CN116348602A - 角鲨烯何帕烯环化酶衍生物及其用于生产降龙涎香醚的用途 - Google Patents
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Abstract
提供了从莫氏葡糖杆菌(Gluconobacter morbifer)分离的角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)的变体,以及使用变体莫氏葡糖杆菌SHC将均法呢醇生物催化转化为降龙涎香醚的方法。
Description
背景技术
具有十二氢萘并[2,1-b]呋喃骨架的化合物作为芳香化学品具有重要的经济意义。其中,被称为降龙涎香醚(ambrox)的(3aR,5aS,9aS,9bR)-十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃)对于提供香料组合物的基调特别重要。最初是从抹香鲸的龙涎香中获得的,现在已经开发出生产降龙涎香醚的合成方法。在一种路径中,香紫苏(快乐鼠尾草(Salvia sclarea))的成分香紫苏醇被用作起始材料。用例如铬酸、高锰酸盐、H2O2或臭氧对香紫苏醇进行氧化降解提供香紫苏内酯,随后用例如LiAlH4或NaBH4将其还原得到降龙涎香醚-1,4-二醇。可替代地,可以通过使用Hyphozyma roseoniger(EP 0204009)进行的生物转化从香紫苏醇制备香紫苏内酯。最后,降龙涎二醇(ambra diol)或四降半日花烷二醇(tetranor labdane diol)在一系列化学过程中环化,得到化合物降龙涎香醚((-)-2)。除其他外,降龙涎香醚的外消旋体rac-2的制备已经通过均法呢酸(homofarnesylic acid)和4-(2,6,6-三甲基环己-1-烯基)丁-2-酮完成。
在另一种路径中,使用角鲨烯何帕烯环化酶(SHC;方案1)生物催化制备降龙涎香醚(Neumann等人(1986)Biol.Chem.[生物化学]Hoppe Seyler 367:723)。
在SHC自然催化角鲨烯环化为何帕烷时,降龙涎香醚的催化是次级反应,比活性为0.02mU/mg蛋白质。对来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)(以前的酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius))、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的SHC进行了纯化,并根据它们的天然(例如角鲨烯)和非天然底物(例如均法呢醇和柠檬醛)进行表征。参见例如WO 2010/139719、WO2012/066059、JP 2009060799和Seitz等人(2012)J.Molecular Catalysis B:Enzymatic[分子催化杂志,B:酶催化]84:72-77)。此外,WO 2016/170099描述了具有改进的E,E-均法呢醇向降龙涎香醚转化率的SHC突变体。
发明内容
本发明提供了一种重组载体,其含有编码重组角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)多肽的核酸分子,该多肽与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性并相对于SEQ ID NO:2在位置166、222、223、226、227、242、249、504、574、640、641、676、677、682或其组合处包含氨基酸取代,其中该氨基酸改变为在位置166、249或574处的同义氨基酸或在位置222、223、226、227、242、504、640、641、676、677或682处的氨基酸取代,或更优选为P166P、V222Q、V222R、K223S、E226V、D227T、S242R、R249R、R504C、A574A、L640G、P641S、M676L、M677E、S682R或其组合。在一些实施例中,SHC多肽相对于SEQ ID NO:2在位置45、46、54、86、139、142、178、184、194、239、278、326、335、386、455、460、603、623、624、656、658或其组合处进一步包含氨基酸取代,其中该氨基酸取代优选为V45I、V45Q、V45L、E46H、E46Q、Q54E、S86A、F139L、Y142R、Q178E、M184A、M184L、M184I、M184V、R194Q、G239V、I278V、T326S、L335F、E386Q、I455T、F460A、Q603H、G623A、G623V、F624Y、F624A、L656E或Y658F。还提供了含有重组载体的重组宿主细胞,以及通过向表达重组SHC的重组宿主细胞提供均法呢醇并收集由此产生的降龙涎香醚来生产降龙涎香醚的方法。根据该方法的一些实施例,均法呢醇包括(3E,7E)均法呢醇。本发明还提供了一种重组SHC多肽,其与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性,并且相对于SEQ ID NO:2在位置166、222、223、226、227、242、249、504、574、640、641、676、677、682或其组合处包含氨基酸取代。
附图说明
图1A至图1C提供了莫氏葡糖杆菌(Gluconobacter morbifer)角鲨烯何帕烯环化酶(GmSHC)与来自运动发酵单胞菌(Z.mobilis)(ZmSHC)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)(BspSHC)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)(RpSHC)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(ScSHC)、双向伯克霍尔德氏菌(Burkholderia ambifaria)(BamSHC)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)(BanSHC)和酸热脂环酸芽孢杆菌(A.acidocaldarius)(AaSHC)的SHC酶的氨基酸序列比较。带下划线的残基表示核心序列Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Trp(SEQ ID NO:3),且加粗的残基表示Asp-Xaa-Asp-Asp-Thr-Ala(SEQ ID NO:4)活性位点基序。
图2显示了突变体GmSHC酶在37℃下与15mg/mL均法呢醇一起孵育6和20小时后产生的降龙涎香醚的峰面积%。虚线显示了野生型SHC的降龙涎香醚产生。
图3显示了在25%酶负载量下突变体GmSHC酶在37℃下与50mg/mL均法呢醇一起孵育6和20小时后的降龙涎香醚产物峰面积%。
图4显示了在5%酶负载量下突变体GmSHC酶在37℃下与50mg/mL均法呢醇一起孵育18小时后的降龙涎香醚产物峰面积%。
具体实施方式
本发明提供了从莫氏葡糖杆菌分离的角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)或更优选均法呢醇-降龙涎香醚环化酶(HAC)的变体,以及使用变体莫氏葡糖杆菌SHC(GmSHC)将均法呢醇生物催化转化为降龙涎香醚的方法。野生型GmSHC的核苷酸序列在SEQ ID NO:1中提供。野生型GmSHC(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列可在GENBANK登录号WP_040507485和EHH69691下获得。GmSHC氨基酸序列与来自运动发酵单胞菌、慢生根瘤菌属物种、沼泽红假单胞菌、天蓝色链霉菌、双向伯克霍尔德氏菌、炭疽芽孢杆菌和酸热脂环酸芽孢杆菌的SHC氨基酸序列的比对(图1A至图1C)表明氨基酸序列同一性范围在37%和76%之间(表1)。
表1
GmSHC包含核心序列Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Trp(SEQ ID NO:3)(Reipen等人(1995)Microbiology[微生物学]141:155-161)以及与SHC活性位点相关联的Asp-Xaa-Asp-Asp-Thr-Ala(SEQ ID NO:4)基序(Wendt等人(1997)Science[科学]277:1811-5)。参见图1A至图1C。本文呈现的数据证明,当在异源宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)中表达时,GmSHC酶的变体或衍生物可以容易地将均法呢醇转化为降龙涎香醚。因此,本文公开的变体或衍生物GmSHC酶可用于使用均法呢醇作为原料或起始材料制备降龙涎香醚的方法中。
如本文所用,术语“降龙涎香醚”指的是(3aR,5aS,9aS,9bR)-十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃),其商业上称为AMBROX(芬美意公司(Firmenich))、降龙涎香醚(Ambroxan)(汉高公司(Henkel))、AMBROFIX(奇华顿公司(Givaudan))、AMBERLYN(奎斯特公司(Quest))、CETALOX Laevo(芬美意公司)、AMBERMOR(国际香精和香料,阿罗莫尔公司(Aromor))和/或降龙涎香内酯醚(Norambrenolide Ether)(太平洋公司(Pacific))。降龙涎香醚的理想感官益处来自(-)立体异构体,而非(+)对映异构体。(-)立体异构体的气味被描述为麝香样、木质、温暖或琥珀味,而(+)对映异构体具有相对较弱的香调。因此,富含(-)-降龙涎香醚的材料是本发明的一个特征。
如本文所述,(-)-降龙涎香醚可以由均法呢醇合成(方案1)。有四种已知的均法呢醇异构体:(3Z,7Z,即ZZ)、(3E,7Z,即EZ)、(3Z,7E,即ZE)和(3E,7E,即EE)异构体。根据诺伊曼等人((1986)Biol.Chem.[生物化学]Hoppe Seyler 367:723),(-)-降龙涎香醚主要从EE均法呢醇获得。US 2012/0135477指出,运动发酵单胞菌SHC酶可以将ZE均法呢醇转化为(-)-降龙涎香醚。然而,Schaefer((2011)Chemie Unserer Zeit45:374-388)指出ZE均法呢醇仅转化为9b-表降龙涎香醚,而不转化为(-)-降龙涎香醚。因此,本发明的均法呢醇原料/起始材料是单一异构体或是均法呢醇的两种或更多种异构体的混合物。在一些实施例中,均法呢醇起始材料是四种异构体EE:EZ:ZZ:ZE的混合物。在其他实施例中,均法呢醇起始材料是ZE:EE、ZE:EZ或EE:EZ的混合物。在包括使用EE:EZ混合物的实施例中,优选EE:EZ的重量比在99:1至约50:50的范围内。更特别地,均法呢醇起始材料的EE:EZ重量比为80:20或70:30。在特定实施例中,均法呢醇起始材料具有>90(3E,7E)均法呢醇。一种示例性均法呢醇EE:EZ立体异构体混合物的CAS编号为35826-67-6。
