°C (30 segundos); 55°C, 58°C ó 61°C (45 segundos); 72°C (2 minutos). Se

completaron las reacciones por incubación a 72°C (10 minutos) durante 1 ciclo. FAO1 produjo el producto esperado (2,1 kb) bajo todas las condiciones ensayadas. Las condiciones óptimas para FAO2 fueron con MgSO4 1,0 - 1,5 mM y 55°C - 58°C.

Purificación en gel de agarosa de productos PCR Se reunieron y purificaron tres de las reacciones PCR para cada gen con el kit de Purificación por PCR QIAquickspin (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se fraccionó luego el ADN sobre un gel de agarosa al 1,0

%. Se removieron las bandas de 2,1 kb y se extrajo el ADN con el Kit de Extracción en Gel QIAEX II (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Ligación dentro de pJF118EH Se digirió el vector de expresión pJF118EH (13) con EcoRI y BamHI, y se fraccionó sobre un gel de agarosa al

1,0%. Se cortó y purificó la banda con el Kit de Extracción en Gel QIAEX II (Qiagen). Se digirieron los productos PCR FAO1 y FAO2 con EcoRI y BamHI, y se purificó el gel en la misma forma. Se visualizaron las bandas digeridas sobre un gel de agarosa pero no se determinaron las concentraciones exactas.

Se incubaron las reacciones de ligación (20 μl) que contenían 1 μl de FAO1 o FAO2 y 4 μl de pJF1 18EH en 1X amortiguador de ligación (Promega) con 1 μl (3 unidades) T4 ADN ligasa (Promega) durante 2 horas a 25°C. Se transformaron 100 μl de Library Efficiency DH5 E. coli (Life Technologies, Inc.) con 1,5 μl de cada reacción de ligación.

Se seleccionaron seis colonias de cada transformación, se hicieron minipreparaciones de ADN y se determinó el tamaño del inserto por medio de digestión con EcoRI y BamHI. 5 de los 6 clones FAO1 contenían el inserto de 2,1 kb. Todos los 6 clones FAO2 contenían al inserto de 2,1 kb.

Se seleccionó un clon de cada uno y se almacenaron patrones de glicerol a -80°C. Se utilizaron también muestras de cada clon para análisis de la expresión y actividad de la enzima. El clon FAO1, denominado FAO1-EC, contenía al plásmido FAO1jf (ver la Figura 1), y el clon FAO2, denominado FAO2-EC, contenía a plásmido FAO2jf (ver la Figura 2). Se confirmó la secuencia de ambos genes FAO en éstos plásmidos por parte de Sequetech Corporation, Mountain View, CA.

Inducción de FAO1 y FAO2 Los cultivos durante la noche de FAO1-EC y FAO2-EC se desarrollaron a 30 °C en 5 ml de Caldo Terrific (TB)

21

(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) más 100 μg/ml de ampicilina a 250 rpm. Se colocaron 50 ml de TB más 100 μg/ml de ampicilina en dos matraces deflectores de 500 ml. Se utilizó TB más 100 μg/ml de ampicilina tanto para los cultivos iniciadores como los cultivos que fueron inducidos para producir la enzima. Se inocularon los matraces con los cultivos de la noche con una absorbancia a 600 nm de aproximadamente 0,2. Los cultivos se desarrollaron a 30 °C, con agitación a 250 rpm. Cuando cada cultivo había alcanzado una absorbancia a 600 nm de 5 a 6, fue inducido con IPTG hasta una concentración final en cada cultivo de 1 mM. Se permitió luego que los fueran incubados otras tres horas después de la inducción. Se recolectaron las células por centrifugación (Sorvall RC5C) aproximadamente a 6.000 x g (rotor GS3 a 6.000 rpm) durante 10 minutos. El caldo sobrenadante agotado (SB) fue removido y recuperado, y se congelaron los precipitados celulares a -20°C para uso posterior.

Preparación de extractos celulares de E. coli

Se prepararon microsomas para ensayos de alcohol oxidasa resuspendiendo los precipitados celulares inducidos en 50 ml de amortiguador de PO4/glicerol. Se añadieron 500 μl de una solución PMSF 100 mM para una concentración final de 1 mM de PMSF en la suspensión. Se rompieron las células pasándolas dos veces a través de una celda francesa presurizada refrigerada, y fueron examinadas por medio de un microscopio de contraste de fases para garantizar que 95% o más de las células habían sido rotas. Se centrifugó la suspensión de células rotas (BCS) aproximadamente a 37.000 x g durante 30 minutos para precipitar los residuos celulares. Se removió el sobrenadante (extracto libre de células, CFE) y guardó para los análisis. El precipitado de residuos celulares (CD) fue resuspendido en 50 ml de amortiguador de fosfato-glicerol para que fuera igual a la concentración original de las células en el cultivo.

Preparación de suspensiones microsomales de E. coli

Se calentaron los extractos libres de células hasta temperatura ambiente y se mezclaron completamente antes de remover 3 ml de muestra de cada uno para la preparación microsomal. Estas muestras fueron centrifugadas en una ultracentrífuga a 100.000 x g durante una hora a 4°C para precipitar los microsomas. El sobrenadante fue luego removido y recuperado, y se resuspendió cada precipitado microsomal en 0,5 ml del amortiguador de PO4/glicerol para una concentración 6x de la enzima FAO.

EJEMPLO 5

Construcción de un gen FAO2a alterado en el codón CTG

Se llevó a cabo una alteración de un codón de FAO2a por medio de PCR de extensión por superposición. Se utilizaron los siguientes grupos de iniciadores para generar los constructos iniciales:

A9.1N 5’ ATC AAC GCC ACC CCA ACC 3’ (SEQ ID NO: 57)

FAO2-CTG-R 5’ GGT TTC TCC ATA AAC GAG TAC CTG AAAGGG TCA ACC 3’ (SEQ ID NO: 58)

Estos iniciadores fueron diseñados para cubrir la región 3’ de 208 pb hasta 3’ de 545 pb del inicio del ORF produciendo un fragmento de 338 pb de longitud. La alteración del codón CTG por CGA (TCG en el complemento inverso) se indica en negrilla. Un sitio de restricción anterior KpnI (GGTACC), anteriormente subrayado, ha sido aliminado por medio de esta alteración del codón.

