JP2014079218A - 糖脂質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を欠失、変異又は発現抑制した形質転換体、並びに該形質転換体を用いた糖脂質の製造方法。(a)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質(b)前記アミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質(c)前記アミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【選択図】なし
Description
アルキルグリコシドやソホロース脂質の工業的生産は、主に糖とアルコールを原料とした化学合成により行われているが、原料アルコールを多量に必要とし、高温・高圧下での反応を行うために原料グルコースが変性してしまう等の問題がある。
このような実情から、より効率のよい生産方法を求めて、微生物を用いた糖脂質の製造技術が検討されている。例えば、酵母の1種であるカンジダ・ボンビコーラ(Candida bombicola)を、糖とアルコールを含有する培地で培養すると、生産物としてアルキルソホロシドやソホロース脂質が得られることが知られている(特許文献1及び非特許文献1参照)。
そこで、本発明は、常温・常圧下で糖脂質を生産性よく製造することができる微生物形質転換体、及び当該形質転換体を用いた糖脂質の製造方法を提供することを課題とする。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(1)前記形質転換体を、アルコール及び糖を含有する培地で培養する工程、及び
(2)得られた培養物から糖脂質を採取する工程
また、本発明は、前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質(以下、「本発明のタンパク質」ともいう)、に関する。
本発明のタンパク質は、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質(以下、「本発明のアルコールオキシダーゼ」ともいう)である。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
微生物のアルコール酸化酵素には、アルコールオキシダーゼ(以下、「AOX」とも略記する)やアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)があり、ともにアルコールをアルデヒドに酸化する反応を触媒する。カンジダ・ボンビコーラのアルコール酸化酵素については、これまで詳しくわかっておらず、今回本発明者らにより初めてアルコールオキシダーゼ及びその遺伝子が同定された。当該タンパク質は、後述の実施例で示すように、アルコールオキシダーゼ活性を有する。カンジダ・ボンビコーラのアルコールオキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号1に、遺伝子の塩基配列を配列番号2に示す。
前記(b)において、アミノ酸配列の同一性は、糖脂質の生産性向上の観点から、80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましい。
本発明においてアミノ酸配列の同一性とは、比較する2つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列(アラインメント)させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性(%)をいう。アミノ酸配列の同一性は通常の方法により解析することができ、例えば、BLASTアルゴリズムを実装したNCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)のblastpや、Genetyx Win実装のHomology search、などにより算出することができる。
なお、これらのタンパク質がアルコールオキシダーゼ活性を有することは、該タンパク質をコードする遺伝子を破壊して菌体内のアルコールオキシダーゼ活性を測定する方法、又は大腸菌等で該タンパク質を生産し、そのアルコールオキシダーゼ活性を測定する方法等により確認することができる。アルコールオキシダーゼ活性の測定には、後述の実施例で用いた方法等を用いることができる。
本発明の遺伝子は、前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子(以下、「本発明のアルコールオキシダーゼ遺伝子」ともいう)である。
前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の具体例として、下記(d)〜(f)のいずれかのDNAからなる遺伝子が挙げられる。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(e)配列番号2で表される塩基配列と50%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(f)配列番号2で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