优选地,用于制备(-)-降龙涎香醚的起始材料是立体异构纯的(3E,7E)均法呢醇(EEH)。制备EEH的方法在本领域是已知的,并且例如由Dodd等人(1992)J.Org.Chem.[有机化学杂志]57:2794;Barrero等人(1996)J.Org.Chem.[有机化学杂志]61:2215;Kocienski等人(1989)J.Org.Chem.[有机化学杂志]54:1215;WO 92/06063以及US 9,493,385描述。
如本文所用,“GmSHC”是指分离自莫氏葡糖杆菌的角鲨烯何帕烯环化酶。特别地,当未被“突变体”或“衍生物”修饰时,“GmSHC”是指具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型蛋白质。通过比较,“突变体GmSHC”、“变体GmSHC”、“GmSHC突变体”、“GmSHC变体”或“GmSHC衍生物”是指与根据SEQ ID NO:2的参考(或野生型)GmSHC序列的氨基酸序列相比被改变的经修饰或变体氨基酸序列。在一个实施例中,GmSHC衍生物具有至少一个改变,该改变改良了(例如,增加了)酶对其底物(例如,均法呢醇,特别是EEH)的活性。在另一个实施例中,GmSHC衍生物具有至少一个改变,该改变改良了酶在异源宿主细胞中的稳定性、定位和/或表达。
如本文所用,术语“氨基酸改变”是指相对于参考氨基酸序列(例如像SEQ ID NO:2的野生型氨基酸序列)的氨基酸序列而言的一个或多个氨基酸残基的插入、一个或多个氨基酸残基的缺失或一个或多个氨基酸残基的取代(可以是保守的、非保守的或同义的)。通过降GmSHC衍生物氨基酸序列与参考或野生型GmSHC的氨基酸序列比较,可以容易地鉴定氨基酸改变。
例如,可以基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行保守的氨基酸取代。20种天然存在的氨基酸可分为以下六个标准氨基酸组:(1)疏水性-Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性亲水性-Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性-Asp、Glu;(4)碱性-His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基-Gly、Pro;以及(6)芳香:Trp、Tyr、Phe。因此,如本文所用,术语“保守取代”意指一个氨基酸被以上所示的六个标准氨基酸组的相同组中列出的另一个氨基酸交换。例如,Glu被Asp交换在这样修饰的多肽中保留了一个负电荷。此外,甘氨酸和脯氨酸可以根据它们破坏α-螺旋的能力相互取代。上述六组中的一些优选的保守取代是以下亚组中的交换:(i)Ala、Val、Leu和Ile;(ii)Ser和Thr;(iii)Asn和Gln:(iv)Lys和Arg;以及(v)Tyr和Phe。给定已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术,本领域的科学家可以很容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。同义或沉默突变虽然不会直接改变所编码蛋白质的氨基酸序列,但仍然会影响剪接的准确性或效率。
如本文所用,“非保守取代”或“非保守氨基酸交换”定义为一个氨基酸被以上所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一个氨基酸交换。通常,使用改变野生型GmSHC生物学功能的非保守取代来制备本公开的GmSHC衍生物。
在各个实施例中,与不具有氨基酸改变或氨基酸改变组合的野生型GmSHC相比,氨基酸改变或氨基酸改变组合增强了GmSHC衍生物将均法呢醇转化为降龙涎香醚的活性。蛋白质建模可用于指引GmSHC参考序列中的这种取代、缺失或插入。例如,可以使用酸热脂环酸芽孢杆菌SHC的坐标来创建GmSHC氨基酸序列的结构模型。这种同源性模型可用于指导在将均法呢醇转化为降龙涎香醚方面改进GmSHC酶,如在与均法呢醇底物接触时比参考野生型酶产生更高量的降龙涎香醚。
可以使用包括PCR、基因克隆、cDNA定点诱变、宿主细胞转化和体外转录在内的已知重组基因技术方案来引入氨基酸改变(如氨基酸取代),这些方案可以用于将这种改变引入GmSHC序列,从而产生GmSHC衍生物酶。然后可以筛选衍生物的GmSHC功能活性。
相对于根据SEQ ID NO:2的参考(或野生型)GmSHC序列的氨基酸序列,GmSHC衍生物可以具有约1至约45个氨基酸改变、约1至约40个氨基酸改变、约1至约35个氨基酸改变、约1至约30个氨基酸改变、约1至约25个氨基酸改变、约1至约20个氨基酸改变、约1至约15个氨基酸改变、约1至约10个氨基酸改变或约1至约5个氨基酸改变。
可替代地,相对于根据SEQ ID NO:2的参考(或野生型)GmSHC序列的氨基酸序列,GmSHC衍生物可以具有至少5、至少10个氨基酸或至少15个氨基酸改变,但理想地不超过约30或40个氨基酸改变。在各个实施例中,相对于参考GmSHC,GmSHC衍生物可具有约1个氨基酸改变、约2个氨基酸改变、约3个氨基酸改变、约4个氨基酸改变、约5个氨基酸改变、约6个氨基酸改变、约7个氨基酸改变、约8个氨基酸改变、约9个氨基酸改变、约10个氨基酸改变、约11个氨基酸改变、约12个氨基酸改变、约15个氨基酸改变、约20个氨基酸改变、约25个氨基酸改变、约30个氨基酸改变、约35个氨基酸改变、约40个氨基酸改变、约45个氨基酸改变或约50个氨基酸改变。
在这些或其他方面,GmSHC衍生物与参考GmSHC(SEQ ID NO:2)共享至少约50%的序列同一性、至少约55%的序列同一性、至少约60%的序列同一性、至少约65%的序列同一性、至少约70%的序列同一性、至少约75%的序列同一性、至少约80%的序列同一性、至少约85%的序列同一性、至少90%的序列同一性、至少91%的序列同一性、至少92%的序列同一性、至少93%的序列同一性、至少94%的序列同一性、至少95%的序列同一性、至少96%的序列同一性、至少97%的序列同一性、至少98%的序列同一性或至少99%的序列同一性。
在一些方面,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2在位置166、222、223、226、227、242、249、504、574、640、641、676、677或682中一个或多个处包含氨基酸改变。在一些实施例中,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有一个或多个以下氨基酸改变:P166X(沉默)、V222X(取代)、K223X(取代)、E226X(取代)、D227X(取代)、S242X(取代)、R249X(沉默)、R504X(取代)、A574X(沉默)、L640X(取代)、P641X(取代)、M676X(取代)、M677X(取代)和/或S682X(取代),其中:
P166X中的X是P;
V222X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y;
K223X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
E226X中的X是A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
D227X中的X是A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
S242X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y;
R249X中的X是R;
R504X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y;
A574X中的X是A;
L640X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
P641X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y;
M676X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;
M677X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y;并且
S682X中的X是A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。
理想地,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有一个或多个以下氨基酸改变:P166X(沉默)、V222X(取代)、K223X(取代)、E226X(取代)、D227X(取代)、S242X(取代)、R249X(沉默)、R504X(取代)、A574X(沉默)、L640X(取代)、P641X(取代)、M676X(取代)、M677X(取代)和/或S682X(取代),其中
P166Z中的X是P;
V222X中的X是D、E、N、Q、H、K或R;
K223X中的X是S、C、U、T或M;
E226X中的X是G、A、V、L或I;
D227X中的X是S、C、U、T或M;
S242X中的X是H、K或R;
R249X中的X是R;
R504X中的X是S、C、U、T或M;
A574X中的X是A;
L640X中的X是G、A、V、L或I;
P641X中的X是S、C、U、T或M;
M676X中的X是G、A、V、L或I;
M677X中的X是D、E、N或Q;并且
S682X中的X是H、K或R。
最优选地,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有以下氨基酸取代中之一或组合:P166P(沉默)、V222Q或V222R、K223S、E226V、D227T、S242R、R249R(沉默)、R504C、A574A(沉默)、L640G、P641S、M676L、M677E和/或S682R。
在一些方面,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有以下氨基酸改变之一或组合:P166X(沉默)、V222X(取代)、K223X(取代)、E226X(取代)、D227X(取代)、S242X(取代)、R249X(沉默)、R504X(取代)、A574X(沉默)、L640X(取代)、P641X(取代)、M676X(取代)、M677X(取代)和/或S682X(取代)(其中X如上定义),与以下一个或多个氨基酸取代组合:V45I、V45Q、V45L、E46H、E46Q、Q54E、S86A、F139L、Y142R、Q178E、M184A、M184L、M184I、M184V、R194Q、G239V、I278V、T326S、L335F、E386Q、I455T、F460A、Q603H、G623A、G623V、F624Y、F624A、L656E和/或Y658F。
在其他方面,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有以下氨基酸取代之一或组合:166、222、223、226、227、242、249、504、574、640、641、676、677和/或682,与以下一个或多个氨基酸取代组合:45、46、54、86、139、142、178、184、194、239、278、326、335、386、455、460、603、623、624、656和/或658。