La PCR utilizó Platino Pfx ADN Polimerasa de Life Technologies, Inc. Las condiciones de reacción para cada reacción de 50 μl eran:

amortiguador 1X (suministrado por el fabricante)

MgSO4 1,0 mM

1 μM cada iniciador

0,3 mM cada uno de los 4 dNTP

200 - 400 ng del plásmido FAO2a

1 unidad de Platino Pfx Polimerasa

A9.1E 5’ ATC TGT CTA GCA AAG GTC 3’ (SEQ ID NO: 59)

22

FAO2-CTG-F 5’ GGT TGA CCC TTT CAG GTA CTC GTT TAT GGA GAA ACC 3’ (SEQ ID NO: 60)

Estos iniciadores fueron diseñados para cubrir la región 3’ de 510 pb hasta 3’ de 2069 pb del inicio del ORF produciendo un fragmento de 1560 pb de longitud. Los FAO2-CTG-F y FAO2-CTG-R son iniciadores de superposición.

Este PCR también utilizó Platino Pfx ADN Polimerasa de Life Technologies, Inc. Las condiciones de reacción para cada reacción de 50 μl eran:

amortiguador 1X (suministrado por el fabricante)

MgSO4 5,0 mM

1 μM cada iniciador

0,3 mM cada uno de los 4 dNTP

200 - 400 ng del plásmido FAO2a

1 unidad de Platino Pfx Polimerasa

Las reacciones fueron incubadas en un termociclador PTC200 (MJ Research) para un ciclo a 94°C durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos a 94°C (15 segundos); 55°C (30 segundos); 68°C (4 minutos). Las reacciones fueron completadas por incubación a 72°C (7 minutos) durante 1 ciclo.

Los fragmentos PCR de tamaño apropiado fueron separados sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1%, y fueron luego cortados en tubos de microfuga separados. Se realizó una tercera PCR utilizando iniciadores A9.1N y A9.1E. Esta PCR también utilizó Platino Pfx ADN polimerasa de Life Technologies, Inc. Las condiciones de reacción para cada reacción de 50 μl eran:

amortiguador 1X (suministrado por el fabricante)

MgSO4 2,0 mM

1 μM cada iniciador

0,3 mM cada uno de los 4 dNTP

1 μl de cada fragmento PCR (338 pb y 1560 pb, agarosa de bajo punto de fusión fundida a 65 °C)

1 unidad de Platino Pfx Polimerasa

Se incubó la reacción en un termociclador PTC200 (MJ Research) para un ciclo a 94°C durante 2 minutos, seguido por 30 ciclos a 94°C (15 segundos); 60°C (30 segundos); 68°C (2 minutos). Las reacciones fueron completadas por incubación a 72°C (7 minutos) durante 1 ciclo. Esto dio como resultado un fragmento PCR que tenía 1862 pb de longitud y cubierto de 208 pb hasta 2069 pb desde el inicio del ORF. Este fragmento era TOPO-TA clonado y el plásmido resultante fue preparado como se describe en Materiales y Métodos (Ejemplo 1).

Con el propósito de reemplazar el codón CTG en el plásmido FAO2jf con la secuencia modificada, se cortó el plásmido, FAO2jf, con KpnI y MfeI para remover un fragmento de 470 pb de longitud, dejando la porción mayor del plásmido, 6924 pb intacta. Se cortó también el fragmento de 1862 pb con KpnI y MfeI para remover un fragmento de 470 pb de longitud. Se purificaron los fragmentos apropiados, el fragmento de 6924 pb del plásmido FAO2j f y el fragmento de 470 pb cortado del fragmento de 1862 pb que contenía el codoón CTG modificado, sobre gel de agarosa al 1%, y luego fueron extraídos del gel utilizando el kit Qiaquick de Qiagen.

Después de obtener los fragmentos apropiados de ADN, se estableció una ligación utilizando el producto y el protocolo de Ligación Quick de New England Biolabs. Esta ligación fue transformada nuevamente en células DH5a. Se seleccionaron preparaciones de plásmido de clones putativos cortando con KpnI y MfeI. Se seleccionó uno de los clones positivos para estudios adicionales y fue denominado como FAO2a’EC. Ya que todo el gen FAO2a modificado en CTG (denominado FAO2a excepto por el fragmento de 469 pb que contenía la modificación del codón cuya secuencia había sido previamente modificada) únicamente se verificó la secuencia de esta porción de 469 pb del gen. El gen tenía el codón apropiado cambiado de un CTG por un TCG (pb 2049 - 2051 en la SEQ ID NO: 9).

23

También tenía una segunda mutación, presumiblemente generada por PCR. La mutación era en pb 2117 y dio como resultado un cambio de codón de ATT a ATC, ambas codifican para isoleucina.

Preparación del casete de amplificación para FAO1 y FAO2

La etapa inicial en la creación del casete de amplificación de FAO1 y FAO2 fue para utilizar iniciadores con sitios de restricción para PacI sobre los extremos para amplificar el ORF y las regiones secuencia arriba de cada gen. Para FAO1 los iniciadores utilizados fueron:

(sitio de restricción para PacI subrayado)

FAO1-F3-PacI 5’ CCT TAA TTA ATG CAT ACT CGG AGC ATA TCG C 3’ (SEQ ID NO: 61)

FAO1-R3-PacI 5’ CCT TAA TTA ATG GGC GGA ATC AAG TGC C 3’ (SEQ ID NO: 62)

La región cubierta es la 5’ de 1939 pb y la 3’ de 245 pb del ORF

Para FAO2 los iniciadores fueron:

FAO2-F1-Pac I 5’ CCT TAA TTA ATC TCA CCA AGT ACG AGA ACG 3’ (SEQ ID NO: 63)

FAO2-R1-Pac I 5’ CCT TAA TTA AGA CGC AAG CAC AGG TGC C 3’ (SEQ ID NO: 64)

La región cubierta es la 5’ de 1520 pb y la 3’ de 526 pb del ORF

Se utilizó el kit Accutaq LA Core (Sigma, #ACCUCORE) para crear los fragmentos PCR. Este kit contiene tanto una Taq ADN polimerasa con una pequeña cantidad de una enzima de corrección de prueba. La mezcla de reacción fue preparada siguiendo las recomendaciones en el kit. Las condiciones seguidas para la PCR fueron: 98°C durante 30 s seguido por 35 ciclos de: 94°C durante 5 s, 65°C durante 20 s y 68°C durante 5 min. Después de esto hubo una prolongación final de 72°C durante 5 min. Estos fragmentos PCR fueron clonados en TA-TOPO dentro del vector PCR 2.1, que fue transformado en células Top10F’ de la cepa de E. coli, creando las cadenas FAO1:PacI y FAO2:PacI.

Con el propósito de reemplazar la mayor parte de la secuencia del ORF obtenida por medio de PCR con ADN genómico, se cortó FAO1:PacI con AatII y ZheI para liberar un fragmento aproximadamente de 1,9 kb de longitud. Su clon de la biblioteca complementaria, A8.1, también fue cortado con AatII y NheI. FAO2:PacI y su clon de la biblioteca complementaria, A9.1, fueron cortados con NheI y BstBI para liberar un fragmento de 3,2 kb. Los fragmentos apropiados fueron purificados sobre gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1%, y luego fueron extraídos del gel utilizando el kit Qiaquick de Qiage.