本発明において塩基配列の同一性とは、比較する2つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列(アラインメント)させ、得られる最大の塩基配列の同一性(%)をいう。塩基配列の同一性は通常の方法により解析することができ、例えば、BLASTアルゴリズムを実装したNCBI BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)のblastpや、Genetyx Win実装のHomology search、などにより算出することができる。
配列番号1に示すアミノ酸配列又は配列番号2に示す塩基配列に変異を導入する場合、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing overlap extension(SOE)PCR反応(Horton et al.,Gene 77,61−68,1989)を利用した方法、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene,152,271-276,1995))、Kunkel法(Kunkel,T. A.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1985,82,488)等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット(タカラバイオ社)、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット(Clonetech社)、KOD-Plus-Mutagenesis Kit(東洋紡社)等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。具体的には、ランダムにクローニングしたDNA断片を用いて相同組換えを起こさせる方法や、γ線等を照射することによりランダムな遺伝子の変異が可能である。
本発明の形質転換体は、前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下したものである。当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制されることにより、本発明の形質転換体は、形質転換前の宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下する。その結果、形質転換体内のアルコール代謝経路が阻害され、糖脂質合成の原料となるアルコールがアルコール代謝経路で消費されることなく糖脂質合成に有効利用されるため、糖脂質の生産性が向上すると推測される。
形質転換体の宿主としては、前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有するものであればよい。糖脂質の生産性向上の観点から、宿主として好ましくは、前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。
当該微生物としては、取り扱い性の向上、糖脂質の生産性向上の観点から、酵母が好ましい。当該酵母としては、カンジダ(Candida)属に属する菌類、ロドトルラ(Rhodotorula)属に属する菌類、ピチア(Pichia)属に属する菌類、ウィケルハミエラ(Wickerhamiella)属に属する菌類、又はスターメレラ(Starmerella)属に属する菌類等が挙げられる。
前記カンジダ(Candida)属に属する菌類としては、Candida bombicola(別名:Starmerella bombicola)、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellata等が挙げられる。
ロドトルラ(Rhodotorula)属に属する菌類、ピチア(Pichia)属に属する菌類、ウィケルハミエラ(Wickerhamiella)属に属する菌類、又はスターメレラ(Starmerella)属に属する菌類としては、Rhodotorula bogoriensis、Pichia anomala PY1、又はWickerhamiella domericqiae等が挙げられる。
これらのなかでも、糖脂質の生産性向上の観点から、カンジダ(Candida)属に属する菌類が好ましく、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、又はCandida stellataがより好ましく、Candida bombicolaがさらに好ましい。
なお、上記宿主微生物は、ATCC(American Type Culture Collection)、NBRC (Biological Resource Center, NITE)等の生物遺伝資源ストックセンター等から入手することができる。
このような相同組換えによる標的遺伝子の欠失・変異・発現抑制方法は、例えば、Besher et al., Methods in molecular biology 47,p.291-302, 1995等の文献を参考に行うことができる。