在另一方面,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有以下氨基酸取代之一或组合:P166P(沉默)、V222Q或V222R、K223S、E226V、D227T、S242R、R249R(沉默)、R504C、A574A(沉默)、L640G、P641S、M676L、M677E和/或S682R,与以下一个或多个氨基酸取代组合:45、46、54、86、139、142、178、184、194、239、278、326、335、386、455、460、603、623、624、656和/或658。
在又另一方面,GmSHC衍生物相对于SEQ ID NO:2具有以下氨基酸取代之一或组合:P166P(沉默)、V222Q或V222R、K223S、E226V、D227T、S242R、R249R(沉默)、R504C、A574A(沉默)、L640G、P641S、M676L、M677E和/或S682R,与以下一个或多个氨基酸取代组合:V45I、V45Q、V45L、E46H、E46Q、Q54E、S86A、F139L、Y142R、Q178E、M184A、M184L、M184I、M184V、R194Q、G239V、I278V、T326S、L335F、E386Q、I455T、F460A、Q603H、G623A、G623V、F624Y、F624A、L656E和/或Y658F。
在某些方面,GmSHC衍生物具有以下项的组合:如表2所示的相对于SEQ ID NO:2的改变,或其任何组合。
表2
酸热脂环酸芽孢杆菌SHC(AacSHC)中在对应于GmSHC的F139L、Y142、I455、G239和F624的氨基酸位置处的氨基酸取代已显示出在将EEH转化为降龙涎香醚方面增加AacSHC酶的活性。参见WO 2016/170099。此外,AacSHC的F601已被鉴定为原核和真核SHC种类中高度保守的氨基酸残基。据报道,AacSHC衍生物F601Y显示出针对氧化角鲨烯底物(不是角鲨烯)的Vmax大大增加;然而,当使用角鲨烯时,相对于野生型AacSHC,F601Y显示出亲和力降低(即更高的KM)和催化效率/活性(Kcat/KM)降低。参见Hoshino&Sato(2002)Chem.Commun.[化学通讯](4):291-301。值得注意的是,在GmSHC中相当于F601Y的SHC衍生物是F624Y。因此,在本发明的某些实施例中,GmSHC衍生物进一步包括一个或多个上文提及的突变。
在特定实施例中,GmSHC衍生物具有表2中列出的突变的组合。在一些实施例中,GmSHC衍生物是经修饰的GmSHC多肽,其氨基酸序列与根据SEQ ID NO:2的野生型/参考氨基酸序列相比具有多达4个突变,并且相对于SEQ ID NO:2至少包含取代Q54E、F624Y、V222R或V222Q。
本文描述了用于测定和定量SHC活性的测定法,并且这些测定法在本领域中是已知的。举例来说,GmSHC和/或GmSHC衍生物活性可通过在适当条件下将纯化的GmSHC酶或来自已产生GmSHC酶的宿主细胞或完整重组宿主生物体的萃取物与适当的底物一起孵育并对反应产物进行分析(例如,通过气相色谱(GC)或HPLC分析)来确定。实例中提供了GmSHC酶活性测定法和对反应产物进行的分析的更多细节。这些测定法包括在重组宿主细胞(如大肠杆菌(E.coli))中产生GmSHC。
如本文所用,术语“活性”意指酶与底物反应以提供目标产物的能力。活性可以在所谓的活性试验中通过作为时间的函数的目标产物的增加、底物(或起始材料)的减少或这些参数的组合来确定。本公开的GmSHC的特征在于其将均法呢醇生物转化为降龙涎香醚的能力。
在涉及使用GmSHC衍生物的实施例中,优选地GmSHC衍生物表现出比参考GmSHC蛋白更好的目标产量。术语“目标产量”是指每克原料可回收产物的克数(可计算为摩尔转化率百分比)。此外,相对于参考GmSHC蛋白,GmSHC衍生物可以表现出改良的(例如,增加的)目标生产率。术语“目标生产率”是指每小时生物转化时间(即添加底物后的时间)中可回收目标产物的量,单位为克/升发酵能力。此外,与参考GmSHC蛋白相比,GmSHC衍生物可以表现出改良的目标产量因子。术语“目标产量因子”是指所获得的产物浓度与反应介质中GmSHC衍生物(例如,纯化的GmSHC酶或来自表达GmSHC酶的重组宿主细胞的萃取物)的浓度之间的比率。在某些实施例中,相对于参考GmSHC蛋白(例如SEQ ID NO:2),GmSHC衍生物表现出至少2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍或100倍的酶活性(例如,将均法呢醇转化为降龙涎香醚)增加。
本文公开的GmSHC蛋白的功能同源物也包括在本发明的范围内。“功能同源物”是与参考多肽具有序列相似性的多肽,并且执行参考多肽的一种或多种生物化学或生理功能。功能同源物和参考多肽可以是天然存在的多肽,并且序列相似性可以是由于趋同或趋异的进化事件。因此,功能同源物有时在文献中被指定为同源物,或直向同源物,或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体,如由野生型编码序列的突变体编码的多肽,本身可能是功能同源物。功能同源物也可以通过对多肽的编码序列进行定点诱变或通过组合来自不同的天然存在的多肽的编码序列的结构域(“结构域交换”)来产生。获得本文所述的GmSHC酶的功能同源物的技术是已知的,其中包括定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术,这些技术可用于以所需方式增加GmSHC酶的比活性、改变底物特异性、改变表达水平或改变亚细胞定位。
优选地,GmSHC酶和功能同源物共享至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性。优选地,功能同源物和参考多肽在20、30、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸残基的连续延伸段上表现出所示的序列同一性。
为了促进GmSHC的表达和降龙涎香醚的产生和分离,在重组宿主细胞中表达GmSHC或GmSHC衍生物。术语“重组宿主”,也称为“经遗传修饰的宿主细胞”或“转基因细胞”,表示包含异源核酸或其基因组已扩充至少一个掺入的DNA序列的宿主细胞。本公开的宿主细胞可以用编码GmSHC或GmSHC衍生物的核酸分子或含有编码GmSHC或GmSHC衍生物的核酸分子的载体进行基因工程改造。
如本文所用,术语“核酸分子”是指本公开的多核苷酸,其可以是DNA、cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA,并且可以是双链或单链、有义链和/或反义链。术语“核酸分子”应特别适用于本文所用(例如,作为全长核苷酸序列或其片段或部分)的多核苷酸,其编码GmSHC或GmSHC衍生物,例如SEQ ID NO:1。该术语还包括cDNA;缺少至少一个侧翼基因的基因组片段;通过聚合酶链式反应(PCR)产生的cDNA或基因组DNA的片段,其缺少至少一个侧翼基因;缺少至少一个侧翼基因的限制性片段;和编码非天然存在的蛋白质(如融合蛋白)的DNA。融合蛋白可以向蛋白质中添加一个或多个氨基酸(如His-tag),通常在蛋白质的N-末端,但也会在C-末端或融合在蛋白质的区域内。这种融合蛋白或编码这种蛋白的融合载体典型地提供(i)重组蛋白产生的增加;(ii)重组蛋白的溶解度的增加;和/或(iii)通过提供用于亲和纯化的配体来辅助重组蛋白的纯化。在某些实施例中,GmSHC或GmSHC衍生物包含支持GmSHC或GmSHC衍生物在重组宿主细胞(例如大肠杆菌)中的表达和/或活性的指导序列。
术语“核酸分子”还包括适合于在特定重组宿主细胞(例如大肠杆菌宿主细胞)中表达的密码子优化序列。术语“密码子优化”是指通过用细菌宿主细胞基因中更频繁使用的密码子取代一个或多个或优选地大量密码子,而适用于在原核或真核宿主细胞(特别是细菌宿主细胞,如大肠杆菌宿主细胞)中表达的蛋白质编码序列。在这方面,编码参考序列SEQID NO:1及其所有变体/衍生物的核苷酸序列可以是在来源(例如GmSHC)中发现的原始序列,或者核苷酸序列可以针对所选宿主生物(如大肠杆菌)进行密码子优化。
如本文所用,术语“分离的DNA”是指从天然来源(例如莫氏葡糖杆菌)分离的核酸或多核苷酸或通过重组DNA技术产生的核酸或多核苷酸,例如DNA构建体包含与宿主细胞异源的任选地掺入宿主细胞中的多核苷酸。嵌合核苷酸序列可以特异性地作为重组分子产生。就酶而言,术语“重组”是指通过重组DNA技术产生的酶,即由编码所需酶的外源DNA构建体转化的细胞产生的酶。术语“重组”应特别适用于多核苷酸的组装,多核苷酸的组装为通过或不通过重组将这些多核苷酸或其部分连接在一起,实现交叉或基因镶嵌。例如,它是如下进行的,将具有所需功能的核酸片段连接在一起,以生成所需的功能组合。编码本文所述多肽的重组核酸分子包括该多肽的编码序列,该编码序列在有义方向上可操作地连接到一个或多个适合表达该多肽的调控区。因为许多微生物能够表达来自多顺反子mRNA的多个基因产物,所以如果需要,可以在这些微生物的单个调控区的控制下表达多个多肽。
当调控区和编码序列被定位成使得调控区有效于调控序列的转录或翻译时,编码序列和调控区被认为是可操作地连接的。转录/翻译调控元件包括但不限于诱导型和非诱导型、组成型、细胞周期调控型、代谢调控型启动子、增强子、操纵子、沉默子、阻遏物和本领域技术人员已知的驱动或以其他方式调控基因表达的其他元件。这类调控元件包括但不限于诸如以下的调控元件:CUP-1启动子;在例如tet-on或tet-off系统中采用的tet-阻遏物;lac系统和trp系统调控元件。举例来说,异丙基β-D-l-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)在100μM至1.0mM的浓度范围内是基因表达的有效诱导剂。这种化合物是别乳糖的分子模拟物,别乳糖是一种触发lac操纵子转录的乳糖代谢物,因此当基因处于lac操纵子控制下时,它用于诱导基因表达。诱导基因表达的调控元件的另一个实例是乳糖。
本公开的一种或多种核酸分子也可以形成编码额外多肽序列的杂合基因的一部分,例如,充当标记物或报告分子的序列。标记物和报告分子的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。如同与本公开的实践相关的许多标准程序一样,本领域技术人员将知道其他有用的试剂,例如,可以起到标记物或报告分子功能的其他序列。
在一些实施例中,本公开提供了编码野生型GmSHC或上述GmSHC衍生物的重组核酸分子,其可以被插入载体中进行表达和任选纯化。这类载体在本文中被称为“表达载体”。通常适合于DNA重组技术的表达载体典型地是质粒类型的。表达载体包括编码野生型GmSHC或本文所述的GmSHC衍生物的重组核酸分子和适合表达多肽的必要调控区。这类载体包括非天然存在于宿主细胞中的核酸分子、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的核酸分子以及人们希望引入宿主细胞的其他基因或核酸分子。应当理解,典型地通过稳定引入一种或多种重组核酸分子来扩充本文所述的重组宿主细胞的基因组。然而,自主或复制质粒或载体也可以在本公开的范围内使用。此外,本公开可以使用低拷贝数(例如单个拷贝)或高拷贝数的质粒或载体来实践。在某些实施例中,本公开的载体是质粒、噬菌粒、噬菌体、粘粒、人工细菌或人工酵母染色体、敲除或敲入构建体、合成核酸分子或以线性多核苷酸、质粒、巨质粒、合成或人工染色体(如植物、细菌、哺乳动物或酵母人工染色体)形式生产的盒。