Después de obtener los fragmentos apropiados de ADN, se estableció una ligación tanto para FAO1 como para FAO2 en la cual el ORF de los clones de la biblioteca estaba ligado dentro del vector PCR 2.1 con las regiones secuencia arriba y secuencia abajo del gen. Estas ligaciones fueron transformadas nuevamente dentro de células Top 10F. Se seleccionaron las preparaciones de plásmido a partir de clones putativos cortando con AatII y NheI para los clones FAO1, o cortando con NheI y BstBI para los clones FAO2, y cortando con PacI para todos los clones.

Debido a que el comienzo y el final de cada ORF fue obtenido a partir de la amplificación original por PCR de cada gen, estas áreas deben ser secuenciadas para estar seguros de que no se habían introducido mutaciones dentro del ORF. Se enviaron tres clones de reemplazo del ORF FAO1:PacI a Sequetech Corp. (Mountain View CA) para secuenciación. Se enviaron también cinco clones de reemplazo del ORF FAO2:PacI a Sequetech Corp. para secuenciación. Los clones de reemplazo de ORF FAO1: PacI 1 y 2, y los clones de reemplazo del ORF FAO2:PacI 1

-

5 eran todas libres de mutaciones, y podrían ser utilizadas para la elaboración de casetes de amplificación.

EJEMPLO 6

Preparación de un constructor de fusión del promotor

Las fusiones entre el promotor del gen CYP52A2 para citocromo p450 monooxigenasa, y el ORF ya sea de FAO1 o de FAO2 fueron preparadas por medio de PCR de prolongación de la superposición. Se establecieron las reacciones PCR tanto para el promotor CYP52A2 como para el ORF de FAO utilizando el kit de PCR Accutaq. Los iniciadores utilizados para obtener el promotor CYP52A2 para la fusión con FAO1 fueron (sitio de restricción de PacI):

24

00218-179A 5’ CCT TAA TTA AAG TCT CCA AGT TGA CCG AC 3’ (SEQ ID NO: 65)

FAO1-A2-R 5’ AAA TGG AGC CAT GGT CGT GAT GTG TG 3’ (SEQ ID NO: 66)

Se diseñó FAO-A2-R para montarlo en el extremo 3’ del promotor CYP52A2, pero la última mitad del extremo 5’ a 3’ del iniciador se derivó de la secuencia complementaria del inicio del ORF de FAO1. Contrariamente, los iniciadores utilizados para amplificar el ORF de FAO1 fueron:

FAO1-A2-F 5’ CAC ATC ACG ACC ATG GCT CCA TTT TTG CC 3’ (SEQ ID NO: 67)

FAO1-R3-Pac I 5’ CCT TAA TTA ATG GGC GGA ATC AAG TGC C 3’ (SEQ ID NO: 68)

Se diseñó FAO1-A2-F para montarlo en el extremo 5’ del ORF de FAO1, con la primera mitad del extremo 5’ a 3’ del iniciador derivada de la secuencia complementaria del extremo del promotor CYP52A2. De este modo, el promotor CYP52A2 y las regiones producidas del ORF de FAO ORF tenían secuencias complementarias entre sí.

Los iniciadores utilizados para obtener el promotor CYP52A2 fueron:

00218-179A 5’ CCT TAA TTA AAG TCT CCA AGT TGA CCG AC 3’ (SEQ ID NO: 69)

FAO2-A2-R 5’ GAA GGT ATT CAT GGT CGT GAT GTG TG 3’ (SEQ ID NO: 70)

Los iniciadores utilizados para las regiones del ORF de FAO2 fueron:

FAO2-A2-F 5’ CAC ATC ACG ACC ATG AAT ACC TTC TTG CC 3’ (SEQ ID NO: 71)

FAO2-R1-Pac I 5’ CCT TAA TTA AGA CGC AAG CAC AGG TGC C 3’ (SEQ ID NO: 72)

Una vez se habían obtenido las bandas PCR apropiadas, se purificó cada fragmento PCR sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1%, que luego fue cortado del gel, y se extrajo el producto PCR. La banda del promotor CYP52A2 era aproximadamente de 1,1 kb para ambas reacciones de fusión. La banda del ORF para FAO1 era aproximadamente de 2,4 kb y la banda del ORF para FAO2 era aproximadamente de 2,7 kb. Se estableció la PCR de fusión utilizando una pequeña porción del promotor CYP52A2 y las bandas purificada en gel del ORF de FAO como ADN molde. Se utilizó el kit Accutaq, y los iniciadores fueron el iniciador hacia adelante para el promotor CYP52A2 y el iniciador inverso para cada ORF de FAO. Durante la reacción PCR, el promotor CYP52A2 y el ORF de FAO hibridaron juntos en sus extremos complementarios, y la reacción PCR continuó sobre la unión para formar el constructo de fusión. La banda de la fusión pCYP52A2FAO1 era de 3,5 kb y la banda de la fusión PCYP52A2FAO2a era de 3,8 kb.

Estas bandas de fusión fueron luego clonadas TA-TOPO y transformadas en células de E. coli Top10F’. Nuevamente, la mayor parte del marco ORF de cada clon de fusión fue reemplazado con el correspondiente ADN genómico debido a la posibilidad para introducir mutaciones de la reacción PCR dentro del ORF. Los clones pCYP52A2FAO1 fueron cortados con las enzimas de restricción AatII y NheI para remover la mayor parte del ORF de FAO1. Los clones pCYP52A2FAO2a fueron cortados con las enzimas de restricción AatII y BstBI. Se obtuvo un fragmento genómico correspondiente para cada ORF de FAO en una forma similar. Después de la digestión, se purificaron los fragmentos apropiados de cada gen y se los ligo entre sí. El plásmido resultante contenía el fragmento PCYP52A2FAO con el ADN genómico de FAO reemplazado en el vector PCR 2.1. Este fue transformado dentro de células Top10F" y tres de los clones pCYP52A2FAO1 y cinco de los clones pCYP52A2FAO2a fueron enviaos a Sequetech Corporation para secuenciación.

Después de la secuenciación, se demostró que los tres clones de reemplazo del ORF de pCYP52A2FAO1 no tenían mutaciones y eran adecuados para elaborar casetes de amplificación. La secuenciación demostró que todos los cinco clones de reemplazo del ORF de pCYP52A2FAO2a tenían mutaciones aparentes introducidas por la PCR en diferentes lugares en el ORF.