例えば電気パルス法により行う場合、対数増殖期まで増殖させた宿主細胞と、相同組換え用のDNA断片やプラスミドとをソルビトール溶液等に懸濁して、電気パルスを加えればよい。相同組換え用のDNA断片やプラスミドと宿主細胞とを接触させる際に、サーモンスパームDNA等のキャリアDNAや、ポリエチレングリコール等を添加することにより、形質転換頻度を高めることも好ましい。電気パルスの条件は、タイムコンスタント値(電圧が最大値の約37%にまで減衰するまでの時間)が約10から20ミリ秒で、パルス後の生菌率が約10〜40%となる条件とすることが好ましい。電気パルスを加えた後、菌液をソルビトール溶液を含む培地にまいて形質転換体を選択する。
目的遺伝子が欠失した形質転換体の選択は、形質転換体からゲノムDNAを抽出して、目的遺伝子部位を含む領域を対象としてPCRを行う方法、又は目的遺伝子領域に結合するDNAプローブを用いたサザンブロッティング法、等により行うことができる。
本発明の糖脂質の製造方法は、上述した形質転換体を用いて行われ、下記(1)及び(2)の工程を含む。
(1)前記形質転換体をアルコール及び糖を含有する培地で培養する工程、及び
(2)得られた培養物から糖脂質を採取する工程
なお、本発明において形質転換体を培地で培養するとは、微生物や動植物あるいはその細胞・組織の培養はもちろん、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。また、培養物には、培養・栽培等した培地及び形質転換体が含まれる。
前記アルコールは、得られた糖脂質を界面活性剤として用いる観点から、炭素原子数10以上22以下、より好ましくは炭素原子数12以上18以下、さらに好ましくは炭素原子数12以上14以下のアルコールであることが好ましい。また、前記アルコールは、同様の観点から、1級又は2級アルコールであることが好ましい。
好ましいアルコールの具体例としては、1−デカノール、1−ウンデカノール、1−ドデカノール、1−トリデカノール、1−テトラデカノール、1−ペンタデカノール、1−ヘキサデカノール、1−ヘプタデカノール、1−オクタデカノール、1−オレイルアルコール、1−イコサノール、1−ドコサノール等の1級直鎖飽和又は不飽和アルコール、2−デカノール、2−ウンデカノール、2−ドデカノール、2−トリデカノール、2−テトラデカノール、2−ペンタデカノール、2−ヘキサデカノール、2−ヘプタデカノール、2−オクタデカノール等の2級飽和又は不飽和アルコール等が挙げられる。なかでも、1−ウンデカノール、1−ドデカノール、1−トリデカノール、1−テトラデカノール、1−ペンタデカノール、1−ヘキサデカノール、2−ウンデカノール、2−ドデカノール、2−トリデカノール、2−テトラデカノール、2−ペンタデカノール、2−ヘキサデカノールが好ましく、1−ドデカノール、1−トリデカノール、1−テトラデカノール、2−ドデカノール、2−トリデカノール、2−テトラデカノール、2−ペンタデカノールがより好ましく、1−テトラデカノールがさらに好ましい。
前記糖は、入手性及び取り扱い性の向上の観点から、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デンプン加水分解物(水あめ)、セルロース加水分解物、又は廃糖蜜(モラセス)が好ましい。なかでも、得られた糖脂質を界面活性剤として用いる観点から、グルコース、マルトース、又は廃糖蜜がより好ましく、グルコースがさらに好ましい。
例えば、宿主が微生物の場合、炭素源としてソルビトールやグリセリン等の糖アルコール類、クエン酸などの有機酸類等、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア水、尿素、大豆タンパク質、麦芽エキス、アミノ酸、ペプトン、コーンスティーブリカー等、無機塩類としてマンガン塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、鉄イオン、銅イオン、硫酸塩、リン酸塩等、ビタミン類としてビオチン、イノシトール等を用いることができる。
特に、宿主が酵母の場合には、窒素源として酵母エキス、塩化アンモニウム、尿素等、無機塩類として硫酸マグネシウム・7水和物、塩化ナトリウム、塩化カルシウム・2水和物、リン酸2水素カリウム、リン酸水素2カリウム等を用いることが好ましい。場合によっては消泡剤などを添加してもよい。
例えば、宿主が微生物の場合には、培地のpHは2.5〜9.0程度に調節することが好ましい。pHの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養温度は15〜35℃程度が好ましく、25〜32℃程度がより好ましい。培養時間は6〜200時間程度が好ましく、24〜148時間程度がより好ましい。必要により通気や攪拌を加えてもよい。
特に、宿主が酵母の場合には、培地のpHは用いる酵母が生育し得る範囲、例えば、pH3.0〜8.0程度に調節することが好ましい。培養温度は15〜35℃程度が好ましく、28〜32℃程度がより好ましい。培養時間は48〜148時間程度が好ましく、振盪又は通気撹拌培養することが好ましい。