根据本发明,在引入载体后,由重组核酸分子编码的GmSHC或GmSHC衍生物在细胞内组成型或诱导型表达。使用标准转化技术,用编码GmSHC或GmSHC衍生物的载体转化微生物细胞。在合适的实施例中,提供复制起点的DNA包含在载体中。复制起点可以由技术人员适合地选择。根据基因的性质,如果基因或基因组本身已经存在可作为复制起点操作的序列,则可能不需要补充的复制起点。
在本发明的上下文中,当外源或异源DNA已被引入细胞内时,微生物细胞(例如细菌或酵母细胞)被转化。转化DNA可以整合即共价连接到细胞的基因组中,也可以不整合到其中。例如,在原核生物和酵母中,转化DNA可以维持在附加体元件如质粒上。就真核细胞而言,稳定转染的细胞是指其中转染的DNA已经整合到染色体中,从而通过染色体复制被子细胞遗传。这种稳定性通过真核细胞建立包括含有转化DNA的子细胞群的细胞系或克隆的能力来证明。
可用于本公开目的的宿主细胞包括但不限于原核细胞,如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)),其可用例如含有本公开的GmSHC核酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA、细菌人工染色体或粘粒DNA表达载体转化;简单真核细胞,像酵母(例如酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)),其可以用例如含有本公开的多核苷酸分子的重组酵母表达载体转化;昆虫细胞(例如杆状病毒昆虫细胞表达系统);人细胞(例如HeLa、CHO和Jurkat)和植物细胞(拟南芥属(Arabidopsis)和烟草)。根据宿主细胞和用于引入本公开的核酸分子的相应载体,核酸分子可以整合到例如染色体或线粒体DNA中,或者可以维持在染色体外(例如作为附加体),或者可以仅短暂地被细胞携带。
在涉及真核细胞的实施例中,优选地细胞是真菌、哺乳动物或植物细胞。合适的真核细胞包括例如但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞(例如,酵母属、念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属和曲霉属(Aspergillus))或昆虫细胞(包括Sf9)、两栖动物细胞(包括载黑素细胞)、或包括隐杆线虫属(Caenorhabditis)(包括秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))细胞在内的蠕虫细胞。合适的哺乳动物细胞包括例如但不限于COS细胞(包括Cos-1和Cos-7)、CHO细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞或其他可转染的真核细胞系。
在涉及原核生物的实施例中,优选地细胞是大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillussp.)或链霉菌属物种(Streptomyces sp.)。优选地,大肠杆菌宿主细胞是被工业和监管机构认可为适合于重组蛋白表达的大肠杆菌宿主细胞(包括但不限于大肠杆菌K12宿主细胞或大肠杆菌BL21宿主细胞)。在某些实施例中,本发明的重组宿主细胞是大肠杆菌。有大肠杆菌的突变体、质粒的文库、代谢的详细计算机模型和其他可用信息,允许合理设计各模块以提高产品产量。因此,在某些实施例中,提供了表达编码GmSHC或GmSHC衍生物编码序列的核酸分子的重组大肠杆菌,用于将均法呢醇转化为降龙涎香醚。
与本公开一起使用的另一种优选宿主细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae),其广泛用于合成生物学。因此,重组宿主细胞可以是酿酒酵母。有酿酒酵母的突变体、质粒的文库、代谢的详细计算机模型和其他可用信息,允许合理设计各模块以提高产品产量。此外,已知制备重组酿酒酵母微生物的方法。因此,在某些实施例中,提供了表达编码GmSHC或GmSHC衍生物编码序列的核酸分子的重组酿酒酵母,用于将均法呢醇转化为降龙涎香醚。
以常规方式进行细胞培养。培养基含有碳源、至少一种氮源和无机盐,并向其中添加维生素。该培养基的成分可以是常规用于培养所讨论宿主细胞的物种的成分。本文所述方法中使用的碳源包括可被重组宿主细胞代谢以促进降龙涎香醚生长和/或产生的任何分子。合适碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如,如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。
在采用大肠杆菌的实施例中,可将确定成分的基本培养基如M9A用于细胞培养。M9A培养基的组分包括:14g/L KH2P04、16g/L K2HP04、1g/L二水柠檬酸三钠(Na3Citrate·2H20)、7.5g/L(NH4)2S04、0.25g/L MgS04·7H20、0.015g/L CaCl2·2H20、5g/L葡萄糖和1.25g/L酵母萃取物。在本公开的另一个实施例中,使用营养丰富的培养基,如LB。LB培养基的组分包括:10g/L胰蛋白酶、5g/L酵母萃取物、5g/L NaCl。矿物培养基和M9矿物培养基的其他实例公开于例如US 6,524,831和US 2003/0092143中。
例如,在采用酵母作为宿主的实施例中,碳源如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。可以在整个培养期间向宿主生物体提供碳源,或者可替代地,生物体可以在另一种能量源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间,然后仅在补料分批阶段向其提供碳源。
可使用公知方法通过简单测试程序来确定用于本公开方法的重组宿主细胞的适用性。例如,待测试的宿主细胞可以在通常用于微生物繁殖的pH、温度和通气条件下在丰富培养基(例如LB培养基、细菌胰蛋白胨酵母萃取物培养基、营养培养基等)中繁殖。一旦重组宿主细胞被鉴定为产生所需的生物转化产物,则典型地由生产宿主细胞系通过合适的表达系统和发酵(例如通过细胞培养中的微生物生产)大规模生产这些产物。
可以按分批、补料分批或连续过程或其组合使重组宿主细胞生长。如本文所用,术语“分批培养”是一种培养方法,其中在培养过程中既不添加也不取出培养基。相比之下,术语“补料分批”是指在培养过程中添加培养基但不取出培养基的培养方法。典型地,重组宿主细胞在培养系统中生长,其中重组宿主细胞在发酵罐中在限定的温度下,在合适的营养源例如碳源的存在下生长所需的时间段,以产生足够的酶将均法呢醇生物转化为降龙涎香醚,并产生所需量的降龙涎香醚,包括(-)-降龙涎香醚。重组宿主细胞可以以任何合适的方式培养,例如通过分批培养或补料分批培养。然而,通常可以通过实施连续过程如产物去除、底物补料和生物质添加或(部分)替换来实现更高的累积产生滴度。
本公开的一个实施例提供了一种在重组宿主细胞中生产降龙涎香醚的方法,通过在培养系统中提供表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组宿主细胞,向培养系统提供均法呢醇(例如,通过补料),使用由重组宿主细胞产生的GmSHC或GmSHC衍生物将均法呢醇转化为降龙涎香醚,收集降龙涎香醚并任选地分离降龙涎香醚(特别是(-)-降龙涎香醚)。在一些实施例中,重组宿主细胞还表达用以增强GmSHC表达或增强制备降龙涎香醚的生物转化途径的其他核酸分子。
本公开的另一个实施例提供了一种在重组宿主细胞中生产降龙涎香醚的方法,通过在培养系统中提供表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组宿主细胞,向培养系统提供均法呢醇,向培养系统补料均法呢醇(例如EEH)以促进均法呢醇转化为降龙涎香醚,收集降龙涎香醚并任选地分离降龙涎香醚(特别是(-)-降龙涎香醚)。在一些实施例中,可以通过向反应混合物中加入增溶剂,特别是非离子表面活性剂或洗涤剂(如聚山梨醇酯80、TritonX-100等),来增强转化。
可以以多种方式培养重组宿主细胞,以便为后续生物转化步骤提供合适量的表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的细胞。由于适用于生物转化步骤的宿主细胞变化很大(例如,真菌细胞、细菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞),当然得调整培养条件以适应每个物种的特定要求,并且这些条件是公知的和有据可查的。用于使重组宿主细胞生长的任何本领域已知方法均可用于产生本公开的后续生物转化步骤中使用的细胞。典型地,使细胞生长到特定密度(可按光密度(OD)测量),以产生足够的生物量用于生物转化反应。
所选择的培养条件可以影响获得的细胞量(生物质)以及生物质如何变成生物催化剂(即,含有野生型GmSHC或GmSHC衍生物的细胞或细胞级分)。在一些实施例中,生物催化剂是表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组全细胞。在其他实施例中,生物催化剂是表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组全细胞悬浮液或固定化细胞。在其他实施例中,生物催化剂是由表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组宿主细胞制备的膜级分或液体级分。产生野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组全细胞包括从发酵罐收集的全细胞(用于生物转化反应)或在发酵罐中的细胞(然后其用于一锅反应)。产生野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组全细胞可以包括完整的重组全细胞和/或细胞碎片。无论哪种方式,野生型GmSHC或GmSHC衍生物以某种方式与膜(如细胞膜)缔合,以便接收底物(例如均法呢醇)和/或与底物相互作用,该膜(如细胞膜)可以是全细胞(例如重组全细胞)的一部分或包括全细胞(例如重组全细胞)。野生型GmSHC或GmSHC衍生物也可以是固定化形式(例如,与酶载剂缔合),其允许野生型GmSHC或GmSHC衍生物与底物(例如均法呢醇)相互作用。野生型GmSHC或GmSHC衍生物也可以可溶形式使用。
在一个实施例中,在生物转化步骤之前,产生足够量的生物催化剂(以产生足够的生物质),收获和洗涤(并且任选地储存(例如,冷冻或冻干))。在另一个实施例中,产生足够量的细胞(以产生足够的生物催化剂),然后调整反应条件,而不需要收获和洗涤用于生物转化反应的生物催化剂。这种一步(或“一锅”)方法是有利的,因为它简化了过程,同时降低了成本。用于使细胞生长的培养基也适合用于生物转化反应,前提是调整反应条件以促进生物转化反应。
细胞生长的最佳pH为6.0-7.0。生物转化反应的最佳pH可能取决于生物转化反应中使用的SHC酶,例如野生型GmSHC或GmSHC衍生物。使用本领域技术人员公知的技术来调节pH。
尽管在本公开中术语“混合物”或“反应混合物”可与术语“培养基”互换使用(特别是当其涉及“一锅”反应时),但应注意,使细胞生长以产生足够的生物质需要细胞培养/发酵培养基,但是生物转化步骤不需要培养基,因为反应缓冲液在合适的pH下就足够了。