La creación de casetes de amplificación para el clon de fusión pCYP52A2FAO1 fue lograda por medio de la remoción del fragmento del vector PCR 2.1 y clonándolo dentro del vector pURA3in. Este vector consistía de 193 pNEB con fragmentos invertidos del gen URA3 de C. tropicalis que flanquea cada región del sitio de inserción. El sitio de inserción es un sitio único para la enzima de restricción PacI, dentro de la cual se puede insertar el clone de fusión pCYP52A2FAO1 después de la digestión de restricción con PacI y la purificación en gel. Los fragmentos del gen URA3 están flanqueados por los sitios de digestión de restricción de AscI y PmeI de tal manera que el fragmento completo de inserción del clon FAO flanqueado por las secuencias del gen invertido URA3 puede ser removido y utilizado para transformar una cepa base Candida tropicalis ura-. Esto fue exitosamente realizado utilizando pCYP52A2FAO1.

25

EJEMPLO 7

Resultados

Actividad de la alcohol oxidasa en muestras de fermentación

Durante el transcurso de una fermentación diácida con la cepa HDC23-3 utilizando HOSFFA como sustrato, la actividad de FAO generalmente no apareció hasta aproximadamente 2 - 4 horas después de la inducción con HOSFFA (ver la Figura 3). La actividad aumentó rápidamente hasta alcanzar un pico aproximadamente 30 - 40 horas después de la inducción, y luego cayó aproximadamente 5 a 10 veces por 100 - 120 horas después de la inducción. Aunque esta tendencia se mantuvo constante a medida que avanzaba la fermentación, el tiempo y la altura del pico de actividad varió algo.

Una de las dificultades encontradas en la medición de la actividad de FAO en los extractos fue la presencia de catalasa en las células. La catalasa convierte peróxido de hidrógeno en la célula en agua y oxígeno molecular. La catalasa en los extractos podría competir con la peroxidasa de rábano por el peróxido de hidrógeno producido por la oxidación del alcohol hasta el aldehído por la FAO, lo cual daría como resultado mediciones de actividad que fueran menores que la actividad real. No se encontró actividad de FAO en el sobrenadante microsomal, pero hubo actividad en el precipitado microsomal resuspendido, y esta actividad fue aproximadamente la misma que aquella en el extracto original. La actividad de la catalasa estaba presente en el precipitado microsomal, pero aproximadamente en 1/100 del nivel encontrado en el extracto original. Estos datos indican que, bajo las condiciones de ensayo utilizadas, la catalasa no compitió significativamente con la peroxidasa de rábano por el peróxido de hidrógeno en la mezcla de reacción.

EJEMPLO 8

Fraccionamiento de la actividad del alcohol oxidasa

Las células de E. coli que contenían los plásmidos, FAO1jf o FAO2jf, fueron inducidas para expresar FAO1 o FAO2 como se describe en Materiales y métodos (Ejemplo 1). El caldo agotado, el extracto libre de células, y la resuspensión de los residuos celulares (ver Materiales y métodos, Ejemplo 1) fueron todos analizados por la actividad de FAO en un esfuerzo para determinar la ubicación de la actividad de FAO. Si se deposita en forma extracelular, la actividad de FAO sería observada en el caldo agotado. Si se deposita internamente, la actividad de FAO sería detectada en el extracto libre de células o en los residuos celulares resuspendidos. La enzima soluble o la enzima microsomal enlazada a la membrana se encontrarían en el extracto libre de células. Para determinar la ubicación en la célula de la alcohol oxidasa, se llevaron a cabo ensayos de actividad con las diversas fracciones. No se observó actividad de FAO en el caldo agotado, y la actividad encontrada en la resuspensión del precipitado de residuos celulares (FAO1 = 0,002 U/ml; FAO2 = 0,002 U/ml) fue de una quinta parte hasta una decima parte de la actividad determinada para el extracto libre de células (FAO1 = 0,026 U/ml; FAO2 = 0,044 U/ml).

Las preparaciones microsomales fueron elaboradas a partir de los extractos libres de células de estos cultivos de E. coli de FAO1 y FAO2. La actividad en cada precipitado microsomal resuspendido y sobrenadante fue analizada por la actividad de FAO. No se observó actividad en el sobrenadante del precipitado microsomal de FAO1, y la actividad en el sobrenadante del precipitado microsomal de FAO2 (0,010 U/ml) fue aproximadamente una quinta parte de la actividad en el precipitado microsomal de FAO2 resuspendido (0,050 U/ml). La actividad en la preparación microsomal de FAO2 fue casi dos veces la actividad que fue observada en la preparación microsomal de FAO1 (0,031 U/ml). Estos datos indican que la mayor parte de la actividad enzimática estaba contenida en los microsomas aislados a partir de los cultivos de E. coli.

Optimización de la inducción

Con el propósito de determinar la temperatura óptima para la síntesis de las enzimas FAO1 y FAO2a en cultivos de

E. coli, se hicieron cultivos de semilla durante la noche a 37 °C y 250 rpm en caldo Terrific. Se añadieron 50 ml de caldo Terrific a cada uno de los cuatro matraces deflectores de 500 ml; uno para cada uno de FAO1 y FAO2a que son incubados ya sea a 30 °C ó 37 °C. Cada matraz fue inoculado con los cultivos realizados durante la noche con una absorbancia a 600 nm de entre 0,7 y 0,8, y luego fue incubado con agitación a 250 rpm. Cuando cada cultivo había alcanzado u a absorbancia a 600 nm de aproximadamente 4,5, fue inducido con IPTG hasta una concentración final de 1 mM. Se recolectaron las células 3 horas después de la inducción por medio de centrifugación a 6000 x g durante 10 minutos. Se removió el sobrenadante y se almacenaron las células a -20 °C. Los cultivos de E. coli de FAO1 y FAO2a que se desarrollaron a 30 °C y 37 °C fueron preparados para ensayos de la enzima como se describe en Materiales y métodos. El extracto libre de células preparado a partir de cada uno de estos cultivos fue analizado por la actividad de FAO. Se encontró que el cultivado a 30 °C dio como resultado una mayor producción de FAO1 (14,7 U/ml) y de FAO2 (2,44 U/ml) que el cultivado a 37 °C (8,8 U/ml para FAO1 y 1,33 U/ml para FAO2a).