糖脂質を単離、回収する方法としては特に限定されず、通常微生物の培養上清から糖脂質成分を単離する際に用いられる方法により行うことができる。例えば、疎水やイオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理等の方法を用いることができる。
本発明の製造方法により製造された糖脂質は、界面活性剤として洗剤、乳化剤、抗菌剤として香粧品等に用いることができる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と50%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個(好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
<2> 前記宿主が微生物である、<1>項記載の形質転換体。
<3> 前記微生物が酵母である、<2>項記載の形質転換体。
<4> 前記酵母が、カンジダ(Candida)属に属する菌類である、<3>項記載の形質転換体。
<5> 前記カンジダ(Candida)属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、<4>項記載の形質転換体。
<6> 前記カンジダ(Candida)属に属する菌類が、Candida bombicolaである、<5>項記載の形質転換体。
(1)<1>〜<6>のいずれか1項に記載の形質転換体を、アルコール及び糖を含有する培地で培養する工程、及び
(2)得られた培養物から糖脂質を採取する工程
<8> 前記アルコールが、炭素原子数10以上(好ましくは12以上)22以下(好ましくは18以下、より好ましくは14以下)の1級又は2級アルコールである、<7>項記載の製造方法。
<9> 前記糖脂質が、アルキルグリコシド又はソホロース脂質である、<7>又は<8>記載の製造方法。
<11> 下記(d)〜(f)のいずれかのDNAからなる、<10>項記載の遺伝子。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA
(e)配列番号2で表される塩基配列と50%以上(好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(f)配列番号2で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
<12> 前記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
カンジダ(Candida)属酵母の培養には、以下の培地を使用した。各培地は、121℃、20分のオートクレーブ後に混ぜ合わせて使用した。
また、前培養はφ24mm×200mm大型試験管(YPD培地5mL仕込み)にて30℃、250rpmで48時間振盪培養した種培養液を、φ24mm×200mm大型試験管(AG生産培地5mL仕込み)に2%(v/v)植菌し、30℃、250rpmで振盪培養した。
YPD培地: 1% (D)-グルコース、1% BactoTM Yeast Extract(日本BD社製)、1% BactoTM Tryptone(日本BD社製)
AG生産培地: 15% (D)-グルコース、0.41% クエン酸3ナトリウム(無水)、0.4% BactoTM Yeast Extract、0.154% 塩化アンモニウム、0.07% 硫酸マグネシウム・7水和物、0.05% 塩化ナトリウム、0.027% 塩化カルシウム・2水和物、0.1% リン酸2水素カリウム、0.012% リン酸水素2カリウム (1M HCLにてpH 5.8に調整)
最小培地: 0.68% Yeast nitrogen base without amino acids(日本BD社製)、2%(D)-グルコース
アルコール資化培地: 0.68% Yeast nitrogen base without amino acids(日本BD社製)、0.05% BactoTM Yeast Extract、2%炭素源
カンジダ・ボンビコーラのゲノムDNAは、φ24mm×200mm大型試験管(YPD培地、5mL仕込み)にて30℃、250rpmにて48時間振盪培養した培養液を、4℃、15000rpmにて1分遠心分離し集めた菌体から、Genとるくん(酵母用)High Recovery(タカラバイオ社製)によって抽出した。
[PCR]
PCR反応にはPrimeStar Max DNA Polymelase(タカラバイオ社製)を用い、添付のプロトコールに従い操作した。
1.カンジダ・ボンビコーラ(Candida bombicola)のEST解析
NBRC (Biological Resource Center, NITE)から入手した、カンジダ・ボンビコーラ NBRC10243株を、50g/L YPD Broth(日本BD社製)5mL入り100mL容試験管に一白金耳植菌し、30℃、250rpm、48時間培養した。得られた前培養液をSL培地(10% (D)-グルコース、10% パルミチン酸エチル(東京化成工業社製)、1% 尿素、0.5% BactoTM Yeast Extract(日本BD社製)、塩酸にてpH5.0となるよう調整)5mLに、2%植菌した。培養器は100mL試験管を用い、30℃、250rpmで培養した。cDNAを作成するRNA源として、培養48時間の培養菌体を用いた。