本公开的生物转化方法在时间、温度、pH和增溶剂的条件下进行,以提供均法呢醇原料向降龙涎香醚的转化。对于GmSHC衍生物酶,反应混合物的pH可以在4至8的范围内,优选为5至6.5,更优选为4.8至6.0;对于野生型GmSHC酶,反应混合物的pH可以在约pH 5.0至约pH 7.0的范围内,并且可以通过向反应混合物中加入缓冲液来维持。所使用的缓冲液可以是柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)或MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液。在某些实施例中,缓冲液是Tris-Cl缓冲液。优选的温度在约15℃和约45℃之间,优选约20℃和约40℃之间。该温度可以保持恒定或可以在生物转化过程中改变。
可任选地使用增溶剂,例如表面活性剂、洗涤剂、溶解度增强剂、水混溶性有机溶剂等,以改进生物转化反应。如本文所用,术语“表面活性剂”是指降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的组分。表面活性剂可充当洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。在某些实施例中,表面活性剂是非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂或两性离子表面活性剂。非离子表面活性剂的实例包括但不限于Triton X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇叔辛基苯基醚)、聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20。示例性阴离子表面活性剂包括但不限于牛磺脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂基硫酸钠(SLS)。
根据本发明的方法,降龙涎香醚是使用添加了均法呢醇底物的生物催化剂生产的。可以使用已知的工具(例如蠕动泵、输液注射器等)通过进料来添加底物。均法呢醇是一种油溶性化合物,以油的形式提供。假设生物催化剂(微生物细胞,如完整的重组全细胞和/或细胞碎片和/或固定化的酶)存在于水相中,当向生物转化反应混合物中加入均法呢醇时,生物转化反应可被视为三相系统(包括水相、固相和油相)。甚至当存在增溶剂时也可能是这种情况。
虽然一些实施例包括使用完整全细胞或细胞萃取物,但其他实施例包括使用游离的、任选纯化的或部分纯化的GmSHC酶或固定化的GmSHC酶将均法呢醇生物转化为降龙涎香醚。在这方面,当可溶性野生型GmSHC或GmSHC衍生物用作生物催化剂时,这被认为是两相系统。
存在的均法呢醇异构体的数量可能影响反应的速度。已经证明,SHC衍生物酶能够从均法呢醇异构体的复杂混合物(例如EE:EZ:ZE:ZZ)中将E,E-均法呢醇生物转化为(-)-降龙涎香醚(参见WO 2016/170099)。然而,使用均法呢醇异构体的复杂混合物通常观察到较低的转化率,这与除EEH之外的均法呢醇异构体可以与EEH竞争接近SHC衍生物酶的观点一致,因此可以作为EEH转化为(-)-降龙涎香醚的竞争性抑制剂和/或也作为替代底物。因此,本方法优选在由2-4种异构体(优选两种异构体)的立体异构体混合物组成的均法呢醇底物存在下进行。在一些实施例中,仅向反应混合物中加入均法呢醇的两种异构体。在某些实施例中,均法呢醇底物由EE:EZ立体异构体混合物组成。在其他实施例中,将立体异构纯的E,E-均法呢醇加入到反应混合物中。
可以收集通过本发明的方法生产的降龙涎香醚,例如,蒸汽萃取/蒸馏或使用非水混溶性溶剂的有机溶剂萃取(以将反应产物和未反应的底物与停留在水相中的生物催化剂分离),随后进行后续的溶剂蒸发以获得粗反应产物,如由气相色谱(GC)分析所确定的。蒸汽萃取/蒸馏和有机溶剂萃取方法是本领域技术人员已知的。作为示例,可以使用有机溶剂如非水混溶性溶剂(例如甲苯)从全反应混合物中萃取所得降龙涎香醚。可替代地,可以使用水混溶性溶剂(例如乙醇)或非水混溶性溶剂(例如甲苯)从反应混合物的固相(例如通过离心或过滤获得)中萃取所得降龙涎香醚。作为进一步的举例,降龙涎香醚以晶体或无定形形式存在于固相中,并且也可以通过过滤的方式从剩余的固相(细胞材料或其碎片)和液相中分离。作为进一步的举例,在高于降龙涎香醚熔点(大约75℃)的温度下,降龙涎香醚可以在水相的顶部形成油层,其中可以去除和收集该油层。为了确保在去除油层后完全回收降龙涎香醚,可以向含有生物质的水相中加入有机溶剂,以便萃取包含在生物质中或生物质上或生物质周围的任何残留降龙涎香醚。可以将有机层与油层合并,然后整体进一步加工以分离和纯化降龙涎香醚。可以进一步使降龙涎香醚选择性结晶以从最终产物中去除副产物(即,除(-)-降龙涎香醚之外的异构体)和任何未反应的均法呢醇底物。术语“选择性结晶”是指使(-)-降龙涎香醚从溶剂中结晶而剩余异构体保持溶解在结晶溶剂中的工艺步骤。在一些实施例中,分离的晶体材料仅包含(-)-降龙涎香醚产物。在其他实施例中,分离的结晶材料包含其他异构体,其中所述异构体仅以嗅觉可接受的量存在。
适合用于(-)-降龙涎香醚的萃取和/或选择性结晶的合适的水混溶性和非水混溶性有机溶剂的实例包括但不限于脂族烃,优选具有5-8个碳原子的那些,如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷;卤代脂族烃,优选具有一个或两个碳原子的那些,如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷;芳香烃,如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯;脂族无环和环状醚或醇,优选具有4-8个碳原子的那些,如乙醇、异丙醇、二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚、四氢呋喃;或酯,如乙酸乙酯或乙酸正丁酯,或酮,如甲基异丁基酮或二噁烷或这些的混合物。尤其优选使用的溶剂是上述庚烷、甲基叔丁基醚(也称为MTBE、叔丁基甲醚和iBME)、二异丙基醚、四氢呋喃、乙酸乙酯和/或其混合物。优选地,将水混溶性溶剂如乙醇用于从反应混合物的固相中萃取(-)-降龙涎香醚。乙醇的使用是有利的,因为它易于处理、无毒并且对环境友好。
在某些实施例中,最终产物是分离的(-)-降龙涎香醚。关于(-)-降龙涎香醚,术语“分离的”是指与伴随它的组分分开或从伴随它的组分中纯化的生物转化产物。在来自不同于其自然起源的来源的细胞系统中产生的实体是“分离的”,因为它必然没有自然伴随它的组分。分离程度或纯度可以通过任何适当的方法测量,例如气相色谱(GC)、HPLC或NMR分析。在一些实施例中,将终产物((-)-降龙涎香醚)分离出来并纯化至同质,例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或89.5%纯,或90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%纯。
最终(-)-降龙涎香醚产物的嗅觉纯度可以使用水中10%乙醇萃取物来确定或通过测试结晶材料来确定。最终(-)-降龙涎香醚产物可以对照(-)-降龙涎香醚产物的市售参考品测试其嗅觉纯度、质量及其感观特征。(-)-降龙涎香醚材料也可以由专家在应用研究中进行测试,以确定该材料是否符合有关其感官特征的规格。
GmSHC酶的活性通过以摩尔百分比表示的反应速率(产物量/(产物量+剩余起始材料量))×100)来定义。优选地,在野生型GmSHC或GmSHC衍生物酶存在下将EEH生物转化为(-)-降龙涎香醚,或在表达野生型GmSHC或GmSHC衍生物的重组宿主细胞存在下,提供5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100的(-)-降龙涎香醚产量,以摩尔百分比给出并基于所采用EEH的摩尔数;尤其优选地,产量在5和100之间、10和100之间、20和100之间、25和100之间、30和100之间、35和100之间,特别是在40和100之间、45和100之间、50和100之间、60和100之间、70和100之间。
在本发明的优选实施例中,在例如4、6、8、10、12、16、20、24、36或48小时的限定时间段内测定产量和/或反应速率,在此期间,含有根据本公开的编码野生型GmSHC或GmSHC衍生物酶的核酸分子的重组宿主细胞将EEH转化为(-)-降龙涎香醚。在另一个实施例中,反应在例如25℃、30℃、40℃、50℃或60℃的限定条件下进行。
在含有编码野生型GmSHC或GmSHC衍生物酶的核酸分子的大肠杆菌重组菌株中由均法呢醇制备(-)-降龙涎香醚的生物转化过程可以为(-)-降龙涎香醚的生产提供低成本和工业上经济的工艺。
理想地,所产生的(-)-降龙涎香醚的量在约1mg/L至约20,000mg/L(20g/L)的范围内或更高,如约20g/L至约200g/L或100g/L至200g/L,优选约125g/L或150g/L。
(-)-降龙涎香醚的各种应用包括但不限于精细芳香剂或消费品如织物护理品、厕所用品、美容护理品和清洁产品,包括目前可获得的降龙涎香醚成分在商业上使用的基本上所有产品,包括但不限于降龙涎香醚(Ambrox)(汉高公司)、Amberlyn(奎斯特公司)和降龙涎香内酯醚(太平洋公司),以及以商标(芬美意公司)、/>(奇华顿公司)、/>Laevo(芬美意公司)和/或/>(阿罗莫尔公司)销售的那些产品。(-)-降龙涎香醚的选择性结晶可能受未反应的均法呢醇底物的存在以及(-)-降龙涎香醚与其他可检测异构体的比率的影响。即使仅获得10%的均法呢醇底物向(-)-降龙涎香醚的转化率,(-)-降龙涎香醚的选择性结晶仍然是可能的。
提供以下非限制性实例用于进一步说明本发明。
实例1:PelB指导序列的插入
作为增加GmSHC酶活性的一种路径,将pelB指导序列插入含有编码GmSHC的核酸的pET28b(+)载体中。制备编码pelB指导序列的寡核苷酸,其具有与NcoI和NdeI相容的端部,用于插入pET28b(+)载体。用NcoI和NdeI消化pET28b(+)载体,并将其用于与pelB指导序列寡核苷酸的过夜连接反应。纯化连接反应并用于电感受态大肠杆菌的转化。用互补的寡核苷酸引物‘pelB-SHC-Fw’和‘pET-XhoI-Rev’通过菌落PCR评估所得转化体大肠杆菌的随机样品,以确定连接反应是否成功。克隆被鉴定为含有正确大小的插入片段。后续DNA序列分析证实了pelB指导序列插入到pET28b(+)载体中。
实例2:PelB-GmSHC融合蛋白的表达分析
将含有pelB-GmSHC克隆的质粒用于转化大肠杆菌BL21(DE3)以表达融合蛋白。转化后,分离单个菌落克隆,并用于接种10mL LB培养基+卡那霉素。将10mL培养物伴随200rpm振荡在37℃下孵育过夜。将过夜培养物用于接种含有1L LB培养基+卡那霉素的烧瓶,在诱导前将该烧瓶伴随200rpm振荡在37℃下孵育6小时。通过加入1mL 1M IPTG来启动蛋白质表达的诱导。诱导后,将培养箱温度降至25℃,将培养物伴随200rpm振荡放置过夜。取出25℃过夜培养物的等分试样(1.5mL)进行SDS-PAGE表达分析,通过离心收获剩余的培养物用于进一步的工作。从SDS-PAGE分析中,观察到表达了正确大小的pelB-GmSHC融合蛋白。