26

En un segundo grupo de experimentos, se determinó la concentración óptima del inductor, IPTG, para E. coli que contenía ya sea FAO1 o FAO2a. El experimento de crecimiento fue creado de la misma manera que el experimento anterior, con cultivos de semilla durante la noche de FAO1 y FAO2a que se desarrollaron a 37°C en Caldo Terrific más 100 μg/ml de ampicilina. Se añadieron 50 ml de caldo Terrific a cada uno de los seis matraces; tres matraces 5 cada uno para FAO1 y FAO2a. Un matraz de cada grupo fue inducido ya sea con IPTG 0,5 mM, IPTG 1,0 mM, o IPTG 2,0 mM. Los cultivos se desarrollaron a 30°C con agitación a 250 rpm. Cuando cada cultivo había alcanzado una absorbancia a 600 nm de aproximadamente 5,0, fue inducido con la concentración apropiada de IPTG. Se permitió que los cultivos se desarrollaran durante otras 2,5 horas después de la inducción antes de recolectar las células por medio de centrifugación a 6000 x g durante 10 minutos. Se almacenaron los precipitados celulares a

10 20°C. Se prepararon extractos libres de células y después de analizar la actividad de la alcohol oxidasa, se encontró que existía poca dependencia de la actividad de FAO1 sobre la concentración de IPTG (0,5 mM = 13,24 U/ml; 1 mM = 13,89 U/ml; 2 mM = 14,3 U/ml). Una respuesta similar a la concentración de IPTG fue observada para FAO2a (0,5 mM = 4,74 U/ml; 1 mM = 5,68 U/ml; 2 mM = 4,65 U/ml). Se escogió una concentración estándar de IPTG de 1 mM para la inducción de FAO1, FAO2a y FAO2a’.

15 Tabla 5. Alcoholes utilizados para analizar la especificidad por el sustrato

Actividad Detectada*

Compuesto Analizado Actividad Detectada Compuesto Analizado

2-Pentanol

1-Fenilpropan-1-ol

2-Hexanol

3-Fenilpropan-1-ol

X

2-Decanol 2-Fenilbutan-1-ol

X

2-Undecanol Metanol

X

2-Dodecanol Etanol

X

2-Hexadecanol Propanol

3-Octanol

Butanol

X

10-Undecen-1-ol X Hexanol

1,8-Octanodiol

X Octanol

X

1,2-Octanodiol X Decanol

X

1,10-Decanodiol X Dodecanol

X

1,2-Dodecanodiol X Tetradecanol

X

1,16-Hexadecanodiol X Hexadecanol

X

�?cido 10-Hidroxidecanoico 4-ciclohexil-1-butanol

X

�?cido 12-Hidroxidodecanoico 3-ciclohexil-1-propanol

X

�?cido 16-Hidroxidodecanoico 2-ciclohexiletanol

Citronelol

Ciclohexilmetanol

Geraniol

Linalool

* "X" = Actividad detectada utilizando este sustrato ya sea con FAO1 o con FAO2

27

Especificidad del sustrato de FAO1, FAO2a y FAO2a’

FAO1, FAO2a y FAO2a’ fueron analizados por su actividad con diversos alcoholes. Los alcoholes mostrados en la Tabla 5 fueron preparados en soluciones patrón 20 mM en acetona. Se indican los alcoholes que muestran actividad ya sea con FAO1 o con FAO2a. La concentración final del alcohol utilizado en el experimento de especificidad por el sustrato era 200 μM. Estos mismos alcoholes fueron utilizados para determinar la Km y la Vmáx de FAO1, FAO2a, y FAO2a’. Se reportaron los perfiles de especificidad por el sustrato de FAO1, FAO2a, y FAO2a’ como porcentajes de actividad para dodecanol, con dodecanol arbitrariamente fijado en una actividad del 100%. La actividad de FAO1, FAO2a, y FAO2a’ con 1-alcanoles es mostrada en la Figura 4. En forma muy interesante, FAO1 prefirió 1-octanol como sustrato, siendo 1-tetradecanol el alcohol preferido de cadena más larga. En contraste, FAO2a y FAO2a’ prefirieron 1-dodecanol por encima de todos los demás 1-alcanoles. Hubo una gran caída en la actividad al pasar de un alcohol C8 a un alcohol C6 con FAO1, FAO2a, y FAO2a’. La actividad de las tres enzimas sobre 2-alcanoles es mostrada en la Figura 5. FAO2a y FAO2a’ oxidan 2-octanoles bastante bien; sin embargo no se detectó actividad con FAO1. En contraste, FAO1 oxida bien ácidos grasos w-hidroxi, pero no se midió actividad para ácidos grasos whidroxi con FAO2a y FAO2a’ (Figura 6). Estos resultados indican que FAO1 y FAO2a parecen ser enzimas muy diferentes, con diferencias significativas en la especificidad por el sustrato. En forma muy interesante, FAO2a y FAO2a’ oxidan 10-undecen-1-ol mucho mejor que FAO1. Dentro del error experimental, la especificidad por el sustrato de FAO2a y FAO2a’ es esencialmente la misma, indicando que tener una serina o una leucina en la posición del aminoácido 177 tiene poco o ningún efecto sobre la especificidad por el sustrato de la enzima. Aunque la especificidad por el sustrato de FAO2b no se llevó a cabo, debido a la cercana homología con FAO2a, es probable que sea muy similar.

Los extractos elaborados a partir de muestras del fermentador inducidas con HOSFFA mostraron buena actividad con ácido 16-hidroxihexadecanoico, pero ninguna actividad con 2-dodecanol (datos no mostrados). Por lo tanto, parece que FAO1 es inducida en un grado mucho mayor que FAO2a y, el menos en fermentaciones con HOSFFA, FAO1 parece ser la oxidasa de alcohol graso predominante.

Determinaciones de Km

Los valores de Km indican la afinidad de una enzima por el sustrato que está siendo investigado. Los valores de Km para la mayoría de los alcoholes que demostraron actividad con FAO1, FAO2a, y FAO2a’ se determinaron por medio de la medición de la actividad de la enzima mientras se mantenía constante la concentración de la enzima y variando la concentración del alcohol añadido a la mezcla de reacción.

La mayor parte de los valores de Km se determinaron a pH 7,6 utilizando el amortiguador HEPES/Triton X-100 y se disolvieron soluciones patrón de alcoholes, que fueron preparadas en concentraciones de 5 mM y/o 1 mM, en este mismo amortiguador. Para FAO2a’, se determinaron los valores de Km en HEPES 0,1 M, pH 7,6, y las soluciones patrón del sustrato se disolvieron en acetona. En este caso, todas las reacciones contenían la misma cantidad de acetona (20 μl/ml). Los resultados se muestran en la Tabla 6.

28

Tabla 6. Valores de Km para FAO1, FAO2a, y FAO2a’.