RNAの抽出は、サンプリング後の菌体よりRNeasy Mini Kit(キアゲン社製)を用い、方法は添付のプロトコールを1部改変した。1mL Buffer Y1を添加し30℃で30分振とうする際に、バッファーにザイモリエイス-20Tを100U/mLとなるよう添加し、細胞壁を溶解させた。得られたRNAよりSMARTer cDNA synthesis kit(Clontech社製)を用いて、完全長cDNAライブラリを合成した。EST解析は株式会社ジナリスに委託し、cDNA配列情報、およびアノテーションデータを得た。
得られたDNA配列をもとに、アルコールオキシダーゼのホモログを探索した。既知のアルコールオキシダーゼと相同性の高い配列は認められなかったが、Candida tropicalis由来AOX 2(Genbank:AAS46880.1)とアミノ酸配列として35% Identityと弱い相同性を示す配列が発見された。この塩基配列を配列番号2に示し、この塩基配列からなる遺伝子を900c 0002遺伝子と名づけた。また、当該遺伝子がコードするアミノ酸配列を、配列番号1に示した。
次に、カンジダ・ボンビコーラ KSM36株(FERM−BP 799)から、900c 0002遺伝子を探索した。その結果、KSM36株も、配列番号1の塩基配列と全く同じ配列の遺伝子を有していることがわかった。
(1)カンジダ・ボンビコーラ ウラシル遺伝子変異株の取得
I. V. Bogaertら, Yeast(2008),25,p.273−278.に記載の手法により、カンジダ・ボンビコーラ KSM36株より、ウラシル要求性株を選抜した。さらに、ウラシル要求性株の中から、ura3遺伝子領域に変異が挿入された株を選抜し、KSMΔura3株とした。
次いで、KSM36株、NBRC10243株、KSMΔura3株のura3遺伝子領域の配列を解析したところ、KSM36株のura3遺伝子配列は、NBRC10243株のura3遺伝子配列(GenBank Accession No. DQ916828)と同一であった。一方、KSMΔura3株では、一塩基変異により、54位のシステイン(Cys)がチロシン(Tyr)に変化していた(図1)。
KSMΔura3株は最小培地では生育できず、5-フルオロオロチン酸添加YPD培地、及びウラシル添加最小培地にて生育可能であった。また、KSMΔura3株に、NBRC10243株由来の野生型ura3遺伝子を、上記IAN Van Bogaertらの手法にて導入したところ、最小培地にて生育可能となった。また、本菌株は、培地にウラシルを添加した場合、ソホロリピッド生産能は親株であるKSM36株と同等であった。
900c 0002遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを、下記の手法で構築した。
pUC-ΔAOXは、900c 0002遺伝子の上流約1000bp、及び下流約1000bpの領域と相補する配列を有し、当該領域間にura3遺伝子が挿入されるよう設計した。
カンジダ・ボンビコーラ KSM36株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRプライマーとしてAOX1 US in F1(5’-AGCTTGCATGCCTGCTTTAAATCCAGAAAGAACTG-3’)(配列番号3)及びAOX1 US-ura R(5’-CGAAAAATATGTACTGATAACTGCGTCAGTCATTG-3’)(配列番号4)、Pura3 F(5’-AGTACATATTTTTCGAAACAGCTCGCAA-3’)(配列番号5)及びura3 R(5’-CTAAGAAACTCATCTTGACTGAACTTTTC-3’)(配列番号6)、ura-AOX1 LS F(5’-AGATGAGTTTCTTAGAAGCCTTATATCGAATACAC-3’)(配列番号7)、AOX1 LS in R1(5’-ATTCGAGCTCGGTACGACACTTCTCAGGAACCCTC-3’)(配列番号8)を用い、900c 0002遺伝子の上流約1000bpの領域、ura3遺伝子、900c 0002遺伝子の下流約1000bpの領域のDNA断片を増幅した。
次に、プラスミドpUC118を鋳型とし、PCRプライマーpUC in F2(5’-GTACCGAGCTCGAATTCGT-3’)(配列番号9)及びpUC in R2(5’-GCAGGCATGCAAGCTTGGC-3’)(配列番号10)を用いてプラスミド領域を増幅し、これをInfusion HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて、上記のDNA断片と結合した。得られたプラスミドを、大腸菌DH5αに導入し、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含むLB寒天培地上にて培養し、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、目的の900c 0002遺伝子欠失用プラスミドpUC-ΔAOXを得た。