实例3:全细胞筛选测定法
包含pelB指导序列以促进GmSHC酶转运到大肠杆菌周质空间,从而使GmSHC酶更容易被细胞周围环境中的底物利用。因此,进行筛选测定法以分析与GmSHC相比,含有pelB-GmSHC的全细胞悬浮液将均法呢醇转化为降龙涎香醚的情况。反应包括全细胞、100μl的1M柠檬酸钠(pH 4.9)、100μl的在增溶缓冲液(0.05M Tris-Cl(pH 8.0)、0.01M MgCl2、1%v/vTRITON X-100)中的100mM均法呢醇以及800μl增溶缓冲液。将反应在37℃、200rpm下孵育,在16和80小时后取出样品。在GC分析之前,用2体积的正庚烷萃取样品。计算每毫克全细胞的平均面积%转化率。结果表明,尽管野生型GmSHC细胞悬浮液提供每小时每毫克全细胞平均0.033%面积的转化率,但pelB-GmSHC细胞悬浮液没有导致均法呢醇向降龙涎香醚的任何转化。因此,pelB指导序列显现出对GmSHC的活性有不利影响。
由于SHC酶不依赖于辅因子,假设GmSHC可能在反应后保留活性。为了确定是否保留任何活性,取出来自上述16小时时间点的细胞并重悬在0.5mL新鲜反应混合物中。然后将这些‘第2程’反应在37℃、200rpm下孵育大约64小时。64小时后,用2体积正庚烷萃取反应进行GC分析。‘第1程’和‘第2程’的比较表明,重复暴露于新鲜反应混合物后,活性下降最小(第1程为0.033%,而第2程为0.037%)。因此,这些数据表明全细胞可以被再利用/再循环以进行重复转化,这可以证明是有利于最小化该工艺的总成本。
实例4:在发酵过程中均法呢醇向降龙涎香醚的转化
如上文所证明的,表达GmSHC的全细胞将均法呢醇生物转化为降龙涎香醚。因此,应确定是否可以实现发酵中转化。使表达野生型GmSHC或沼泽红假单胞菌SHC(RpSHC;WO2010/139719)的细胞以以下方式生长和表达。使用含有编码GmSHC和RpSHC的核酸的细胞的过夜10mL(LB培养基+卡那霉素,37℃,200RPM)起子培养物来接种1L LB培养基+卡那霉素。将1L培养物在37℃、200rpm下孵育大约4小时。随后,将1mL 1M IPTG加入培养物中以诱导SHC蛋白表达,并将培养物的孵育温度降至25℃进行过夜孵育。
为了证实GmSHC和RpSHC的表达,对细胞培养物进行SDS-PAGE分析。取出过夜培养物的等分试样(1.5mL)并以14,500rpm离心2分钟。丢弃上清液,将细胞沉淀重悬于200μLSDS上样缓冲液中。然后将重悬的细胞加热至95℃保持5分钟。在14,500rpm短暂离心10秒后,将上样缓冲液中SHC的样品放入预制4%-20% SDS-PAGE凝胶的孔中。该分析的结果表明GmSHC和RpSHC都表达。
在证实GmSHC和RpSHC的表达后,如表3所提供的制备重复反应。
表3
*WO 2010/139719中描述的乳剂。
制备反应并将其在37℃、200rpm下孵育。孵育16小时后取出样品,用2体积正庚烷萃取进行GC分析。40小时后,将剩余的反应混合物离心以使细胞沉淀,用2体积的正庚烷萃取上清液进行GC分析。表4呈现了每小时的面积%转化率的平均值。
表4
SHC培养物 | A组 | B组 |
GmSHC | 0.46 | 0.00 |
RpSHC | 0.10 | 0.00 |
表4中呈现的结果证明了细胞培养物中的SHC将均法呢醇转化为降龙涎香醚。结果还证明,TRITON X-100中的均法呢醇比牛磺脱氧胆酸盐中的乳剂更容易转化为降龙涎香醚。
实例5:GmSHC衍生物的生成
采用了三种不同的路径来生成GmSHC衍生物:理性诱变(定点诱变)、半理性诱变(通过位点饱和文库)和随机诱变(易错PCR)。使突变体在异源系统中表达,并通过GC进行筛选。
同源性建模。利用同源性建模建立GmSHC的三维结构。使用的模板是crystals1GSZ(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9:639-45)和3SQC(Wendt等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]286:175-87),它们与95%的GmSHC序列共享44%和43%的序列同一性。
分子对接。然后将均法呢醇的基态表现形式对接到GmSHC结构的活性中心。这是通过定义以第一质子供体的质子化氧原子为中心的3D网格盒来实现的。该网格盒确定了活性中心口袋区域,在分子对接运行期间将在该区域对底物构象进行采样。然后使用Lamarckian遗传算法进行分子对接(LGA;Morris等人(1998)J.Comput.Chem.[计算化学杂志]19:1639-62;Morris等人(2009)J.Comput.Chem.[计算化学杂志]30:2785-91)。每个系统总共进行了1000次LGA运行。群体为300,GA精英(GA elitism)=1,最大世代数为27000,最大能量评估次数为2500000。因此,对于每次LGA运行,第一代从具有300个随机底物构象的群体开始。当前群体中的最佳底物构象自动存活到下一代(GA精英=1)。因此,下一代群体从上一代最合适的底物构象加上另外299个构象开始。当达到最大世代数或能量评估次数时,LGA运行停止。对于每次LGA运行,获得一种底物构象。然后根据能量和均方根偏差对底物构象进行分类。排名最高的结构对应于最稠密集群的具有最低平均结合能的最低结合能结构。
SHC结构分析及催化机理。SHC是采用二聚体3D排列的完整单面膜蛋白。每种单体的特征在于八个QW基序(Sato等人(1998)Biosci.Biotechnol.Biochem.[生物科学、生物技术和生物化学]62:407-11),其紧密连接许多α-螺旋,形成两个高度稳定的α/α-桶结构域(Wendt等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]286:175-87)。活性中心腔埋藏在两个α/α-桶结构域内,可以通过内部疏水通道进入。对于AaSHC,通道和活性中心腔被由残基F166、V174、F434和C435构成的负责底物识别的狭窄缩窄部隔开(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9:639-45)。对于GmSHC,这些残基对应于F176、M184、F457和C458。除非另有指示,所提供的关于GmSHC的氨基酸残基的位置参考SEQ ID NO:2。在活性中心腔的顶部观察到构成保守的DXDD基序的残基(Wendt等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]286:175-87)。那些残基之一是第一质子供体D396,它通过向双键2和3贡献一个质子来启动环化(方案2)。在GmSHC中,D396的氧原子与双键2,3的碳3相距
DXDD基序之后是色氨酸和苯丙氨酸残基,它们负责通过强阳离子-π相互作用稳定阳离子中间体(Dougherty(1996)Science[科学]271:163-168)。在腔的底部是谷氨酸残基,最终质子受体,它可以从羟基接收质子,并导致第三个环的闭合和产物降龙涎香醚的形成。GmSHC的结构分析表明,这种酶具有两个可能的最终质子受体。然而,根据对接结果,GmSHC的E386最有可能是最终质子受体。均法呢醇羟基氧与E386之间的距离仅为显然,最终质子受体的这种布置在这种酶的催化功效中起着重要作用。
使用分子模型,确定了建立负责稳定阳离子中间体的阳离子-π相互作用的GmSHC残基和其他主要催化残基。值得注意的是,大多数重要的催化残基对于其他RpSHC酶而言是保守的(WO 2010/139719)。主要差异包括:a)GmSHC活性中心是残基45;b)GmSHC残基184与残基176、457和458一起负责疏水通道和活性中心腔之间的狭窄缩窄部,其与底物选择性有关;和c)QW基序的模式有些不同。
结构性热点。基于分子建模和分子对接结果,鉴定了以下在突变时可以改进酶催化的化学步骤的活性中心结构热点:残基V45、E46、Q54、F176、M184、F457、C458、W179、I278、Q279、T326、F385、E386、D397、F443、F460、F624、F654和L656。
特异性决定位置和保守残基。特异性决定位置指示哪些残基在共享给定催化特异性的家族的蛋白质亚组内协同进化。因此,它允许跟踪同一蛋白质家族中与获得多种生物学功能相关的进化过程。使用Xdet算法从包含1000个同源序列的多序列比对中计算特异性决定位置。
GmSHC的进化。为了改进均法呢醇向降龙涎香醚的催化转化,修饰GmSHC以(1)改进Michaelis-Menten复合体;(2)基于结构和共同进化热点,引入可以增加碳阳离子中间体的阳离子-π稳定性的突变;(3)通过使仅对催化5环天然底物角鲨烯至关重要的残基突变来打开催化腔;(4)使辅助最终质子受体的残基突变以促进产物形成;(5)改变活性中心;(6)使负责疏水通道和活性中心腔之间狭窄缩窄部的残基突变;(7)增加QW基序。
使用分子对接,对旨在改进Michaelis-Menten复合体,增加碳阳离子中间体的阳离子-π稳定性,通过使仅对催化5环天然底物角鲨烯至关重要的残基突变来打开催化腔,使辅助最终质子受体的残基突变以促进产物形成以及改变活性中心的GmSHC变体进行了计算机模拟测试。该分析的结果呈现在表5中。
表5
表6列出了针对上述每个修饰的额外突变。
表6
*来自文献。
SHC突变体酶表达。将表6的野生型和GmSHC突变体逐个克隆到pET28a(+)中。将这些DNA构建体转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,并铺在含有卡那霉素的琼脂板上。将这些在37℃下孵育过夜。挑选单个细菌菌落,用于接种96孔板中的500μL LB+卡那霉素。将该板在37℃下伴随搅拌孵育过夜。使用这些原代培养物(10μL)接种50mL falcon试管中的10mL LB+卡那霉素,随后在37℃、180rpm下孵育约7小时。然后加入1mM IPTG诱导蛋白质表达。将培养箱温度降至25℃,并将培养物进一步在180rpm下孵育过夜。第二天,将培养物以4000rpm离心10分钟,并丢弃上清液。在用于反应测定法之前,将细胞沉淀暴露于2轮冷冻/解冻。
将细胞沉淀(1μL)点在硝酸纤维素膜上,风干30分钟。在室温下,伴随温和搅拌,将膜放入5%奶粉中保持1小时。然后将膜用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3×5分钟。加入抗组氨酸抗体溶液(1/10,000稀释度),并在室温下伴随振荡孵育1小时。随后将印迹在PBS中洗涤3×5分钟。向印迹中加入显影溶液(6mg二氨基联苯胺(DAB)和5μL 30% H2O2(在10mL PBS中))。一旦显影,立即除去显影溶液,用水冲洗印迹。
该分析的结果表明,在25℃下,在加入1mM IPTG后,所有构建体都在BL21(DE3)大肠杆菌中表达。在酶表达和加工之后,进行斑点印迹以评估特定突变的引入是否改变了蛋白质表达。值得注意的是,大多数GmSHC突变体显示出与野生型GmSHC构建体相似的表达水平。