FAO1

FAO2a FAO2a’

Sustrato

Km Coeficiente de Correlación Rango deValores Bajo Alto Km Coeficiente de correlación Rango deValores Bajo Alto Km Coeficiente de correlación Rango deValores Bajo Alto

OctanolDecanolDodecanolTetradecanolHexadecanol2-Decanol 2-Undecanol 2-Dodecanol2-Hexadecanol 1,2-dodecanodiol 1,10-decanodiol1,16-hexadecanodiol10-undecen-1-ol 12-hidroxi-dodecanoico 16-hidroxihexadecanoico

41,0μM15,1μM14,9μM28,1μM11,9μMNRNRNRNRNR67,0μM10,3μM9,9 μM99,0μM7,4 μM 0,9996 0,99120,99380,99760,9998 0,9997 0,99950,9963 0,99300,9912 35,011,811,920,811,158,99,38,878,25,9 49,321,319,943,311,877,611,611,3134,49,9 503 μM74 μM2,5 μM4,6 μM56 μM934 μM141 μM41,3 μM 350 μM998 μM425 μM37,3 μM45 μMNRNR 0,9977 0,99900,99070,99680,9977 0,9991 0,9970 0,9990 0,9992 0,9935 0,9985 0,99690,9986 329,364,32,4 4,5 51,2823,2 125,939,60332,5720,2394,433,9 40,7 1069,2 85,92,54,861,71078,5 159,043,06370,01622,7 462,341,550,1 654 μM 69,6 μM 4,4 μM 2,4 μM 85 μM 1090 μM 162 μM75,3 μM 720 μM 928 μM 1607 μM 16,3 μM 36,1 μMNRNR 0,9976 0,9978 0,9928 0,9751 0,9987 0,9834 0,9913 0,9980 0,9982 0,9969 0,9975 0,9978 0,9916 323,565,13,92,278,4567,3150,967,9628,1742,61377,2 15,732,7 30607,9 74,84,42,593,513696,9 174,584,5844,21237,3 1927,5 16,940,4

Para la mayoría de los alcoholes analizados, FAO1 produjo valores de Km entre 10 - 20 μM. El valor más bajo de Km se encontró con el ácido 16-hidroxi-hexadecanoico. Utilizando ya sea FAO2a o FAO2a’ como enzima, los valores de Km para los diversos alcoholes fueron muy similares, demostrando nuevamente que tener una serina o una leucina en la posición del aminoácido 177 no tiene mucho efecto sobre la afinidad de la enzima por un sustrato particular. Para FAO2, los valores de Km fueron generalmente mucho más variables y produjeron valores en el rango de 2 μM hasta superiores a 1 mM. Los sustratos con los valores más bajos de Km fueron 1-dodecanol y 1-tetradecanol. Con base en estos resultados, es lógico que FAO1 parezca ser la oxidasa de alcohol graso predominante producida en fermentaciones de HOSFFA, ya que los ácidos grasos w-hidroxi son intermediarios en la oxidación de ácidos grasos hasta diácidos.

EJEMPLO 9

Amplificación de FAO1 en Candida tropicalis

En fermentaciones con HOSFFA como sustrato, los ácidos grasos w-hidroxi son producidos en niveles entre 0,1% hasta 0,5% (p/p) en caldo de fermentación. Esto indica que existe un menor cuello de botella en la segunda etapa en la producción de diácido, es decir la conversión del alcohol hasta el aldehído. Se encontró que este ácido graso whidroxi interfiere con la purificación del diácido y causa una pérdida significativa en la recuperación. Por lo tanto, es importante reducir el nivel de ácidos grasos w-hidroxi producidos en la fermentación. Ya que los análisis de especificidad por el sustrato y las determinaciones de Km realizadas con FAO1 y FAO2 indicaron que FAO1 era la oxidasa de alcohol graso predominante producida durante la fermentación con HOSFFA, se persiguió inicialmente la amplificación del gen FAO1.

Se prepararon casetes de amplificación con sitios de restricción para PacI en los extremos de los genes FAO1 y FAO2 como se describe en Materiales y métodos (Ejemplo 1). Sin embargo, ninguno de estos constructos ha sido probado en Candida tropicalis. Un constructo en el cual el promotor del gen CYP52A2 reemplazó al promotor nativo en FAO1 (SEQ ID NO: 7) fue exitosamente preparado y transformado dentro de Candida tropicalis. El gen CYP52A2 codifica una citocromo P450 monooxigenasa que hace parte del complejo de hidroxilasa responsable por catalizar la primera etapa en la producción de diácido, es decir la conversión del ácido graso en el alcohol. Por medio de la fusión de la región promotora de este gen con el ORF del gen FAO1, se planteó la hipótesis de que el gen de la alcohol oxidasa y la correspondiente enzima serían inducidas primero y más fuertemente que podría ser de otra manera. Esto haría más rápida la conversión al diácido y ayudaría a reducir el cuello de botella en este punto de la reacción. Se seleccionaron tres clones, llamados HDC40-1, HDC40-5 y HDC40-7 para analizar en los fermentadores. Por medio de la comparación de las intensidades de las bandas en un análisis de transferencias tipo Southern y estimando los números de copias, HDC40-1 parece tener un número bajo de copias (una copia adicional de FAO1); HDC40-5 tiene un número mayor de copias (dos copias adicionales); y HDC40-7 tiene múltiples copias adicionales por célula.

Estas cepas fueron analizadas en fermentaciones con HOSFFA como sustrato. La Figura 7 muestra que, bajo condiciones de fermentación similares, todas las cepas produjeron más diácido que la cepa base, H5343. Tanto HDC40-1 como HDC40-7 tenían valores iniciales similares de productividad hasta aproximadamente 24 h del período de bioconversión. HDC40-1, sin embargo, mantuvo un nivel más alto de productividad que HDC40-7 durante las siguientes 48 h. La Figura 8 muestra el nivel de ácidos grasos w-hidroxi producidos en cepas HDC40, con relación a la cepa base, H5343, que no tenía genes amplificados. Obsérvese que, aunque aún existen algunos ácidos grasos w-hidroxi producidos, los niveles son considerablemente reducidos, comparado con H5343. Un perfil de actividad de la alcohol oxidasa (Figura 9) determinado durante el transcurso de la fermentación demuestra que la alcohol oxidasa, como se esperaba, había sido considerablemente amplificada y es muy activa durante las primeras horas de la fermentación. Cuando se utiliza ácido ricinoleico como sustrato de fermentación en lugar de HOSFFA, se detectan altos niveles de ácidos grasos w-hidroxi (con relación a la cantidad de diácido producida) durante la fermentación. Por esta razón, las fermentaciones con ácido ricinoleico son una prueba más definitiva de la efectividad de la amplificación de FAO1. Cuando se compararon las fermentaciones de HDC40-1, HDC40-5 y HDC40-7, se descubrió que el número de copias del gen FAO1 estaba correlacionado en forma inversa con el reducido nivel de ácidos grasos w-hidroxi, es decir el porcentaje de ácidos grasos w-hidroxi producidos con relación al nivel total de producto oxidado (Figura 10).