M. D. DE. Backerら, Yeast(1999), 15,p.1609−1618.の手法に従い、pUC-ΔAOXを用いてKSMΔura3株を形質転換した。具体的には、KSMΔura3株を300ppmのウラシルを添加したYPD培地5mLに植菌し、30℃、250rpm、48時間前培養した。培養液0.5mLを300ppmのウラシルを添加したYPD培地50mLに接種し、30℃、120rpmで約6時間培養した。生育した菌体を集菌した後、氷冷した滅菌水20mLで菌体を2回洗浄した。菌体を、氷冷した1mLの1M ソルビトール溶液に懸濁し、5000rpmで5分間遠心し、上清を捨てた後、400μLの1M ソルビトールを加えて懸濁した。菌体懸濁液を50μLずつ分注し、pUC-ΔAOXを2.5μg加えた。菌体懸濁液を、BIO-RAD GENE PULSER II(バイオラッド社製)を用いてエレクトロポレーションした後、1M ソルビトールを含む最小培地にまいて、30℃で1週間培養した。
得られた形質転換体から、PCR法により、900c 0002遺伝子の上流及び下流領域での二重交叉による相同組換えが生じた株を選抜した。得られた形質転換体よりゲノムDNAを抽出し、プライマーAOX1 US in F1(5’-AGCTTGCATGCCTGCTTTAAATCCAGAAAGAACTG-3’)(配列番号3)及びAOX1 LS in R1(5’-ATTCGAGCTCGGTACGACACTTCTCAGGAACCCTC-3’)(配列番号8)を用いてPCRを行った。この結果、得られた形質転換体あたり70%の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔAOX株とした。
900c 0002遺伝子欠失株の対照菌株として、KSMΔura株に、900c 0002遺伝子が欠失しないように、野生型ura3遺伝子をKSMΔura株の変異ura3領域に導入した株を作製した。
カンジダ・ボンビコーラ KSM36株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、プライマーPura3 F(5’-AGTACATATTTTTCGAAACAGCTCGCAA-3’)(配列番号5)、及びura3 R2(5’-TTCATCATCGTCACTATA-3’)(配列番号11)を用いて、PCR法にてura3領域のDNA断片を増幅した。得られたDNA断片を、Mighty Cloning Reagent Set Blunt End(タカラバイオ社製)を用いて、pUC118DNA HincII/BAP(タカラバイオ社製)へ挿入し、プラスミドpUC-ura3を得た。
プラスミドpUC-ura3を用い、上記(3)と同様の手法にてKSMΔura株に導入した。得られた形質転換体よりゲノムDNAを抽出し、プラスミド領域に設計したプライマーpUC seq 1(5’-GGCGAAAGGGGGATGTGC-3’)(配列番号12)及びpUC seq 2(5’-GCACCCCAGGCTTTACAC-3’)(配列番号13)を用いて、PCRによる組換えの確認を行った。この結果、得られた形質転換体あたり11%の確率で二重交叉による相同組換え株が得られ、これをKSMΔura-ura株とした。
カンジダ・ボンビコーラ KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて30℃、250rpm、48時間、前培養した。前培養液を、炭素源として(D)-グルコース、1-テトラデカノール、1-ヘキサデカノール、及び2-テトラデカノールのいずれかを含むアルコール資化培地、又は炭素源を含有しない培地にそれぞれ0.01%植菌し、30℃、250rpmにて培養し、生菌数を測定した。培養時間と生菌数との関係を図2に示す。図2において、glcは(D)-グルコースを、C14olは1-テトラデカノールを、C16olは1-ヘキサデカノールを、2-C14olは2-テトラデカノールを、それぞれ炭素源として用いたことを示す。
炭素源としてアルコールを用いた場合、KSMΔura-ura株では1-テトラデカノール、1-ヘキサデカノール、又は2-テトラデカノール含有培地で生育した。一方、KSMΔAOX株では1-テトラデカノール、1-ヘキサデカノール、及び2-テトラデカノールのいずれの含有培地でも生育しなかった。
これらの結果から、KSMΔura-ura株はアルコールをアルデヒドに酸化して炭素源として利用することができるが、KSMΔAOX株はアルコールを炭素源として利用できず、アルコール資化能が消失していることがわかった。
カンジダ・ボンビコーラ KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて30℃、250rpm、48時間、前培養した。前培養液を、炭素源として(D)-グルコース、及び1-ヘキサデカノールを10g/Lずつ添加したアルコール資化培地に1%植菌し、30℃、250rpmにて48時間培養した。培養後の菌体からミクロソーム膜タンパク質画分を調製し、アルコールオキシダーゼ活性(AOX活性)を測定した。なお、微生物のアルコールオキシダーゼは膜タンパク質画分に局在することが知られている。
[ミクロソーム膜タンパク質画分の調製]