SHC突变体筛选反应。制备柠檬酸钠缓冲液(pH 5.3)(等体积的1M柠檬酸钠pH 4.9和0.1M柠檬酸钠pH 6.5),并将500μL的该缓冲液添加到每种突变体的冻干全细胞(来自用所需突变体质粒转化的大肠杆菌的1L摇瓶发酵)中。这些结果是在酶负载量为5%(w/w)的情况下获得的。随后,向缓冲液/酶混合物中加入均法呢醇(50 mg/mL)。将反应在37℃下伴随搅拌孵育18小时。为了停止反应并萃取产物,向每个反应中加入2X体积的3:2庚烷:异丙醇。然后将这些在37℃下伴随搅拌孵育30分钟以充分混合。将反应以4000 rpm离心10分钟以沉淀任何细胞材料。然后取出上部有机层并放入干净的气相色谱(GC)小瓶中。
GC分析方法。使用GC分析方法来检测筛选反应中使用的每种起始材料和产物。由于生成的样品量很大,开发了一种快速方法,运行时间仅为4.5分钟。GC分析条件是如表7所呈现的。
表7
在添加3和10 mg/mL均法呢醇后对SHC突变体反应样品的分析表明,与野生型酶相比,许多SHC突变体/衍生物表现出改进的活性。表8列出了特别令人感兴趣的突变体。
表8
结果证明,许多酶达到了用于生成降龙涎香醚的均法呢醇异构体的完全消耗。因此,进行进一步分析以鉴定一种或多种最佳SHC酶。特别地,将底物负载量增加到15 mg/mL,并使孵育进行有限的时间段(即4小时和20小时)。如表9所示,有多种突变体酶展示出比野生型SHC酶更高的活性。特别地,F624Y SHC突变体在4小时后显示最高活性,而E46Q SHC突变体在20小时后显示最高活性。值得注意的是,在位置184处具有突变(M184L、M184V、M184I和M184A)的旨在通过改变通向活性中心的疏水通道来影响酶特异性的每种酶在较长的孵育期后表现出活性增加。
表9
*相对于SHC野生型的平均降龙涎香醚产生差异。
除了降龙涎香醚之外,还测试了突变体由均法呢酸产生香紫苏内酯的情况。该分析表明,与野生型GmSHC相比,G623V、I278V、L335F和Q54E突变体表现出香紫苏内酯产生的增加(表10)。
表10
图2显示,只有7种突变体在4小时孵育后表现出比野生型SHC更高的降龙涎香醚产生(所有高于虚线的柱),而15种突变体在20小时孵育后表现出更高的活性(图2)。特别地,V45L+T326S、F624Y、E46Q、M184L、M184V、M184I和Q178E突变体在两个时间点都表现出增加的活性。除了这七种突变体,计算机模拟分析和体外分析表明,G623A、Q54E、R194Q和M184A突变体也是令人感兴趣的。因此,提供了组合突变体,其表现出在增加GmSHC酶活性方面的累加或协同作用(表11)。
表11
当将选择的组合突变体与50mg/mL均法呢醇一起孵育20小时时,发现与野生型GmSHC相比,每种突变体都表现出活性增加(表12)。当将组合突变体与50mg/mL均法呢醇一起在25%酶负载量下孵育6或20小时时,观察到类似的结果(图3)。
表12
实例6:后续轮次的半理性诱变(通过位点饱和文库)和随机诱变(易错PCR)
为了进一步改进GmSHC活性,生成了额外的突变体,并与野生型相比针对降龙涎香醚产生进行筛选(表13)。GmSHC衍生物筛选测定法包括使用50g/L均法呢醇在2.5%或5%酶负载量下在37℃下孵育24小时或28小时。图4示出了与野生型相比时,在孵育一些SHC突变体后产生的降龙涎香醚产物峰%。
表13
*相对于SHC野生型酶的平均降龙涎香醚产生差异
观察到V45I/Q54E/V222Q/T326S/F624Y GmSHC衍生物和V45I/Q54E/K223S/D227T/T326S/F624Y GmSHC衍生物显示出良好的均法呢醇向降龙涎香醚的转化,其不会随着时间的推移而趋于平稳。在100mg/mL均法呢醇与5%酶负载量下,V45I/Q54E/K223S/D227T/T326S/F624Y GmSHC衍生物的表现优于用Q54E/V45L/T326S/I278T GmSCH衍生物(其具有迄今为止最好的表现)进行的发酵。此外,V45I/Q54E/D227T/T326S/F624Y/M677E GmSCH衍生物;V45I/Q54E/D227T/T326S/F624Y/A574A GmSCH衍生物;和V45L/Q54E/M184I/V222Q/D227T/I278T/T326S/M676L/A574AGmSCH衍生物都显示出良好的降龙涎香醚产生和比以前看到的更高的转化。此外,这些突变体表现出良好的生长、表达和活性。
当被引入45L/Q54E/M184I/I278T/T326S和V45I/Q54E/T326S/F624Y GmSHC衍生物中时,引入V222Q显示出均法呢醇向降龙涎香醚的转化显著增强,当被引入V45I/Q54E/V222Q/T326S/F624Y亲本模板中时,V222R改进了均法呢醇向降龙涎香醚的转化。此外,Q54E/M184I/45L/T326S/I278T/D227T/V222Q/M767L/S242R亲本模板中V222Q到V222R的改变显现出加速了均法呢醇的初始转化。
当被引入45L/Q54E/M184I/V222Q/D227T/I278T/T326S/M767L;45L/Q54E/M184I/V222Q/D227T/I278T/T326S/F654T;V45I/Q54E/K223S/T326S/F624Y;和V45I/Q54E/D227T/T326S/F624Y GmSHC衍生物中时,A574A的引入显示出均法呢醇向降龙涎香醚的转化的良好改进。
当被引入E46Q/Q54E/R194Q/V222Q/D227T/A574A/F624Y;V45I/Q54E/V222Q/T326S/F624Y;和V45I/Q54E/K223S/D227T/T326S/F624Y GmSHC衍生物中时,L640G和M676L的引入显示出均法呢醇向降龙涎香醚的转化的良好改进。类似地,将P641S引入V45L/Q54E/M184I/V222Q/D227T/I278T/T326S/M676L中改进了该亲本模板的均法呢醇向降龙涎香醚转化。位置640和641位于环中,这些残基中任一个的突变都增加了该环的柔性。假设环靠近通道的负责底物识别的狭窄缩窄部,增加柔性预计会对底物识别产生间接影响。然而,该分析的结果表明,具有L640G或P641S氨基酸突变的突变体未显现出能利用除E,E异构体之外的均法呢醇异构体。
将P166P、S682R和M676L引入亲本模板V45I/Q54E/T326S/F624Y;V45I/Q54E/V222Q/T326S/F624Y;和V45I/Q54E/K223S/T326S/A574A/F624Y GmSHC衍生物中改进了均法呢醇向降龙涎香醚的转化。然而,当引入V45I/Q54E/V222Q/T326S/F624Y GmSHC衍生物中时,S242R显现出对酶活性有害。
R249R是在易错文库中鉴定出来的。与亲本GmSHC衍生物相比,将这种沉默突变引入Q54E/M184I/V45L/T326S/I278T/D227T/V222Q/M676L/P641S和Q54E/V45I/T326S/F624Y/V222R GmSHC衍生物中增强了均法呢醇向降龙涎香醚的转化。
M677和M80在Q54E/M184I/V45L/T326S/I278T/D227T/V222Q/M676L/A574A中突变为Glu显现出稳定了酶并改进了均法呢醇的转化。
尽管Q54E/M184I/V45L/T326S/I278T/D227T/V222Q/M676L/P641S/A574A/R504CGmSHC衍生物显示了有希望的均法呢醇转化,但R504C的引入未显现出改进通过包含Q54E/M184I/V45L/T326S/I278T/D227T/V222Q/M676L/P641S/A574A突变的亲本模板观察到的已经令人印象深刻的转化。
包含R249R插入和S682R取代的GmSHC衍生物与包含以下突变的相应亲本模板 相比 时 显 示 出 提 升 :V45L/Q54E/M184I/V222Q/D227T/I278T/T326S/R504C/A574A/P641S/M676L 和V45L/Q54E/M184I/V222Q/D227T/I278T/T326S/A574A/P641S/M676L。
实例7:GmSHC衍生物概要
SHC是采用二聚体3D排列的完整单面膜蛋白。每个单体的特征在于QW基序,其紧密连接许多α-螺旋,形成两个高度稳定的α/α-桶结构域(Wendt等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]286:175-87)。活性中心腔埋藏在两个α/α-桶结构域内,并且其可通过被认为是酶的膜浸没区的内部疏水通道进入(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9:639-45)。该通道和活性中心腔被负责底物识别的狭窄缩窄部隔开(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9:639-45)。对于GmSHC,那些残基对应于Phe176、Met184、Phe457和Cys458。在活性中心腔的顶部发现构成保守的DXDD基序的残基(Wendt等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]286:175-87)。那些残基中的一个是第一质子供体Asp396,它通过向双键C2=C3贡献一个质子来启动均法呢醇的环化。DXDD基序之后是色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基,它们负责通过强阳离子-π相互作用稳定阳离子中间体(Dougherty(1996)Science[科学]271:163-8)。在腔的底部是带负电荷的残基,最终质子受体,它从羟基接收质子,从而导致第三个环的闭合和降龙涎香醚的形成。
为了改进均法呢醇向降龙涎香醚的转化,使GmSHC在SEQ ID NO:2的位置45、位置46、位置54、位置178、位置184、位置194、位置247、位置278、位置326、位置386、位置335、位置460、位置623和位置624的一个或多个残基处突变。
位置45和326。根据GmSHC同源性模型和分子对接计算,残基V45和T326位于底物羟基附近。GmSHC位置45突变为谷氨酰胺、亮氨酸或异亮氨酸,位置326突变为丝氨酸,以增加与底物的分子间相互作用。这两种突变的组合(V45L+T326S)显示,在与15g/L均法呢醇一起孵育20小时后,降龙涎香醚产生增加了1.4倍。
位置46、54和386。根据GmSHC同源性模型和分子对接计算,残基E46或E386作为最终质子受体从底物羟基接收质子。AaSHC(Reinhert等人(2004)Chem.Biol.[化学生物学]11:121-6)和GmSHC同源性模型之间的结构比对表明GmSHC的Q54与AaSHC的残基E45(其为该酶的最终质子受体)叠合(Dang&Prestwich(2000)Chem.Biol.[化学生物学]7:643-9)。因此,使GmSHC的残基54突变为谷氨酸,以在该位置掺入最终质子受体,而不对与保守的DXDD基序相关的电荷网络产生负面影响。残基46突变为谷氨酰胺、丙氨酸或组氨酸,而残基386突变为谷氨酰胺,以改变最终质子受体位置。与野生型酶相比,在位置E386处具有突变的突变体对酶活性没有影响。然而,位置E46和Q54处的突变都显示出均法呢醇向降龙涎香醚的转化增加。在15g/L均法呢醇孵育20小时后,与野生型酶相比,E46Q和E46H突变体的活性分别表现出1.8倍和1.2倍改进,而Q54E突变体的活性表现出1.4倍改进。
位置178。GmSHC同源性模型和同源人羊毛甾醇合酶之间的结构比对(Thoma等人(2004)Nature[自然]432:118-22)表明GmSHC的Q178与人羊毛甾醇合酶的残基H232(其为该酶的最终质子受体)叠合。因此,使GmSHC的残基178突变为谷氨酸,以在该位置掺入最终质子受体。与野生型酶相比,这种突变的引入将均法呢醇向降龙涎香醚的转化增加了1.4倍。