EJEMPLO 10

Identificación de motivos firma únicos para FAO1 y FAO2.

Las secuencias de aminoácidos correspondientes a los genes objetivo FAO1 y FAO2 fueron examinados por la presencia de uno o más de las siete secuencias de péptidos identificadas por Slabas et al. (12) como indicativas de un gen FAO. La Tabla 7 muestra una comparación de los péptidos firma identificados por Slabas et al. entre los genes FOA1 y FAO2 de la presente invención, y el gen FAOT de C. tropicalis. También se comparan secuencias similares de la enzima FAO de Candida albicans (FAOCA). Como se refleja en la Tabla 7, todos los siete péptidos

30

FAOT están de acuerdo con los péptidos firma identificados por Slabas et al. Seis de los siete péptidos FAO1 pero únicamente cuatro de los siete péptidos FAO2 están de acuerdo con los péptidos firma. En forma muy interesante, aunque FAO2 es más cercano a FAOT en la identidad y similitud de la secuencia de aminoácidos (Tabla 3), FAO1 es más similar a FAOT cuando se comparan los siete péptidos firma.

El péptido 4 de FAO1 y de FAO2 (CGFCYLGC) es un péptido único, no encontrado en las FAO previamente caracterizadas. El péptido 1 de FAO2a y FAO2b (IIGSGAGAGVMA) así como el péptido 4 tanto de FAO1 [como de] FAO2a y FAO2b (CGFCYLGC) es también un péptido único, no encontrado en las FAO previamente caracterizadas.

31

Tabla 7. Comparación de los péptidos firma de FAO1 y FAO2 de Cognis con FAOT de C. tropicalis y FAOCA de C. albicans

Péptido 1

Péptido 2 Péptido 3 Péptido 4 Péptido 5 Péptido 6 Péptido 7

Péptidofirma1,2

IIGSG(X) GAGVVA (SEQ ID NO: 15) AGSTFGGG (SEQ ID NO: 18) NWSACLKTP(SEQ ID NO: 20) CG(X)CHLGC (SEQ ID NO: 22) IG(X)NL(X) LHPVS (SEQ ID NO: 24) SAHQMS(X) CRMSG (SEQ ID NO: 27) PTASG(X)NPM(SEQ ID NO: 30)

FAOT

IIGSGAGAGVVA (SEQ ID NO: 16) AGSTFGGG (SEQ ID NO: 18) NWSACLKTP(SEQ ID NO: 20) CGFCHLGC(SEQ ID NO: 23) IGKNLTLHPVS (SEQ ID NO: 25) SAHQMSTCRMSG (SEQ ID NO: 28) PTASGANPM (SEQ ID NO: 31)

FAO1

IIGSGAGAGVVA (SEQ ID NO: 16) AGSTFGGG (SEQ ID NO: 18) NWSACLKTP(SEQ ID NO: 20) CGFCYLGC(SEQ ID NO: 13) IGKNLTLHPVS (SEQ ID NO: 25) SAHQMSSCRMSG(SEQ ID NO: 29) PTASGANPM (SEQ ID NO: 31)

FAO2a

IIGSGAGAGVMA (SEQ ID NO: 14) AGSTLGGG(SEQ ID NO: 19) NWSACLKTP(SEQ ID NO: 20) CGFCYLGC(SEQ ID NO: 13) IGKNLTLHPVS (SEQ ID NO: 25) SAHQMSTCRMSG (SEQ ID NO: 28) PTASGANPM (SEQ ID NO: 31)

FAO2b

IIGSGAGAGVMA (SEQ ID NO: 14) AGSTLGGG(SEQ ID NO: 19) NWSACLKTP(SEQ ID NO: 20) CGFCYLGC(SEQ ID NO: 13) IGKNLTLHPVS (SEQ ID NO: 25) SAHQMSTCRMSG (SEQ ID NO: 28) PTASGANPM (SEQ ID NO: 31)

FAOCA

IIGSGAGSGVVA (SEQ ID NO: 17) AGSTFGGG (SEQ ID NO: 18) NWSACIKTP.(SEQ ID NO: 21) CGFCHLGC(SEQ ID NO: 23) IGANLTLHPVT (SEQ ID NO: 26) SAHQMSSCRMSG(SEQ ID NO: 29) PTASGANPM (SEQ ID NO: 31)

1 Los aminoácidos en negrilla indican las diferencias de aminoácidos con respecto al péptido firma 2 (X) indica que cualquier aminoácido puede estar en esta posición

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Eirich, L. Dudley Craft, David L.

<120> Genes y proteínas de oxidasa de alcohol graso de Candida tropicalis y métodos relacionados con los mismos

<130> U0154 (1010-92)

<150> 60/374.021

<151> 2002-04-19

<160> 72

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 4296

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1940)..(4051)

<400> 1

33

34

35

36

37

<210> 2

<211> 704

<212> PRT

38

<213> Candida tropicalis

<400> 2

39

40

41

42

<210> 3

<211> 4158

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1521)..(3632)

<400> 3

43

44

45

46

47

<210> 4

<211> 704

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 4

48

49

50

51

52

<210> 5

<211> 3753

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1099)..(3213)

<400> 5

54

55

56

57

<210> 6

<211> 704

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 6

58

59

60

61

<210> 7

<211> 3545

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1179)..(3290)

<400> 7

62

63

64

65

66

<210> 8

<211> 704

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 8

67

68

69

70

<210> 9

<211> 4158

<212> ADN

71

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1521)..(3632)

<400> 9

73

74

75

76

<210> 10

<211> 704

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 10

77

78

79

80

<210> 11

<211> 3753

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> CDS

<222> (1099)..(3213)

<400> 11

81

82

83

84

85

<210> 12

<211> 704

86

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 12

87

88

89

90

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 13

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 14

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> característica nueva

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

91

<400> 15

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 16

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 17

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 18

92

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 19

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 21

<210> 22

93

<211> 8

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> característica nueva

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 22

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 23

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> característica nueva

<222> (3)..(3)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

94

<221> característica nueva

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 24

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 25

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 26

<210> 27

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<220>

95

<221> característica nueva

<222> (7)..(7)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 28

<210> 29

<211> 12

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<220>

96

<221> característica nueva

<222> (6)..(6)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 30

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Candida tropicalis

<400> 31

<210> 32

<211> 24

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> característica nueva

<222> (3)..(3)

<223> y es c ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (6)..(6)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

97

<222> (9)..(9)

<223> y es c ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (12)..(12)

<223> y es c ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (15)..(15)

<223> y es c ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (16)..(16)

<223> y es c ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (18)..(18)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (21)..(21)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (24)..(24)