培養後の菌体20mLを、8000rpm、4℃にて10min遠心して集菌した後、菌体を10mLの生理食塩水で2回洗浄した。菌体を1/15M リン酸バッファー(pH7.4) 500μLを加え懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械製)、及び媒体に0.5mmグラスビーズを用いて破砕した。500μLの1/15M リン酸バッファー(pH7.4)を添加、混合し、破砕液を4℃、3000gで5分遠心し、破砕されなかった菌体を除去した。上清を4℃、20000gで60分遠心し、ミトコンドリアとペルオキシソーム画分を除去した。残った上清を回収し、4℃、100000gで90分遠心し、沈殿を回収し200μLの1/15M リン酸バッファー(pH7.4)を添加し懸濁した。この懸濁液を、ミクロソーム膜タンパク質画分として、以下のアルコールオキシダーゼ活性の測定に用いた。
0.1M リン酸バッファー(pH7.4) 100μL、2.8g/L 2,2’-azino-di [3-ethylbenzothiazoline-(6)-sulfonic acid](ABTS)溶液 50μL、horseradish peroxidase 47units/mL溶液 30μL、及びミクロソーム膜タンパク質画分 10μLを混合し、30℃で5分インキュベートした。その後、5mM 1-ドデカノール DMSO溶液 10μLを添加し、0分、及び5分後の405nmにおける吸光度を測定した。アルコールオキシダーゼは、1μmolのアルコールを酸化し、2μmolのラジカルカチオンを産生する。1mMのラジカルカチオン型ABTSは405nmで18.4の吸光度を示すが、これは0.5mMの酸化された基質と同義である。そこで、1分間に0.0368の吸光度変化を、アルコールオキシダーゼ活性の1Uと定義した。
ミクロソーム膜タンパク質1gあたりのアルコールオキシダーゼ活性を図3に示す。
カンジダ・ボンビコーラ KSM36株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、プライマーAOX F(5’-gaaggagatatacatatgactgacgcagttatcctc-3’)(配列番号14)、及びAOX R(5’-agtgcggccgcaagctagcttagtttgaagcttag-3’)(配列番号15)を用いて、PCR法にて、900c 00002遺伝子のDNA断片を増幅した。また、プラスミドpET21a(Novagen社製)を鋳型とし、プライマーpET21 F(5’-gcttgcggccgcactcgag-3’)(配列番号16)、及びpET21 R(5’-atgtatatctccttcttaaag-3’)(配列番号17)を用いて、PCR法にてDNA断片を増幅した。得られた二つのDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて融合し、プラスミドpET-AOXを得た。
プラスミドpET-AOXを、大腸菌BL21(DE3)(フナコシ社製)に導入し、BL21(DE3)-pET-AOX株を得た。また、対照菌株として、プラスミドpET21aを大腸菌BL21(DE3)に導入したBL21(DE3)-pET株を作成した。
これらの組み換え株を、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含有したLB培地(和光純薬工業社製)で37℃、250rpmで12時間培養した後、100ppmのアンピシリンナトリウム塩を含有したLB培地に1%植菌し、37℃、250rpmで2.5時間培養した。続いて、終濃度が0.1mMとなるよう1M IPTG溶液を添加し、25℃、250rpmで16時間培養した。培養後の菌体5mLを、15000rpm、4℃にて2min遠心して集菌した後、菌体を1mLの生理食塩水で2回洗浄した。菌体に、1/15M リン酸バッファー(pH7.4) 500μLを加えて懸濁し、マルチビーズショッカー(安井器械社製)、及び0.1mmグラスビーズを用いて破砕した。破砕液を4℃、15000rpmで5分遠心し、破砕されなかった菌体を除去した。残った上清を回収し、タンパク質濃度解析、SDSポリアクリルアミド電気泳動解析(SDS-PAGE)とアルコールオキシダーゼ活性の測定を行った。
電気泳動の結果を図4に示す。図4において、レーン1は対照菌株であるBL21(DE3)-pET株を、レーン2は900c 0002遺伝子を導入したBL21(DE3)-pET-AOX株を、それぞれ示す。
アルコールオキシダーゼ活性の測定は、前記4.と同様に行った。なお、活性測定の基質として1−ドデカノールを用いた。結果を図5に示す。
また、図5から、900c 0002遺伝子を導入、発現したBL21(DE3)-pET-AOX株では、アルコールオキシダーゼ活性が確認された。一方、BL21(DE3)-pET株では、アルコールオキシダーゼ活性が確認されなかった。
これらの結果から、上記1.で単離された900c 0002遺伝子は、長鎖アルコールに作用する新規アルコールオキシダーゼ遺伝子であると考えられる。
KSMΔura-ura株、及びKSMΔAOX株を、YPD培地にて、30℃、250rpmで48時間前培養した。前培養液を、AG生産培地30mL仕込み500mL坂口フラスコに2%植菌し、30℃、120rpmにて48時間培養した後、基質として1-テトラデカノールを10g/Lとなるよう添加した。