位置184。残基M184位于负责底物识别的狭窄缩窄部中(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9:639-45)。因此,为了改变底物识别,使GmSHC的M184突变为非极性氨基酸,即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸。通过使这个位置突变,也防止了任何的甲硫氨酸氧化现象,该现象可能对底物识别产生负面影响。观察到M184突变为Leu、Ile、Val或Ala中任一种均导致活性增加。值得注意的是,M184I突变体表现出最大的增加,当在低底物负载量下筛选时,均法呢醇向降龙涎香醚的转化改进了1.7倍。
位置194。QW基序牢固地连接α-螺旋,有助于两个α/α-桶的建立。这些高度稳定的α/α-桶保护酶免受与高释能催化反应相关的能量释放影响。根据GmSHC的同源性模型,残基R194位于残基W152附近。因此,使残基194突变为谷氨酰胺,以引入新QW基序与W152一起,从而增加酶的结构稳定性。在实验上,这种突变显示了转化的改进,在低底物负载量下,均法呢醇向降龙涎香醚的转化改进了1.3倍。
位置247。根据GmSHC同源模型,残基P247位于被认为是酶的膜浸没区的通道入口处的环中。使残基P247突变为非脯氨酸残基,以改变该区域中通道的动力学。当在组合突变体V45L+T326S+M184I+R194Q中测试时,当在40%酶负载量下与50g/L均法呢醇一起孵育时,观察到转化改进了2.7倍。
位置278。根据GmSHC同源性模型和分子对接计算,残基I278位于底物羟基的正下方。当残基I278突变为缬氨酸时,分子对接计算表明,通过使底物C2=C3双键的位置更靠近第一质子供体D396,活性中心内的底物排列得到改进。残基I278的突变没有显示出均法呢醇转化的任何改进;然而,当将酶与均法呢酸一起孵育时,当在10g/L底物负载量和100%酶负载量下测试时,与野生型酶相比,酸向香紫苏内酯的转化显示出2倍的改进。随后发现,在该位置引入苏氨酸而非缬氨酸是极其有益的。
位置335。根据GmSHC同源性模型和分子对接计算,残基L335位于第一质子供体残基D396附近,且当突变为苯丙氨酸时,它可以引入与底物阳离子中间体的强阳离子-π相互作用。该位置处的突变提供了在均法呢酸向香紫苏内酯转化方面的1.8倍改进。
位置460。根据GmSHC同源性模型,GmSHC的残基F460是活性中心腔中与负责底物识别的狭窄缩窄部相邻的残基(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9:639-45)。残基F460突变为丙氨酸,以增加向活性中心腔中的底物进入。结果,当在15g/L底物负载量下与均法呢醇反应时,该突变显示出1.3倍的改进。
位置623。根据GmSHC同源性模型和分子对接计算,残基G623的位置靠近底物的羟基。因此,使残基G623突变为丙氨酸或缬氨酸,以增加与底物的分子间相互作用。当G623A突变体在15g/L均法呢醇存在下显示降龙涎香醚产生改进1.6倍时,G623V突变体表现出均法呢酸向香紫苏内酯的转化的1.9倍增加。
位置624。根据GmSHC同源性模型和分子对接计算,残基F624建立了强阳离子-π相互作用,稳定了阳离子中间体。因此,使残基F624突变为酪氨酸或色氨酸,从而引入与底物阳离子中间体更强的阳离子-π相互作用。当该位置改变为色氨酸时,获得从均法呢醇产生降龙涎香醚的1.45倍改进。
位置222。每个SHC单体的特征在于QW基序,其紧密连接许多α-螺旋,形成两个高度稳定的α/α-桶结构域(Wendt等人(1999)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]286(1):175-87)。突变体V222Q旨在建立新的QW基序与W229一起,这进一步增加了酶的结构稳定性。在莫氏葡糖杆菌SHC(GmSHC)的1000种同源酶的序列比对中,位置222的共有残基是精氨酸。共有残基,像V222R,典型地与较高的结构稳定性相关(Steipe等人(1994)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]240(3):188-92)。因此,使V222突变为Q或R有望改进活性。
位置223。K223S直接与狭窄缩窄部的残基F460相互作用,狭窄缩窄部将通道与活性中心隔开,并负责底物识别(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9(5):639-45)。突变体K223S可以改变其所在环的动力学,并间接影响负责底物识别的狭窄缩窄部。
位置226。E225、E226和D227侧链的负电荷不被附近的任何带正电荷的残基反平衡。在所分析的1000种莫氏葡糖杆菌SHC(GmSHC)同源酶的任一种中都没有观察到该基序。突变体E226V降低了具有三个带负电荷的连续残基的排斥效应,而没有增加任何空间惩罚,从而增加了酶的稳定性。
位置227。D227T可以与T453的侧链和主链建立偶极-偶极相互作用。该突变还降低了与具有三个带负电荷的连续残基(E225、E226和D227)相关的排斥。这两种作用都有助于增加酶的稳定性。
位置242。残基S242位于负责酶:膜相互作用的α-螺旋上。参见Gustafsson等人(2017)ACS Omega 2(11):8495-8506。
位置249。该残基与细胞膜相互作用。
位置504。位置504位于环中。突变体R504C引入了具有E503侧链的离子-偶极和具有N505侧链的偶极-偶极相互作用,这增加了环的稳定性,并有助于增加酶的整体结构稳定性。
位置640。位置L640位于环中。突变体L640G增加了该环的柔性,该环靠近通道的负责底物识别的狭窄缩窄部(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9(5):639-45)。在这个环中增加柔性可能对底物识别有间接影响。
位置641。位置P641位于环中。该残基的突变有助于环的局部重排,因为它去除了刚性脯氨酸并引入了更具柔性的残基。预期这对底物识别具有间接影响,因为位置641接近通道的负责底物识别的狭窄缩窄部(Lenhart等人(2002)Chem.Biol.[化学生物学]9(5):639-45)。此外,P641S在这个位置引入了共有残基。共有残基典型地与较高的结构稳定性相关(Steipe等人(1994)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]240(3):188-92)。
位置676。残基M676位于酶的C-末端区域中,并暴露于溶剂。具有M676L取代的酶可防止长期暴露于溶剂引发的甲硫氨酸氧化。
位置677。残基M677位于酶的C-末端区域中,并暴露于溶剂。具有M676L取代的酶可防止长期暴露于溶剂引发的甲硫氨酸氧化。此外,M677E在这个位置引入了共有残基。共有残基典型地与较高的结构稳定性相关。
位置682。残基S682位于酶的C-末端区域的端部,并暴露于溶剂。C-末端由相当高数量的带电残基(D680、E679、K678、R675、R674和R672)组成。S682R在C-末端增加了一个带电荷的残基,观察到这有利于酶的活性。
Claims (13)
1.一种包含编码角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)多肽的核酸分子的重组载体,所述多肽与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性,并且相对于SEQ ID NO:2在位置166、222、223、226、227、242、249、504、574、640、641、676、677、682或其组合处包含氨基酸改变。
2.如权利要求1所述的重组载体,其中所述氨基酸改变包括位置166、249或574处的同义氨基酸或位置222、223、226、227、242、504、640、641、676、677或682处的氨基酸取代。
3.如权利要求1所述的重组载体,其中所述氨基酸改变包括P166P、V222Q、V222R、K223S、E226V、D227T、S242R、R249R、R504C、A574A、L640G、P641S、M676L、M677E、S682R或其组合。
4.如权利要求1所述的重组载体,其进一步包含相对于SEQ ID NO:2在位置45、46、54、86、139、142、178、184、194、239、278、326、335、386、455、460、603、623、624、656、658或其组合处的氨基酸取代。
5.如权利要求4所述的重组载体,其中所述氨基酸取代包括V45I、V45Q、V45L、E46H、E46Q、Q54E、S86A、F139L、Y142R、Q178E、M184A、M184L、M184I、M184V、R194Q、G239V、I278V、T326S、L335F、E386Q、I455T、F460A、Q603H、G623A、G623V、F624Y、F624A、L656E、Y658F或其组合。
6.一种重组宿主细胞,其包含如权利要求1所述的重组载体。
7.一种重组角鲨烯何帕烯环化酶(SHC)多肽,其与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性,并且相对于SEQ ID NO:2在位置166、222、223、226、227、242、249、504、574、640、641、676、677、682或其组合处包含氨基酸改变。
8.如权利要求7所述的重组SHC,其中所述氨基酸改变包括位置166、249或574处的同义氨基酸或位置222、223、226、227、242、504、640、641、676、677或682处的氨基酸取代。
9.如权利要求7所述的重组SHC,其中所述氨基酸改变包括P166P、V222Q、V222R、K223S、E226V、D227T、S242R、R249R、R504C、A574A、L640G、P641S、M676L、M677E、S682R或其组合。
10.如权利要求7所述的重组SHC,其进一步包含相对于SEQ ID NO:2在位置45、46、54、86、139、142、178、184、194、239、278、326、335、386、455、460、603、623、624、656、658或其组合处的氨基酸取代。
11.如权利要求10所述的重组SHC,其中所述氨基酸取代包括V45I、V45Q、V45L、E46H、E46Q、Q54E、S86A、F139L、Y142R、Q178E、M184A、M184L、M184I、M184V、R194Q、G239V、I278V、T326S、L335F、E386Q、I455T、F460A、Q603H、G623A、G623V、F624Y、F624A、L656E、Y658F或其组合。
12.一种用于生产降龙涎香醚的方法,所述方法包括
(a)向如权利要求6所述的重组宿主细胞提供均法呢醇,以及
(b)收集所述宿主细胞产生的降龙涎香醚。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述均法呢醇包括(3E,7E)均法呢醇。
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