<223> y es c ó t

<400> 32 tgyggnttyt gytayytngg ntgy

<210> 33

<211> 36

98

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<220>

<221> característica nueva

<222> (3).. (3)

<223> h es a ó t ó c

<220>

<221> característica nueva

<222> (6)..(6)

<223> h es a ó t ó c

<220>

<221> característica nueva

<222> (9)..(9)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (10)..(10)

<223> wes a ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (11)..(11)

<223> s es g ó c

<220>

<221> característica nueva

<222> (12)..(12)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (15)..(15)

<223> n es a, c, g, ó t

99

<220>

<221> característica nueva

<222> (18)..(18)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (21)..(21)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (24)..(24)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (27)..(27)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (30)..(30)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (36)..(36)

<223> n es a, c, g, ó t

<400> 33 athathggnw snggngcngg ngcnggngtn atggcn 36

<210> 34

<211> 24

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

100

<220>

<221> característica nueva

<222> (3)..(3)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (6)..(6)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (7)..(7)

<223> wes a ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (8)..(8)

<223> s es g ó c

<220>

<221> característica nueva

<222> (9)..(9)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (12)..(12)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (13)..(13)

<223> y es c ó t

<220>

<221> característica nueva

101

<222> (15)..(15)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (18)..(18)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (21)..(21)

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> característica nueva

<222> (24)..(24)

<223> n es a, c, g, ó t

<400> 34 gcnggnwsna cnytnggngg nggn 24

<210> 35

<211> 18

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 35 tcgtggcgtg actctcct 18

<210> 36

<211> 18

<212> ADN

<213> Candida cloacae

<400> 36 tcatggagag actctcct 18

<210> 37

<211> 18

102

<212> ADN

<213> Candida cloacae

<400> 37 tcatggagag actctcca

<210> 38

<211> 16

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 38 ctggtgctgg tgtagt

<210> 39

<211> 16

<212> ADN

<213> Candida cloacae

<400> 39 caggagcagg tgtggt

<210> 40

<211> 16

<212> ADN

<213> Candida cloacae

<400> 40 cgggagcagg agtggt

<210> 41

<211> 19

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 41 ttggtaccca tgcttgtgg

<210> 42

<211> 19

103

<212> ADN

<213> Candida cloacae

<400> 42 ttggtaccca agcttgtgg

<210> 43

<211> 19

<212> ADN

<213> Candida cloacae

<400> 43 ttggtaccca agcttgtag

<210> 44

<211> 18

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 44 tcgtggcgtg actcccct

<210> 45

<211> 18

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 45 tcttggcgtg attccccg

<210> 46

<211> 18

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 46 gcctggcgtg attccccg

<210> 47

<211> 16

104

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 47 ccggtgctgg tgtcgt

<210> 48

<211> 16

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 48 ccggtgctgg tgtcat

<210> 49

<211> 16

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 49 ccggtgctgg tgtcat

<210> 50

<211> 19

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 50 ttggcaccca tggttgggg

<210> 51

<211> 19

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 51 ttggcaccca tggctgtgg

<210> 52

<211> 19

105

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 52 ttggcaccca tgcctgtgg 19

<210> 53

<211> 26

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 53 ccgaattcga catggctcca tttttg

<210> 54

<211> 30

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 54 ccggatccat tactacaact tggccttggt

<210> 55

<211> 26

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 55 ccagtgaatt cagatgaata ccttct

<210> 56

<211> 26

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 56 ccggatcccc gtctcactac aacttg

<210> 57

<211> 18

106

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 57

atcaacgcca ccccaacc 18

<210> 58

<211> 36

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 58

ggtttctcca taaacgagta cctgaaaggg tcaacc

36

<210> 59

<211> 18

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 59

atctgtctag caaaggtc 18

<210> 60

<211> 36

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 60

ggttgaccct ttcaggtact cgtttatgga gaaacc

36

<210> 61

<211> 31

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 61

ccttaattaa tgcatactcg gagcatatcg c

31

<210> 62

<211> 28

107

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 62 ccttaattaa tgggcggaat caagtgcc

<210> 63

<211> 30

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 63 ccttaattaa tctcaccaag tacgagaacg

<210> 64

<211> 28

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 64 ccttaattaa gacgcaagca caggtgcc

<210> 65

<211> 29

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 65 ccttaattaa agtctccaag ttgaccgac

<210> 66

<211> 26

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 66 aaatggagcc atggtcgtga tgtgtg

<210> 67

<211> 29

108

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 67

cacatcacga ccatggctcc atttttgcc

29

<210> 68

<211> 28

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 68

ccttaattaa tgggcggaat caagtgcc

28

<210> 69

<211> 29

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 69

ccttaattaa agtctccaag ttgaccgac

29

<210> 70

<211> 26

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 70

gaaggtattc atggtcgtga tgtgtg

26

<210> 71

<211> 29

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 71

cacatcacga ccatgaatac cttcttgcc

29

<210> 72

<211> 28

109

<212> ADN

<213> Candida tropicalis

<400> 72

ccttaattaa gacgcaagca caggtgcc 28

Referencias

1.

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Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una oxidasa de alcohol graso o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior al 90% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

2. 2.

   Una oxidasa de alcohol graso de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior al 95% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

3. 3.

   La oxidasa de alcohol graso de la reivindicación 1 ó 2 que comprende además un péptido firma que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13.

4. 4.

   Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una oxidasa de alcohol graso que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, o un análogo, derivado o fragmento enzimáticamente activo de la misma que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior al 90% cuando se la compara con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.

5. 5.

   La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 4 que contiene una secuencia de nucleótidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 1.

6. 6.

   Un vector que comprende una de las moléculas aisladas de ácido nucleico seleccionadas de entre el grupo que consiste de moléculas aisladas de ácido nucleico de la reivindicación 4 o la reivindicación 5.

7. 7.

   Los vectores de la reivindicación 6 en donde el vector es un vector plásmido, fagémido, fago, cósmido, o vector de ADN lineal.

8. 8.

   Una célula huésped que comprende uno de los vectores de la reivindicación 7.

9. 9.

   La célula huésped de la reivindicación 8 en donde la célula es una célula bacteriana, una célula de hongo, una célula de insecto, una célula de animal o una célula de una planta.

10. 10.

    La célula de hongo de la reivindicación 9 en donde la célula de hongo es una célula de levadura seleccionada de entre el grupo que consiste de Yarrowia sp., Bebaromyces sp., Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. y Candida sp.

11. 11.

    Un método para la producción de una proteína FAO1 que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, dicho método comprendiendo: la transformación de una célula huésped adecuada con una secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la SEQ ID NO: 2, y el cultivo de la célula bajo condiciones que favorezcan la expresión de la proteína FAO1.

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