基質添加から72時間培養後の培養液を、下記のLC-MS分析及びGC分析に供した。
装置はUFLC 20A-LCMS 2020(島津製作所社製)を用い、カラムとしてL-column ODS 4.6 x 150mm, 5μm(化学物質評価研究機構)を用いた。溶離液Aに0.01M 酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Bに0.01M酢酸アンモニウムメタノール溶液を用い、流量1mL/分、カラムオーブン温度40℃、50%(5分)→20%/min→90%→95%(5分)→100%(30分)のタイムプログラムにて行った。検出はネガティブイオンモードにて行った。
これらのピークは、アセチルテトラデシルマルトシドの分子量が580.3、2アセチルテトラデシルマルトシドの分子量が622.5であること、及びS. Fleurackersら、Eur. J. Lipid Sci. Technol. (2010),112,p.655−662から判断して、10.068分のピークが下記構造式1に示すアセチルテトラデシルソホロシド(1-O-tetradecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)6’acetate)、11.275分のピークが下記構造式2に示すアセチルテトラデシルソホロシド(1-O-tetradecyl-(2’-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside)6’,6’’diacetate)であると考えられる。
培養液5mLより内部標準として1-オクタデカノールを0.05%添加した1-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った。次に、遠心エヴァポレーターにて乾固し、1M NaOH水溶液を添加し、100℃で4時間処理した。続いて、1-ブタノール2.5mLにて2回抽出を行った後、遠心エヴァポレーターにて乾固し、トリメチルシリル(TMS)化試薬を用いて誘導体化した。TMS化したサンプルを以下のGC-FID法にて解析し、糖脂質生産量、及び残存基質量を得た。
GCは、装置として7890A(アジレント・テクノロジー社製)、カラムとしてDB-1 ms 25m×0.20mm×330μm(J&W scientific社製)、移動相に高純度ヘリウムを用い、流量1mL/min、昇温プログラム100℃(1分)→10℃/分→300℃(10分)にて行った。標準物質としてn−ドデシルマルトシド(CALBIOCHEM社製)を用い、18分から19.5分に検出されるアルキルグルコシド由来のピークを積算し、アルキルグルコシド量として算出した。
GC分析の結果を図6に示す。なお、図6において、1-C14olは1-テトラデカノール、ISは内部標準として用いた1-オクタデカノール、AGはアルキルグルコシドのピークをそれぞれ示す。
この結果から、KSMΔura-ura株では、アルコール及び糖を基質として加えてもアルキルグルコシドはほとんど産生しないが、KSMΔAOX株はアルコール及び糖からアルキルグルコシドを産生することがわかった。
Claims (10)
- 下記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子が欠失、変異又は発現抑制され、該宿主と比べてアルコールオキシダーゼ活性が低下した形質転換体。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質 - 前記宿主が微生物である、請求項1記載の形質転換体。
- 前記微生物が酵母である、請求項2記載の形質転換体。
- 前記酵母がカンジダ(Candida)属に属する菌類である、請求項3記載の形質転換体。
- 前記カンジダ(Candida)属に属する菌類が、Candida bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、及びCandida stellataからなる群より選ばれる、請求項4記載の形質転換体。
- 下記(1)及び(2)の工程を含む、糖脂質の製造方法。
(1)請求項1〜5のいずれか1項に記載の形質転換体を、アルコール及び糖を含有する培地で培養する工程、及び
(2)得られた培養物から糖脂質を採取する工程 - 前記アルコールが、炭素原子数10以上22以下の1級又は2級アルコールである、請求項6記載の製造方法。
- 前記糖脂質が、アルキルグリコシド又はソホロース脂質である、請求項6又は7記載の製造方法。
- 下記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質 - 下記(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列と50%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルコールオキシダーゼ活性を有するタンパク質
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